Спосіб дослідження нейронів паравентрикулярних ядер гіпоталамусу

Реферат: UA 90450 U UA 90450 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до галузі нормальної фізіології і може бути використаним при клінічних діагностичних та наукових дослідженнях, а також при виконанні експериментальних науково-дослідних робіт. Провідною структурою - пейсмекером циркадіанного періодизму в ссавців є супрахіазматичні ядра (СХЯ) гіпоталамуса, а роль головного нейроендокринного посередника в забезпеченні циркадіанного періодизму відводять епіфізу мозку (шишкоподібній залозі). Через ретино-гіпоталамічний тракт СХЯ одержують інформацію про рівень зовнішньої освітленості. Коливання цього рівня, які сприймаються фоторецепторами сітківки, є головним часозадавачем для «біологічного годинника» СХЯ. У нейроендокринній регуляції, зокрема такій в умовах стресу, одну з головних ролей відіграють паравентрикулярні ядра (ПВЯ) гіпоталамуса - структури, які є вищим центром координації вегетативних функцій; нейронні мережі даних ядер істотно залучені у формування відповідей організму на дію стресорних чинників. Ці ядра складаються з низки нейронних популяцій - суб'ядер, що різняться за своїми структурно-функціональними особливостями і характером нервових зв'язків з різними відділами нервової та нейроендокринної систем. Мультисинаптичні шляхи, що надходять в епіфіз мозку через ПВЯ, регулюють нічний синтез мелатоніну епіфізом і пригнічення даного процесу при підвищенні освітленості. Доведено, що при утримуванні щурів в умовах звичайного світлового режиму (світло/темрява по 12 год.) рівень мелатоніну набував максимальних значень вночі (127,0 пг/мл), водночас тривале перебування тварин в умовах постійного освітлення (24 год. світло/ 0 год. темрява) призвело до різкого зниження рівня гормону (7,4 пг/мл). Нейрони медіальних дрібноклітинних суб'ядер ПВЯ (мдПВЯ) гіпоталамуса синтезують кортикотропін-релізінг-фактор (КТРФ); отже, ці суб'ядра є однією з ключових структур у механізмах ініціації та регуляції відповідей організму на дію стресогенних чинників. Оскільки різні структурно-функціональні підрозділи гіпоталамуса тісно пов'язані між собою, є підстави вважати, що не тільки СХЯ, але і мдПВЯ мають брати істотну участь у процесах нейроендокринної регуляції при реалізації циркадіанного періодизму. Зміни рівня освітленості, тобто основного зовнішнього параметра, що визначає циркадіанний періодизм, призводять до істотних зрушень експресії гена надранньої відповіді cfos у нейронних структурах, залучених у циркадіанну регуляцію функцій. Насамперед це відбувається у нейронах СХЯ; відповідно, в них змінюється інтенсивність синтезу імуноспецифічного протеїну c-fos, що може бути виявлено у перебігу відповідних імуногістохімічних досліджень. Є підстави вважати, що зміни вмісту c-Fos не є «пасивною» реакцією нейронів згаданих структур на зміни умов освітлення; даний білок може здійснювати певні модулюючі впливи на активність цих нейронів і, отже, може бути «активним гравцем» у процесах синхронізації такої активності зовнішніми циклічними впливами. Найближчим аналогом способу є корисна модель № 81332 Україна, МПК А61К 51/00 Спосіб імуногістохімічного дослідження мелатонінових рецепторів 1А у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса (автори: Булик Р.Є., Пішак В.П., Хоменко В.Г., Кривчанська М.І., Черновська Н.В. Бюл. № 12 від 25.06.2013 p.), який базується на імуногістохімічних змінах мелатонінових рецепторів. Спосіб визначення мелатонінових рецепторів 1А у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса з урахуванням циркадіанних змін, полягає в тому, що з метою підвищення точності діагностики оцінки імуногістохімічної характеристики мелатонінових рецепторів використовують поліклональні антитіла до мелатонінових рецепторів 1А виробника Abeam (Велика Британія) та стрептавідинбіотинову систему візуалізації LSAB2 для визначення щільності мелатонінових рецепторів 1А у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса. Недоліком найближчого аналогу є дослідження імуногістохімічної характеристики мелатонінових рецепторів 1а у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса, без враховування морфометричного дослідження нейронів паравентрикулярних ядер гіпоталамусу в умовах нормального та зміненого світлового режиму. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб дослідження нейронів двох гіпоталамічних ядер в умовах нормального фотоперіодизму та штучних модифікацій. Поставлена задача співставити імуногістологічні та морфометричні характеристики нейронів двох гіпоталамічних ядер в умовах нормального фотоперіодизму та штучних модифікацій, згідно корисної моделі, експерименти були проведені на 36 статевозрілих самцях безпородних білих щурів масою 150-180 г. Тварин утримували в стандартних умовах віварію при сталих температурі і вологості повітря та вільному доступі до води та їжі. Експериментальні щури були розподілені на три групи, кожна з яких, у свою чергу, складалася з двох підгруп (по шість тварин). 1 UA 90450 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тварини першої групи (інтактні) перебували сім діб в умовах звичайного світлового режиму (світло/темрява по 12 год., LD, освітлення з 08.00 до 20.00 за допомогою люмінесцентних ламп, рівень освітленості в клітках із тваринами 500 лк). Щури другої групи перебували протягом семи діб в умовах постійного освітлення аналогічної інтенсивності (LL, індукція гіпофункції епіфіза). Тварини третьої групи знаходилися протягом того ж самого періоду в умовах постійної темряви (світлова депривація, DD, індукція епіфізарної гіперфункції). Наступного дня після закінчення семиденного періоду о 14.00 і 02.00 тварин виводять з експерименту, здійснюючи одномоментну декапітацію під етаміналовим наркозом (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно). Мозок тварин негайно вилучають і вміщують в 10 %-вий розчин формаліну на фосфатному буфері (0.1 М, рН 7.2) на 20 год при кімнатній температурі. Після стандартної процедури зневоднення й просочення хлороформом і парафіном зразки заливають в парафін. Для ідентифікації протеїну c-fos у гістологічних зрізах гіпоталамуса застосовують непряму імунофлуоресцентну методику. Зрізи завтовшки 14 мкм спочатку депарафінують в ксилолі, потім проводять регідратацію в розчинах етанолу шести низхідних концентрацій (100-40 %) і тричі по 10 хв. відмивають у фосфатному буфері (0.1 М, рН 7.2). Як первинні антитіла застосовують кролячі антитіла (імуноглобуліни - IGG) до c-fos ("SigmaAldrich", США). Спочатку зрізи протягом 45 хв інкубували при 37 °С у 0.3 %-вому розчині Triton X-100 ("Sigma-Aldrich", США) на 0.1 Μ фосфатному буфері (рН 7.2) з додаванням 1 % козячої сироватки. Потім на послідовні серійні зрізи наносять згадані первинні антитіла (1:1000) і протягом 24 год. інкубують у вологій камері в умовах зниженої температури (4 °С). Після відмивання надлишку первинних антитіл у 0.1 Μ фосфатному буфері зрізи інкубували 60 хв. при 37 °С із вторинними антитілами в розведенні 1:200. Як вторинні антитіла застосовували козячий гаммаглобулін, котрий є антитілом щодо глобулінів кролика, кон'югований із флуоресцеїнізотіоціонатом (FITC; "Sigma-Aldrich", США). Після інкубації зрізи промивають фосфатним буфером (0.1 М) і вміщують в суміш гліцерину й фосфатного буфера (9:1) для подальшого дослідження за допомогою люмінесцентної мікроскопії. Контроль специфічності імуногістохімічної реакції проводять аналогічним чином, виключаючи етап інкубації з первинними антитілами до c-fos. Межі мдПВЯ гіпоталамуса визначають згідно з атласом структур головного мозку щура. Ідентифікацію c-fos у нейронах даного суб'ядра і визначення вмісту цього протеїну здійснювали із застосуванням комп'ютерної системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386 ("Kontron Elektronik", ФРН) в ультрафіолетовій частині спектра. Для отримання флуоресцентного зображення використовують високоемісійний фільтр із діапазонами збудження та емісії 370-390 та 420-450 нм відповідно та спеціалізований об'єктив із широкою апертурою. Зображення за допомогою 8-бітової CCD-камери COHU-4922 ("COHU Inc.", США) уводять в згадану систему аналізу зображень, таким чином уникаючи негативного ефекту "вигоряння" препарату, пов'язаного із поступовим руйнуванням молекул FITC під впливом тривалого ультрафіолетового опромінювання. Уведене імунофлуоресцентне зображення оцифровують за денситометричною шкалою з 256 градаціями сірого кольору. Аналіз зображення проводять в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 ("Kontron Elektronik", ФРН). Програмно ідентифікують ділянки препаратів, у котрих інтенсивність флуоресценції вірогідно перевищувала фонові значення (притаманні так званій неспецифічній флуоресценції); ці ділянки розміщувались в межах ядер досліджуваних нейронів. Вимірюють площу таких ділянок та повну площу перерізу ядер нейронів мдПВЯ, котрі вміщували 2 імунопозитивний матеріал (S та SЯ відповідно, мкм ) та розраховували значення відносної площі, зайнятої імунопозитивним матеріалом (St/SЯ-100 %). З урахуванням інтенсивності флуоресценції в імунопозитивних ділянках та інтенсивності флуоресценції фону (D- та D) обчислюють показники, які характеризують концентрацію c-fos та вміст цього протеїну в ядрах імунопозитивних клітин, К, - | lg (D/D) | та Ct - Kj-Si (умовні одиниці, ум.од.) відповідно. Оскільки дані показники є відносними, а не абсолютними величинами, далі вони іменуються індексами концентрації та вмісту c-fos в імунопозитивних клітинах. Топографічну приналежність імунопозитивних нейронів до окремих структур гіпоталамуса картують згідно зі стереотаксичним атласом мозку щура. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням пакета прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 ("Kontron Elektronik", ФРН) і EXCEL-2003 ("Microsoft Corp.", США). Для вибірок усіх показників розраховують значення середнього арифметичного, середньоквадратичного відхилення та похибки середнього. Вибірки імунопозитивних клітин мдГТВЯ, у котрих вимірюють St та SЯ, та розраховують значення К, та СІ у різних групах експериментальних тварин, складалися зі 122-168 одиниць. 2 UA 90450 U 5 10 15 20 25 30 Окрім того, розраховують щільність локалізації c-fos-імунопозитивних нейронів у межах досліджених зрізів мдПВЯ. Для цього попередньо визначають кількість клітин з c-fosпозитивними ядрами у декількох (чотирьох-семи для кожної тварини) випадково обраних полях зору і розраховують середню кількість подібних нейронів на 1 мм площі зрізу. Вірогідність відмінностей між значеннями в дослідних і контрольних групах тварин визначають за критерієм Стьюдента (t); вірогідними вважали різниці, для яких р