Фулеренвмісний нанокомпозит фулерасил для покращення штучного та природного запліднення

Реферат: Фулеренвмісний нанокомпозит для покращення штучного та природного запліднення за рахунок підвищення життєздатності сперматозоїдів шляхом застосування у суспензії клітин високодисперсних речовин як високодисперсну речовину містить фулеренвмісний високодисперсний кремнезем. UA 79893 U (12) UA 79893 U UA 79893 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства (тваринництва) та медицини і полягає у покращенні репродуктивних функцій сперматозоїдів свійських тварин і людини, що полягає у стимуляції життєздатності репродуктивних клітин, і може бути використана для покращення штучного і природного запліднення з метою збільшення продуктивності тваринництва та вирішення проблем чоловічого безпліддя. Технологія довгострокового збереження генофонду сільгосптварин, а також людини, яка використовується в сільському господарстві та відповідно в репродуктивній медицині, є багатостадійним процесом. Вона включає такі стадії: 1. - одержання клітин (в даному випадку це - сперма биків) від біооб'єкта та додавання до них певного багатокомпонентного кріосередовища; 2. - підготовку за температурним показником клітин, які знаходяться в кріосередовищі до процесу кріоконсерваціїї, (так звана еквілібрація); 3. - кріоконсервацію, найчастіше в парах рідкого азоту; 4. - реконсервацію (деконсервацію); 5. - процес штучного запліднення деконсервованими клітинами; 6. - контроль за результатами штучного запліднення. Оскільки кріосередовища, незважаючи на їх різноманіття та наявність в них різних кріопротекторів, не здатні в повній мірі забезпечити життєздатність всіх клітин після холодового шоку, йде інтенсивний пошук різних речовин, які б сприяли більшому їх виживанню після кріоконсервації. Тому оптимізація технології частіше всього відбувається за рахунок збагачення ними кріосередовищ або додаванням їх до сперми перед кріоконсервацією (стадія 1), або після її реконсервації (стадія 4). В даних експериментах ми додавали Фулерсил саме на стадії реконсервації. Загалом вважають, що за рухливість гамет можна визначати ступінь їх життєздатності, оскільки їх здатність до руху спричиняється за рахунок енергоємних речовин в клітинах, які в даному випадку скоріше всього стимулюються завдяки активації процесів енергоутворення в присутності фулерсилу. Раніше було встановлено, що підвищення рухливості сперматозоїдів можна досягти додаванням високодисперсних матеріалів, зокрема високодисперсного кремнезему (торгові та промислові назви: Аеросил, Силард, Полісорб, Атоксил) до стандартних кріосередовищ, які застосовуються в процесі низькотемпературного заморожування сперми сільгосптварин в технології довгострокового зберігання їх генофонду. Біологічна активність як високодисперсного кремнезему, так і нанокомпозитів на його основі із деякими біомолекулами була перевірена на репродуктивних клітинах сільгосптварин [1-3]. Біомолекули як модифікатори поверхні високодисперсного кремнезему в нанокомпозитах використовувались не тільки з метою пролонгації їх дії, але й в ряді випадків для підвищення селективності щодо певних компонентів клітинної поверхні. Була встановлена перспективність такого підходу, однак випробувані нанокомпозити недостатньо підвищують рухливість гамет [4, 5]. Поставлена задача вирішується за допомогою введення в клітинний матеріал фулеренвмісного пірогенного кремнезему з вмістом фулерену 0,2-0,99 ммоль/г. Приготування композицій фулерен-кремнезем. Хімічно модифіковані фулереном кремнеземи одержували в середовищі органічних розчинників, зокрема: толуолу, -метилнафталіну, карбон дисульфіду, гексану, тощо, або їх сумішей. В реактор вносили розраховану наважку фулерену, додавали розчинник. Реакційну суміш перемішували при певній температурі протягом певного часу, фільтрували і до фільтрату додавали наважку пірог енного кремнезему (аеросилу) або іншого високодисперсного кремнезему чи амінопропілкремнезему або аміноаеросилу. Реакційну суміш при інтенсивному перемішуванні нагрівали при певній температурі протягом певного часу, фільтрували на скляному фільтрі. Модифікований фулереном (С60) кремнезем промивали розчинником в екстракторі Сокслета протягом певного часу або не промивали. Продукт сушили при 80-100 °C на повітрі або у атмосфері інертного газу або у вакуумі. Оскільки фулерен повністю змивається з поверхні немодифікованого аеросилу, адсорбційні комплекси фулерену не відмивали розчинником, а після синтезу відфільтровували і сушили на повітріпри 80-100 °C. Приклади синтезів наведено нижче. Приклад 1. Синтез модифікованного фулереном (С60) аміноаеросилу. До реактора вносять 0,083 г (0,12 ммоль) фулерену (С60), додають 30 мл абсолютного толуолу, нагрівають до 50 °C, охолоджують, фільтрують через скляний фільтр. До фільтрату додають 0,3 г (0,30 ммоль NH2-груп) аміноаеросилу. Реакційну суміш при інтенсивному перемішуванні нагрівають при температурі 60 °C протягом 6 годин, охолоджують, фільтрують 1 UA 79893 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на скляному фільтрі. Осад висушують на повітрі при 80 °C до постійної маси. Вихід 0,29 г (96 %). (концентрація фулерену - 0,30 ммоль/г SiO2) Приклад 2. Синтез модифікованого фулереном (С60) аміноаеросилу. До реактора вносять 0,1 г (0,13 ммоль) фулерену (С 60) приливають 30 мл абсолютного толуолу, нагрівають при інтенсивному перемішуванні при 60 °C протягом 60 хвилин. Реакційну суміш фільтрують гарячою на скляному фільтрі. До гарячого фільтрату додають наважку 0,3 г (0,30 ммоль NH2-груп) аміноаеросилу. Реакційну суміш при інтенсивному перемішуванні нагрівають при 60 °C протягом 6 годин, фільтрують гарячою на скляному фільтрі, екстрагують толуолом у апараті Сокслета протягом 24 год., висушують на повітрі при 100 °C до постійної маси. Вихід 0,25 г (83 %). (концентрація фулерену - 0,21 ммоль/г SіO2) Приклад 3. Синтез модифікованого фулереном (С60) аміноаеросилу. До реактора вносять наважку 0,1 г (0,13 ммоль) фулерену (С60), додають 20 мл метилнафталіну, нагрівають при інтенсивному перемішуванні до 50 °C протягом 60 хвилин, охолоджують, фільтрують на скляному фільтрі. До фільтрату додають 0,3 г (0,32 ммоль) аміноаеросилу, нагрівають при інтенсивному перемішуванні при 100 °C протягом 6 годин, екстрагують толуолом у апараті Сокслета протягом 24 год., охолоджують, фільтрують, висушують при 100 °C до постійної маси. Вихід 0,28 г (93 %). (концентрація фулерену - 0,28 ммоль/г SiO2) Біологічна активність наноматеріалів визначалась методом лазерно-доплеровської спектроскопії (ЛДС) на програмно-апаратному комплексі "Spectrolas Instruments. Model LDS MQE" (Україна). В процесі експерименту прилад дає можливість одержувати миттєві середні параметри руху клітин в їх популяції в присутності різних речовин, в тому числі наноматеріалів [6]. Використання приладу, який будує кореляційну функцію розсіяного на рухливих клітинах світла в реальному масштабі часу, дозволяє вивчати зміну таких параметрів, як кількість рухливих клітин (%), частоту обертання їх джгутика (гц), середню швидкість руху (мкм/сек), а також витрати енергії на рух у в'язкому середовищі (ум. од.). Витрати енергії визначаються швидкістю руху клітин, коефіцієнтом, пов'язаним із їх формою та розмірами, а також властивостями середовища. При визначенні біологічної активності нанокомпозитів були використані деконсервовані репродуктивні клітини бугаїв. Гранули сперми, замороженої в стандартному лактозогліцериново-жовтковому кріосередовищі при температурі рідкого азоту, були одержані із Національного банку генофонду тварин (Інститут розведення та генетики тварин НААН України). їх розморожували, додаючи до 1 гранули 1 мл 2,9 % цитрату натрію та витримуючи 15 хв. при t=37 °C. Досліджуваний наноматеріал у вигляді суспензії в 2,9 % цитраті додавали до розмороженої сперми у співвідношенні 3:1. Кінцева концентрація наноматеріалу в пробах становила 0,00015-0,56 %. Після інкубації проб протягом 15 хв. при 37 °C проводили виміри параметрів руху гамет в кюветі об'ємом 1 мл протягом 3 хвилин під дією лазера з довжиною хвилі 632,8 нм. Оцінюючи дію наноматеріалу на клітини, враховували зменшення активності їх руху з часом в порівнянні із контролем, в якому були відсутні наноматеріали і який був прийнятий за 100 %. Біологічну активність оцінювали відносно показників проб до контролю. Кількість вимірів складала 10 для кожної проби. Дослідження методом ЛКС супроводжувались визначенням рухливості клітин за допомогою фазово-контрастної мікроскопії з комп'ютерним відображенням при збільшенні ×900. Встановлено, що досліджені наноматеріали виявляють різну дію на клітини в залежності від природи поверхні та концентрації в кріосередовищі. Додавання нанокомпозиту фулерену (НК1) з концентрацією 0,13 моль/г до клітин пригнічує їх рухливість незалежно від концентрації. Для найбільшої концентрації 0,56 % спостерігається агрегація часток, які у вигляді осаду випадають на дно кювети, що підтверджується даними фазово-контрастної мікроскопії. При збільшенні концентрації фулерену на поверхні наночасточок силіки до 0.22 ммоль/г, нанокомпозит (НК2) виявляє здатність до активації руху клітин в межах концентрацій 0,00080,024 %. Максимальні значення енергії спостерігались при 0,0008 % та 0,004 % і становили відповідно на 30,8 % та 39,5 % по відношенню до контролю. При цьому кількість рухливих клітин збільшувалась на 16 % та більше відсотків. В присутності амінопропілаеросилу показники енергії руху збільшуються при концентраціях 0,024-0,13 % більше, ніж на 32 %. Оскільки зазначені концентрації є досить високими для суспензій із клітинами, є підстави вважати, що в цьому разі має місце утворення агрегатів, які сприяють іммобілізації клітин на їх поверхні, що супроводжується прискореним утворенням осаду наноматеріалу в кюветі. Відносно аеросилу А300, слід відзначити, що він також виявляє активність, але на відміну від амінопропілаеросилу, при концентраціях не вище 0,004 % (із максимумом енергії руху при 2 UA 79893 U 5 10 15 20 0,0008 %, який становив 28,4 % від контролю). При тих же концентраціях зростають показники частоти обертання та швидкості руху клітин. Однак кількість рухливих клітин в цьому випадку не збільшується. Отже, можна вважати, що біологічна активність досліджених наноматеріалів по відношенню до деконсервованих гамет биків утворює ряд: НК2>А300>АПА. Джерела інформації: 1. Недава В.Е., Чуйко А.А., Бегма Л.А., Бегма А.А., Богомаз В.И. Использование аэросилов в практике искусственного осеменения // Зоотехнія.-1990. - № 8. - С. 63-65. 2. Ковтун С., Куновський Ю., Галаган Н. Вплив наноматеріалів на запліднення яйцеклітин свиней // Тваринництво України.-2007. - № 2. - С. 72-74. 3. Настасієнко Н.С., Кузема И.О., Галаган Н.П., Покровський В.О. Дослідження біологічної активності кремнеземів, модифікованих ди- та триметилсилільними групами і сорбітом, по відношенню до бичачих сперматозоїдів биків методом фотон кореляційної спектроскопії // Фізика живого.-2007. - № 1. - С. 100-110. 4. Галаган Н.П., Клименко Н. Ю., Орел И.Л., Новикова Е.А., Туров В.В. Биофункциональные наноматериалы на основе високодисперсного кремнезема, белка и аминоуглеводов // Биополимеры и клетка.-2010. - Т. 26, № 3. - С. 1-10. 5. Клименко Н.Ю., Новикова О.А., Галаган Н.П. Нанобіокомпозити з аміноцукрами як компоненти кріосередовища в біотехнології зберігання генофонду // Укр. біохім. журн.-2010. - Т. 82, № 4. - С. 260. 6. Галаган Н.П., Власенко В.В., Настасієнко Н.С., Чуйко О.О. // Вісн. Харк. ун-ту.-2005. № 665. - С. 94-99. - (Біофізичний вісник. Вип. 1 (15). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Фулеренвмісний нанокомпозит для покращення штучного та природного запліднення за рахунок підвищення життєздатності сперматозоїдів шляхом застосування у суспензії клітин високодисперсних речовин, який відрізняється тим, що як високодисперсну речовину містить фулеренвмісний високодисперсний кремнезем з поверхневим вмістом фулерену від 0,20 до 0,99 ммоль/г. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3