Спосіб визначення ступеня виразності інтерлобулярного та перидуктального фіброзу підшлункової залози

Реферат: UA 82848 U UA 82848 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується медицини, а саме патологічної анатомії, хірургії та гастроентерології, і може бути використаною для визначення ступеня фіброзу підшлункової залози. Існує небагато способів визначення ступеня фіброзу підшлункової залози, до того ж вони недостатньо інформативні, трудомісткі, потребують значної кількості часу, наявності спеціального лабораторного обладнання та вимагають значних фінансових витрат. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб визначення ступеня фіброзу підшлункової залози, який полягає в проведенні патоморфологічного дослідження біопсій підшлункової залози у хворих на хронічний алкогольний панкреатит та визначені орієнтовного ступеня фіброзу згідно з наведеними нижче критеріями: І стадія - помірний і фокальний інтерлобулярний фіброз, що оточує одиничні групи дольок та суміжні зони некрозу, зміни протоків відсутні; II стадія - інтенсивний інтерлобулярний фіброз, що оточує численні дольки, альтерація протоків відсутня; III стадія - визначається щільний інтерлобулярний фіброз та фокальний інтралобулярний фіброз, що оточує більшість дольок; виявляються деформація і дилатація протоків та протеїнові пробки; IV стадія - розповсюджений тяжкий інтер- та інтралобулярний фіброз, що залучає всі дольки; деформація і значна дилатація протоків та формування каменів. (Beger H. The pancreas: An integrated textbook of basic science, medicine, and surgery, second edition. / H. Beger, A. Warshaw, M. Buchler et al. // Blackwell Publishing Limited.-2008. - P. 375-376.) Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: - патоморфологічне дослідження тканини підшлункової залози; - визначення поширеності фіброзу підшлункової залози. Цей спосіб є недостатньо ефективним через наявність лише орієнтовних морфологічних критеріїв та не може бути запропонованим для впровадження у практичну діяльність патологоанатомічних бюро, оскільки не є уніфікованим способом для визначення ступеня фіброзу підшлункової залози при хронічному панкреатиті іншого ґенезу (окрім хронічного алкогольного панкреатиту), та є досить суб'єктивним та недостовірним через приблизне оцінювання ступеня фіброзу підшлункової залози без використання морфометричного аналізу з подальшим цифровим обчисленням. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення ступеня виразності інтерлобулярного та перидуктального фіброзу підшлункової залози шляхом застосування імуногістохімічного методу дослідження експресії -ізоформи гладком'язового актину (-SMA) в тканині підшлункової залози, маркера активованих панкреатичних зірчастих клітин, з подальшим морфометричним аналізом з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ, що забезпечить можливість розробки більш точних діагностичних критеріїв ступеня фіброзу підшлункової залози, для подальшого вибору лікувальної тактики та визначення прогнозу для хворих. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який полягає у проведенні патоморфологічного дослідження тканини підшлункової залози та визначенні поширеності фіброзу підшлункової залози новим є те, що додатково проводять імуногістохімічне дослідження експресії -ізоформи гладком'язового актину (-SMA), маркера активованих панкреатичних зірчастих клітин, та з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ проводять подальше морфометричне дослідження і, якщо в ділянках з інтерлобулярним фіброзом площа імунопозитивних активованих зірчастих клітин складає від 3,08 % до 8,04 %, то діагностують легкий ступінь інтерлобулярного фіброзу, від 8,05 % до 22,70 % - діагностують тяжкий ступінь інтерлобулярного фіброзу; якщо в вогнищах перидуктального фіброзу площа імунопозитивних активованих зірчастих клітин складає від 1,19 % до 2,90 %, то діагностують легкий ступінь перидуктального фіброзу, від 3,01 % до 6,27 % - діагностують тяжкий ступінь перидуктального фіброзу. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Основним морфологічним проявом активації фіброзу є значне збільшення у периацинарних, периваскулярних та перидуктальних просторах кількості активованих панкреатичних зірчастих клітин, що експресують надлишкову кількість колагенів, зокрема І, III та IV типу, та інших компонентів позаклітинного матриксу. Більше ніж у 90 % активовані панкреатичні зірчасті клітини експресують цитоскелетний білок -гладком'язовий актин (-SMA), тому -SMA є головним імуногістохімічним маркером цих клітин. 1 UA 82848 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Кількісне визначення площі імунопозитивних активованих зірчастих клітин дозволяє точно, а не орієнтовно встановити площу та ступінь фіброзу підшлункової залози в кожному окремому випадку. Використання поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ дозволяє виконувати морфометричні дослідження без застосування спеціального лабораторного обладнання та необхідності у дорогому устаткуванні. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних ознак дозволить підвищити достовірність та точність діагностики фіброзу підшлункової залози та удосконалити спосіб визначення виразності ступеня фіброзу при проведенні патогістологічного дослідження тканини підшлункової залози, що дозволить визначити подальшу правильну лікувальну тактику та прогноз для хворих. Спосіб здійснюють таким чином. Під час операційного втручання отримували шматочки тканини з головки, тіла та хвоста підшлункової залози, біоптати фіксували в 10 % нейтральному забуференому формаліні. Після рутинного виготовлення парафінових блоків з їхнім наступним різанням на санному мікротомі й фарбуванням препаратів гематоксиліном і еозином при світловій мікроскопії проводили визначення основних патогістологічних змін, для оцінки виразності та виділення гістотопографічних різновидів фіброзу ПЗ застосовувались гістохімічні методики забарвлення за Ван-Гізон і Масон-триколор. Для імуногістохімічного дослідження в депарафінованих зрізах ПЗ проводили демаскування антигенів у цитратному буфері на водяній бані протягом 20 хвилин та непрямим імунопероксидазним методом визначали експресію -SMA з використанням моноклональних антитіл до -ізоформи гладком'язового актину Mo a-Hu Alpha Smooth Muscle Actin, Clone IA4 і системи візуалізації DAKO EnVision+ (Данія) з діамінобензидином. Зрізи дофарбовували гематоксиліном Майєра та заключали у бальзам. Для морфометричних вимірювань фотографували 5 полів зору з наявною експресією -SMA одному панкреатобіоптаті. З використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ (розробка ініційована автором Wayne Rasband в Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) в отриманих зображеннях шляхом багаторазового вимірювання оптичної щільності зон експресії -SMA в зображенні досягався статистичний достовірний поріг чутливості. З урахуванням цього порога цифрове зображення переводилось у розряд бінарного. Потім визначали площу імунопозитивних активованих зірчастих клітин в паренхімі підшлункової залози, яка являє собою відсоткове співвідношення числа пікселів цифрового зображення, що відповідають -SMAпозитивним клітинам до числа всіх пікселів у зображенні. Результати оцінювали наступним чином: якщо площа імунопозитивних активованих зірчастих клітин в зонах перидуктального фіброзу складала від 1,19 % до 2,90 %, то діагностували легкий ступінь перидуктального фіброзу, від 3,01 % до 6,27 %, то діагностували тяжкий ступінь перидуктального фіброзу; а якщо площа імунопозитивних активованих зірчастих клітин в зонах інтерлобулярного фіброзу складала від 3,08 % до 8,04 %, то діагностували легкий ступінь інтерлобулярного фіброзу, від 8,05 % до 22,70 % то діагностували тяжкий ступінь інтерлобулярного фіброзу. Приклад 1. Хворий О., 1974 р.н., звернувся в лікарню зі скаргами на біль в епігастральній ділянці, загальну слабкість, нудоту, в умовах хірургічного відділення Запорізької обласної клінічної лікарні було діагностовано хронічний фіброзно-дегенеративний панкреатит з протоковою гіпертензією. 08.05.2012 р. хворому була виконана поздовжня тотальна панкреатовірсунодуоденопапілотомія, холецистектомія та отримані шматочки тканини з головки, тіла і хвоста підшлункової залози, жовчного міхура. Після проведення рутинного гістологічного дослідження встановлений діагноз: "Помірний перидуктальний фіброз, в міждольковій фіброзній тканині - вогнища ліпоматоза. Помірний субсерозний фіброз стінки жовчного міхура". Після проведення імуногістохімічного дослідження виявлена помірна перидуктальна експресія -SMA активованими панкреатичними зірчастими клітинам. Далі фотографували 5 полів зору з наявною експресією -SMA в біоптаті та з використанням медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ в отриманих зображеннях проводилося вимірювання співвідношення числа пікселів "чорного" кольору, що в даному випадку відповідало площі -SMA-позитивних клітин до пікселів "білого" кольору. У даному зображенні "чорних" пікселів - 65044, "білих" - 1610881. Всього зображення складено з 1675925 пікселів. Розрахунок відсотка -SMA-позитивних клітин, виконують обчисленням частки від ділення числа "чорних" пікселів на загальне число пікселів в зображенні - 65044/1675925* 100 % = 3,88 %. Середнє значення площі -SMA-позитивних клітин визначене в 5 полях зору з наявною експресією -SMA в ділянках інтерлобулярного фіброзу дорівнювало 3,97 %, що відповідає критеріям легкого ступеня інтерлобулярного фіброзу. 2 UA 82848 U 5 10 15 20 25 Приклад 2. Хворий Г., 1960 р.н., що звернувся в лікарню зі скаргами нудоту, блювання, відрижку, епігастральну біль в умовах хірургічного відділення Запорізької обласної клінічної лікарні було діагностовано хронічний фіброзно-дегенеративний панкреатит з протоковою гіпертензією, кістозно-кальцинозною трансформацією. 27.02.2012 р. хворому була виконана поздовжня тотальна панкреатовірснодуоденопапілотомія та отримані шматочки тканини з головки, тіла і хвоста підшлункової залози. Після проведення рутинного гістологічного дослідження встановлений діагноз: "Значний перидуктальний фіброз, помірний міждольковоацинарний фіброз хвоста та головки підшлункової залози і периневрально-периваскулярний фіброз тіла підшлункової залози". Після проведення імуногістохімічного дослідження виявлена значна перидуктальна та помірна інтерлобулярна експресія -SMA активованими панкреатичними зірчастими клітинам. Далі фотографували 5 полів зору з наявною експресією -SMA в біоптаті та з використанням медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ в отриманих зображеннях проводилося вимірювання співвідношення числа пікселів "чорного" кольору, що в даному випадку відповідало площі -SMA-позитивних клітин до пікселів "білого" кольору. У даному зображенні в ділянках інтерлобулярного фіброзу "чорних" пікселів - 185201, "білих" - 1490724, а в зонах перидуктального фіброзу "чорних" пікселів 58829, "білих" - 1617096. Всього зображення складено з 1675925 пікселів. Розрахунок відсотка -SMA-позитивних клітин, виконують обчисленням частки від ділення числа "чорних" пікселів на загальне число пікселів в зображенні, таким чином відсоток -SMA-позитивних клітин в ділянках інтерлобулярного фіброзу склав -185201/1675925*100 % = 11,05 %, а в зонах перидуктального фіброзу -58829/1675925*100 % = 3,51 %. Середнє значення площі -SMA-позитивних клітин в ділянках інтерлобулярного фіброзу визначене в 5 полях зору з наявною експресією -SMA дорівнювало 10,86 %, що відповідає критеріям тяжкого ступеня інтерлобулярного фіброзу, а в зонах перидуктального фіброзу - 3,86 %, що також відповідає критеріям тяжкого ступеня фіброзу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 Спосіб визначення ступеня виразності інтерлобулярного та перидуктального фіброзу підшлункової залози шляхом проведення патоморфологічного дослідження тканини підшлункової залози та визначення поширеності фіброзу підшлункової залози, який відрізняється тим, що додатково проводять імуногістохімічне дослідження експресії ізоформи гладком'язового актину (-SMA), маркера активованих панкреатичних зірчастих клітин, та з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ проводять подальше морфометричне дослідження і, якщо в ділянках з інтерлобулярним фіброзом площа імунопозитивних активованих зірчастих клітин складає від 3,08 % до 8,04 %, то діагностують легкий ступінь інтерлобулярного фіброзу, від 8,05 % до 22,70 % - діагностують тяжкий ступінь інтерлобулярного фіброзу, якщо в вогнищах перидуктального фіброзу площа імунопозитивних активованих зірчастих клітин складає від 1,19 % до 2,90 %, то діагностують легкий ступінь перидуктального фіброзу, від 3,01 % до 6,27 % - діагностують тяжкий ступінь перидуктального фіброзу. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3