Середовище “гіполід” для гіпотермічного зберігання ізольованої печінки

Середовище для гіпотермічного зберігання ізольованої печінки, що включає сахарозу, фосфорнокислий натрій, фосфорнокислий калій, сірчанокислий магній, хлористий кальцій і бідистильовану воду, яке відрізняє ться тим, що додатково містить поліетиленгліколь з молекулярною масою 8000 в концентрації 0,5-5%. (19) (21) u200808655 (22) 01.07.2008 (24) 26.01.2009 (46) 26.01.2009, Бюл.№ 2, 2009 р. (72) ПЕТРЕНКО ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ, U A, СЕМЕНЧЕНКО ОЛЬГА АНАТОЛІЇВНА, UA, ЧЕРКАШИНА ДАР'Я ВІКТОРІВНА, UA, СОМОВ ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ, U A, ТКАЧЕВА ОЛЕНА МИКОЛАЇВН А, U A, ЛЕБЕДИНСЬКИЙ ОЛЕКСАНДР СЕРГІЙОВИЧ, UA, ФУЛЛЕР БАРРІ Д. 3 38844 1,4мм) і фіксували його лігатурою. Потім печінку з катетером акуратно видаляли з тіла тварини і негайно переносили в бюкси, наповнені охолодженим середовищем консервування. Підготовлену описаним вище чином печінку щурів зберігали в умовах побутового холодильника при температурі 0-4°С протягом 1 і 18 годин. В якості розчинів консервування використовували відомий розчин і середовище "Гіполід" (фосфорнокислий натрій 1,8г/л, фосфорнокислий калій 4,08г/л, магній сірчанокислий 0,15г/л, кальцій хлористий 0,71г/л, сахароза 85г/л, ПЕГ-8000 10г/л бідистильованої води, рН 7,4). Наприкінці кожного терміну зберігання з печінки готували гомогенат, в якому визначали вміст АТФ. Після відповідного терміну холодового зберігання, печінку підключали через катетер до системи рециркуляційної перфузії. Перфузію здійснювали 130мл мінімального сольового розчину Кребс-Рінгер-бікарбонат (рН 7,4) протягом 60хв. при 37°С. Перед початком перфузії в розчин вводили 10мМ HEPES, 5мМ глюкози й насичували карбогеном (час газації 3хв.). Наприкінці нормотермічної реперфузії ізольованої печінки в перфузаті визначали активність цитоплазматичного фермента лактатдегідрогенази (ЛДГ). У свіжовиділеній і відмитій від крові печінці вміст АТФ становить 2,5-4,5мкмоль/г ткані. Одержані нами результати узгоджуються з цими показниками (Табл.1). При дослідженні внутрішньоклітинного вмісту АТФ після годинного зберігання ізольованого органу в розчині за прототипом і середовищі "Гіполід" були отримані аналогічні результати, які свідчать про високий рівень інтактності клітин печінки і про їх адекватну реакцію на умови короткочасної холодової ішемії (60 хв.) і наступної нормотермічної реперфузії. Після 18-годинного гіпотермічного зберігання ізольованої печінки зафіксовано зниження рівня АТФ, що можна пояснити, з одного боку, виснаженням внутрішньоклітинних субстратів окислення, а з іншого - його витратою на підтримку гомеостазу клітин при холодовій ішемії. Однак при використанні середовища "Гіполід", рівень внутрішньоклітинного АТФ вище, ніж у відомому розчині. 4 Наступна нормотермічна реперфузія зразків виявила ще більшу різницю в ефективності середовищ. Використання середовища "Гіполід" дозволило зберегти цей показник на вищому рівні (Табл.1). Для подальшого обґрунтування введення ПЕГ8000 в середовище гіпотермічного зберігання печінки, була вивчена динаміка зміни рівня активності ЛДГ в перфузаті під час нормотермічної реперфузіі ізольованої печінки. Переведення печінки з умов холодової ішемії в нормотермічний стан дозволяє виявити латентні пошкодження гепатоцитів у складі органу. Стан плазматичних мембран клітин печінки чутливо реагує на найменші впливи, в результаті чого відбувається втрата розчинних ферментів і дезорганізація клітин в цілому. Як видно із представлених результатів (Табл.2), протягом нормотермічної реперфузії у середовищі інкубації спостерігається поступове збільшення активності ЛДГ незалежно від складу консервуючих середовищ. I якщо в контрольних пробах (60хв. зберігання) різниця в активності ферменту не є достовірною, то після 18-годинного зберігання печінки в заявлюваному середовищі рівень ЛДГ після реперфузії нижчий, ніж у прототипі. Приклад 2. Для обґрунтування концентрації ПЕГ-8000 в заявлюваному середовищі були проведені експерименти щодо вивчення активності ЛДГ в реперфузійному середовищі після 18годинного зберігання ізольованої печінки в розчинах консервування, які містять різні концентрації ПЕГ-8000. Як показують представлені дані (Табл.3), найменший вихід ЛДГ у позаклітинне середовище спостерігається при використанні у складі консервуючого розчину ПЕГ-8000 у концентрації 0,5-5%. Таким чином, отримані результати свідчать, що заявлюване середовище "Гіполід", яке містить у своєму складі від 0,5 до 5% ПЕГ-8000, більшою мірою, у порівнянні з прототипом, забезпечує збереження функціонально-метаболічного статусу ізольованої печінки після 18-годинного гіпотермічного зберігання органа при 4°С. Таблиця 1 Вміст АТФ (мкмоль/г) в печінці після її зберігання при 4°С (n=6) Умови зберігання та інкубації Контроль, 4°С, 60хв. Наступна реперфузія при 37°С, 60хв. Зберігання, 4°С, 18год. Наступна реперфузія при 37°С, 60хв. Середовище зберігання за прототипом "Гіполід" 3,61±0,24 4,44±0,45 2,86±0,42 2,98±0,36 2,08±0,15 2,32±0,21 1,40±0,19 1,56±0,17 5 38844 6 Таблиця 2 Рівень активності ЛДГ (U/V) в розчині нормо термічної реперфузії після зберігання ізольованої печінки в середовищах різного складу (n=6) Середовище за прототипом "Гиполід" Умови зберігання Контроль, 60хв., 4°С 16,6±1,8 15,8±0,8 18 год., 4°С 24,0±0,8 20,8±1,3* *- зміни достовірні порівняно з відомим розчином Таблиця 3 Рівень активності ЛДГ (U/V) в розчині нормотермічної реперфузії (60хв.) після зберігання ізольованої печінки в середовищах з різною концентрацією ПЕГ-8000 (n=6) Концентрація ПЕГ-8000, % 0,25 0,5 1 2 3 4 5 6 Активність ЛДГ 28,7±0,8* 23,8±1,3 20,8±0,8 23,2±1,9 23,2±1,4 24,5±1,4 24,1±2,0 30,8+1,9** * - зміни достовірні порівняно з наступними концентраціями ПЕГ ** - зміни достовірні порівняно з попередніми концентраціями ПЕГ Джерела інформації: 1. Wahlberg J., Eklund T. Hillered comparison of energy metabolism in rat liver grafts during preservation in University of Winconsin or Euro-Collins //Transplant. Proseed. -1995. -V.27. -P.721-722. Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 2. Семенченко О.А., Шаніна І.В., Петренко О.Ю. Середовище для гіпотермічного зберігання ізольованої печінки. /Патент України 57680A, AO1N1/02, 2003. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601