Спосіб імуногістохімічного дослідження мелатонінових рецепторів 1а у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса

Реферат: Спосіб імуногістохімічного дослідження мелатонінових рецепторів 1А у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса з урахуванням циркадіанних змін включає використання поліклональних антитіл до мелатонінових рецепторів 1А виробника Abcam, стрептавідинбіотинову систему візуалізації LSAB2, визначення щільності мелатонінових рецепторів 1А у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса. UA 81332 U (12) UA 81332 U UA 81332 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до галузі нормальної фізіології і може бути використаним для клінічних діагностичних та наукових дослідженнях, а також при виконанні експериментальних науково-дослідних та дисертаційних робіт. Відомо на сьогодні, що в організмі всіх еукаріотів наявні потужні функціональні системи, які синхронізують циркадіанні (білядобові) ритми. Згідно з сучасними уявленнями на роль провідного водія ритму (пейсмекера) циркадіанних ритмів (ЦР) у головному мозку ссавців претендують супрахіазматичні ядра гіпоталамуса (СХЯ), а ендокринним посередником у цьому процесі є шишкоподібна залоза (ШЗ). Вона синтезує значну кількість ідентифікованих біологічно активних речовин, серед яких чільне місце займає мелатонін. Через мелатонінові рецептори (мембранні та ядерні) гормон контролює стан гіпоталамо-гіпофізарної системи й активність ендокринних залоз. Окрім того, за механізмом зворотного зв'язку він втручається в діяльність самих СХЯ. Авторадіографія і радіоімунний аналіз показали присутність мелатонінових рецепторів у різних структурах мозку людини, кишечнику, яєчниках і кровоносних судинах. Припускають, що рецептори в супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса, регулюють циркадіанний ритм. Унікальним положенням на стику нервової й ендокринної систем зумовлена своєрідна модулювальна роль ШЗ, здатної інтегрувати різні екзогенні й ендогенні сигнали, трансформуючи їх у гормональну відповідь. Маючи широкий спектр ефектів, мелатонін може відігравати також роль як ендогенного синхронізатора ритмічних процесів, так і запускати ЦР деяких фізіологічних показників. Показано, що секреція мелатоніну підпорядкована чітким добовим варіаціям з мінімальним значенням вдень і максимумом близько 02.00 год. Таким чином, ефекти гормону зумовлені як різною функціональною активністю ШЗ впродовж доби, так і різною щільністю рецепторів мелатоніну в СХЯ, через які гормон здійснює підлаштування ритмів циркадіанного осцилятора. Однак, відомості щодо характерстики мелатонінових рецепторів у СХЯ гіпоталамуса носять фрагментарний характер і не висвітлюють цілісного уявлення про вказані структури. Найближчим аналогом є корисна модель № 36648 "Спосіб дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів 1а у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса" (автори: Булик Р.С., Пішак В.П., Магаляс В.М., Давиденко І.С. Бюл. № 21 від 10.11.2008 p.), який базується на циркадіанних змінах мелатонінових рецепторів. Спосіб дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів 1а у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса, полягає в тому, що отримують цифрові копії оптичного зображення, які в подальшому аналізують, а саме - проводять комп'ютерну мікроденситометрію, аналіз здійснюється на підставі вимірювань мікрозондованої методики у місцях позитивного забарвлення за показником "оптична щільність" в умовних одиницях з діапазоном 0-1, причому "0" відповідає абсолютній оптичній прозорості у мікрозонді, а "1" - абсолютній оптичній непрозорості. Недоліком прототипу є дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів 1а у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса, без враховування імунногістохімічних змін мелатонінових рецепторів 1а у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса. В основу корисної моделі поставлено задачу визначити щільність мелатонінових рецепторів у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса у імунногістохімічному аспекті. Для вирішення поставленої задачі визначають щільність мелатонінових рецепторів у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса у імунногістохімічному аспекті. Згідно винаходу, експерименти проводяться на 40 статевозрілих самцях безпородних білих щурів масою 0,15-18 κг. Тварин утримували в твариннику при сталій температурі, вологості повітря та вільному доступі до води й їжі. Дослідних тварин поділено па 4 групи (10 особин у кожній), які перебували за умов звичайного світлового режиму 12.00С:12.00Т (світло з 08.00 до 20.00 год. лампи денного світла ЛБ-40, освітленість приміщення на рівні тварин 200 Лк) впродовж 7-ми діб. З метою виявлення циркадіанних відмінностей мелатонінових рецепторів та враховуючи циклічність продукції мелатоніну, евтаназію щурів виконували з 6-годинним інтервалом (02.00, 08.00, 14.00 та 24.00 год.) шляхом декапітації на 8-му добу. Всі етапи експерименту проведено з дотриманням основних вимог Європейської конвенції щодо гуманного ставлення до тварин (Страсбург, 1986). Для імуногістохімічного дослідження ідентифіковану ділянку СХЯ гіпоталамуса фіксують у 10 %-му розчині нейтрального забуференого формаліну впродовж 22 год. Після цього виконують прискорене зневоднювання у спиртах висхідної концентрації, заливають у парафін при температурі 58 °C з наступним отриманням гістологічних зрізів 5 мкм завтовшки. З метою виконання імуногістохімічної методики використовують поліклональні антитіла до мелатонінових рецепторів 1A виробника Abcam (Велика Британія) та стрептавідинбіотинову систему візуалізації LSAB2 (пероксидазна мітка + діамінобензидин) виробника Chemicon 1 UA 81332 U 5 10 15 International Inc. (США). Максимально дотримуються стандартизації протоколу методики для всіх зрізів. Дофарбовування ядер виконують гематоксиліном Майера. Кількісні дослідження інтенсивності зафарбовування проводять за наступною схемою. Спочатку, при використанні об'єктива мікроскопа х40, отримують цифрові копії оптичного зображення, які в подальшому аналізують за допомогою ліцензійної копії комп'ютерної програми "ВидеоТест - Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия), а саме - проводять комп'ютерну мікроденситометрію. Аналіз здійснюють на підставі вимірювань мікрозондовою методикою у місцях позитивного забарвлення за показником "Оптична щільність" (в умовних одиницях з діапазоном 0-1, причому "0" відповідає абсолютній оптичній прозорості у мікрозонді, а "1" абсолютній оптичній непрозорості). Враховуючи необхідність виконання множинних статистичних порівнянь середніх величин у статистичних вибірках, для визначення відмінностей між сукупностями використовують критерій Ньюмена-Кейлса. Спосіб імуногістологічної характеристики мелатонінових рецепторів 1А у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса забезпечується тим, що при користуванні запропонованим способом відмічено найвищу щільність мелатонінових рецепторів 1А у нейронах супрахіазматичних ядер щурів, яка спостерігається на 02.00 та 20.00 год., а на 08.00 та 14.00 год. вона суттєво знижується (табл.). Таблиця Циркадіанна динаміка оптичної щільності забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у "великих" нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса (x±Sx) Години доби 02.00 08.00 14.00 20.00 Величина вірогідності за критерієм Ньюмена-Кейлса