Конструкція носія для формування біоплівки мікроорганізмів

Реферат: Конструкція носія для формування біоплівки мікроорганізмів включає трубчасту поверхню, причому вона виконана у вигляді трубки довжиною в межах від 1 до 3 см і товщиною в межах від 0,5 до 1,5 см. UA 89439 U (12) UA 89439 U UA 89439 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Розробка належить до пристроїв для роботи з мікроорганізмами, зокрема до пристроїв, використовуваних для дослідження властивостей мікроорганізмів, наприклад оцінки чинників їх росту. Заявлена розробка може бути використана при лабораторному дослідженні антибактеріальної активності дезінфектантів. Відомо, що більшість бактерій існують в природних екосистемах не у вигляді окремих плаваючих клітин, а у вигляді специфічно організованих біоплівок, що прикріплюються до певних субстратів і дають таким чином їм перевагу при виживанні. Біоплівки - це високоорганізоване мікробне “співтовариство” одного або кількох видів мікроорганізмів, які в складі біоплівки об'єднані складними міжклітинними зв'язками. Відомо про формування біоплівок та вплив на них антибактеріальних препаратів – антибіотиків – [Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А. и др. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium / Ж. микробиол., 2006, № 4, с. 38-42]. При цьому для перевірки ефективності дії нових дезінфектантів у лабораторних умовах як тест-об'єкти використовують різноманітні конструкції носіїв, наприклад батистові тканини, предметні скельця, пластинки, виготовлені з нержавіючої сталі, кахелю, бетону, цегли, дерева тощо. Але, як було встановлено, багато хронічних інфекцій, виникнення яких пов'язано з використанням медичного обладнання, що імплантується в організм людини (лінзи, катетери, протези, штучні клапани серця), обумовлені здатністю мікроорганізмів рости у вигляді біоплівок всередині таких пристроїв, а тому існуючі конструкції носіїв потребують удосконалення і наближення до умов існування в організмі хворого. Відома конструкція субстрату у вигляді об'ємних гранул для культивування мікроорганізмів у вигляді біоплівки на гранулах завантаження насипаних в порожнини біореактора [див. RU 94027125, МПК C02F 3/00, C02F 3/02, C02F 3/06, дата публікації заявки: 27.04.41996]. Недоліком такої конструкції субстрату є нерівномірна товщина біоплівки в різних частинах гранул, внаслідок того, що в зонах контактів гранул товщина рідкого середовища збільшується і має складну змінну об'ємну форму, визначувану умовами формування меніска поверхні рідини, що не дозволяє вважати таку конструкцію здатною моделювати біоплівки. Відома конструкція носія мікроорганізмів в засобах для культивування мікроорганізмів [див. RU 2465312, МПК С12М 1/00, С12М 3/00, C12N 5/07, С01В 31/02, дата публікації 27.10.2012], структура якого складається з основи у вигляді покривного скла, на якому неврегульовано розташований масив вуглецевих нанотрубок, що проводять струм, діаметром від 1 до 10 нм, і щільністю, що забезпечує перколювання сітки, а також принаймні двох біосумісних електродів, що забезпечують підведення зовнішнього електричного поля або струму. Відома конструкція носія мікроорганізмів може бути застосована для дослідження впливу струму на зріст мікроорганізмів в об'ємі рідини, однак як і у попередньому аналогу недоліком такої конструкції є нерівномірна товщина біоплівки в різних частинах поверхні, внаслідок того, що в зонах вуглецевих нанотрубок між собою та покривного скла з вуглецевими нанотрубками товщина рідкого середовища збільшується і має складну змінну об'ємну форму, визначувану умовами формування меніска поверхні рідини, що не дозволяє важити таку конструкцію здатною моделювати біоплівки. Крім того на товщину плівки рідини на таких поверхнях буде впливати явище електроосмосу. Задачею розробки є створення конструкції носія мікроорганізмів, в якому за рахунок застосування нової просторової форми та підібраних емпіричним шляхом розмірів покращуються умови моделювання формування біоплівкок мікроорганізмів різних таксономічних груп, за рахунок підвищення частки її поверхні з гарантовано визначеною товщиною біоплівки. Для вирішення цієї задачі є конструкція носія для формування біоплівки мікроорганізмів що включає трубчасту поверхню. Новою в конструкції є те, що вона виконана у вигляді трубки довжиною в межах від 1 до 3 см і товщиною в межах від 0,5 до 1,5 см. Трубка може бути виготовлена з гуми, поліхлорвінілу, пластику, металу, скла або кераміки. Застосування в конструкції носія мікроорганізмів нової просторової форми та підібраних емпіричним шляхом розмірів покращує умови моделювання формування біоплівкок мікроорганізмів різних таксономічних груп, за рахунок підвищення частки її поверхні з гарантовано визначеною товщиною біоплівки. Розроблена конструкція носія мікроорганізмів може бути виготовлена з гуми, поліхлорвінілу, пластику, металу, скла або кераміки. Запропонована конструкція носія мікроорганізмів ілюструється прикладами її застосування як моделі при вивченні формування на ній біоплівки з різних мікроорганізмів in vitro (в рідкому живильному середовищі). 1 UA 89439 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приготування тест-об'єктів з бактеріальною біоплівкою: Гумові катетери, вінілові, скляні та металеві трубки діаметром 0,5 см розрізали на фрагменти довжиною 1 см, для зручності зв'язували натуральною ниткою по кількості тестів для однієї експозиції для одного деззасобу. Отримані засоби стерилізували кип'ятінням в водопровідній воді. Засоби стерильно вносили в чашки Петрі, розміщували вертикально на стерильний фільтрувальний папір, висушували в термостаті. В чашки Петрі з висушеними стерильними тестами вносили однодобову бактеріальну культуру досліджуваного штаму, вирощену на рідкому живильному середовищі - триптоказо-соєвому бульйоні і розведену бульйоном 1:10 до рівня висоти тест-об'єкта, накриваємо кришкою. Чашки вміщували на шуттель-апарат і інкубували при 28 °С для створення біоплівки впродовж 24 шуттель-апарат і інкубували при 28 °С для створення біоплівки впродовж 24 год. Далі стерильно переносили носії на поверхню стерильного фільтрувального паперу в чашці Петрі для видалення надлишку рідини. Проводили візуальний огляд наявності біоплівки на зовнішній стороні носіїв. Для підтвердження наявності на тест-об'єктах біоплівки проводили забарвлення контрольних тест-об'єктів розчином ген ціан-віолету за широковідомим методом [Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А. и др. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium / Ж. микробиол., 2006, № 4, с. 38-42; Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордава Э.Р., Гинцбург А.Л., Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса, поиск средств борьбы с биопленками, Вестник Российской Академии медицинских наук, 2011. - № 10. - C. 31-39.]. В стерильних пробірках методом серійних розведень готували розчини ДЗ різних концентрацій. Початковим розведенням ДЗ є його найменша робоча концентрація згідно з відповідним регламентуючим документом. В широкогорлу пробірку з 5 мл ДЗ в різних концентраціях (число пробірок визначає завдання дослідження) вносили по 3 дослідні носії на кожну експозицію, не торкаючись стінок пробірок. Експозиція ДЗ на бактеріальній біоплівці - 10, 20, 30 та 60 хвилин. По закінченні експозиції з'єднані ниткою тести виймали з пробірки з ДЗ і переносили в стерильний відповідно підібраний нейтралізатор, а з нього в пробірки з відповідним рідким поживним середовищем (5 мл). Посіви з носіями інкубували 24 год. при 37 °С. Візуально визначали наявність росту в пробірках. Контроль досліду - суспензійний метод дослідження на таких же концентраціях та експозиціях ДЗ з використанням нейтралізаторів. Підбір і приготування розчину нейтралізатора. В залежності від складу ДЗ і хімічно активних компонентів в ньому, використовували стерильні розчини нейтралізаторів: універсальний нейтралізатор (твін-80 - 3 %; сапонін - 3 %; гістидин - 0,1 %; цистеїн - 0,1 %) - для композиційних ДЗ та гуанідинвмісних; 0,5 % розчин тіосульфату натрію - для хлорвмісних ДЗ, або інші, які рекомендуються фірмами-виробниками ДЗ. Оцінка результатів. В дослідженнях визначали найменшу бактерицидну концентрацію (НБК) ДЗ, яка була ефективною для знезараження бактеріальної біоплівки, що утворювалась на фрагментах медичної апаратури - гумових, вінілових, скляних, металевих носіях, що імітують вироби медичного призначення - катетери, трубки в апаратах штучного дихання і т. і. Досліджувана культура мікроорганізмів в біоплівці вважається стійкою до дії ДЗ при наявності росту її в пробірках з найменшою робочою концентрацією дезінфектанту при заданій робочій експозиції. В дослідженнях були використані штами сальмонел різних видів S. typhimurium, полірезистентні до антибіотикіів S. derby та S. jena, полірезистентний до антибіотиків штам Acinetobacter baumanii, які були виділені від хворих в лікувально-профілактичних закладах та музейні штами, отримані з Музею патогенних для людини мікроорганізмів ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМНУ". Серед досліджених деззасобів були дезінфектанти з вмістом як хімічно-активних компонентів четвертинно-амонієвих солей (ЧАС) "CD-256", хлорвмісні - "Дезактив-хлор", композиційні з ЧАС та пероксидами "СД-пероксид", гуанідинвмісні "Гембар". Встановлено, що кратність збільшення НБК для знезараження сальмонельозних біоплівок на гумових, полівінілових тестах була вищою за показники знезараження від планктонних суспензійних клітин в 8-32 рази при застосуванні засобу CD-256. Так, кратність НБК між біоплівкою та бактеріями в суспензії для штаму S. typhimurium була більшою в 8 разів, для S. derby - в 16 разів, для S. jena - в 32 рази. На скляних та металевих тестах НБК була вищою лише в 4-16 разів. 2 UA 89439 U 5 10 15 Для хлорвмісного ДЗ "Дезактив-хлор" різниця НБК для знезараження бактерій в біоплівці на гумових та вінілових тестах в порівнянні з планктонними бактеріями в суспензії цих штамів була в 16-64 разів більшою. Для гуанідинвмісного ДЗ "Гембар" НБК для знезараження бактерій в біоплівці та планктонних клітин цих же штамів сальмонел була в 2-8 разів вищою за суспензійні культури, оскільки полігуанідинвмісні ДЗ самі створюють знезаражуючу плівку. Для знезараження бактерій в сформованій на тестах біоплівці свіжовиділеного полірезистентного до антибіотиків штаму Acinetobacter baumanii та цих же планктонних суспензійних бактерій при використанні ДЗ "CD-256" різниця НБК була більшою в 14 разів, для ДЗ "Дезактив-хлор" - в 6 разів; для гуанідинвмісного ДЗ "Гембар" різниця була в 2 рази. Встановлено, що при дослідженні формування бактеріальної біоплівки на тестах з різних матеріалів протягом 24 год. найтовша плівка утворюється на гумових та вінілових носіях, менш піддаються обростанню біоплівкою металеві та скляні носії мікроорганізмів. Запропонований носій дозволяє більш якісний і адекватний підбір дезінфектантів і їх концентрацій для дезінфекції медичного обладнання з метою знезараження мікроорганізмів в сформованих біоплівках. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 1. Конструкція носія для формування біоплівки мікроорганізмів, що включає трубчасту поверхню, яка відрізняється тим, що вона виконана у вигляді трубки довжиною в межах від 1 до 3 см і товщиною в межах від 0,5 до 1,5 см. 2. Конструкція за п. 1, яка відрізняється тим, що трубка виготовлена з гуми, поліхлорвінілу, пластику, металу, скла або кераміки. 25 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3