Комплексний інсектоакарицидний біопрепарат “бактофунгін-ls” та спосіб його отримання

1. Iнсектоакарицидний біопрепарат, який відрізняється тим, що містить спори, кристали δендотоксину, екзотоксин штаму Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186, бластоспори штаму Beauveria bassiana IMB-F-100043 та поживне середовище після вирощування зазначених мікроорганізмів. 2. Спосіб отримання інсектоакарицидного біопрепарату за п. 1, який відрізняється тим, що одночасно в глибинних умовах вирощують мікроорганізми Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 та Beauveria bassiana IMB-F-100043 на поживному середовищі, що містить кукурудзяний екстракт, зелену патоку та гумат, до рівня споруляції бактерій 95-98 % та максимального накопичення бластоспор гриба протягом 4-5 діб, після чого препарат стабілізують додаванням NaCl до кінцевої концентрації 3-5 %. (19) UA (11) (21) a200813915 (22) 03.12.2008 (24) 10.05.2011 (46) 10.05.2011, Бюл.№ 9, 2011 р. (72) ВІННІКОВ АЛЬБЕРТ ІВАНОВИЧ, ЧЕРЕВАЧ НАТАЛІЯ ВАСИЛІВНА, ДРЕГВАЛЬ ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА (73) ДНІПРОПЕТРОВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ОЛЕСЯ ГОНЧАРА (56) RU C1 2278159, 20.06.2006. RU 2172588, 27.08.2001. Wraight S.P., Ramos M.E. “Synergistic interaction between Beauveria bassianaand bacillus thuringiensis tenebrionis-based biopesticides applied against field populations of Colorado potato beetle larvae”, Journal of Invertebrate Pathilogy 90 (2005) 139-150. UA C2 84325, 10.10.2008. UA A 45103, 15.03.2002. UA A 62542, 15.12.2003. UA U 5765, 15.03.2005. UA A 56033, 15.04.2003. UA A 53097, 15.01.2003. UA U 36935, 10.11.2008. Дрегваль О.А. та інш. «Підбір оптимальних режимів кислотності середовища та аерації при глибинному культивуванні Bacillus thuringiensis та C2 2 94457 1 3 94457 4 кровосисних комарів і домашніх мух, які можуть радіальним методом. Як змішування, так і спільне переносити збудників небезпечних хвороб людини культивування не призводило до суттєвих змін і тварин. значень таких параметрів як титр життєздатних Даний біопрепарат отримують способом, що клітин і біологічна активність. передбачає глибинне культивування штаму Приклад. Для одержання біопрепарату «БакBacillus thuringiensis var. thuringiensis (BKM-3226) тофунгін - LS» пропонується глибинний спосіб вина поживному середовищі, до складу якого вхорощування обох мікроорганізмів на загальному дять кормові дріжджі, кукурудзяне та соєве бороживильному середовищі (ферментаційному серешно, крейда. Після закінчення ферментації кульдовищі) наступного складу (г/л): кукурудзяний екстуральну рідину концентрують шляхом вакуумного тракт - 13; зелена патока - 15; К2НРО4 - 0,5; упарювання при 65-68 °С, вносять стабілізатори та (NH4)2HPO4 - 2,3; гумат - 4,4; рН 7,0. Стерилізують наповнювач (30 % хлористого натрію та 40 % каоавтоклавуванням при 112 °С 30 хвилин. Гумат ліну), висушують у розпилювальній сушильній готують на 0,01 н розчині NaOH, стерилізують в установці [4]. Недоліком способу є засів поживного автоклаві при 1 атм 40 хвилин. середовища одним штамом-продуцентом, що обДля отримання маточної культури В. межує спектр інсектицидної дії препарату, викориthuringiensis вирощують на МПБ протягом 48 гостання у якості компонентів поживного середовидин, В. bassiana на ферментаційному середовищі ща кормових та харчових субстратів, а також без гумату протягом 5 діб. висока енергетична та економічна вартість кінцеЗасів здійснюють ендоспорами В. thuringiensis вого процесу - сушіння. і бластоспорами В. bassiana в кількості 2 % від 7 Задачею винаходу є створення на основі актиоб'єму середовища, що в сумі складає 2∙10 вних штамів ентомопатогенних бактерій і грибів спор/мл. Співвідношення спор бактерій В. екологічно безпечного комплексного інсектоакариthuringiensis і бластоспор грибів В. bassiana у посі7 7 цидного препарату широкого спектру дії, активного вному матеріалі 3:1 (1,5∙10 спор і 0,5∙10 бластоспроти великого кола комах-шкідників рослин, у пор на 1 мл ферментаційного середовища) на потому числі тих, що мешкають у ґрунті, а також прочатку культивування. ти кровосисних комарів, мух та кліщів, що уражаКультивування здійснюють в глибинних умоють рослини. вах на круговій гойдалці (200 об/хв.) в колбах ємніЗадача вирішується створенням комплексного стю 1000 мл з об'ємом середовища 100 мл, інтенінсектоакарицидного біопрепарату «Бактофунгін сивність аерації 9 ммоль О2/год., при температурі LS», який містить спори, кристали δ-ендотоксину, 27-29 °С протягом 5 діб. екзотоксин штаму Bacillus thuringiensis var. Висока продуктивність обох культур спостеріthuringiensis IMB-7186, бластоспори штаму гається в діапазоні інтенсивності аерації від 7 до Beauveria bassiana IMB-F-100043 та залишки по14 ммоль О2/год. живного середовища, у якому вирощувались обиКонцентрацію ендоспор В. thuringiensis визнадва мікроорганізми. чають методом серійних розведень з послідуючим Спосіб отримання комплексного біопрепарату висівом на МПА. Концентрацію бластоспор В. «Бактофунгін - LS» полягає в тому, що поживне Bassiana визначають методом серійних розведень середовище, що містить кукурудзяний екстракт, з подальшим висівом на агаризоване ферментазелену патоку та гумат, одночасно інокулюють ційне середовище, до якого додається антибіотик посівними культурами мікроорганізмів Bacillus ампіцилін для пригнічення росту бактерій. Параthuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 та лельно підраховують кількість бластоспор у камері Beauveria bassiana IMB-F-100043, культивують до Горяєва. рівня споруляції бактерій 95-98 % та максимальноПродуктивність сумісної культури через 5 діб 8 го накопичення бластоспор гриба протягом 4-5 діб, вирощування становить 4,19±0,72∙10 спор В. 8 після чого стабілізують додаванням NaCl до кінцеthuringiensis і 7,83±0,98∙10 бластоспор В. вої концентрації 3-5 %. bassiana. Сумарна кількість спор і бластоспор ста9 Обидва штами-продуценти є природними, буновить 1,2∙10 в 1 мл. Культура містить також 8 ли виділені із загиблих колорадських жуків і селек2,56±1,07∙10 кристалів/мл δ-ендотоксину B. ціоновані шляхом багатоступінчатої селекції із thuringiensis, підрахунок яких здійснюють за метовихідних штамів В. thuringiensis B-2 і В. bassiana Fдом Виноградського - Бріда [5]. 1. Відбір клонів здійснювали за продуктивністю та Для зберігання препарату протягом 6 місяців інсектицидною активністю по відношенню до тестдодають хлористий натрій до концентрації 3-5 %. комах. Штами депоновано в Депозитарії Інституту Препарат, одержаний при сумісному вирощумікробіології та вірусології НАН України під номеванні мікроорганізмів, не поступається за продукрами Bacillus thuringiensis var. thuringiensis IMBтивністю препаратам, одержаним при роздільному 8 7186 та Beauveria bassiana IMB-F-100043. вирощуванні штамів: 9,3±0,81∙10 спор та кристаВищезгадані мікроорганізми із різних таксонолів 6-ендотоксину В. thuringiensis та 9,08 ±0,78∙10 мічних груп утворюють синергідну асоціацію мікбластоспор В. bassiana. роорганізмів із збереженням життєздатності кож«Бактофунгін - LS» не вірулентний і не токсичного із складових компонентів. Попередні ний для лабораторних тварин і людини, не виявдослідження взаємодії штамів В. thuringiensis і В. ляє негативної дії на корисні організми біоценозу, bassiana як при механічному змішуванні, так і при може використовуватися в будь-яку фазу розвитку спільному вирощуванні не виявили антагонізму рослин. між ними. Перевірка здійснювалась методом лунРідка форма препарату - нативна культуральки, перпендикулярних рисок, агарових блочків та на рідина зі спорокристалічним комплексом В. 5 94457 6 thuringiensis та бластоспорами В. bassiana, одердіб. В дослідах з личинками мух спостерігають за жана вирощуванням в балонах на гойдалці, або в процесом утворення лялечок та вильотом з них ферментері, доповнена консервантом, характеримух. Лялечки, з яких комахи не вилітають, витризується високим рівнем активності протягом шести мують не менше 10 діб. місяців зберігання при температурі 4-5 °С. Інсектицидну активність по відношенню до Перевірку інсектоакарицидної активності здійкровосисних комарів визначають на личинках III снюють на лабораторних тест-об'єктах: личинках віку комарів Culex pipiens і Aedes aegypty. По 50 вощинної молі (Gallerie melonella L.) та личинках личинок поміщають в стандартні кювети розміром 3 мух (Musca domestica), а також на личинках коло(13×18×4) см , заповнені до країв дехлорованою радського жука (Leptinotarsa decemlineata), листоводопровідною водою. Використовують 5 концентвертки всеїдної (Archips podana), американського рацій препарату з шагом 5. Як корективний контбілого метелика (Hyphantria cunea), кровосисних роль застосовують серії розведень біопрепарату комарів (Culex pipiens і Aedes aegypty) та павутин«Бактокуліцид». До контрольних кювет нічого не ному кліщі (Tetranychus urticae). додають. Інкубують при температурі 21-23 °С. ЗаІнсектицидну активність по відношенню до різгибель личинок визначають через 3 доби. Дослід номанітних шкідників рослин та мух визначають проводять у 5-ти повторностях в 3-х незалежних методом вільного поїдання змоченого суспензією випробуваннях. препарату корму. Для личинок вощинної молі виІнсектоакарицидну активність препарату використовують штучний корм на основі воску, меду, ражають у процентах смертності (С) личинок, з гліцерину борошна, сухих дріжджів та молока [6], поправкою на контроль, за формулою Аббота [2]. для мух - на основі молока та дріжджів [7], для Mo  Mк C x100 , де інших тест-об'єктів - природний рослинний корм. 100  Mк Корм для Gallerie melonella L та Musca domestica Мо - % загибелі особин у досліді (середньоаобробляють 5 % суспензією препарату, для інших рифметичне), об'єктів – 1 % суспензію (до 3 г корму додають 1 Мк - % загибелі у контролі (середньоарифмемл суспензії препарату). Корм для контрольної тичне). групи особин змочують стерильною дистильоваІнсектоакарицидну активність біопрепарату ною водою. Інкубацію здійснюють при 25-28 °С та «Бактофунгін - LS» в лабораторних умовах у порівологості 70-75 %. Личинки вощинної молі інкубувнянні з прототипом наведено у таблиці 1. ють у темному приміщенні. Підрахунок живих та мертвих особин здійснюють щодобово протягом 7 Таблиця 1 Інсектоакарицидна активність біопрепарату «Бактофунгін - LS» в лабораторних умовах у порівнянні з прототипом (смертність, %) Кровосисні Паву- Тютю- Муха комарі, личинВощинна Американський Колорадський Листовертка ки Біопрепарати тинний новий кімнатна, міль білий метелик жук всеїдна кліщ трипс личинки Culex Aedes pipiens aegypty Бактофунгін 79,2 93,0 77,3 93,3 90,2 79,8 76,2 95,1 93,0 Бітоксибацилін 53,0 40,0 67,0 93,0 91,2 39,9 42,4 0 0 Отримані результати показують, що запропонований біопрепарат «Бактофунгін - LS» має більш високу інсектоакарицидну активність та більш широкий спектр інсектицидної дії порівняно з прототипом. Що стосується дії на кровосисних комарів, то активність винаходу є досить високою і знаходиться на рівні активності корективного контролю - біопрепарату «Бактокуліцид». Рідинний препарат «Бактофунгін - LS» пройшов успішні випробування в польових умовах. Результати інсектоакарицидної активності (підтверджені актами випробування) представлені в таблиці 2. Препарат виявився високоактивним по відношенню до представників Лускокрилих, Жорсткокрилих, Попелиць, Жужелиць, Трипсів, Двокрилих, павутинного кліща. Біологічна ефективність знаходилась в межах 74,1 до 100 % при нормі витрат препарату 4-6 л/га. Перевагами розробленого способу виготовлення препарату є те, що одночасно здійснюють інокуляцію живильного середовища посівними культурами обох штамів-продуцентів: В. thuringiensis var. thuringiensis IMB-7186 і В. bassiana IMB-F-100043 у спільне поживне середовище, до складу якого входять більш дешеві та доступні в Україні компоненти (кукурудзяний екстракт, зелена патока, гумат), ніж компоненти в середовищі прототипу (кормові дріжджі, кукурудзяне та соєве борошно). Одержання кінцевого препарату в рідинній формі із додаванням 3-5 % NaCl як консерванту виключає енергоємний процес сублімаційного висушування. Технічним результатом винаходу є зниження енергоємності та трудових витрат технологічного процесу з одночасним збільшенням якості препарату - значне розширення спектру інсектицидної дії. Результат досягається одночасним вирощуванням у змішаній культурі на спільному поживному середовищі двох штамів продуцентів В. thuringiensis і В. bassiana. 7 94457 8 Таблиця 2 Інсектоакарицидна активність біопрепарату «Бактофунгін - LS»в польових умовах (смертність, %) Вік Шкідники Американський білий метелик Попелиці (яблуні) Попелиці (капуста) Колорадський жук Попелиці (хризантеми) М'яка псевдощитівка Павутинний кліщ Блестянка Хлібна жужелиця Тютюновий грипс Кровосисні комарі pp.Culex та Aedes Доба смертність, % Норма витрат препарату, л/га личинки І-ІІ 7 81,3 6 личинки личинки, імаго личинки І-ІІ 10 7 15 78,5 86 87 6 4 4 личинки, імаго 6 93,7 6 імаго, личинки личинки, імаго личинки І-ІІ личинки III личинки, імаго 6 (дві обробки) 6 7 10 10 5 95,69 90,4 75 100 74,1 89,7 6 4 4 5 5 4 личинки І-ІІІ 4 100 4 Таким чином, отриманий біопрепарат за інсектоакарицидною активністю не поступається відомим препаратам і в той же час має більш широкий спектр дії, ніж існуючі препарати. Джерела інформації 1. Navon A. Bacillus thuringiensis insecticides in crop protection - reality and prospects //Crop Protection. - 2000. - №19. P.669-676. 2. Бровдій В.М., Гулий В.В., Федоренко В.П. Біологічний захист рослин. - К.: Світ. 2004. - 352 с 3. Дядечко М.П., Падій М.М., Шелестова B.C., Барановский М.М., Черній A.M., Дегтярьов Б.Г. Біологічний захист рослин. За ред. Дядечка М.П. та Падія М.М.. - Біла Церква. - 2001, 312с. Комп’ютерна верстка І. Скворцова 4. А. С. СССР №1412290, МПК С 12 N 1/20, А 01 N 63/00, 1986. 5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под. ред. Н.С. Егорова. - 2-е изд. М.: изд-во Моск. ун-та, 1983. - 215с. 6. Гулый В.В., Иванов В.В. и др.. Микробиологическая борьба с вредными организмами - М.: «Колос» - 1982. 7. Абросимова Л.И., Бабаева П.В., Зубарева Г.М., Шевцов В.В. Влияние минеральных солей на экзотоксинообразование и продуктивность культуры Bacillus thuringiensis //Микробиология - 1986. т. 55, №3 - с.440-445. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601