Спосіб отримання пастоподібної форми інсектоакарицидного біопрепарату “бактофунгін-ls”

Реферат: Спосіб отримання пастоподібної форми комплексного мікробного інсектоакарицидного біопрепарату "Бактофунгін-LS" включає сумісне вирощування Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 та Beauveria bassiana IMB-F-100043 на поживному середовищі до рівня споруляції бактерій 95-98 % та максимального накопичення бластоспор. Для осадження βекзотоксину Bacillus thuringiensis до культуральної рідини додають 20 % СаСl2 до кінцевої концентрації 5 %, після чого центрифугують при 6000 об/хв протягом 10-15 хв, до отриманого осаду додають 3-3,5 % карбоксиметилцелюлози, 5-6 % KСl та 3-3,5 % гліцерину. UA 90437 U (12) UA 90437 U UA 90437 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до біологічних засобів захисту рослин і може бути використана у виробництві мікробних препаратів для захисту рослин від шкідників. Відомо, що мікроорганізми широко використовуються для регулювання чисельності шкідливих комах і кліщів у агроценозах. Найбільш поширеними є препарати на основі різних варіантів Bacillus thuringiensis, ентомопатогенних грибів Beauveria bassiana, Verticillium lecanii, Metarhizium anisopliae [1-3]. Найближчим аналогом до заявлюваної корисної моделі є спосіб одержання комплексного інсектоакарицидного біопрепарату "Бактофунгін-LS", який містить спори, кристали δендотоксину, екзотоксин штаму Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186, бластоспори штаму Beauveria bassiana IMB-F-100043 та залишки поживного середовища після вирощування зазначених мікроорганізмів. Рідку форму препарату "Бактофунгін-LS", вибрану як найближчий аналог, отримують шляхом сумісного глибинного культивування штамії. Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 та Beauveria bassiana IMB-F-100043 на поживному середовищі, до складу якого входять зелена патока, кукурудзяний екстракт, гумат, двозаміщені фосфати калію та амонію до рівня споруляції бактерій 95-98 % та максимального накопичення бластоспор гриба протягом 4-5 діб, після чого препарат стабілізують додаванням NaCl до кінцевої концентрації 35 % [4]. Недоліками цього препарату є рідка форма, яка містить невисоку концентрацію ентомоцидних компонентів і є незручною для зберігання, транспортування та використанні на великих площах оброблюваних територій. В основу корисної моделі поставлено задачу створення пастоподібної форми біопрепарату "Бактофунгін-LS" з більш високим вмістом ентомоцидних складових і меншим вмістом вологи порівняно з рідкою формою, із збереженням високої інсектицидної активності, спектру дії та термінів зберігання. Поставлена задача вирішується способом отримання пастоподібної форми комплексного мікробного інсектоакарицидного біопрепарату "Бактофунгін-LS", який включає сумісне вирощування Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 та Beauveri.i bassiana IMB-F100043 на поживному середовищі до рівня споруляції бактерій 95-98 % та максимального накопичення бластоспор, згідно з корисною моделлю для осадження β-екзотоксину Bacillus thuringiensis до культуральної рідини додають 20 % СаСl2 до кінцевої концентрації 5 %, після чого центрифугують при 6000 об/хв протягом 10-15 хв, до отриманого осаду додають 3-3,5 % карбоксиметилцелюлози (КМЦ), 5-6 % KСl та 3-3,5 % гліцерину. Пастоподібна форма препарату "Бактофунгін-LS" містить споро-кристалічний комплекс та βекзотоксин В. thuringiensis і бластоспори В. bassiana, залишки середовища після культивування, наповнювач КМЦ, консерванти гліцерин та KСl, має темно-коричневий колір та в'язку консистенцію, термін зберігання не менше 6 місяців. Приклад. Для одержання пастоподібної форми біопрепарату "Бактофунгін-LS" пропонується глибинний спосіб вирощування обох мікроорганізмів на ферментаційному середовищі наступного складу (г/л): кукурудзяний екстракт 13 зелена патока 15 K2НРО4 0,51 (NH4)2HPO4 2,32 гумат 4,4 рН 7,0. Середовище стерилізують автоклавуванням при 112 °C 30 хвилин. Гумат готують на 0,01 н розчині NaOH, стерилізують в автоклаві при 121 °C 40 хвилин. Для отримання маточних культур використовують ферментаційне середовище без гумату, В. thuringiensis вирощують протягом 48 годин, В. bassiana - протягом 4-5 діб. Засів здійснюють ендоспорами В. thuringiensis і бластоспорами В. bassiana в кількості 2 % від об'єму середовища, 7 що в сумі складає 2·10 спор/мл. Співвідношення спор бактерій В. thuringiensis і бластоспор грибів В. bassiana у посівному матеріалі 1:1. Культивування здійснюють в глибинних умовах на круговій качалці (200 об/хв.) у склянках ємністю 3000 мл з об'ємом середовища 900 мл, при t=28 °C протягом 3-4 діб. Концентрацію ендоспор В. thuringiensis у культуральній рідині визначають методом серійних розведень з послідуючим висівом на МПА. Концентрацію бластоспор В. bassiana визначають методом серійних розведень з послідуючим висівом на агаризоване ферментаційне середовище, до якого додається антибіотик стрептоміцин для пригнічення росту бактерій. Паралельно підраховують кількість бластоспор у камері Горяєва. 9 Продуктивність сумісної культури через 5 діб вирощування становить (2,5±0,3)×10 КУО/мл 8 В. thuringiensis і (1,3±0,4)×10 КУО/мл В. bassiana. Для осадження β-екзотоксину В. thuringiensis 1 UA 90437 U 5 до культуральної рідини додають 20 % СаСl2 до кінцевої концентрації 5 %. Культуральну рідину 10 центрифугують при 6000 об/хв 10-15 хв. Титр одержаної пасти становить (1,4±0,5)×10 КУО/г В. 9 thuringiensis та (1,0±0,3)×10 КУО/г В.bassiana. Як видно з даних, наведених в таблиці 1, найкращими добавками для зберігання пастоподібного препарату є 3-3,5 % КМЦ, 5-6 % KСl та 3-3,5 % гліцерину. Термін зберігання пастоподібного препарату з цими добавками при температурі 4 °C-6 місяців. Таблиця 1 Вплив різних концентрацій добавок на життєздатність спор ентомопатогенних мікроорганізмів Добавки до препарату 2 % КМЦ 4 % KСl 2 % гліцерину 3 % КМЦ 5 % KСl 3 % гліцерину 3,5 % КМЦ 6 % KСl 3,5 % гліцерину 4 % КМЦ 7 % KСl 4 % гліцерину 3 % КМЦ 3,5 % КМЦ 10 15 9 (1,8±0,3)×10 5 10 (4,5±0,2)×10 6 10 (4,2±0,5)×10 6 9 (1,2±0,3)×10 4 9 (3,7±0,4)×10 4 (3,2±0,1)×10 (1,5±0,2)×10 (1,2±0,1)×10 (1,3±0,4)×10 (6,2±0,2)×10 4 (1,7±0,1)×10 9 (2,4±0,5)×10 Перевірку інсектицидної активності здійснюють на лабораторних тест-об'єктах: личинках вощинної молі Gallerie melonella та личинках мух Haematobia serra методом вільного поїдання інфікованого корму. Личинки мух використовують у якості тест-об'єкту на дію β-екзотоксину. Для личинок вощинної молі використовують штучний корм на основі воску, меду, гліцерину, борошна, сухих дріжджів та молока [5], для мух - на основі молока та дріжджів [6]. Контрольні групи комах годують неінфікованим кормом. Личинки комах утримують у темному приміщенні при 25-28 °C та вологості 70-75 %. Підрахунок живих і мертвих особин здійснюють щодобово протягом 7 діб. У дослідах з личинками мух спостерігають за процесом утворення лялечок та вильотом з них мух. Лялечки, з яких комахи не вилітають, витримують не менше 10 діб. Інсектицидну активність препарату виражають у процентах смертності (С) личинок, з поправкою на контроль, за формулою Аббота [2]. C 20 Кількість КУО/г через 6 місяців зберігання В. thuringiensis B. bassiana Мо  Мк x100 100  Мк , де Мо - % загибелі особин у досліді (середньоарифметичне), Мк - % загибелі у контролі (середньоарифметичне). В таблиці 2 наведені дані щодо концентрації колонієутворюючих одиниць в 1 г (мл) пастоподібної та рідкої форми (найближчий аналог) препарату та їх інсектицидної активності. 25 Таблиця 2 Порівняння пастоподібної та рідкої форм біопрепарату "Бактофунгін-LS" Концентрація КУО/г (мл) Форма препарату В. thuringiensis В. bassiana 10 9 Смертність личинок, % * Gallerie Haematobia serra melonella 85,6 90,0 Пастоподібна (1,4±0,5)×10 (1,0±0,3)×10 Рідка (найближчий 9 8 (2,5±0,3)×10 (1,3±0,4)×10 79,2 85,2 аналог) 8 Примітки: * - інсектицидна активність у лабораторних умовах при застосуванні 5·10 КУО/мл В. 7 thuringiensis 4·10 КУО/мл В. bassiana Отримані результати показують, що запропонована пастоподібна форма біопрепарату "Бактофунгін-LS" містить більшу концентрацію ентомоцидних факторів і характеризується більш високою інсектицидною активністю порівняно з рідкою формою. Для приготування робочих 2 UA 90437 U 5 10 розчинів використовується менша кількість (за масою) пастоподібної форми препарату порівняно з рідкою, що робить застосування більш економічним і зручним. Біологічна ефективність пастоподібного біопрепарату "Бактофунгін-LS" в польових умовах проти колорадського жука складає 85-93 % при нормі витрати препарату 1,5-3,0 кг/га. Для досягнення такого ефекту при обробці рідинною формою препарату необхідно витратити 4-6 л/га. Перевагами розробленого способу виготовлення препарату є те, що пастоподібна форма препарату містить вищу концентрацію ентомоцидних компонентів, ніж рідка форма, більш зручна при зберіганні, транспортуванні та використанні, не потребує внесення перед застосуванням прилипачів, оскільки до її складу входить КМЦ. Технічним результатом винаходу є зменшення об'єму виготовленого препарату з одночасним збільшенням концентрації ентомоцидних факторів, надання форми зручної для транспортування, зберігання та використання. 15 20 25 30 Джерела інформації: 1. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis I Н.В. Кандыбин, Т.И Патыка, В.П. Ермолова, В.Ф. Патыка. - С.-Петербург, Пушкин: Научное издание "Инновационный центр защиты растений", 2009. - 252 с. 2. Бровдій В.М., Гулий В.В., Федоренко В.П. Біологічний захист рослин. - К.: Світ. 2004. - 352 с. 3. Дядечко М.П., Падій М.М. Шелестова B.C., Барановский MM, Черній A.M., Дегтярьов Б.Г. Біологічний захист рослин. За ред. Дядечка М.П. та М.М. Падія. - Біла Церква. - 2001, 312 с. 4. Пат. № 94457 Україна, МПК C12N 1/20, C12N 1/14, C12R 1/07, C12R 1/645. Комплексний інсектоакарицидний препарат "Бактофунгін-LS" та спосіб його отримання /А.І. Вінніков, Н.В. Черевач, О.А. Дрегваль; заявник і патентовласник Дніпропетровський національний ун-т.; заявл. 03.12.2008; Опубл. 10.05.2011, Бюл № 9. 5. Гулый В.В., Иванов В.В. и др. Микробиологическая борьба с вредными организмами - М.: "Колос" - 1982. 6. Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами [под ред. М.С. Гилярова, пер. с англ. Н.А. Емельяновой]. - М.: Колос, 1976. - 583 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб отримання пастоподібної форми комплексного мікробного інсектоакарицидного біопрепарату "Бактофунгін-LS", який включає сумісне вирощування Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 та Beauveria bassiana IMB-F-100043 на поживному середовищі до рівня споруляції бактерій 95-98 % та максимального накопичення бластоспор, який відрізняється тим, що для осадження β-екзотоксину Bacillus thuringiensis до культуральної рідини додають 20 % СаСl2 до кінцевої концентрації 5 %, після чого центрифугують при 6000 об/хв протягом 1015 хв, до отриманого осаду додають 3-3,5 % карбоксиметилцелюлози, 5-6 % KСl та 3-3,5 % гліцерину. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3