Середовище для культивування та збереження ембріонів ссавців

Середовище для культивування та збереження ембріонів ссавців, що містить NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, антимікробний засіб та дистильовану воду, яке відрізняється тим, що додатково містить екстракт ембріонів жуйних тварин чи курей, а як антимікробний засіб - сульфацил натрію, при наступному співвідношенні компонентів, на 1 л: Винахід відноситься до області сільського господарства, зокрема до біотехнології відтворення ссавців: короткочасне та тривале культивування і збереження жіночих гамет і ембріонів, отриманих in vivo та in vitro, що в подальшому можуть бути використані для прискориення розмноження тварин методом трансплантації. Для маніпуляцій з ембріонами використовуються середовища Ігла, Хема, ТСМ 199, а також фізіологічні сольові розчини такі, як фосфатний буфер Дюльбекко і розчин Кребса. Відомі живильні середовища за кількістю ком понентів поділяються на прості та складні. Зменшення числа компонентів до мінімуму, необхідного для забезпечення росту і розвитку клітин, привело до створення так званих мінімальних середовищ, до яких, насамперед, відноситься мінімальне середовище (MEM), яке запропоновано Іглом. У його склад входять 13 амінокислот, 8 вітамінів, глюкоза і 6 неорганічних солей [Сергеев Β.Α., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии. Киев: Урожай, 1970]. Склад середовища Ігла (MEM), мг/л: 8,5-8,7 г 2,1-2,8 г 0,2-0,4 г 3-5 г 100-200 мл до 1,0 л. L-метіонін L-фенілаланін L-треонін L-триптофан L-тирозин Піридоксаль-НСl Рибофлавін Тіамін НСl Холінхлорид Фолієва кислота і-інозитол 15,0 32,0 48,0 10,0 36,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 2,0 (11) UA 6800,0 400,0 140,0 200,0 200,0 2200,0 1000,0 105,0 24,0 31,0 46,0 (19) NaCI КСl NaH2PO4×Н2О MgSO4×7H20 СаСl2 (безводний) NaHCO3 D-глюкоза L- аргінін L-цистин L-гістидин L-валін 77745 (13) C2 NaCl Na3HPO4 KH2PO4 сульфацил натрію екстракт ембріонів жуйних тварин чи курей дистильована вода 3 L-глутамін L-изолейцин L-лейцин L-лізин 292,0 52,5 52,4 58,0 77745 Нікотинамід D-пантотенат Са Феноловий червоний Основним призначенням середовища Ігла є використання його для вирощування культур кліток, що використовуються для різних цілей: культивування вірусів і мікроорганізмів, виготовлення вакцин, тривалого культивування культур кліток, що перевиваються. У зв'язку з відсутністю спеціалізованих середовищ його також використовують для культивування ембріонів ссавців із внесенням додаткових компонентів, зокрема гонадотропних і гестагенних гормонів. Середовище Ігла дуже чутливе до змін зовнішнього середовища. При контакті з останнім воно утрачає свою первісну біологічну якість: концентрація водневих іонів зрушується в кислу сторону. MEM є гарним живильним середовищем для розвитку банальної мікрофлори. Крім перерахованих недоліків - це середовище закордонного виробництва, багатокомпонентне і, відповідно, дороге. Відоме середовище для культивування та короткочасного зберігання ембріонів крупного рогатого скота, основою якого являється буферний розчин Дюльбекко (Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. - Москва, 1987) з концентрацією водневих іонів (рН) 7,05-7,6 і осмотичним тиском - 290-300 МОсм, включає: NaCl; Na2HPO4; КН2РO4; дистильовану воду, фетальну сироватку й антимікробний засіб (пеніцилін 100000 Од/л). Склад розчину Дюльбекко, мг/л: Натрій хлористий 8,0 Калій хлористий 0,20 Натрій фосфат двох заміщений безводний 1,15 Калій фосфат одно заміщений 0,20 Магній хлористий 6-водний 0,10 Кальцій хлористий безводний 0,10 Глюкоза 1,0 Натрій-піруват 0,036 Розчин Дюльбекко складається з достатнього числа компонентів. Готування цього розчину представляє деяку складність: перераховані компоненти повинні розчинятися тільки в зазначеній нижче послідовності, у противному випадку утворяться важко розчинні опади вуглекислих та фосфорних солей кальцію і магнію. Тому останні розчиняють окремо, а потім ці розчини додають до основної частини, що включає інші компоненти. При стерилізації приготовленого розчину Дюльбекко виникають труднощі з вищевказаної причини, зокрема його не можна стерилізувати будь-яким способом крім фільтрації. Стерилізація автоклавуванням чи радіаційним методом робить розчин непридатним до використання. Таким чином, багато компонентність розчину Дюльбекко, позтапність і складність готування, зміна його якості при стерилізації автоклавуванням і іонізуючим випромінюванням - усе це ускладнює його застосування і відповідно підвищує вартість біоматеріалу. В усі середовища безпосередньо перед культивуванням і збереженням ембріонів додають 10 4 1,0 1,0 10,0 20% фетальної сироватки крові великої рогатої худоби. Однак дотепер немає єдиної думки про роль сироватки при культивуванні клітинних культур. На думку одних дослідників наявність сироватки у культуральному середовищі служить джерелом не ідентифікованих факторів росту. Інші вчені говорять, що сироватка є джерелом незамінних низько - чи високомолекулярних з'єднань. На нашу думку роль сироватки при культивуванні ембріонів не стільки «трофічна», скільки «ріст стимулююча». Готування сироваток крові, зокрема фетальної сироватки, є трудомістким і дорогим процесом. Для цього необхідно виконати ряд вимог: одержати кров від телят відразу ж після їхнього народження до прийому першої порції молозива і приготувати сироватку, яку необхідно піддати стерилізації й іспиту. Головним недоліком фетальної сироватки є варіабельність її складу, наявність антитіл, часта контамінація вірусами, мікоплазмами та іншими мікроорганізмами. Окремі серії сироватки мають токсичність. Таким чином, висока вартість, періодичний дефіцит через труднощі одержання достатнього обсягу з постійним складом і якістю, зниження активності ростового фактору при тепловій інактивації, процес контролю і перевірки кожної серії - все це обмежує можливість використання сироватки для культивування і збереження ембріонів in vitro. В основу винаходу поставлена задача - розробити вітчизняне мало компонентне середовище для культивування та збереження ембріонів ссавців in vitro перед їх пересадкою. Практика показує, що ряд речовин, що входять до складних середовищ може бути виключені або замінені без збитку для нормального розвитку жіночих гамет при культивуванні їх in vitro. Поставлена задача вирішується тим, що середовище для культивування та збереження ембріонів ссавців, яке включає NaCl; Na2HPO4; КН2РO4; дистильовану воду, фетальну сироватку й антимікробний засіб (пеніцилін 100 од/мл) і відрізняється тим, що воно містить NaCl - 8,5-8,7; Na2HPO4 - 2,17-2,8; КН2РO4 - 0,2-0,4; дистильовану воду - 1,0л; замість фетальної сироватки 10-20% екстракту ембріона жуйних тварин чи курей та антимікробний засіб - 3-5г/л суль-фацил-натрію. При складанні рецептури середовища для культивування і збереження ембріонів ми виходили з того, щоб у його склад входила мінімальна кількість компонентів, необхідних для росту і розвитку клітин. За основу середовища для культивування і збереження ембріонів ссавців взяли розчин для вилучення ембріонів [Авторское свидетельство №1713529, 1989, Ф.И.Осташко, М.К.Дибиров, Н.Д.Безуглый], якій у подальшому називаємо стабілізованний фосфатно-сольовий буфер (СФСБ). Дорогу фетальну сироватку замінили на екстракт ембріона жуйних тварин або курей, тим самим замінили її компоненти («ріст 5 77745 6 стимулюючі» фактори, гормони, енергетичні субпературі -20°С протягом 48 годин. Потім екстракт страти) на наявні у екстракті. При цьому імітували знову відтавали та центрифугували. Відбирали склад рідини, що оточує клітини in vivo, та дотринадосадочну рідину і розфасовували її в мували принцип «кондиційного середовища». поліетиленові капсули об'ємом 0,25мл для Після приготування контрольного та розробраціонального використання і виключення контакленого середовищ визначали їх фізико-хімічні поту з зовнішнім середовищем та зберігали у холоказники. Осмотичний тиск вимірювали за допомодильнику при температурі -20°С. Усі описані вище гою осмометра ОМК ИС-01, який у розробленому процедури виконували з дотриманням асептичних середовищі відповідає 328 МОсм та 318-у конвимог. Стерильність отриманого матеріалу визнатрольному. Осмотичний тиск середовищ у досліді і чали шляхом посіву 0,25мл екстракту ембріона на контролі перебільшує припустиму межу (260-310). живильні середовища для культивування Однак існують дані, що він може коливатися у мемікроорганізмів. Перед застосуванням необхідну жах ±10% без шкоди для клітин. Іономером марки кількість екстракту повільно розморожували і стеУЭВ-74 визначали рН середовищ, які були 7,7 у рилізували через міліпорові фільтри діаметром дослідного та 7,6 у контрольного. У процесі роботи 0,45 mm. показники рН коректували до норми (7,2-7,4). Приготовлений екстракт ембріону вносили у Запропоноване середовище для культивуванСФСБ від 10 до 20% до загального об'єму середоня і збереження ембріонів ссавців складається з вища. Для зручності при використанні та тривалоNaCl – 8500,0мг; Na2HPO4 ×6H2О – 2170,0мг; го збереження екстракт ембріона можна КН2РO4 – 200,0мг; екстракту ембріона великої роліофілізувати та розфасува ти в ампули чи флакогатої худоби, вівці, кози або курки – 100,0мл; ни. сульфацил-натрію – 50.0мг та бідистильованої У результаті пошукових досліджень підібрано води - 1,0л. антимікробний препарат -сульфацил-натрія, що Для одержання екстракту ембріона у тварин володіє широким спектром антимікробної дії та як після забою відбирали вагітну матку. Потім речовина найбільш прийнятна для роботи з яйзовнішню поверхню матки ретельно промивали цеклітинами й ембріонами. У досліді використову0,85%-им розчином хлориду натрію, а місце ін'єкції вали сульфацил-натрію, що випускається обробляли 5%-им спиртовим розчином йоду. Після вітчизняною фармацевтичною промисловістю. цього матку розташовували на стерильній кюветі Були випробувані наростаючі концентрації сульта робили прокол голкою з канюлею для відбору фацил-натрія, що приготовлені на основі амніотичної рідини, робили розріз, через який вифізіологічного розчину, і встановлена його тягали ембріон. нешкідлива для біообьекту та бактерицидна для Екстракт виготовляли з 30-35-ти денного мікробів концентрація - 30-50мг/л, що була нами ембріона великої рогатої худоби, 14-20-ти денного використана в подальшій роботі. Токсичність преембріона вівці чи кози, 8-10-ти денного курячого парату визначали шляхом постановки біопроби на ембріона. Ембріон розрізали на маленькі шматочсперміях бугаїв і баранів. Бактерицидні властики і гомогенізували при 4-х тис.об./хв. протягом 15 вості сулфацил-натрію перевіряли шляхом внехвилин. Отриману масу змішували порівну зі стесення його у контрольне та дослідне середовище з рильним 0,85%-им розчином хлориду натрію чи наступним посівом проб на живильні середовища стабілізованим фосфатно-сольовим буфером для мікроорганізмів. (СФСБ) і ставили на екстрагування в холодильник Для підтвердження робочої гіпотези, що запри температурі +4°С на 24-48 годин, а потім ценпропонований екстракт ембріона не уступає за трифугували при 4-х тис.об./хв. протягом 40 і хвибіологічно важливими показниками від фетальній лин. Надосадочну рідину відбирали у стерильний сироватці великої рогатої худоби, були проведені поліетиленовий пакет та заморожували при тембіохімічні дослідження (таблиця 1). Таблиця 1 Біохімічний склад фетальної сироватки та екстракту ембріона великої рогатої худоби Імплементор Фетальна сироватка Екстракт ембріона Білок заг., мг % Глюкоза, мг % Холестерин, мг % Тригліцериди, Ммоль Піровиноградна кислота рН Осмолярність, осм 4,7±0,2 185,0±3,0 43,5±2,4 сліди 1,6±0,1 7,3±0,1 300,2±5,07 5,3±0,1 132,2±1,2 59,0±0,1 0,58±0,01 1,2±0,4 7,2±0,1 306,0±5,08 Бактеріологічний контроль приготовлених середовищ проводили шляхом посіву їх на живильні середовища для мікроорганізмів (МПБ, ΜΠΑ). Результати досліджень показали, що у контрольному та дослідному середовищі без додавання антисептиків спостерігався ріст мікроорганізмів. При додаванні у контрольне середовище в якості антисептика пеніциліну у дозі 100000 Од/л, а у дослідне - сульфацил-натрію в концентрації 30-50 мг/л були отримані аналогічні результати (таблиця 2). 7 77745 8 Таблиця 2 Бактеріологічний контроль середовищ Ріст мікроорганізмів на живильних середовищах Без антисептиків З антисептиками ФБР+10% ЕЕ (дослід) + ФСБД +10% ФС (контроль) + *Примітка: ФБР - фізіологічний буферний розчин; ФСБД - фосфатно-сольовий буфер Дюльбекко; ЕЕ екстракт ембріона; ФС - фетальна сироватка. Середовище Відомо, що при тривалому використанні антибіотиків, зокрема пеніциліну, у мікроорганізмів виробляється стійкість до нього. Крім цього проведені нами дослідження з визначення токсичності антисептиків шляхом біопроби на сперміях бугаїв і Таблиця 3 Вплив антибіотиків на переживаність сперміїв при інкубуванні у дослідному та контрольному середовищах Активність сперміїв за часом в балах,год. /бал. 0 2 4 6 24 48 Дослід ФБР+ЕЕ+5 мг/мл СН 7,5 7,0 6,5 6,0 3,0 0,5 Контроль ФСБД+ФС+100од/мл 8,0 7,5 6,0 3,5 0,5 Μ Π Склад середовища баранів показали, що вони у дослідному середовищі зберігали активний рух протягом 48 годин, а у контрольному - 24 годин (таблиця 3). *Примітка : ФБР- фосфатно-буферний розчин; ЕЕ - екстракт ембріона; СН - сульфацилнатрія; ФСБД - фосфатно-сольовий буфер Дюльбекко; ФС - фетальна сироватка; Π пеніцилін. У наступних дослідах визначали вплив екстракту ембріона, отриманого від різних видів жуйних тварин, при додаванні його у середовища для розбавлення сперми баранів-плідників у концентраціях від 10 до 20% (таблиця 4). Таблиця 4 Вплив екстракту ембріонів різних видів тварин у залежності від його концентрації на показники сперми баранів-плідників Якісні показники сперми при її розведенні Рухливість сперміїв Переживаність Абсолютна виживаність після розведення сперсперміїв (t), год. сперміїв (Sa), ум.од. ми, бал. 1. ФБР+20%ЕЕТ+СН 7,3±0,11 13,3±0,31 65,8±2,24 2. ФБР+10%ЕЕТ+СН 8,0±0 13,6±0,34 69,6±0,67 3. ФБР+20%ЕЕЯ+СН 8,0±0 14,0±0 70,0±2,97 4. ФБР+10%ЕЕЯ+СН 8,0±0 13,6±0,34 67,0±4,58 5. ФБР+20%ЕЕЦ+СН 8,0±0 13,6±0,34 68,3±2,19 6. ФБР+20%ЕЕЦ+СН 8,0±0 14,0±0 74,6±3,41 7. ФСБД+20%ФС+П 8,0±0 13,6±0,34 69,6±0,67 *Примітка: ФБР - фізіологічний буферний розчин; ЕЕТ - екстракт ембріона теляти; ЕЕЯ - екстракт ембріона ягняти; ЕЕЦ - екстракт ембріона цапеняти; ФСБД - фосфатно-сольовий буфер Дюльбекко; ФС - фе тальна сироватка; СН -сульфацил-натрія; П - пеніцилін. Склад середовища Результати досліджень показали, що спермії баранів не чуттєві до зміни концентрації ЕЕ від 20 до 10% і виду жуйних тварин, від яких отримано екстракт ембріона. При цьому переживаність (t) і абсолютна виживаність (Sa) сперміїв у середовища х з додаванням 20; 10% ЕЕ будь-якого виду жуйних тварин змінювалася відповідно від 13,3±0,31; 13,6±0,34; 14,0±0; 13,6±0,34; 13,6±0,34; 14,0±0,0 і 13,6±0,34 год. та 65,8±2,24; 69,6±0,67; 70,0±2,97; 67,0±4,58; 68,3±2,19; 74,6±3,41 і 69,6±0,67 ум.од. й вірогідно не відрізнялася від значень цих показників у контролі. Найбільш доступним у наших умовах є екстракт ембріона теляти, тому лабораторну перевірку придатності розробленого середовища для культивування та збереження ембріонів проводили з використанням саме цього екстракту у концентрації 10% до загального об'єму середовища. Ефективність запропонованого середовища оцінювали по здатності ембріонів розвиватися in vitro протягом 24-48 годин. Культивування ембріонів проводили за загальноприйнятою методикою. У контролі використовували розчин Дюльбекко з додаванням фабричної фетальної сиро 9 77745 10 ватки й антибіотиків відповідно до інструкції (Инстбораторних тварин (пацюків і мишей) на різних рукция по трансплантации эмбрионов крупного стадіях розвитку, задовільної, гарної і відмінної рогатого скота, 1987). Для культивування викориякості. Результати проведених досліджень навестовували ембріони великої рогатої худоби та ладено в таблиці 5. Таблиця 5 Вплив імплементору на розвиток ембріонів ссавців при культивуванні їх in vitro Ембріони Корів Пацюків Мишей Розвилося ембріонів до наступної стадії ФБР+10%ЕЕТ+СН ФСБД+10%ФС+П шт. % шт. 9/10 90,0±5,21 9/10 17/16 98,3±3,12 9/10 20/19 99,05±1,45 20/18 % 90,0±5,21 90,0±5,21 99,1±1,68 *Примітка: ФБР - фізіологічний буферний розчин; ЕЕТ- екстракт ембріона теляти; ФСБД - фосфатносольовий буфер Дюльбекко; ФС - фе тальна сироватка; СН - сульфацил-натрію; Π - пеніцилін. Визначено, що як у контрольному, так і дослідному середовищі усі ембріони доімплантаційних стадій відмінної та гарної якості досягли наступної стадії розвитку. Ранні морули задовільної якості як у досліді, так і у контролі дегенерували. Таким чином, лабораторна перевірка показала, що в якості імплементору у середовище можна додавати екстракт ембріону в концентрації 10%, незалежно від якого виду жуйних тварин його отримали. Створення мало компонентного вітчизняного середовища з доступного і більш дешевого ма Комп’ютерна в ерстка Г. Паяльніков теріалу забезпечує збереженість ембріонів від лабораторних (пацюки, миші) та сільськогосподарських тварин (велика рогата худоба) поза організмом після їх вилучення протягом декількох діб, підвищує санітарний рівень при їх збереженні, дозволяє проводити біотехнологічніроботи з досягненням аналогічного ефекту як при використанні інших середовищ. Має велике прикладне значення в рішенні проблем відтворення та прискореного розмноження сільськогосподарських тварин методом трансплантації ембріонів. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601