Біосумісний гідрогель медичного призначення та спосіб його одержання

1. Біосумісний гідрогель медичного призначення, що є зшитим співполімером з дисперсійним середовищем, який відрізняється тим, що він додатково містить лікарський препарат, а співполімер містить ланки гідрофобних та гідрофільних мономерів, а також ненасичених кислот, при цьому як дисперсійне середовище використовується культуральне середовище з біологічними мікрооб'єктами. 2. Гідрогель за п.1, який відрізняється тим, що зазначені компоненти містяться при наступному співвідношенні, у мас. %: 2 (19) 1 мікроорганізмів і клітин ссавців (зокрема, диференційованих і стовбурових) з метою подальшого застосування як лікарський засіб у медичній практиці. Наприклад, пропонований гідрогель із включеними мезенхімальлими стовбуровими клітинами та/або 3 диференційованими клітинами шкіри може використатися в якості ефективного тимчасового штучного замінника шкіри при лікуванні опіків, особливо великих за площею (понад 70%) та глибоких, що зачіпають підшкірні тканини, а також інших уражень шкіри. Як відомо, раневі покриття у вигляді гелів володіють рядом переваг: прозорість, щільний контакт із раною, висока поглинаюча здатність стосовно раневого ексудату, можливість аерації й переміщення продуктів метаболізму, безболісність видалення. Однак, наявні гідрогелеві покриття часто малоефективні через низьку механічну міцність, схильність до пересихання, недостатню сорбційну здатність [Парамонов БА., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Опіки.-Санкт-Петербург, Спецлиг, 2000.-488 с.]. Винахід відноситься до способу одержання зшитого кополімерного гідрогелю на основі акрилових мономерів, що володіє комплексом властивостей, які створюють оптимальні умови для культивування на його поверхні та в об'ємі клітин, у тому числі мезенхімальних стовбурових, і призначеного для використання в медицині, насамперед, для одержання противоопікових покрить. По функціональному призначенню зазначений гідрогель відноситься до захисних покрить, по стійкості - до біоінертних або недеградуючих синтетичних матеріалів, по механізму дії - до сорбуючих покрить, що запобігають випаровуванню ексудату. Завдяки розробці способу одержання зазначеного гідрогелю будуть поліпшені захисні, сорбційні, лікувальні, транспортні й технологічні властивості синтетичних раневих покрить. Відповідно до запропонованого винаходу здійснюється насичення зазначеного гідрогелю культуральним середовищем, в якому містяться біологічні мікрооб'єкти, що забезпечує оптимальні умови для їх іммобілізації, життєдіяльності, росту й розмноження т vitro та in vivo. Використання мезенхімальних стовбурових клітин як клітинного компоненту гідрогелевої мембрани є перспективним, тому що у відповідному мікрооточенні вони здатні диференціюватися в різні типи клітин, у тому числі епітеліальні, м'язеві та клітини сполучної тканини й інші [Jiang Y. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow // Nature.-2002.-418.-P.41-49]. Даний спосіб веде до збільшення здатності даного гідрогелю до поглинання й тривалого утримування достатньої кількості різних лікарських препаратів, культуральних середовищ, ростових факторів і спеціальних добавок, що використовуються у процесі культивування як мікроорганізмів, так і клітин ссавців з різним рівнем диференціювання. У результаті здійснення запропонованого способу зазначеному гідрогелю надаються не лише властивості до ефективної сорбції, але й до наступного пролонгованого вивільнення різних медикаментозних препаратів (зокрема, знеболювальних, противогрибкових, бактерицидних, гормональних, гемостатичних, вітамінних, ферментативних та ін.). При використанні складних клітинних композицій з 82583 4 гелю виділяються численні ростові фактори й інші речовини клітинного походження, які сприяють загоєнню рани. Таким чином, розробленому нами гідрогелю, отриманому заявленим способом, надаються такі корисні для загоєння уражень шкіри експлуатаційні властивості, як механічна міцність, еластичність, прозорість, висока поглинаюча здатність стосовно раневого ексудату. Завдяки застосуванню технології культивування на поверхні гідрогелю мезенхімальних стовбурових клітин та/або диференційованих клітин шкіри гідрогель набуває властивостей "еквіваленту шкіри". Відоме застосування широкого кола полімерів для культивування мікроорганізмів і клітин ссавців (як in vitro, так і in vivo). При цьому використовуються природні й синтетичні полімери, як гідрофобні, так і гідрофільні. Застосування кожного з перерахованих класів полімерів володіє рядом переваг та недоліків.Однак, дотепер не створено універсального матеріалу, придатного для використання на всіх фазах загоєння ран опіків різної глибини. Так, у [патенті US 3949073] описане застосування природного біодеградуємого полімеру - розчинного колагену, що зараз досить широко використовується в якості природного покриття при лікуванні опікових ран. У зазначеній роботі спочатку в організм за допомогою ін'єкції вводився сам полімер, а потім його заселяли клітинною популяцією. Відомі випадки використання культур клітин, розміщених у матриці, що утворена при взаємодії колагену й зшиваючого агенту, біфункніонального поліетиленгліколю [WO 9526761]. У даному патенті висвітлено розробку комбінованого матриксу, що може використовуватись для ендопротезування (заміщення внутрішніх тканин організму), але непридатного для зовнішнього застосування. Як правило, саме колаген застосовують у біотехнології для одержання гелю з метою формування "дермального еквівалента" і ''живого еквівалента шкіри" [Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Опіки.-Санкт-Петербург, Спецлит, 2000.-488 з]. При цьому готують складні клітинні композиції з розчином колагену й культуральним середовищем. Отримані суміші при низьких температурах залишаються рідкими, а при нанесенні на рану при температурі тіла полимеризуются в гель. Незважаючи на безліч цінних властивостей колагену як природного покриття, що піддягає біодеградації йому властиві й недоліки, що виявляються у цілому ряді робіт. Так, існують труднощі ідентифікації цього природного полімеру: структура колагену, а також відповідно і його властивості, змінюються залежно від конкретного джерела його одержання [див., наприклад, ЕР 0681846]. Серед інших недоліків покрить на основі колагену слід зазначити його високу вартість, складність виділення й обробки, схильність до заселення хвороботворними мікроорганізмами й неможливість парової стерилізації внаслідок денатурації при підвищених температурах. Крім того, плівки колагену не посідають достатньої міцності на розрив. Тому 5 використання колагену для загоєння ран і опіків обмежується внаслідок збільшення ризику додаткового інфікування ран, а також можливості імунних реакцій. Слід зазначити, що наведені недоліки колагенових покрить нівілюються при використанні пропонованого нами синтетичного гідрогелевого покриття. Ддя виготовлення синтетичних покрить можуть використовуватись гідрофобні полімери, наприклад, полістирол [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж-Вудворда. Москва. "Мир". 1988. 215 с.] або кополімер етилену з вінілацетатом [ЕР 0681846]. Є дані про те, що такі гідрофобні полімерні покриття не пригнічують ріст клітин різного походження та не володіють цитотоксичністю. Зазначеним покриттям притаманний низький рівноважний водовміст (близько 5-7%), внаслідок чого вони мають підвищену твердість і жорсткість. Проте саме це перешкоджає використанню їх у якості противооігікових покрить, для яких вкрай важливі протилежні властивості: еластичність, м'якість, здатність відтворювати рельєф рани, а також атравматичність при застосуванні й біосумісність, що збільшується по мірі росту рівноважного водовмісту. Інший гідрофобний двошаровий матеріал на основі поліуретану застосовують для виготовлення тимчасового штучного раневого покриття [JP 6104116]. Матеріал являє собою синтетичний полімерний шар насичений культуральним середовищем і шар з клітинами. Недоліком вказаного матеріалу внаслідок його гідрофобності є низька поглинаюча здатність стосовно раневого ексудату. Крім того, внаслідок низької термостабільності, матеріал не витримує термостерилізації, що створює загрозу його заселення мікроорганізмами. Відомо також застосування гідрофільних синтетичних покрить для культивування клітин. Найбільше широко описане застосування гідрогелів на основі поліакриламіду. Відоме застосування поліакриламідного гелю в якості субстрату для культивування клітин, причому спочатку гель вводиться в організм ссавця, а потім його ін'єкційним методом заселяють клітинами [RU 2151800]. Однак, зазначений спосіб придатний лише для вакцинації всього організму ссавця й не дозволяє здійснювати адресну клітинну терапію конкретних зовнішніх уражень шкіри, зокрема, опіків. Найбільш близьким за технічним рішенням є метод одержання поліакриламідного гелю для медико-біологічних цілей, у тому числі й для культивування клітин [SU 977466], який був обраний нами в якості прототипу. Спосіб передбачає проведення гелеутворення акриламіду у фізіологічному розчині, у присутності зшиваючого агента та ініціаторів полімеризації з наступним відмиванням від непрореагованих низькомолекулярних домішок та інкубацією клітинних культур. Отриманий сітчастий полімер не токсичний (за умов якісно виконаного відмивання від залишків мономерів), має високу еластичність та прозорість. Взагалі, поліакриламідний гель володіє високим рівноважним водовмістом (може досягати значень 82583 6 порядку 95-97%) і, як наслідок, унікальною біосумісністю, однак, його механічна міцність дуже низька [Kondo Т., Muramatsu N. In: Microencapsulation (Nixon J.R., ed), p.67, Marsel Dekker, Inc., New York, 1976], що не дозволяє використовувати його для виготовлення противоопікових покрить, які, крім забезпечення необхідних умов для культивування клітин, повинні надійно захищати уражену поверхню від інфікування ззовні. Крім того, у випадку недостатньої механічної міцності покриття існує висока ймовірність того, що його дрібні фрагменти із гнійно-некротичкими виділеннями залишатимуться на поверхні рани. Варто також підкреслити, що відсутність іоногенних функціональних груп у поліакриламідному гелі обмежує можливість його збагачення елементами культурального середовища та їх тривалого закріплення, що не сприяє якісній іммобілізації клітин на поверхні [Immobilised cells and ensymes. A practical approach. Woodward J., ed IRL Press. Oxford. Washigton. 1985]. відомо з літературних даних, Крім того, як здатність поліакриламідного гелю до іммобілізації й пролонгованого вивільнення лікарських речовин украй низъька [К.А. Макаров, С.А. Кибардин. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. Москва. Медицина. 1980]. Задовільна ефективність іммобілізації досягалася лише у випадку ферментів з високою молекулярною масою, що долають стеричні перешкоди при дифузії крізь часто зшиту макромолекулярну сітку гідрогелю. Однак, високий ступінь зшивки в поліакриламідному гелі негативно позначається на культивуванні клітин [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж.Вудворда. Москва. "Мир". 1988. 215с.]. використання вказаних З огляду на викладене, гідрогелевих покрить з адресним пролонгованим вивільнення комплексу лікарських препаратів поряд із клітинною терапією не є ефективним. У результаті проведених нами досліджень було продемонстровано, що кополімеризація гідрофобних й гідрофільних мономерів дозволяє досягти того гідрофільно-гідрофобного балансу, при якому створюються оптимальні умови для культивування клітин (адгезія, розпластування, розмноження, утворення моношару) та забезпечується комплекс необхідних фізикохімічних властивостей покриття (сорбційна здатність стосовно раневого ексудату, паро- та киснепроникшсть, міцність, еластичність, атравматичність при застосування). Мікробіологічні дослідження показали, що на гідрофільних поверхнях (наприклад, на поверхні гомополіакриламідного гедю) не спостерігається пригнічення росту клітин, однак ні розпластування клітин, ні утворення моношару при цьому не виявлено. У випадку надмірної гідрофобності кополімерного покриття клітини погано прикріплюються до поверхні, а внаслідок непрозорості матеріалу спостереження за ростом клітин та за процесом загоєння рани ускладнюється. Крім того, надмірна твердість такого матеріалу не дозволяє виготовляти з нього атравматичні противоопікові покриття. 7 Таким чином, оптимальні експлуатаційні параметри гідрогелевих покрить у поєднанні з найкращими умовами для культивування клітин досягаються саме у випадку застосування помірно гідрофільних і одночасно помірно гідрофобних гідрогелів, що одержуються в процесі кополімеризації гідрофільних і гідрофобних мономерів. Додаткове введення в зазначений кополімернии гідрогель мономерів з іоногенними групами (наприклад, ненасичених кислот) сприяє кращому насиченню покриття культураиьним середовищем й закріпленню з наступною пролонгацією вивільнення лікарських засобів, що використовуються при лікуванні опіків та інших уражень шкіри. Основним завданням, на рішення якого спрямовано даний винахід, е вдосконалення способу одержання багатофункціонального гідрогелю медичного призначення й покращення його характеристик. Поставлене завдання вирішується тим, що запропоновано біосумісний недеградуючий гідрогель медичн призначеннэ,що містить у мас% зшитого кополімеру на основі гідрофільного мономеру, гідрофобного мономеру, ненасиченої 2,0-70,0 кислоти та біфункціонального лікарського препарату 0,001-5 мономеру культурального середовища з мікрооб'єктами залишок до 100 Одержують його за допомогою кополімеризації гідрофільного мономеру (наприклад, Nвінілігіролідону, 2-гідрооксиетилметакрилату, акриламіду, метакриламіду), гідрофобного мономеру (наприклад, метилакрилату, етилакрилату, метилметакрилату, акрилонітрилу, метакрилонітрилу), ненасиченої кислоти (наприклад, акрилової кислоти, метакрилової кислоти, кротонової кислоти, 2-акриламідо-2метилпропансульфонової кислоти) та біфункціонального мономеру (наприклад, етиленглікольдиметакрилату, N,N'-метилен-бісакриламіду, 1,4-диакрилоілпиперазину). Зазначений зшитий кополімер одержують при наступних концентраціях комономерів, мас.%: гідрофільний мономер 3,5-60 гідрофобний мономер 0,5-30 ненасичена кислота 0,05-5 біАункпіональний мономер 0,001-1 з наступним відмиванням гелю в апірогенній воді, висушуванням, стерилізацією, насиченням культуральним середовищем й нанесенням на його поверхню клітинної суспензії, що містить в 1 мл не менш ніж 105 клітин. Тестування гідрогелевих матриць як покрить для культивування клітин здійснювали в такий спосіб. Сухі гідрогелеві зразки покрить поміщали в чашки Петрі (фірма "Anumbra'", діаметр 35 мм) й заливали їх культуральним середовищем на 12 годин для набухання. Потім надлишок рідини видаляли й наносили клітинну суспензію (105 клітин в 1 мл культурального середовища). Для приготування клітинних суспензій використовували мезенхімальні стовбурові клітини лінії 4BL2, 82583 8 отримані з периферійної донорської крові. Клітини 4BL2 культивували in vitro у стандартному середовищі ДМЕМ (фірма "Sigma") з додаванням 5% сироватки новонароджених особин великої рогатої худоби (фірма "Sigma"), а також антибіотиків пеніциліну й стрептоміцину по 100 ОД/мл. Для одержання клітинних суспензій моношарову культуру на поверхні скляних флаконів або чашок Петрі обробляли розчином трипсину й версену [Бужиевская Т.И., Лукаш Л.Л., Подольская С.В. Экспериментальные модели для изучения мугагенеза и трансформации, индуцированных вирусами и нуклеиновыми кислотами // Методы молекуляр. биологии.-Киев: Наук. Думка, 1986. -С. 147-158]. В якості контролю клітини висівали на поверхню стандартних чашок Петрі. Інкубацію клітинних культур проводили при температурі 37°С. Спостереження за клітинами проводили під інвертованим мікроскопом щодня протягом тижня. При цьому досліджувалися здатність клітин до іммобілізації на гідрогелевих зразках, агрегація, адгезивні властивості, ріст й розмноження, а також морфологічні властивості. Через добу після посіву клітин на більшості із досліджуваних гідрогелевих зразків спостерігалося прикріплення клітин до поверхні, часткове розпластування; а також утворення агрегатів різної величини (Рис.1). Лише при використанні помірно гідрофобних і одночасно помірно гідрофільних покрить спостерігалося прикріплення, ефективне розпластування, розмноження й ріст клітин з утворенням моношару (Рис.2). Надалі суть винаходу ілюструється прикладами конкретного виконання. Отримані гідрогелеві зразки покрить аналізувалися за такими показниками, як міцність на розрив, тривалість вивільнення введених хіміотерапевтичних засобів та характер взаємодії клітин та оцінки швидкості вивільнення лікарських Для гідрогелевого зразку. засобів гідрогелеві зразки покрить поміщали в дистильовану воду при температурі 25°С й спостерігали за зміною інтенсивністі смуги поглинання в УФ-області, що визначалась з використанням спектрофотометра "SPECORDM40'''. Міцність на розрив синтезованих гідрогелів визначали з використанням розривної машини "FP 100/1" (Німеччина). Параметри гідрогелів різного складу наведені в Таблиці 1. Приклад 1 В 100мл апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 45,0г N-вініл-піролідону (всі використані реактиви - виробництва фірми "Sigma", для біомедичних цілей), 2,5г метилакрилату, 0,5г метакрилової кислоти, 0,2г етиленглікольдиметакрилату, 0,15г персульфату амонію й 0,15г тетраметилетилендіаміну. Отриманий розчин відфільтровують крізь бактерицидний фільтр із розміром пор 0,45мкм, продувають газоподібним азотом й розливають для проведення полімеризації в плоскопаралельні прес-форми для одержання пластин з товщиною 0,7мм. Прес-форми витримують при температурі 25°С протягом 2-х годин. Потім 9 матеріал виймають із прес-форм і піддають відмиванню в апірогенній воді при температурі 75°С (співвідношення гідрогелю й води 1:3) протягом 7діб з щоденною заміною води. Гідрогелеві покриття після хроматографічного контролю залишкового вмісту мономерів висушують при температурі 40°С, пакують в полімерну плівку, стерилізують, насичують культуральним середовищем, що містить 5% бактерицидного препарату хлоргексидину біглюконату й наносять клітинну суспензію, що містить 105 клітин в 1мл культурального середовища (процес інкубації клітин описаний вище). Визначали міцність на розрив гідрогелевих покрїптів, тривалість вивільнення введеного лікарського препарату й спостерігали за характером поводження клітин на поверхні. Результати зведені в Таблицю 1. Приклад 2 В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 90,0г акриламіду, 10г акрилонітрилу, 1 г акрилової кислоти, 0,2г М,К'-метилен-бісакриламіду, 0,1г персульфату калію й 0,125г метабісульфіту натрію. Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснюють аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% анестетику лідокаїну гідрохлориду. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1. 3 Приклад В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 70г акриламіду, 30г акрилонітрилу, 2г акрилові кислоти, 1 г N,N'-метилен-біс-акриламіду, 0,05г персульфату амонію й 0,1г метабісульфіту натрію- Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснювали аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% анестетику лідокаїну гідрохлориду. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1. Приклад 4 В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 35г акриламіду, 55 г акрилонітрилу, 10г метакрилової кислоти, 2г N,N'-метилен-бісакриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3диметиламінопропіонітрил. Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснювали аналогічно прикладу 1. Використовують культурадьне середовище, що містить 5% антибіотику лінкоміцину гідрохлориду. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1.5 (порівняльний) Приклад В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 2,0г акриламіду, 0,1г акрилонітрилу, 0,15г метакрилової кислоти, 0,05г N,N'-метиленбіс-акриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3-метабісульфіту натрію. Внаслідок низької концентрації комономерів гідрогель не утворювався. (порівняльний) Приклад 6 В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 205г акриламіду, 20г акрилонітрилу, 5г акрилової кислоти, 2,5г N,N'-метилен-бісакриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3диметиламінопропіонітрил. Внаслідок високої 82583 10 концентрації мономерів спостерігалася бурхлива спонтанна вибухоподібна реакція гелеутворення зі вспінюваниям суміші й різким погіршенням фізикомеханічних властивостей полімеру. Приклад 7 (порівняльний) Одержують поліакриламідний гель, що містить 11,0% поліакриламіду й 89,0% 0,5%-ного водного розчину хлористого натрію (відповідно до прикладу 1 та прототипу – [SU 977466]). Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснюють аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% бактерицидного препарату хлоргексидину біглюконату. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1. Таблиця 1 Гідрогелевий зразок згідно прикладу Міцн ість на розр ив, кПа 1 180 2 245 3 420 4 570 5 (порівняльний) 6(порівняльний) 7 (порівняльний) Тривалість Характер вивільненн взаємодії я клітин з лікарських поверхнею препаратів, гідрогелевого години зразку Клітини розпластуютьс 85 я, прикріплюютьс я до поверхні Клітини розпластуютьс 120 я, прикріплюютьс я до поверхні Клітини розпластуютьс я 134 прикріплюютьс я до поверхні, утворюють моношар Клітини розпластуютьс я 145 прикріплюютьс я до поверхні, утворюють моношар Гель не утворюється Спонтанна вибухоподібна полімеризація Клітини не розпластуютьс 125 12 я, моношар не утворюється Таким чином, наведені приклади підтверджують, що запропонований біосумісний гідрогель медичного призначення може бути отриманий. У порівнянні із прототипом досягається значне зміцнення матеріалу, пролонгація вивільнення введених у його сполуку лікарських засобів, поліпшення біосумісності із клітинами, що вперше показано на прикладі мезенхімальних стовбурових клітин людини. 11 Комп’ютерна верстка В. Клюкін 82583 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601