Спосіб отримання біопрепарату “сізарин” для захисту рослин від шкідників

Спосіб отримання біопрепарату для захисту рослин від ШКІДНИКІВ, який включає посів клітин бактерій-антагоністів фітопатогенних грибків, культивування їх у живильному середовищі, що містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на живильному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату під час пригнічення фітопатогенів на різних сільськогосподарських культурах, який відрізняється тим, що для отримання бюпродукту використовують активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens Kluyver, штам 2687 або 2116, культивування штам у-продуцента проводять на збалансованому живильному середовищі при такому співвідношенні компонентів, г/л автолізат дріжджів пекарських цукор К2НР04 NH4S03 NaCI 46-50 8-10 0,4-0,5 0,8-1,0 0,9-1,0 Винахід відноситься до галузі мікробіологи, а саме, до способу отримання бактеріальних препаратів для біологічного захисту рослин і може бути використаний в мікробіологічній промисловості, а також у ДОСЛІДНИЦЬКІЙ практиці ВІДОМІ способи отримання препаратів для біологічного захисту рослин на основі штамів Streptomyces gnseovindes ATCC 39271-39273 (див наприклад, спосіб захисту рослин від зів'янення, яке спричиняють фітопатогенні гриби Патент вода дистильована решта рН 7,2-7,5, а отримання цільового продукту здійснюють таким чином стерилізують 100 г живильного середовища протягом 2 годин при температурі 100°С, охолоджують до 33-35°С, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, вміщують туди початкову культуру, вирощують и протягом 34-35 год при температурі 27-30°С, потім стерилізують 10 л живильного середовища протягом 2-х годин при температурі 100°С, охолоджують до 33-35°С, визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої у пробірці, вирощують культуру в міні-ферментері протягом 34-36 годин при температурі 30-32°С при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища, 10 л наробленої біомаси поміщають у стерилізоване живильне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, здійснюють засів ферментера через засівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 45-48 годин при температурі 32-35°С при подаванні повітря тиском до 1 атм і одержують біомасу з титром 9-1010, у період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій у біомасі, з апарата відбирають проби першу - через 2 години після засіву, іншу наприкінці вирощування культури СРСР №1477231-прототип) Даний спосіб ефективний для боротьби зі шкідниками (чорна ніжка, аскохітоз, сіра гниль), що ушкоджують такі рослини як капуста, огірки, салат, суниця, і передбачає отримання біопрепарату шляхом культивування зазначеного штаму в живильному середовищі, що містить солодовий екстракт, дріжджовий екстракт, казеїновий гідролізат, глюкозу чи лактозу, агар з наступним культивуванням початкового продукту на рідкому 1 о (О 60702 2116, культивування штам у-продуцента проводять на збалансованому живильному середовищі при такому співвідношенні компонентів у КІЛЬКОСТІ г/л автолізат дріжджів пекарських 46-50 цукор 8-Ю К2НРО4 0,4-0,5 NH4SO3 0,8-1,0 NaCI 0,9-1,0 вода дистильована - решта рН 7,2-7,5 , а отримання цільового продукту здійснюють таким чином стерилізують 100г живильного середовища протягом 2-х годин при температурі 100°С, охолоджують до 33-35°С, помішують Юмл стерилізованого середовища у пробірку, вміщують туди початкову культуру, вирощують 34-35 годин при температурі 27-30°С, потім стерилізують 10л живильного у середовища протягом 2-х годин при температурі 100°С, охолоджують до 33-35°С, визначають титр біомаси, помішують її в МІНІферментер на 50л, засівають середовище Юмл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в міні-ферментері протягом 34-36 годин при температурі 30-32°С при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря, До недоліків зазначеного способу варто також проводять перевірку матеріалу на стерильність, віднести порівняльну тривалість циклу отриманні визначають титр біомаси, проводять визначення бюпродукту, спричинену недостатньою рН середовища, 10л наробленої біомаси збалансованістю живильного середовища, що помішують у стерилізоване живильне середовище знижує продуктивність, культури, а також того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, виникнення проблем, зв'язаних зі збереженням здійснюють засів ферментера через посівний спорової маси у пластмасових мішках в умовах штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 45-48 негативної температури годин при температурі 32-35°С при подаванні Крім того, відомо, що представники зазначеної повітря тиском до 1атм і отримують біомасу з групи мікроорганізмів - стрептоміцети можуть в титром 9 Ю10, у період культивування для окремих випадках спричинити захворювання контролю процесу розвитку бактерій у біомасі з теплокровних апарата відбирають проби першу - через 2 години Метою винаходу є одержання у виробничому після засіву, другу - наприкінці вирощування варіанті необхідної КІЛЬКОСТІ бюпродукту, що культури забезпечує ефективний захист сільськогосподарських культур, у тому числі, Визначення рН біопрепарату здійснюють зернових, зернобобових, винограду, томатів, шляхом розведення його 5см 3 у 40см3 плодових (яблуні, груші) від грибних бактеріальних дистильованої води, суспензію розмішують на хвороб і що не є фітотоксичними і не токсичними магнітній мішалці і проводять вимір рН згідно для людини, теплокровних тварин, риб інструкції до приладу В основу винаходу поставлено завдання Досвідним ШЛЯХОМ встановлено, що створення способу отримання у виробничому оптимальне нарощування біомаси відбувається варіанті з мінімальними енергетичними витратами при рН 7,2-7,5, в оптимальному інтервалі необхідної КІЛЬКОСТІ бюпродукту встановленого температур - 32-35°С титру, що забезпечує захист Новизна способу характеризується вибором для його реалізації живильного середовища зі сільськогосподарських культур (зокрема зернових, збалансованими елементами живлення з зернобобових, винограду, томатів, яблунь, груш) введенням у нього дріжджів пекарських, а також від ШКІДНИКІВ Поставлене завдання вирішується цукру в концентрації Юг/л, що забезпечило тим, що у способі отримання біопрепарату найбільший вихід біомаси з підвищенням и титру "Сізарин" для захисту рослин від ШКІДНИКІВ, ЯКИЙ до 9 Ю 1 0 І дозволило використати те саме включає посів клітин бактерій-антагонистів живильне середовище на всіх стадіях виробництва фітопатогенних грибків, культивування їх у біомаси, крім того, використання для засіву і живильному середовищі, що містить в собі всі вирощування біомаси на проміжній стадії МІНІнеобхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни ферментера замість традиційних колб і качалок, і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на дозволило при кращому перемішуванні живильному середовищі з отриманням у середовища повітрям і збільшенні часу її промисловому варіанті цільового продукту у вирощування отримати культуру з необхідним вигляді суспензії встановленого титру, визначення титром 9 Ю 1 0 активності препарату під час пригнічення фітопатогенів на різних сільськогосподарських Порівняльний аналіз способу, що заявляється, культурах, для отримання бюпродукту з іншими відомими з наукової і патентної використовують активний штам бактерій літератури дозволяє виявити ознаки, які Pseudomonas aureofaciens Kluyver, штами 2687 чи відрізняють рішення, що заявляється, від середовищі в колбах, де його витримують протягом двох тижнів, внаслідок чого утворюється шар міцелію з виниклими на поверхні середовища повітряними спорами, що декантують, гомогенізують у стерильній воді, суспензію центрифугують, вологу спорову масу зберігають у пластмасових мішках і перед уживанням суспензують у воді Недолік даного способу полягає в тім, що застосування мікроорганізмів р, Streptomyces як агентів біологічної боротьби із сірою гниллю, аскохітозом, чорною ніжкою поєднане з низкою технологічних труднощів для нарощування біомаси, зв'язаних з необхідністю застосування дорогих живильних середовищ, у т ч тих, що є харчовою сировиною (солодовий екстракт, казеїновий гідролізат, глюкоза чи лактоза), необхідністю триразової обробки, отриманий біопрепарат недостатньо ефективний у боротьбі зі шкідниками, що уражають зернові та зернобобові культури (фузаріозні, гельмінтоспорюзні, кореневі гнилі), виноград (оїдіум, мільдью), плодові культури (борошниста роса, парша) 60702 прототипу, що дає можливість авторам зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ ознак, які заявляються, критерію «суттєві ВІДМІНИ», що визначає новизну винаходу Базовим показником, по якому йшла оптимізація живильного середовища був титр препарату наприкінці кожної стадії його отримання Статистичній обробці підлягала біомаса після вирощування в пробірці, на виході з МІНІферментера й у процесі вирощування у ферментері Визначення титру препарату проводили методом, заснованому на підрахунку колоній, що виросли на живильному агарі, при засіві у чашки Петрі суспензії різних концентрацій препарату у вигляді послідовних десятикратних розведень, виготовлених на середовищі МЛА Склад середовища - пептон, г -10 - натрій хлористий, г - 5 - агар мікробіологічний, г -13 - м'ясний бульйон, г -1000 - рН середовища - 7,3 Усі компоненти середовища поміщали в колбу, рН середовища доводили до 7,3 і стерилізували протягом ЗОхв при температурі 121 °С, Із середньої проби препарату готували низку послідовних розведень за загальноприйнятою методикою Використовували стерильну дистильовану воду Під час проведення ІСПИТІВ стерильною 3 8 9 10 піпеткою 1см суспензії розведень 10 , 10 , 10 був нанесений на поверхню середовища (МЛА) трьох чашок Петрі Засіяні чашки витримували в термостаті при температурі 28°С протягом 48-72 годин КІЛЬКІСТЬ життєздатних бактеріальних клітин 3 (Т), млрд/см обчислювали за формулою Т = П/Р, Де П - КІЛЬКІСТЬ колоній (середня КІЛЬКІСТЬ з З чашок Петрі) Р- розведення, узяте для посіву Приклад 1 Результати визначення титру культури після її вирощування представлені в таблиці 1 Таблиця 1 Компоненти живильного середовища ,г/л Автолізат дріжджів пекарських 40 48 55 Цукор К2НРО4 NH4SO3 NACI 6 9 12 0,2 0,45 0,6 0,6 0,9 1,2 0,7 0,95 1,1 Живильне середовище у міні-ферментері засівалося культурою, вирощеною в пробірці зі співвідношенням компонентів, що забезпечили її вихід з максимальним титром 9-1 ° рН Титр, млрд/см3 7,4 9-Ю' 9-Ю' 9-10' D Приклад 2 Результати визначення титру культури після вирощування її в міні-ферментері при різних часових інтервалах і оптимальній температурі 31 °С представлені в таблиці 2 Таблиця 2 Живильне середовище Компоненти КІЛЬКІСТЬ, Г/Л Автолізат дріжджів пекарських Цукор К2НРО4 NH4SO3 NaCI Вода дистильована рН У ферментері здійснювався засів культури з міні-ферментера з титром 9-1010 У процесі культивування біомаси у ферментері відбиралися проби, перша - через 2 години після засіву, друга - наприкінці вирощування культури Визначення титру препарату проводилося за вищенаведеною методикою Величина титру продукту з проби узятої у ферментері через 2 години культивації та наприкінці складала 9-Ю10 Біопрепарат має таку характеристику ЗОВНІШНІЙ ВИГЛЯД, колір і запах «Сізарина» визначають у момент узяття проб 48 9 0,45 0,9 0,95 решта 7,2 Час Температура, вирощування, °С год 27 31 Титр, млрд/см3 9 10" 31 9 10 10 32 9 109 органолептичне «Сізарин» по зовнішньому вигляді і кольору являє собою світло-коричневу рідину з запахом живильного середовища Культурально-морфолопчні особливості біопрепарату Біопрепарат вирощений при температурі 28°С протягом 24 годин на МПА утворює однорідну суміш і слабкий дрібнодисперсний осад Перегляд на предметному склі суспензії з добової культури, пофарбованої по Граму (перегляд при збільшенні 15x40 не менш 10 полів зору по діагоналі) показав, що бактерії Pseudomonas aureofaciens -добре розвиті грамнегативні, пофарбовані в світло-коричневий колір палички середньої довжини і товщини з округлими полями розміром від 0,5 до 3-8мк, бактерії добре ростуть на печінково-пептоновому бульйоні й інших середовищах, що мають нейтральну чи злегка лужну реакцію (рН 7,2-7,5) в аеробних умовах при температурі 35°С Фізюлого-бюхімічні ознаки Факультативний анаероб, нерухомий, каталізонегативний, не відновлює нітрити і нітрати, не розріджує желатини, слабко пдролізує ескулін, не утворює аміак з арпніна, не виживає після прогрівання при температурі 63°С, росте при температурі від 25 до 50°С, оптимальна температура росту 32-35°С, оптимальне рН 7,27,5 Як джерело вуглецю використовують цукор, як джерело азоту використовують NH4SO3, культура добре росте на концентрованих середовищах, що містять до 10 г/л цукру, культура резистентна до кисню, не втрачає свою активність при зберіганні біопрепарату тривалий час Біопрепарат не є токсичним для людини, теплокровних, у застосовуваній концентрації не має фітотоксичності, не впливає на запах і смак одержуваної продукції Після вирощування біопрепарату на культуральному середовищі (МБП із ВІДПОВІДНИМИ добавками) протягом 2-х тижнів при температурі 30°С у термостаті одержують фільтрат і досліджують його токсичність у дослідах на білих мишах вагою 18-20г Фільтрат уводять перорально 60702 8 через зонд або внутрішньочеревними ІН'ЄКЦІЯМИ Спостереження за тваринами проводили щодня протягом 15 днів після закінчення ін'єкції чи перорального введення У період спостереження усі тварини були активні, добре поїдали харчові раціони, їх фізіологічні відправлення не порушувалися, поведінка була звичайною, змін з боку вовняного покриву не відзначалося Таким чином, фільтрат, що вводився не робив патологічної дії на тварин і не був токсичним Приведені дані дають підставу вважати, що біопрепарат «Сізарин» не токсичний, тобто не є патогенним для теплокровних тварин Визначення біологічної активності препарату «Сізарин» Готують розчин препарату з розрахунку норми витрати на обробку 1 га площі посіву Частку сільськогосподарської культури з захворюванням поміщають у чашку Петрі, наносять на неї препарат, помішують в автоклав і витримують у заданій концентрації - виноград - протягом 48 годин - пшеницю, жито, овес, ячмінь - протягом 24 годин - помідори, огірки - протягом 36 годин Після ЧОГО визначають відсоток знищення хвороботворних мікроорганізмів за визначений інтервал часу «Сізарин» застосовують методом обприскування сільськогосподарських культур, їх насіння водяною суспензією препарату Приклад 3 Результат знищення хвороботворних мікроорганізмів за визначений інтервал часу представлений у таблиці З Таблиця З Об'єкт впливу Досліджуваний вид хвороби Виноград Деревина, листи Мільдью, оїдіум Пшениця, Насіння, коренева система, стебло, колосся Чорна головешка, борошниста роса, коренева гниль Фітофтороз, парша, аскохітоз, борошниста роса Культура ЯЧМІНЬ, жито, овес Томати, огірки Поверхня, коренева система З таблиці 3 видно, що оптимальними концентраціями бюпродукту для максимального знищення хвороботворних мікроорганізмів на різних сільськогосподарських культурах є -для винограду - бл/га -для пшениці, ячменю, жита, вівса - 7 л/га -для томатів, огірків - 10л/га Як показало тривале спостереження за рослинами, КІЛЬКІСТЬ хвороботворних Норма витрати препарату, л/га 4,5 5 6 5 6,5 8 8 9 10 Час обробки, год 0,5 0,5 0,5 Знищення хвороботвор них мікропор ганизмів, % 75-80 80-85 85-90 75-82 80-86 85-92 75-80 80-85 85-90 мікроорганізмів, що залишилася при зазначеному часі і КІЛЬКОСТІ обробок, не мають негативного впливу на величину врожайності приведених сільськогосподарських культур Приклад 4 Вплив обробки сільськогосподарських культур розчином препарату представлений в таблиці 4 60702 10 Таблиця 4 Культура Площа обробки, га Виноград Пшениця, ячмінь, жито, овес Томати, огірки КІЛЬКІСТЬ препарату, л/га 1000 6 7 50 Підвищення Число обробок за врожайності після обробки препаратом, сезон % 4-5 28-35 2 25-30 10 400 Приклад 5 Дія штаму АТСС 39271 актиноміцетового гриба Стрептоміцес і біопрепарату «Сізарин» на зернові культури шляхом культивування насіння ячменю Karri, що 30-35 5-6 спочатку занурювали у водяну суспензію зазначеного актиноміцетового гриба і суспензію біопрепарату «Сізарин», а потім висушували Результати представлені в таблиці 5 Таблиця 5 Вплив обробки насіння ячменю актиноміцетовьім грибом Стрептоміцес і біопрепаратом "Сізарин" на врожай зерна при різних типах СІВОЗМІНИ Насіння оброблене штамом Стрептоміцес АТС 39271 Рослини в попередні роки 1 рікячмінь + земля під паром 2 рікячмінь + земля під паром 3 рікячмінь + земля під паром 6 рікячмінь Насіння оброблене біопрепаратом "Сізарин" Без обробки врожай, кг/га Додатковий врожай, кг/га,(%) +837(17,6) 3700 +925 (25,0) 4500 +948(21,0) 3500 980 (28%) 4563 +102(2,2) 3650 146(4%) 4527 +285 (6,3) 3600 327(9,1%) Без обробки врожай, (прототип) кг/га 4755 Додатковий врожай кг/га, (%) За даними таблиці видно, що при обробці насіння ячменю суспензією препарату «Сізарин» врожайність вище, ніж при обробці того ж насіння суспензією штаму актиноміцету Приклад 6 Гнітюча дія на захворювання, що уражає підставу огірків і спричинене грибами Fusanum oxysporum штаму актиноміцету АТСС 39271 і біопрепарату «Сізарин», Инокулювання здійснювали шляхом обприскування кореневої системи рослини Результати представлені в таблиці 6 Таблиця 6 Поширення захворювання Необроблені Індекс 0-3 Здорові рослини, % 1,37 32 З таблиці видно, що при обробці кореневої системи огірків препаратом «Сізарин» захворюваність культури нижче, ніж при обробці и штамом Стрептоміцес АТС 39271 Економічний ефект від використання препарату «Сізарин» забезпечується за рахунок того, що замість солодового екстракту - одного з основних компонентів живильного середовища, на якому культивують штам Streptomyces griseovirides АТСС 3921 для отримання біопрепарату, використовуваного в прототипі для захисту рослин - у біопрепараті «Сізарин» використовується цукор Ціна 1кг солодового екстракту - 4грн 20коп Ціна 1кг цукру - 2грн 50коп Витрата солодового Оброблені штамом Стрептоміцес АТС 39271 1,07 50 Оброблені препаратом «Сізарин» 1,02 80 екстракту на 1т біопрепарату - 10кг Витрата цукру на 1т біопрепарату - 10кг Вартість солодового екстракту для виробництва 1 тонни біопрепарату 42грн , а вартість цукру - 25грн Отже, тільки за рахунок заміни одного з компонентів живильного середовища для виробництва 1 тонни біопрепарату досягається економія 17грн Таким чином, запропонований спосіб дозволяє в промисловому варіанті одержати біопрепарат без застосування дорогих елементів живильного середовища для захисту ряду сільськогосподарських культур від грибкових і бактеріальних хвороб 11 Комп'ютерна верстка О В Курасв 60702 12 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119