Спосіб одержання водорозчинної фітосубстанції з протизапальною дією

Спосіб одержання водорозчинної фітосубстанції з протизапальною дією, що включає використання сухої рослинної сировини з плодів перцю стручкового (Capsicum annum), її подрібнення, який відрізняється тим, що подрібнену суху рослинну сировину кількаразово екстрагують при температурі 90-95°С очищеною водою у співвідношенні 1:15-1:20 впродовж 30-60 хвилин з наступним просвітленням, фільтруванням та ліофільним висушуванням кінцевого продукту. (19) UA (11) (21) a200607252 (22) 30.06.2006 (24) 25.04.2008 (46) 25.04.2008, Бюл.№ 8, 2008 р. (72) ДУБРОВНА ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА, UA, БЕНЗЕЛЬ ЛЕОНІД ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ВОВК ЮРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, UA, НЄКТЄГАЄВ ІГОР ОЛЕКСІЙОВИЧ, UA, БЕНЗЕЛЬ ІГОР ЛЕОНІДОВИЧ, UA, МАСЛЮК МАРІЯ ВОЛОДИМИРІВНА, UA (73) ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. Д. ГАЛИЦЬКОГО, UA (56) Чекман І.С. Клінічна фітотерапія. - К.:А.С.К., 2003.- с.78-79. Борисенко А. Н., Давиденко И. И. Модель асептического воспаления мягких тканей полости рта у крыс //Стоматология. - 1973. - № 5. - С. 73Доклінічні 74. дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації / Під ред. Стефанова О. В. - К.: Авіцена, 2001. - 528 с. Горячковский А. М. Справочное пособие по клинической биохимии. -Одесса: ОКФА, 1994. - С. Сайт 180. Компании "Международный Коралловый Клуб", ПЕРЕЦ, опубл. в Internet 18.05.2006 (http://web.archive.org/web/*/http://www.coralclub.mk sat.net/producti/rbc/capsicum.htm), [Знайдено 07.12.2007]. Знайдено в Internet: . C2 2 82582 1 3 біологічно активних речовин та високий вихід готового ліофілізованого продукту. Вказане завдання вирішується тим, що у способі отримання фітосубстанції з протизапальною дією, що включає використання сухої рослинної сировини з плодів перцю стручкового (Capsicum annum), її подрібнення, згідно з винаходом, подрібнену суху рослинну сировину кількаразово екстрагують при температурі 90-95°С очищеною водою у співвідношенні 1:15-1:20 впродовж 30-60 хвилин, з наступним просвітленням, фільтруванням та ліофільним висушуванням кінцевого продукту. Розроблений спосіб екстрагування плодів перцю стручкового дає можливість одержати водорозчинну ліофілізовану фітосубстанцію з виходом біологічно активних речовин у кількості 33,6-38,1% і стабільністю вираженої протизапальної дії впродовж 2-3 років. Запропонований спосіб здійснюють таким чином. Сухі плоди перцю стручкового (Capsicum annum) подрібнюють на частинки розміром 3-5мм, екстрагують діючі речовини очищеною водою при температурі 90-95°С у співвідношенні 1:15-1:20 впродовж 30-60 хвилин і проціджують. Екстрагування проводять 3-4 рази, після чого об'єднані екстракти просвітлюють впродовж 10-15 годин, фільтрують і висушують. Одержаний ліофілізований екстракт є комплексом біологічно активних речовин у вигляді гігроскопічного аморфного порошку жовтокоричневого кольору з легким специфічним запахом і пекучим смаком. Вихід кінцевого продукту становить 33,6-38,1%. У ліофілізаті, умовно позначеному "ПС", виявлені капсаїциноїди, флавоноїди, сапоніни, фенолкарбонові кислоти та інші фізіологічно активні сполуки. Вміст капсаїциноїдів становитьнаступними прикладами. Спосіб ілюструється 3,7%. Приклад 1 50г подрібненої сухої лікарської рослинної сировини з плодів перцю стручкового (Capsicum annum) екстрагували в круглодонній колбі ємністю 2,0л доведеною до кипіння очищеною водою у співвідношенні сировина - екстрагент 1:15 на водяній лазні при температурі 90°С впродовж 30 хвилин. Аналогічний спосіб отримання біологічно активних речовин повторювали ще тричі, після чого об'єднані екстракти просвітлювали при температурі 8-10°С впродовж 10 годин і фільтрували. Фільтрати розливали у флакони по 250мл і висушували за допомогою сублімаційного апарату КС-30. Вихід кінцевого продукту становив 33,6%. Приклад 2 50г подрібненої сухої лікарської рослинної сировини з плодів перцю стручкового (Capsicum annum) екстрагували в круглодонній колбі ємністю 2,0 л доведеною до кипіння очищеною водою у співвідношенні сировина - екстрагент 1:20 на водяній лазні при температурі 93°С впродовж 45 хвилин. Вказане екстрагування повторювали ще двічі, після чого об'єднані екстракти просвітлювали при температурі 8-10°С впродовж 12 годин, фільтрували і проводили ліофільне висушування. Вихід кінцевого продукту становив 35,9%. Приклад 3 82582 4 50г подрібненої сухої лікарської рослинної сировини з плодів перцю стручкового (Capsicum annum) екстрагували в круглодонній колбі ємністю 2,0л доведеною до кипіння очищеною водою у співвідношенні сировина - екстрагент 1:17 на водяній лазні при температурі 95°С впродовж 60 хвилин. Аналогічний спосіб отримання біологічно активних речовин повторювали ще тричі, після чого об'єднані екстракти просвітлювали при температурі 8-10°С впродовж 15 годин, потім фільтрували і ліофільно висушували. Вихід кінцевого продукту становив 38,1%. Вивчення впливу фітосубстанції з плодів перцю стручкового (Capsicum annum) на перебіг асептичного запалення м'яких тканин ротової порожнини проводили в дослідах на 42 статевозрілих білих щурах-самцях лінії Вістар віком 5-6 місяців і масою 240-350г. Експеримент тривав 8 днів. Для відтворення запалення м'яких тканин ротової порожнини використано "скипидарну" модель асептичного запалення [2]. Дослідження проводились згідно з методичними рекомендаціями та відповідали основним вимогам Державного фармакологічного центру МОЗ України [3, 4]. Для порівняльної характеристики і оцінки активності "ПС" використовували засіб "Ротокан", який застосовували за оптимальною для нього схемою введення: на рясно змочених ватних турундах. Тварини були поділені на 4 групи: перша група (6 тварин) - інтактні тварини; друга - контрольна (12 тварин) - модель асептичного запалення м'яких тканин ротової порожнини без лікування; третя група - дослідна №1 (12 тварин) - після моделювання асептичного запалення як лікувальний засіб використано "Ротокан"; четверта група - дослідна №2 (12 тварин) - після моделювання асептичного запалення як лікувальний засіб використано 4% водний розчин "ПС". Запалення м'яких тканин ротової порожнини відтворювали шляхом введення очищеного скипидару мікрошприцом з фіксованою канюлею та нанесеним на відстані 3мм від кінця голки обмежувачем в перехідну згортку з вестибулярної сторони нижньої щелепи в зоні, яка відповідає розташуванню першого правого моляра. Об'єм введеного скипидару - 0,04мл на 1кг маси тіла. Через три-чотири години після введення скипидару з'являлась асиметрія голови тварин за рахунок набряку правої щоки. Праве око щурів частково закривалось. На наступну добу приєдналась сльозотеча з ока, тризм жувальних м'язів, гіперемія слизової оболонки щоки та збільшення набряку. Методика нанесення "ПС" була наступною: 4% водний розчин фітосубстанції з плодів перцю стручкового наносили на ватну турунду в кількості 0,1-0,25мл та вводили щурам дослідної групи №2 в присінок ротової порожнини з боку запалення на 3-4 хвилини. Реєстрацію клінічних даних проводили щоденно, починаючи з першого дня досліду і до зникнення клінічних симптомів запалення у тварин. З великого спектру клінічних симптомів, що характеризують перебіг гострого запального процесу, для оцінки його інтенсивності були обрані 5 82582 і проаналізовані такі ознаки: стан слизової оболонки щоки, наявність набряку, ступінь відкривання рота, стан слизової оболонки ока. З метою вивчення механізму протизапальної дії фітосубстанції і оцінки ефективності його застосування при асептичному запаленні м'яких тканин ротової порожнини, на 4-й і 8-й день були досліджені клінічні та біохімічні показники крові (лейкоцитарна формула, активність лужної фосфатази нейтрофілів крові та вміст білка в сироватці крові) [5, 6]. Гостра токсичність "ПС" вивчалась на білих мишах-самках, масою 190-200г, які знаходились на звичайному раціоні харчування та при вільному доступі до води. Фітосубстанцію вводили в очеревину (д/о) та в шлунок (д/ш) відповідно у дозах від 500 до 4000мг/кг та від 1000 до 6000мг/кг. За тваринами спостерігали протягом 14 днів. Відмічали час загибелі, зміни у поведінці та в зовнішньому вигляді тварин. При д/ш введенні загибель тварин не відмічено, тому за 6 середньосмертельну дозу (LD50) умовно взяли максимально введену дозу 6000мг/кг (IV клас безпеки згідно з ГОСТ 12.1007-76). Як контрольну використовували групу тварин, які отримували еквівалентний об'єм 0,9% розчину натрію хлориду. LD5o для білих мишей-самок при д/о визначали за методом Лічфілда і Уїлкоксона. LD50=2800мг/кг (V клас безпеки за класифікацією Сідорова К.К.) [7, 8, 9]. Статистична обробка результатів проводилась за допомогою Microsoft Excel. Для оцінки розбіжностей між середніми величинами при нормальному розподілі вибіркових сукупностей використовували t-критерій Стьюдента. При перевірці гіпотез використовувався рівень значимості р=0,05. проведених Результати досліджень з вивчення динаміки клінічних показників у щурів в умовах моделювання асептичного запалення м'яких тканин ротової порожнини та застосування водного розчину "ПС" наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Динаміка клінічних показників у щурів із асептичним запаленням м'яких тканин ротової порожнини Клінічні прояви 1 Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал). Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Група інтактних Контрольна тварин група 2 3 1-й день досліду 100,0±0,0 65,61±1,49 1,00±0,00 1,12±0,02 Дослідна група №1 4 Дослідна група №2 5 70,52±1,0 1,14±0,01 69,46±1,46 1,15±0,02 0,00±0,00 1,33±0,16 1,30±0Д2 1,42±0,34 0,00±0,00 7,75±0, 20 7,0±0,5 7,33±0,25 2-й день досліду 100,0±0,0 67,04±2,17 1,00±0,00 1,19±0,02 71,24±2,1 1,12±0,02 73,92±2,67* 1,13±0,01 0,00±0,00 1,92±0,19 1,58±0,1 1,50±0,16 0,00±0,00 7,25±0,14 5,2±0,25 5,83±0,12* 3-й день досліду 100,0±0,0 70,02±2,02 1,00±0,00 1,18±0,01 75,45±1,9 1,10±1,01 77,43±2,91* 1,10±0,02* 0,00±0,00 1,92±0,19 1,17±0,12 1,25±0,14* 0,00±0,00 7,42±0,16 1,08±1,09 5,00±0,30* 4-й день досліду 100,0±0,0 73,92±2,23 1,00±0,00 1,15±0,01 77,33±1,12 1,1±0,01 82,73±2,15*** 1,08±0,01* 0,00±0,00 1,83±0,12 1,08±0,09 0,92±0,16* 0,00±0,00 6,00±0,30 4,91±0,28 3,83±0,35*** 5-й день досліду 100,0±0,0 76,16±2,34 1,00±0,00 1,12±0,01 80,5±1,24 1,08±0,01 88,23±2,36*** 1,06±0,015* 7 82582 8 Продовження таблиці 1 1 Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) Ступінь відкривання рота (%) Набряк щоки (мм) Стан слизової оболонки щоки (бал) Стан слизової оболонки ока (бал) 2 0,00±0,00 0,00±0,00 6-й день досліду 100,0±0,0 1,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 7-й день досліду 100,0±0,0 1,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 8-й день досліду 100,0±0,0 1,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 3 1,58±0,16 5,17±0,30 4 1,0±0,19 4,5±0,21 5 0,75±0,14* 3,17±0,26*** 79,62±2,02 1,09±0,01 1,16±0,12 3,92±0,28 85,16±1,80 1,05±0,01 0,075±0,11 3,08±0,21 93,14±2,42*** 1,03±0,01* 0,50±0,16* 2,00±0,30*** 81,81±2,05 1,08±0,01 1,08±0,16 2,50±0,34 87,25±2,10 1,05±0,02 0,20±0,02 1,58±0,21 97,33±1,01*** 1,01±0,01*** 0,16±0,02* 0,75±0,14*** 83,32±2,35 1,06±0,02 0,75±0,20 1,66±0,46 88,50±2,9 1,03±0,01 0,00±0,00 1,0±0,28 98,75±1,53*** 1,00±0,00* 0,00±0,00* 0,00±0,00*** Примітка: * - достовірні відмінності (р