Спосіб отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro

Реферат: UA 79592 U UA 79592 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, генетиці для створення нових форм рослин цукрових буряків. Метод культури калюсних клітин in vitro використовується для вирішення багатьох фундаментальних питань клітинної біології, фізіології і генетики рослин. Проходження клітинами стадії неорганізованого росту in vitro призводить до виникнення нових форм - сомаклональних варіантів, які відрізняються від вихідних рослин за фенотиповими та генотиповими ознаками, що дає можливість використання цього методу в селекції кормових буряків. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб отримання калюсу цукрових буряків з сегментів листових пластинок і черешків стерильних клонів цукрових буряків (В.І. Редько., Т.М. Недяк., O.K. Драгунова., О.В. Дубін/ Калусогенез і сомаклональна мінливість у цукрових буряків. Збірник наукових праць. УННА Інституту цукрових буряків.—К.: 2000. -С- 138143), який включає культивування сегментів листових пластинок та черешків довжиною 3-5 мм, отриманих зі стерильних клонів цукрових буряків на живильних середовищах Мурасіге і Скуга (MS) та Гамборга і Евелега (В5) модифікованих додаванням БАП - 0,1-0,5 мг/л, гідролізату казеїну - 100 мг/л, інозитолу - 100 мг/л, аскорбінової кислоти - 2,5 мг/л, 2,4-Д - 0,1-0,2 мг/л. Культивування проводили при температурі +35±2 °C, спочатку в темноті (в умовах термостату), а потім на світлі, при відносній вологості 70 %. Субкультивування калюсної тканини проводили кожні 3-4 тижні. За таких умов на 35 добу отримували калюсні глобули розміром 1,5-3,5 мм. Відомий і пропонований способи отримання калюсогенезу у буряків мають спільні ознаки: використання як експлантів вилучених тканин, агаризовані живильні середовища Гамборга і Евелега, умови культивування вилучених експлантів в темряві (термостаті) перших 3 тижні культивування. Проте, даний спосіб є доволі трудомістким, не забезпечує швидкого отримання калюсу з інших експлантів в достатній кількості і має додаткові етапи отримання стерильних експлантів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro за допомогою недозрілих зародків кормових буряків, що забезпечить пришвидшення отримання калюсу, дозволить зменшити додаткові етапи та підвищити рівень рентабельності. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro, у якому для культивування беруть сегменти листових пластинок та черешки довжиною 3-5 мм, які отримують з стерильних клонів цукрових буряків. В подальшому їх переносять на живильні середовища Мурасіге і Скуга (MS) та Гамборга і Евелега (В5) модифікованих додаванням БАП - 0,1-0,5 мг/л, гідролізату казеїну - 100 мг/л, інозитолу - 100 мг/л, аскорбінової кислоти - 2,5 мг/л, 2,4-Д - 0,1-0,2 мг/л. Проводили культивування при температурі +35±2 °C, спочатку в темноті (в умовах термостату), а потім на світлі, при відносній вологості 70 %. Субкультивування калюсної тканини проводили кожні 3-4 тижні. За таких умов на 35 добу отримували калюсні глобули розміром 1,5-3,5 мм. Запропонований спосіб отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro включає використання недозрілих зародків кормових буряків, які стерилізують 35 % розчином Білизна за експозиції 70-80 хвилин, але попередньо одну добу витримують в умовах холодильної камери при температурі + 4 °C. Вилучені недозрілі зародки висаджують на живильне середовище Гамборга і Евелега з додаванням БАП - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 1 мг/л, НОК - 1 мг/л, 2,4-Д - 0,5-0,8 мг/л, гліцину - 2,0 мг/л, цукрози - 30-50 г/л. Культивують 3 тижні в умовах термостату (темряві) при температурі 24±2 °C, потім переносять в термальне приміщення з освітленням 3000-4000 лк і 16 годинним фотоперіодом. Новими відмінними від існуючого прототипу ознаками є: стерилізація квітконосних пагонів; використання 35 % розчину Білизна; введення як експланту - недозрілі зародки; використання цукрози; використання гліцину - 2,0 мг/л; використання гіберелової кислоти - 1,0 мг/л; зниження температури при культивування до 24±2 °C; скорочення терміну культивування до 2 етапів; холодова обробка при +4 °C перед введенням - 1 доба. Відмінні від прототипу ознаки при взаємодії з відомими ознаками забезпечують скорочення строків культивування і створення калюсу кормових буряків з різним рівнем регенераційної здатності, дозволяють отримати рослини з маложиттєздатних зародків, дає змогу удосконалити склад живильного середовища та отримати калюс за 3 тижні культивування без додаткових етапів та підвищити рівень рентабельності. 1 UA 79592 U 5 10 15 Ефективність нового способу отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro вивчали на вихідному матеріалі недозрілих зародків кормових буряків: Веселка, Уманський напівцукровий, Роте Вальц, Сонет. Згідно з результатами досліджень видно, що надто висока температура 35±2 °C згубно діє при культивуванні, доцільно знизити її до 24±2 °C. У відомому способі використовують гідролізат казеїну та інозетол - 100 мг/л, які були замінені гліцином - 2,0 мг/л і гібереловою кислотою - 1,0 мг/л та цукрозу - 30,0-50,0 г/л, що дозволяє отримати калюс розміром 5,0-9,8 мм. Пропонований спосіб отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro здійснюється таким чином: використовують квітконосні пагони II порядку після цвітіння кормових буряків, які 1 добу витримують в умовах холодильної камери при температурі + 4 °C, промивають мильним розчином, стерилізують 35 % розчином Білизна за експозиції 70-80 хвилин та промивають стерильною дистильованою водою 4-5 разів впродовж години. Вилучають недозрілі зародки та висаджують їх на живильне середовище Гамборга і Евелега з додаванням БАП - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 1,0 мг/л, НОК - 1,0 мг/л, 2,4-Д - 0,5-0,8 мг/л, гліциу - 2,0 мг/л, цукрози - 30-50 г/л. Культуру зародків культивують 3 тижні в умовах термостату (темряві) при температурі 24±2 °C, потім переносять в термальне приміщення з освітленням 3000-4000 лк і 16 годинним фотоперіодом, що забезпечує отримання калюсу у 86,2-100 % експлантів, розміром 5,0-9,8 мм (табл). Таблиця Спільні та відмінні показники використання запропонованого способу отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro Показники Експлант Мінеральна основа середовища Температура культивування, °C Умови культивування Термін культивування, тижні Довжина фотоперіоду, годин БАП мг/л ІОК мг/л Гіберелова кислота, мг/л НОК мг/л 2,4-Д, мг/л Гідролізат казеїну, мг/л Гліцин, мг/л Цукроза, г/л Інозетол, мг/л Розмір калусних глобул, мм Відомий спосіб Запропонований спосіб сегменти черешків, недозрілі зародки листові пластинки Мурасіге і Скуга Гамборга і Евелега 35±2 24±2 темрява темрява 4 3 16 16 0,1-0,5 0,5 0,1-0,5 1,0 0,1-0,2 1,0 0,1-0,2 0,5-0,8 100 2,0 30,0-50,0 100 1,5-3,5 5,0-9,8 20 25 Впровадження запропонованої корисної моделі сприятиме скороченню строків культивування і створення калюсу кормових буряків з різним рівнем регенераційної здатності, дозволить отримати рослини з маложиттєздатних зародків при самонесумісності та віддаленій гібридизації рослин, дасть змогу удосконалити склад живильного середовища та отримати калюс за 3 тижні культивування без додаткових етапів і підвищити рівень рентабельності. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб отримання калюсної тканини у кормових буряків в культурі in vitro, що включає вилучення стерильних експлантів кормових буряків, культивування на модифікованому агаризованому живильному середовищі Гамборга і Евелега, в умовах термостату протягом 3 тижнів, який відрізняється тим, що стерилізують квітконосні пагони, культивування проводять за температури 24±2 °C, як експлант використовують недозрілі зародки, використовують середовище Гамборга і Евелега з додаванням: БАП 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 1,0 мг/л, НОК - 1,0 мг/л, 2,4-Д - 0,5-0,8 мг/л, гліцину - 2,0 мг/л, цукрози - 30,0-50,0 г/л. 2 UA 79592 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3