Спосіб виявлення вірусних уражень рослин

Спосіб виявлення вірусних уражень рослин, який включає опромінення листка рослини, після темнової фази, світлом в діапазоні хвиль 400 650нм, прийом, вимірювання та реєстрацію сигналів наведеної флуоресценції в діапазоні хвиль 670 770нм, із значень яких будують індукційну криву флуоресценції та визначають стаціонарну флуоресценцію Fst, який відрізняється тим, що в ньому додатково визначають значення фонової F0, максимальної Fm і варіабельної флуоресценції Fm-F0, та значення флуоресценції плато Fpl, а також визначають максимальне значення модуля різниці між поточними значенням флуоресценції повільної фази Fn та відповідним йому значенням лінійного спаду флуоресценції Ft визначеного для моменту вимірювання Fn в межах від максимального Fm до стаціонарного Fst значень і по величині коефіцієнта плато Крl=(FplF0):(Fm-F0) 0,4 та коефіцієнта нелінійності Кnl=|FnFt|max:(Fm-Fst) 0,1 роблять висновок про вірусне ураження рослини. Спосіб належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення їх фізичних властивостей, зокрема флуоресценції нативного хлорофілу. Спосіб призначений для використання у сільському господарстві, зокрема рослинництві та селекційній роботі. Зовнішніми ознаками вірусних уражень є хлоротичні плями різної форми - мозаїчні, кільцеві, смугасті, махровість листя, «відьмове помело» та інші. Відомо імуно-ферментний «Способ тестирования растений на вирусы»; патент RU 2147173; який полягає у заражені рослин-індикаторів соком дослідних рослин з наступним визначенням ураженості рослин-індикаторів шляхом порівняння оптичних щільностей зразка і контролю. Спільними рисами аналогу і запропонованого способу є опромінення рослини, прийом та вимірювання оптичного сигналу, що взаємодіє з опроміненою областю листа. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що спосіб-аналог складний, працемісткий, потребує складного лабораторного обладнання, реактивів, багато часу (з рослиною-індикатором до 4 років) і не дозволяє здійснювати визначення in Vivo у польових умовах. (19) UA (11) 91452 (21) a200903000 (22) 30.03.2009 (24) 26.07.2010 (46) 26.07.2010, Бюл.№ 14, 2010 р. (72) АРТЕМЕНКО ДМИТРО МИХАЙЛОВИЧ, ВАСЮТА СВІТЛАНА ОЛЕКСАНДРІВНА, ВОЙТОВИЧ ІГОР ДАНИЛОВИЧ, КИТАЄВ ОЛЕГ ІГОРОВИЧ, КЛОЧАН ПЕТРО СТЕПАНОВИЧ, КОЛЕСНИК ЮРІЙ СТЕПАНОВИЧ, МІЩЕНКО ЛІДІЯ ТРОХИМІВНА, РОМАНОВ ВОЛОДИМИР ОЛЕКСАНДРОВИЧ, СКРЯГА ВІКТОРІЯ АЛІФАРМАНІВНА, ТАРАНУХО ЮЛІЯ МИКОЛАЇВНА, ФЕДАК ВОЛОДИМИР СЕМЕНОВИЧ (73) ІНСТИТУТ КІБЕРНЕТИКИ ІМ. В.М.ГЛУШКОВА НАН УКРАЇНИ (56) UA 83679 C2, 11.08.2008. UA 35033 A, 15.03.2001. RU 2147173 C1, 10.04.2000. RU 92010565 A, 19.06.95. UA 82714 C2, 12.05.2008. UA 82894 C2, 26.05.2008. UA 85524 C2, 26.01.2009. UA 24908 U, 25.07.2007 EP 0215399 A2, 25.03.87. C2 2 (13) 1 3 Відомо «Способ обнаружения вирусных инфекций растений» А.С. SU 1507253; A01G67/00, G01N21/35, який полягає у реєстрації інфрачервоного поглинання листа рослини у спектральній області 850 1750см у мінус першому ступені із швидкістю 160 400см у мінус першому ступені/хв. Ураженим вважають зразок з максимальною інтенсивністю інфрачервоного поглинання в порівняні із здоровою рослиною. Спільними рисами аналогу і запропонованого способу є опромінення рослини, прийом та вимірювання оптичного сигналу, що взаємодіє з опроміненою областю листа. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що у способіаналогу для діагностики використовуються незворотні структурні зміни клітин листка, які визначають по інфрачервоному поглинанню. Це не дозволяє здійснювати ранню діагностику за функціональними зворотними, змінами клітин листка. Найближчим по суті до запропонованого способу є «Спосіб ідентифікації вірусної строкатості рослин», патент UA 83679, 11.08.2008. Бюл. №5. 2008р. Спосіб полягає в опроміненні листка рослини, після темпової фази, світлом в діапазоні хвиль 400 650нм, прийом вимірювання і реєстрацію сигналів наведеної флуоресценції в діапазоні хвиль 670 770нм, із значень яких будують індукційну криву та визначають значення стаціонарної флуоресценції в області судини листка FTC та між судинами, того ж листка FTM і порівнюють ці значення, а по величині FTC 1,5FTM рослину вважають ураженою вірусною строкатістю. Спільними рисами способу - прототипу та запропонованого способу є опромінення листка рослини після темпової фази світлом в діапазоні довжин хвиль 400 650нм, прийом, вимірювання і реєстрація сигналів флуоресценції в діапазоні довжин хвиль 670 770нм із значень яких будують індукційну криву та визначають стаціонарну флуоресценцію FSt. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що у способі прототипу ідентифікують тільки вірусну строкатість і неможливо визначити інші вірусні ураження та загальну ураженість рослин вірусними інфекціями. Задачею винаходу є вибір таких характерних ознак індукції флуоресценції нативного хлорофілу, способу їх визначення та інтерпретації, які дозволяють виявити загальну ураженість вірусними інфекціями, на ранніх стадіях ураження. Вирішення поставленої задачі досягається тим, що запропонований спосіб включає опромінення листка рослини, після темнової фази, світлом в діапазоні хвиль 400 650нм, прийом, вимірювання та реєстрацію сигналів наведеної флуоресценції в діапазоні хвиль 670 770нм, із значень яких будують індукційну криву флуоресценції та визначають стаціонарну флуоресценцію Fst а також в ньому додатково визначають значення фонової F0, максимальної Fm і варіабельної флуоресценції Fm-F0, та значення флуоресценції плато Fpl, а також визначають максимальне значення модуля різниці між поточ 91452 4 ними значенням флуоресценції повільної фази Fn та відповідним йому значенням лінійного спаду флуоресценції Ft визначеного для моменту вимірювання Fn в межах від максимального Fm до стаціонарного Fst значень і по величині коефіцієнта плато Крl=(Fpl-F0):(Fm-F0) 0,4 та коефіцієнта нелінійності Кnl=|Fn-Ft|max:(Fm-Fst) 0,1 роблять висновок про вірусне ураження рослини. Відмінними ознаками запропонованого способу є те, що в ньому додатково визначають значення фонової F0, максимальної Fm і варіабельної флуоресценції Fm-F0, та значення флуоресценції плато Fpl, а також визначають максимальне значення модуля різниці між поточними значенням флуоресценції повільної фази Fn та відповідним йому значенням лінійного спаду флуоресценції Ft визначеного для моменту вимірювання Fn в межах від максимального Fm до стаціонарного Fst значень і по величині коефіцієнта плато Крl=(Fpl-F0):(Fm-F0) 0,4 та коефіцієнта нелінійності Кnl=|Fn-Ft|max:(Fm-Fst) 0,1 роблять висновок про вірусне ураження рослини. Введення у відомий спосіб визначення коефіцієнта плато швидкої фази флуоресценції та коефіцієнта нелінійності повільної фази індукції флуоресценції, способу їх визначення та кількісної інтерпретації дозволяє роботи висновок про вірусне ураження рослини. Запропонований спосіб виявлення вірусних уражень рослин грунтується на використанні в якості діагностичних ознак біофізичних властивостей нативного хлорофілу інтактного листка рослини, а саме окремих показників флуоресценції хлорофілу індукованої світлом. На Фіг. зображено загальний вид індукційної кривої (крива індукції флуоресценції, крива Каутського), де значення флуоресценції представлено у відносних одиницях, Сутність запропонованого способу полягає в тому, що лист рослини, або його фрагмент, спочатку витримують у темряві. Темнова фаза листка рослини необхідна для приведення системи фотосинтезу в початковий стан, коли окисновідновлювальні ланки електрон-транспортних ланцюгів відкриті. Тривалість темнової фази від 3 до 20хв. впливає на точність визначення показників індукції флуоресценції. Темнова фаза менша 3хв. ускладнює визначення флуоресценції плато Fpl та стаціонарної флуоресценції Fst, а збільшення темнової фази більше за 20хв. суттєво зменшує швидкодію вимірювань. Для надійних визначень характерних показників при екпресних обстеженнях достатньо темнової адаптації не менше 3хв. Далі лист рослини, або фрагмент опромінюють світлом, яке збуджує флуоресценцію хлорофілу. Збудження флуоресценції хлорофілу виконують у спектральному діапазоні його поглинання, тобто в діапазоні фотосинтетично активної радіації (ФАР) від 390 до 730нм. В цьому діапазоні існують два основні максимуми поглинання нативного хлорофілу на хвилях 430 i 660нм та два слабо виражених (500 і 600нм). За межами цього діапазону збудження флуоресценції хло 5 рофілу взагалі малоефективне. Крім того, інші пігменти рослин, що поглинають світло і передають енергію на реакційні центри хлоропластів, характеризуються максимумами поглинання у тому ж діапазоні. При збудженні флуоресценції на хвилях більше 650нм виникають значні суто технічні труднощі при виділенні сигналів флуоресценції у діапазонах хвиль від 670 до 770нм на фоні збуджуючого опромінення, оскільки в цьому випадку потрібні вузькосмугасті світлофільтри. Вибираючи хвилю збудження флуоресценції нативного хлорофілу, враховують, з одного боку, максимум поглинання ( =430нм), а з іншого, технічні складнощі виділення сигналу флуоресценції на фоні опромінення, тобто 650нм. Тому оптимальним для збудження флуоресценції хлорофілу є діапазон від 400 до 650нм. Джерелами збудження можуть слугувати сонячне проміння, ртутна лампа або лампа розжарення з відповідним фільтром, а також суперяскраві світлодіоди з необхідною довжиною хвилі. Далі приймають сигнали наведеної флуоресценції. Флуоресценцію хлорофілу спостерігають в усьому діапазоні хвиль від 670 до 770нм з вираженими максимумами на 680 та 730нм. На хвилі 680нм її пов'язують здебільшого з роботою фотосистеми II, а флуоресценцію на хвилі 730нм - з фотосистемою І. Тому вимірювання флуоресценції в усьому діапазоні від 670 до 770нм посередньо охоплює роботу обох фотосистем фотосинтезу. Сигнали флуоресценції на фоні опромінення виділяють з допомогою спектральних приладів, зокрема світлофільтрів з відповідною смугою пропускання від 670 до 770нм, наприклад, скляних або майларових. Прийом оптичних сигналів флуоресценції та перетворення їх для подальшого вимірювання в сигнали електричні здійснюють з допомогою фотоприймачів, якими слугують фотоелектронні перемножувачі або напівпровідникові фоточутливі елементи, зокрема фотодіоди чи фототранзистори. Далі прийняті сигнали флуоресценції вимірюють і реєструють. Із поточних значень флуоресценції будують індукційну криву (Фіг.) і визначають стаціонарну флуоресценцію. Індукована флуоресценція хлорофілу проходить фазу швидкої флуоресценції (до 3сек) (Фіг.) в якій виділяють фонову флуоресценцію F0, значення плато Fpl, максимальну флуоресценцію Fm, варіабельну флуоресценцію Fm-F0 (між F0 та Fm), та повільну фазу флуоресценції (Фіг.) - спад після максимального значення Fm, в якій виділяють стаціонарне значення Fst. Хід флуоресценції в повільній фазі в межах від Fm до Fst для неуражених рослин увігнутий або опуклий (Фіг.). Такий хід можна апроксимувати прямою лінією між максимальним Fm та стаціонарним Fst значеннями. Характерні значення флуоресценції F0, Fpl, Fm та Fst визначають з індукційної кривої (Фіг.), або шляхом порівняння ряду послідовних зареєстрованих значень флуоресценції. Так умовою визначення фонової початкової флуоресценції F0, є FiFi-1 Fi+1-Fi або мінімум другої похідної від індукційної кривої (Фіг.). Флуоресценцію плато Fpl визначають як зменшення наростання флуоресце 91452 6 нції за умовою Fj-Fj-1 Fj+1-Fj або по мінімуму першої похідної. Умовою визначення максимальної флуоресценції з ряду поточних значень є Fn1 Fn>Fn+1. Стаціонарне значення флуоресценції визначають за умови Fk-Fk+1 0,01Fm. Значення Fi, Fj, Fn та Fk - відповідно послідовні поточні значення флуоресценції зареєстровані за цикл вимірювання. Характерні значення індукції флуоресценції визначають в кінці циклу вимірювань або у процесі вимірювань в залежності від обчислювальних можливостей вимірювального пристрою. Відомо, що певні ділянки індукції флуоресценції нативного хлорофілу інтактного листка рослини корелюють з відповідними ланками ланцюгу фотосинтезу, тому можуть слугувати діагностичними ознаками порушень фотосинтетичного процесу. В результаті експериментальних досліджень в якості діагностичних ознак ураженості рослин вірусними інфекціями вибрано порушення у відновлені пулу первинних акцепторів реакційних центрів фотосистеми II, які визначають шляхом вимірювання флуоресценції плато Fpl в межах варіабельної флуоресценції F0 Fm. Поява проміжного плато Fpl в швидкій фазі флуоресценції викликане блокуванням електронного транспорту між первинними акцепторами фотосистеми II під впливом різних чинників, зокрема вірусними ураженнями хлоропластів. Збільшення Fpl використовують для оцінки ступеню інгібірування електронного транспорту, тобто як діагностичну ознаку впливу вірусного ураження. Другою діагностичною ознакою вибрано порушення ходу гальмування відтоку електронів від первинних акцепторів реакційних центрів фотосистеми II до реакційних центрів фотосистеми І в ланцюгу темпової фази фотоситнеза, яку оцінюють шляхом визначення максимальної нелінійності повільної фази індукції флуоресценції, як максимального значення модулю різниці поточного значення флуоресценції та флуоресценції лінійного спаду в момент часу tn. Лінійний спад флуоресценції в повільній фазі індукції флуоресценції свідчить про блокування окремих ланок в ланцюгу фотосинтезу, зокрема затримка активації циклу Кельвіна, відтоку електронів до фотосистеми І та ін., викликане вірусними ураженнями хлоропластів. Ступінь наближення реальної функції спаду повільної фази індукції флуоресценції до лінійного спаду в межах від Fm до Fst вибрано для оцінки ступеню порушення фотосинтезу, а тим самим ступеню вірусного ураження рослини. Оцінку нелінійності реальної функції спаду флуоресценції здійснюють по величині максимальної нелінійності. Максимальна нелінійність виражає максимальне відхилення ходу реальної залежності, увігнутої або опуклої, від лінійної залежності монотонного спаду флуоресценції в межах від максимального Fm до стаціонарного Fst значень, тобто від апроксимуючої прямої між значеннями Fm та Fst. Апроксимуючу пряму (Фіг. пунктир) визначають як: 7 Fm Fst (1) t st t m де tst та tm відповідно моменти часу вимірювань Fst та Fm (Фіг.). Для поточних значень флуоресценції Fn в моменти їх вимірювань tn по формулі (1) визначають відповідні значення флуоресценції для лінійного її спаду. Різниця значень при реальному і лінійному спаді флуоресценції, по модулю, визначають як миттєву нелінійність в точці tn. Із ряду миттєвих значень нелінійності в межах від Fm до Fst вибирають максимальне, яке і буде значенням максимальної нелінійності Fnl=|Fn-Ft|max. Далі з величин F0, Fpl, Fm визначають різниці Fpl-F0 та Fm-F0 і порівнюють їх, а також з величин Fn, Ft, Fm та Fst визначають різниці |Fn-Ft| max та Fm-Fst і теж порівнюють їх між собою. Відношення різниць виражають у вигляді коефіцієнтів: (2) Крl=(Fpl-F0):(Fm-F0) 0,4 Крl - коефіцієнт плато (3) Кnl=|Fn-Ft|max:(Fm-Fst) 0,1 Кnl - коефіцієнт нелінійності по значенням яких роблять висновок про вірусне ураження рослин. Кожен з вибраних показників індукції флуоресценції значення плато Fpl та інтегральна нелінійність залежить від декількох чинників і використання відповідних їх змін є необхідною умовою виявлення вірусних уражень. При використанні контрольних неуражених рослин для порівняння достатньо визначення однієї з ознак. При тестуваннях без використання контрольних рослин одного з показників індукції флуоресценції недостатньо. Використання двох показників індукції флуоресценції суттєво збільшує вірогідність та надійність виявлення вірусних уражень. Приклад реалізації способу. Окремі характерні показники індукції флуоресценції нативного хлорофілу листка рослини, необхідні для виявлення вірусних уражень рослини можна визначити наприклад з допомогою флуориметра «Флоратест» патент UA 18179, або будь якого іншого хлорофіл-флуорометра, з пам'яттю достатньою для накопичення цифрової інформації за цикл вимірювання, при забезпеченні режимів темнової адаптації, опромінення, необхідного виділення сигналів флуоресценції та програмного забезпечення по алгоритму запропонованого способу. Порядок дії способу наступний: листок рослини, або його робочу зону, витримують у темряві на протязі не менше 3 хв., збуджують флуоресценцію нативного хлорофілу шляхом опромінення робочої зони світлом на хвилі 470нм з інтенсивністю 25Вт/м2, приймають, виділяють, вимірюють і реєструють сигнали індукованої Ft=Fm 91452 8 флуоресценції у діапазоні хвиль 670-770нм на протязі 180сек. З поточних значень флуоресценції визначають характерні показники F0, Fpl, Fm, Fst та моменти часу вимірювання, Fm та Fst - відповідно tm і tst, які використовують для визначення апроксимуючої прямої. Для кожного з реальних поточних значень флуоресценції повільної фази Fn визначають відповідне значення для лінійного спаду Ft з рівняння апроксимуючої прямої (1) для моменту tn вимірювання Fn. Із характерних показників індукції флуоресценції визначають коефіцієнт плато Крl=(Fpl-F0):(Fm-F0) 0,4 та коефіцієнт нелІнійності Кnl=|Fn-Ft|max:(Fm-Fst) 0,1 і по їх значенням роблять висновок про вірусне ураження. Приклад застосування способу: запропонований спосіб було використано при визначенні уражень рабдовірусом ягідних культур, зокрема смородини сорту «Козацька» на дослідних ділянках Інституту садівництва УААН. Порівнювали значення коефіцієнта плато Крl (2) та коефіцієнта нелsнійності Кnl (3) для безвірусної рослини та ураженої рабдовірусом. Для безвірусної смородини сорту «Козацька» визначили F0=29,4, Fpl=43,0, Fm=58,6 та коефіцієнт плато (2) Крl=0,23 що менше 0,4. Для ураженої рабдовірусом смородини сорту «Козацька» F0=52, Fpl=53,4, Fm=59,8 та коефіцієнт плато (2) Крl=0,77 що більше 0,4. Для безвірусної смородини сорту «Козацька» визначили Fst=35,0, Fn=53,26, Ft=46,72 та коефіцієнт нелІнійності (3) Кnl=0,26 що більше 0,1. Для ураженої рабдовірусом смородини сорту «Козацька» визначили Fst=55,2, Fn=52,5, Ft=51,18 та коефіцієнт нелІнійності (3) Кnl=0,053 що менше 0,1. Результати вимірювань характерних показників індукції флуоресценції нативного хлорофілу листя безвірусних рослин і уражених рабдовірусом визначених на їх основі коефіцієнтів плато Крl та нелІнійності Кnl свідчать про дієвість запропонованого способу визначення вірусного ураження рослин. Запропонований спосіб виявлення вірусних уражень, як видно з його опису, може бути реалізовано у виробничих умовах з використанням серійних хронофлуориметрів які здійснюють вимірювання та реєстрацію поточних значень індукції флуоресценції Запропонований спосіб виявлення вірусних уражень рослин планується використати при визначені вірусних уражень саджанців садових і ягідних культур у розплідниках і дослідних господарствах УААН та при промисловому вирощуванні саджанців. Спосіб може бути використаний також для визначення вірусних уражень польових трав’янистих культур. 9 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 91452 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601