Спосіб отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro

Реферат: UA 79591 U UA 79591 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, генетиці для створення нових форм рослин цукрових буряків. Цукрові буряки, порівняно з іншими культурними рослинами, мають відносно невелику генетичну різноманітність. Проте, чим вона вища, тим більша вірогідність виявлення форм, поєднання яких здатне дати високий ефект гетерозису. Метод культури клітин і тканин in vitro дає можливість практично використовувати в селекції новий тип сомаклональної мінливості, Калюсогенез - це перший етап для отримання сомаклональних варіантів, який потребує перепрограмування розвитку спеціалізованих тканин. Клітина переведена в умови культивування in vitro зберігає свою генетичну інформацію і при наявності певних умов може її реалізувати в новому організмі. Поряд з цим, фізичні та хімічні фактори культивування мають мутагенну дію і створюють умови для отримання генетично змінених рослин. Доведено дослідженнями багатьох авторів про одержання калюсогенезу у цукрових буряків. Однак, отримання органогенного калюсу залишається досить складним завданням для багатьох експлантів і генотипів цукрових буряків. Як вихідні експланти для отримання калюсної культури можуть бути використані будь-які тканини і органи рослин: листя, сім'ядолі, черешки, стебло, корінь, пиляки, мікроспори. При їх культивуванні утворюються калюси різні за кольором і консистенцією (пухкі і тверді), здатні і нездатні до морфогенезу. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб отримання калюсу з тканин сегментів черешків і листових пластинок цукрових буряків (С.А. Криловська. Особливості морфогенезу in vitro цукрових буряків (Beta vulgaris L.). Збірник наукових праць НААН ІБКіЦБ К.2012.вип.14. -С. -461-465). Даний метод характеризується тим, що вихідними експлантами для одержання калюсу використовують сегменти черешків і листових пластинок стерильних бруньок цукрових буряків, регенерацію калюсу отримують на живильному середовищі Мурасіге і Скуга з додаванням: БАП - 1-2 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, ІОК - 0,1-0,5 мг/л, 2,4-Д - 2,0 мг/л, гідролізат казеїну 0,5 мг/л, інозитолу - 100 мг/л, вітаміну B1 - 0,5 мг/л, яке забезпечує отримання інтенсивності калюсогенезу від 40 до 100 %, маса калюсних глобул складає 0,46 - 1,12 г за умов культивування в термостаті при температурі 25 °C протягом трьох тижнів. Відомий і пропонований способи отримання калюсогенезу у цукрових буряків мають спільні ознаки: використання як експлантів вилучених тканин цукрових буряків, агаризовані живильні середовища, умови культивування експлантів. Але, за відомого способу не можливо отримати калюс з інших експлантів цукрових буряків в достатній кількості. Крім того, він є доволі трудомістким, так як включає додатковий етап розмноження стерильних клонів, не забезпечує отримання достатньої кількості калюсних структур, а також потребує довшого терміну культивування. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб отримання органогенного калюсу цукрових буряків in vitro шляхом використання як експлантів недозрілих зародків цукрових буряків, що дає змогу отримати калюс за 3-4 тижні культивування без додаткового підготовчого етапу і підвищити рівень рентабельності. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі отримання калюсу у цукрових буряків в культурі in vitro, що включає стерилізацію вихідного матеріалу, розмноження стерильних клонів, вилучення сегментів листових пластинок і черешків з стерильних клонів, культивування вилучених експлантів на живильних середовищах Мурасіге і Скуга модифіковане додаванням БАП - 1-2 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, ІОК - 0,1-0,5 мг/л, 2,4-Д - 2,0 мг/л, гідролізат казеїну 0,5 мг/л, інозитолу - 100 мг/л, вітаміну В1 - 0,5 мг/л, яке забезпечує отримання інтенсивності калюсогенезу від 40 до 100 %. Культивування експлантів в умовах термостату при температурі +35±2 °C, потім на світлі при відносній вологості - 70 %. Такі умови дозволять отримати калюсні глобули вагою 0,46 - 1,12 г. Запропонований спосіб отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro включає використання недозрілих зародків цукрових буряків, які 1 добу витримують в умовах холодильної камери при температурі + 4 °C, промивають мильним розчином, потім стерилізують 35 % розчином Білизна за експозиції 70-80 хвилин. В подальшому вилучають недозрілі зародки і висаджують на живильне середовище Гамборга і Евелега з додаванням БАП - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 1 мг/л, НОК - 1 мг/л, 2,4-Д - 0,5-0,8 мг/л, гліцину - 2,0 мг/л, цукрози - 30-50 г/л. Культивують 3 тижні в умовах термостату (темряві) при температурі 24±2 °C, потім переносять в термальне приміщення з освітленням 3000-4000 лк і 16 годинним фотоперіодом. Новими відмінними від існуючого прототипу ознаками є: - стерилізація квітконосних пагонів; - використання 35 % розчину Білизна; - введення як експланту недозрілих зародків; 1 UA 79591 U 5 10 15 20 25 30 35 - використання цукрози; - зниження концентрації БАП - 0,5 мг/л; - зниження концентрації В1 - 1,0 мг/л; - зниження концентрації 2,4-Д- 0,5-0,8 мг/л; - використання гліцину - 2,0 мг/л; - холодова обробка при + 4 °C перед введенням - 1 доба. Відмінні від прототипу ознаки при взаємодії з відомими ознаками забезпечують скорочення строків культивування і створення калюсу цукрових буряків з різним рівнем регенераційної здатності, дозволяють отримати рослини-регенеранти з маложиттєздатних зародків при самонесумісності та віддаленої гібридизації рослин, дає змогу удосконалити склад живильного середовища та отримати калюс за 3-4 тижні культивування без додаткового підготовчого етапу і підвищити рівень рентабельності. Ефективність нового способу отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro вивчали на вихідному матеріалі недозрілих зародків диплоїдних цукрових буряків сортів Ялтушківської однонасінної, багатонасінних - Уладівський 752 та диких видів В. trigina, В. patellaris. Даний спосіб має основою мінерального живлення середовище MS, в складі використано 2,4-Д в концентрації - 2,0 мг/л. Серед регуляторів з ауксиновою активністю досить часто використовується 2,4-дихлорфеноксі-оцтова кислота, яка сприяє поділу клітин і дозволяє підтримувати стійкий ріст калюсу. Слід зазначити, що важливе значення має концентрація 2,4-Д. Так, при використанні 2,4-Д в концентрації 0,05-0,02 мг/л в середовищі, вона викликає стимуляцію поділу, при збільшенні концентрації до 1,0 мг/л в багатьох випадках викликає затримку процесу калюсогенезу. Аналіз літературних даних про вплив екзогенних регуляторів росту на регенерацію калюсу у цукрових буряків показав, що вони дуже розрізнені і не піддаються відтворенню. Це пояснює складність культивування цукрових буряків in vitro та генотиповою залежністю процесу калюсогенезу. Пропонований спосіб отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro з недозрілих зародків виконують таким чином: вилучають верхівки квітконосних погонів II порядку після цвітіння цукрових буряків, потім 1 добу зволожені експланти витримують в умовах холодильної камери при температурі +4 °C, промивають мильним розчином. Стерилізують 35 % розчином Білизна за експозиції 70-80 хвилин; промивають стерильною дистильованою водою 45 разів впродовж години; в умовах ламінарного боксу препарувальною голкою вилучають недозрілі зародки і висаджують їх на живильне середовище Гамборга і Евелега з додаванням БАП 0,5 мг/л, гіберелова кислота - 1 мг/л, НОК - 1 мг/л, 2,4-Д - 0,5-0,8 мг/л, гліцин - 2,0 мг/л, цукроза - 30-50 г/л. Культуру зародків культивують 3 тижні в умовах термостату (темряви) при температурі 24±2 °C, потім переносять в термальне приміщення з освітленням 3000-4000 лк і 16 годинним фотоперіодом, що забезпечує отримання калюсу у 86,2-100 % експлантів, розміром 4,8-9,6 мм (табл. 1.). 2 UA 79591 U Таблиця 1 Показники ефективності використання запропонованого способу отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro Показники Відомий спосіб сегменти черешків, листові Експлант пластинки Мінеральна основа середовища Мурасіге і Скуга Температура культивування, °C 25 Умови культивування темрява Термін культивування, тижні 3 Довжина фотоперіоду, годин 16 БАП мг/л 1,0-2,0 ІОК мг/л 0,1-0,5 Гіберелова кислота, мг/л НОК мг/л 0,5 2,4-Д мг/л 2,0 Гідролізат казеїну, мг/л 0,5 Гліцин, мг/л Цукроза, г/л В1, мг/л 0,5 Інозетол, мг/л 100 Маса калюсу, г 0,46-1,12 5 10 15 Запропонований спосіб недозрілі зародки Гамборга і Евелега 24±2 темрява 3-4 16 0,5 1,0 1,0 0,5-0,8 2,0 30,0-50,0 0,1 0,52-2,09 Впровадження запропонованої корисної моделі сприятиме скороченню строків культивування і створення калюсу цукрових буряків з різним рівнем регенераційної здатності, дозволить отримати рослини-регенеранти з маложиттєздатних зародків при самонесумісності та віддаленій гібридизації рослин, дасть змогу удосконалити склад живильного середовища та отримати калюс за 3-4 тижні культивування без додаткового підготовчого етапу і підвищити рівень рентабельності. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання калюсогенезу у цукрових буряків в культурі in vitro, що включає вилучення стерильних експлантів цукрових буряків, культивування на модифікованому агаризованому живильному середовищі Гамборга і Евелега, в умовах термостату протягом 3 тижнів, який відрізняється тим, що стерилізують квітконосні пагони, як експлант використовують недозрілі зародки, для калюсогенезу застосовують середовище Гамборга і Евелега модифіковане з додаванням: БАП - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 1,0 мг/л, НОК - 1,0 мг/л, 2,4-Д - 0,5-0,8 мг/л, гліцину 2,0 мг/л, цукрози - 30,0-50,0 г/л, культивування проводять за температури 24±2 °C. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3