Спосіб прогнозування наявності біоплівки людини

Спосіб прогнозування наявності біоплівки у людини, що включає дослідження біологічного 3 два полоскання зразка по 10хв. кожне у 0.1М фосфатному буфері за Соренсеном; обробку зразків 1% осмієм протягом 1 години; зневоднення зразка обробкою в етанолі послідовно збільшеної концентрації: 30%, 50%, 70%, 90%, 100% протягом 15хв. кожна; повторення процесу зневоднення за допомогою послідовно збільшеної концентрації етанолу; промивання зразка гексаметілдісілаване 4 рази по 15хв.; витримування зразка протягом 10-12год. в сухому капюшоні, з попереднім нанесенням на нього декількох крапель гексаметілдісілаване; монтування зразків і покриття їх золотом; готування зрізів, які сканують за допомогою електронного мікроскопу; виявлення біоплівки шляхом візуалізації на дисплеї комп’ютера її компонентів - бактерій та полісахаридного глікокаліксу; Недоліками способу є такі: отримання ураженої тканини для дослідження шляхом біопсії або її вилучення; довготривала підготовка зразка до мікроскопії; необхідність спеціалізованої лабораторії електронної мікроскопії, яка може здійснювати спеціальну підготовку зразка для мікроскопії; необхідність професійно підготовленого працівника, який володіє електронною мікроскопією; отримання результату дослідження апостеріорі, після вилучення хворого органу. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: дослідження біологічного матеріалу; визначення ознак наявності біоплівки. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб прогнозування наявності біоплівки людини, який шляхом визначення стану активності лужної фосфатази нейтрофілів (ЛФн) периферичної крові обстежуваного з використанням цитохімічної реакції дозволяє здійснювати експрес-діагностику у клініко-діагностичній лабораторії будь-якого рівня акредитації. Суттєвими ознаками способу є: реєстрація дати дослідження та діагнозу; забір капілярної крові; приготування мазка; визначення активності лужної фосфатази цитохімічним методом; визначення рівня активності лужної фосфатази нейтрофілів обстежуваного відносно значення контролю з урахуванням місяця дослідження у відсотках і при значенні отриманого показника більш ніж 130% прогнозування наявності біоплівки. Відмінними від прототипу ознаками є: реєстрація дати дослідження та діагнозу; забір капілярної крові; приготування мазка; визначення активності лужної фосфатази нейтрофілів цитохімічним методом; визначення рівня активності лужної фосфатази нейтрофілів обстежуваного відносно значення контролю з урахуванням місяця дослідження у відсотках і при значенні отриманого показника більш ніж 130 % прогнозування наявності біоплівки. 49692 4 Теоретичну основу способу склали новітні дані відносно біології біоплівки та нейтрофілів. 1. До 80% хронічних інфекційних та системних захворювань обумовлені формуванням збудниками біоплівок [С. Wagner; F. Gunther; Wabnitz et al. Host defence against staphylococcus aureus biofilms: phagocytosis by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and formation of neutrophil extracellular traps (NETs)// JBJS (British). - 2009. - Vol91 - В. №II. P.301.]. 2. Біоплівки - організоване угрупування бактерій та грибів, що адгезували до поверхні слизової оболонки, або іншої тканини тіла, здатне до формування обширної полімерної позаклітинної речовини (слиз, глікокалікс). До складу глікокаліксу входять полісахариди, ДНК та білки. Біоплівки мають канали для живлення, сигнальну систему. У складі біоплівок збудники не доступні для антибіотиків та системи імунного захисту, вони не змиваються детергентами, їх не можливо визначити в культурі, бо їхній фенотип значно відрізняється від такого, який вони мали у планктонній формі. Біоплівки мають властивості хематрактантів для нейтрофілів та В-лімфоцитів, тому нейтрофільна інфільтрація слизових оболонок, уражених біоплівкою, наростає у часі [Karatan E., Watnick P. Signals, Regulatory Networks, and Materials That Build and Break Bacterial Biofilms / Есе Karatan, Paula Watnick //Microbiol. Molec. Biol. Rev . - 2009. Vol.73, No.2. - P.310-347]. 3. Біоплівки індукують формування нейтрофілами позаклітинних мереж, пасток (NETs) [С. Wagner; F. Günther; G. Wabnitz et al. Host defence against staphylococcus aureus biofilms: phagocytosis by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and formation of neutrophil extracellular traps (NETs)//JBJS (British). - 2009. - Vol 91B, №11. P.301]. NETs є фізіологічним, властивим тільки нейтрофілам, еозинофілам та тучним клітинам, механізмом позаклітинного знищення збудників. Мережі NETs складаються з ниток хроматину ядер нейтрофілів, у які включені гістони та білки гранул клітин [V. Brinkmann, U. Reichard, Ch. Goosmann et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science.- 2004. - Vol.303. - P.1532-1535]. У присутності біоплівок NETs не виконують функцію кілінгу бактерій, біоплівки руйнують їх. ДЯК та білки, що звільняються з NETs, використовується біоплівкою як біологічний матеріал для живлення, який стимулює її зростання та посилення хемотаксису нейтрофілів [T.S Walker., K.L. Tomlin, G.S Worthen et al. Enhanced Pseudomonas aeruginosa Biofilm Development Mediated by Human Neutrophils // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73, №6. - P.3693-3701]. 4. Хематрактанти біоплівки викликають безперервний у часі потік нейтрофілів до місця її локалізації. Останнє та стійкість біоплівки до чинників імунного захисту обумовлюють формування хронічного запального процесу, який супроводжується підвищенням рівня передзапальних цитокінів [F. Wartha, В. Henriques - Normark. ETosis: a novel cell death pathway // Sci. Signal - 2008 - Vol.1, №21. Р.25]. 5. Ефекторна функція нейтрофілів відносно збудників здійснюється за участю компонентів їх 5 ніх гранул. Гранули нейтрофілів класифікують на первинні, вторинні, третинні та секреторні пухирці. Відмінності між класами гранул можуть бути визначені після аналізу білків маркерів. У процесі міграції з крові у вогнище запалення нейтрофіл визволяє свої гранули в ієрархічному порядку. Секреторні пухирці визволяються як тільки підвищується рівень передзапальних цитокінів, вони готують клітини до екстравазації, шляхом експресії молекул адгезії між нейтрофілом та ендотелієм судин мікроциркуляторного русла; третинні гранули мобілізуються, коли нейтрофіл проникає в тканини, вторинні і первинні - визволяються у вогнищі запалення [S.М. Uriarte, D.W. Powell, G.С. Luerman et al. Comparison of Proteins Expressed on Secretory Vesicle Membranes and Plasma Membranes of Human Neutrophils // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180. P.5575-5588]. 6. Секреторні пухирці - це пул рецепторів мембран, які включаються в плазматичну мембрану після злиття їхньої мембрани з мембраною нейтрофіла [Soehnlein О., Хіе X, Ulbrich H. Е. et al. Neutrophil -derived heparin - binding protein (HBP/CAP37) deposited on endothelium enhances monocyte arrest under flow conditions//J Immunol. 2005. -Vol.174. -P.6399 - 6405]. Маркером здійснення цього процесу є підвищення активності структурного компонента секреторних пухирців лужної фосфатази [Lominadze G, Powell DW, Luerman GC et al. Proteomic analysis of human neutrophil granules//Mol Cell Proteomics-2005- Vol.4. - P.1503-1521]. Відносно недіючий нейтрофіл перетворюється в клітину, яка здатна до взаємодії з ендотелієм, моноцитами і дендритними клітинами та реагування на сигнали запалення з навколишнього середовища. Викладене дозволяє використовувати лужну фосфатазу циркулюючих нейтрофілів як маркер при прогнозуванні наявності біоплівки в обстежуваного. Спосіб обґрунтовано дослідженнями активності ферменту в мазках периферичної крові 28 хворих на хронічний середній отит (ХСО), 21 хворого на хронічний риносинусит (ХРС), 81 хворого на червоний плоский лишай слизової оболонки ротової порожнини (КПЛ СОПР), 85 жінок із загрозою не виношування вагітності та 31 жінки з нормальним перебігом вагітності (контрольна група); контрольну групу для хворих на ХСО, ХРС та ЧПЛ СОПР склали 218 практично здорових осіб, у 15 18 з яких методом випадкової вибірки щомісячно протягом року відбирали кров та досліджували активність ЛФн. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють дату дослідження, діагноз, проводять забір каплі капілярної крові; готують мазок [Keplow LS. А histochemical procedure for localizing and evaluating leukocyte alkaline phosphatase activity in smears of blood and marrow // Blood - 1955. - Vol.10. - P.10231029], фіксують мазок в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С, інкубують мазок у свіжоприготованому субстратно-буферному розчині, який містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу (рН 9,75) 35мг -нафтілфосфату натрію, 49692 6 35мг міцного гранатового, при кімнатній температурі протягом 5-10хв, швидко промивають проточною водою, дофарбовують 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; висушують; мікроскопують; виявляють активність ЛФн за забарвленими у коричневий колір гранулами в місцях локалізації ферменту, підраховують активність ЛФн у 100 нейтрофілах в умовних одиницях за Ф.Г. Дж. Хейхоу та Д. Кваглино [Гематологическая цитология. М.: Медицина, 1983. - C.144]. Для чого, залежно від кількості забарвлених гранул у цитоплазмі, досліджувані нейтрофіли розподіляють на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); далі число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножують на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.), визначають рівень активності лужної фосфатази нейтрофілів обстежуваного відносно значення контролю з урахуванням місяця дослідження. При значенні отриманого показника більш ніж 130% прогнозують наявність біоплівки, що є підставою для використання відповідного протоколу лікування хворого. Статистичний аналіз отриманої бази даних здійснювали за допомогою ППП SPSS, використовували методи непараметричної статистики: U-test Мана-Уїтні, однофакторний дисперсійний аналіз; достовірними вважали відмінності між досліджуваними групами при значенні Р