Спосіб прогнозування розвитку геморагічних ускладнень при проведенні терапії непрямими антикоагулянтами

Реферат: Спосіб прогнозування розвитку геморагічних ускладнень при проведенні терапії непрямими антикоагулянтами, що включає індивідуалізацію фармакотерапії при застосуванні НАК, причому ще до початку антикоагулянтної терапії проводять молекулярно-генетичне дослідження поліморфного варіанта G1639A гена VKORC1 і при наявності генотипу АА1639 та генотипу GA1639 роблять висновок про необхідність призначення меншої добової дози варфарину для досягнення цільових значень МНВ та зниження ризику геморагічних ускладнень. UA 86051 U (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ РОЗВИТКУ ГЕМОРАГІЧНИХ УСКЛАДНЕНЬ ПРИ ПРОВЕДЕННІ ТЕРАПІЇ НЕПРЯМИМИ АНТИКОАГУЛЯНТАМИ UA 86051 U UA 86051 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме молекулярної генетики і кардіології і може бути використана для індивідуального підбору дози непрямого антикоагулянта, а саме, варфарину, з метою профілактики тромбозів. Незважаючи на розроблені методи лабораторного контролю при антикоагулянтній терапії, основною небезпекою призначення препаратів цієї групи і надалі залишається розвиток кровотеч, що виникають з частотою до 26 %, в тому числі великих та фатальних до 4,2 %. Безперечно, що пошук нових алгоритмів вибору режиму дозування непрямих антикоагулянтів (НАК) дозволить підвищити безпеку та ефективність антикоагулянтної терапії і тому є актуальною задачею. Відмічається різна чутливість пацієнтів до варфарину та широкий діапазон його дозування для досягнення терапевтичного рівня міжнародного нормалізованого відношення (МНВ). Вивчення факторів, що визначають індивідуальну чутливість до варфарину є вкрай актуальним. Генетичні особливості пацієнта є одним з таких факторів, що здійснюють свій ефект протягом всього життя хворого, на відміну від зовнішніх факторів. Відомі способи прогнозування розвитку геморагічних ускладнень при терапії НАК: спосіб прогнозування розвитку геморагічних ускладнень антикоагулянтної терапії гострого інфаркту міокарда із зубцем Q [Пат. № 62292, UA, МПК G01N 33/48, А61В 5/0205. Опубл. 25.08.2011, бюл. № 16], тест-система та спосіб контролю ефективності лікування та профілактики тромбозів антикоагулянтами непрямої дії [Пат. № 86856, UA, МПК G01N 33/50, А61В 5/00. Опубл. 25.05.2009, бюл. № 10] та спосіб експрес-тестування стану системи гемокоагуляції за допомогою визначення часу зсідання плазми [Пат. № 14516, UA, МПК G01N 33/86, C12Q 1/56, C12Q 1/25, С07К 14/75, С07К 14/745. Опубл. 28.02.2000, бюл. № 1]. Недоліками вищезазначених методів є їх трудоємність, висока вартість досліджень та потреба в спеціалістах, що мають високу кваліфікацію. Найбільш близьким до запропонованого, а тому прийнятий нами за прототип є спосіб контролю ефективності лікування та профілактики тромбозів антикоагулянтами непрямої дії [Пат. № 86856, UA, МПК G01N 33/50, А61В 5/00]. Тест-система та спосіб контролю ефективності лікування та профілактики тромбозів антикоагулянтами непрямої дії. Корольова Д.С., Чернишенко Т.М., Платонова Т.М., Волков Г.Л., Дєєв В.А., Куповська С.І., -а200708173; Заявлено 18.07.2007; Опубл. 25.05.2009, Бюл. № 10], що полягає у порівнянні результатів активації протромбіну плазми крові двома активаторами-тромбопластином та екамуліном, і дозволяє виявити декарбоксильований протромбін, що є маркером ефективності лікування антикоагулянтами непрямої дії. Спільними ознаками запропонованого способу та прототипу є індивідуалізація фармакотерапії при застосуванні НАК. Серед недоліків вибраного прототипу можна назвати високий рівень суб'єктивізму, необхідність отримання додаткових біохімічних показників для аналізу, тривалість методу, а також необхідність витрачати великі кошти при дослідженні вказаних біохімічних показників з певною періодичністю при терапії непрямими антикоагулянтами. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб прогнозування розвитку геморагічних ускладнень при терапії НАК шляхом визначення генотипу за поліморфним варіантом G1639А гена VKORC1. Проведення даного дослідження можливе ще до початку антикоагулянтної терапії, що дозволить виявити групу пацієнтів, які мають підвищену чутливість до варфарину та потребують меншої добової дози препарату для досягнення терапевтичного рівня МНВ та запобігти виникненню кровотеч в цій групі при проведенні терапії НАК. Поставлена задача вирішується за допомогою проведення молекулярно-генетичного дослідження поліморфного варіанта G1639A гена VKORC1, і при наявності генотипу АА1639 та генотипу GA1639 роблять висновок про зростання ризику геморагічних ускладнень при терапії НАК внаслідок підвищеної чутливості до варфарину. Спосіб здійснюється таким чином: виконується забір біологічного матеріалу та проводиться молекулярно-генетичне дослідження поліморфного варіанта G1639A гена VKORC1. Як матеріал для аналізу використовують периферичну кров або зішкряб з внутрішньої сторони щоки. Виділення ДНК із біоматеріалу проводиться хлор-фенольним методом або із використанням комерційного комплекту реагентів для виділення ДНК (не є предметом даного патенту). Генотипування за поліморфним варіантом G1639A гена VKORC1 проводили методами полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і рестрикційного аналізу (поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів - ПДРФ). ПЛР проводили з використанням послідовностей праймерів: 5'-GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3' та 5'-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3'. Умови ПЛР: ДНК денатурували протягом 1 хв. при 94 °C; 30 циклів: плавлення - 94 °C-40 сек., відпал 59 °C-40 сек., синтез 72 °C-40 сек.; пролонгований синтез 72 °C-2 хв. 1 UA 86051 U 5 10 15 20 25 Продукти ампліфікації, довжиною 290 пар нуклеотидів (п.н.), піддавали рестрикції шляхом додавання в рестрикційну суміш аліквот продуктів ПЛР об'ємом 2,5 мкл і 10 одиниць активності ендонуклеази рестрикції Msp1 з подальшою інкубацією при 37 °C протягом 16-ти годин. Детекцію продуктів ампліфікації та ПДРФ проводили в 2 % агарозному гелі, що містив 18 мкл етидію броміду. Візуалізацію результатів здійснювали в ультрафіолетовому світлі за допомогою відеосистеми для документування гелів. Довжини фрагментів аналізували шляхом порівняння з ДНК-маркером (DNA Ladder). При дослідженні поліморфного варіанта гена VKORC1 наявність фрагменту ДНК розміром 290 пар нуклеотидів (п.н.) відповідає генотипу АА1639, наявність трьох фрагментів довжиною 290 п.н., 169 п.н. і 121 п.н. - генотипу GA1639, а наявність двох фрагментів довжиною 169 п.н. і 121 п.н. - генотипу GG1639. У пацієнтів з генотипами GA1639 та АА1639 за поліморфним варіантом G1639A гена VKORC1 спостерігається підвищена чутливість до варфарину, тому при прийомі варфарину у стандартній дозі, в них частіше спостерігаються епізоди надмірної гіпокоагуляції і високий ризик виникнення кровотеч, на відміну від пацієнтів з генотипом GG1639. Тому пацієнти з генотипами GA1639 та АА1639 за поліморфним варіантом G1639A гена VKORC1 потребують меншої добової дози варфарину для досягнення цільового рівня МНВ. Запропонованим способом було проведено обстеження 84 пацієнти, яким проводилась антикоагулянтна терапія. Початкова доза варфарину складала 5 мг/добу. Ступінь гіпокоагуляції оцінювали за рівнем МНВ. Формування бази даних і статистичні розрахунки здійснювались з використанням програмних пакетів Statistica 6.0 та MS Exsel 2003. Для порівняння розподілення частот генотипів між групою хворих, у яких спостерігались епізоди надмірної гіпокоагуляції при проведенні антикоагулянтної терапії та групою хворих, у яких рівень МНВ не виходив за межі 2 терапевтичного діапазону, використовували критерій χ Пірсона. Статистично достовірними вважали відмінності при р4.0 наведені у таблиці. Генотип G1639G G1639A А1639А 30 35 40 n, % (n-84) 30 (35,7 %) 39 (46,4 %) 15 (17,9 %) Середня доза МНВ>4.0, кількість варфарину, мг/добу пацієнтів 4,58±0,31 2,89±0,15 2,18±0,14 1 12 15 Часті епізоди надмірної гіпокоагуляції, кіл-ть пацієнтів 0 3 7 У пацієнтів з генотипом АА1639 за поліморфним варіантом G1639A гена VKORC1 достовірно частіше спостерігались епізоди надмірної гіпокоагуляції у порівнянні з пацієнтами з 2 2 генотипом GG1639 (x =13,22, р = 0,001) та з генотипом GA1639 (x =8,48, р = 0,0027). Також пацієнти з генотипом АА1639 за поліморфним варіантом G1639A гена VKORC1 потребували меншої добової дози варфарину для досягнення цільового рівня МНВ. Технічним результатом, що досягається запропонованим способом, є прогнозування розвитку кровотеч при проведенні терапії НАК в осіб, які мають генотип АА1639 та генотип GA1639 за поліморфним варіантом G1639A гена VKORC1, що дозволяє сформувати групи підвищеного ризику розвитку геморагічних ускладнень ще до початку проведення антикоагулянтної терапії. Таким пацієнтам необхідно рекомендувати розпочинати терапію варфарином з малих доз та частіше проводити моніторування МНВ для підвищення безпеки та ефективності терапії варфарином. Запропонований нами спосіб є інформативним, проводиться один раз за життя пацієнта, та не вимагає великих коштів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб прогнозування розвитку геморагічних ускладнень при проведенні терапії непрямими антикоагулянтами, що включає індивідуалізацію фармакотерапії при застосуванні НАК, який відрізняється тим, що ще до початку антикоагулянтної терапії проводять молекулярногенетичне дослідження поліморфного варіанта G1639A гена VKORC1 і при наявності генотипу АА1639 та генотипу GA1639 роблять висновок про необхідність призначення меншої добової дози варфарину для досягнення цільових значень МНВ та зниження ризику геморагічних ускладнень. 2 UA 86051 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3