Спосіб діагностики хромосомних аномалій у ембріона при вагітностях, які були отримані за допомогою репродуктивних технологій

Реферат: Спосіб діагностики хромосомних аномалій у ембріона при вагітностях, які були отримані за допомогою допоміжних репродуктивних технологій, включає забір трансцервікальних проб та їх ідентифікацію. Для ідентифікації трофобластичних клітин проводять імуногістохімічне дослідження, для якого використовують mAbs, що ідентифікує як фетальний ядерноспецифічний маркер, так і моноклональні антитіла (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласта з наступним аналізом в fluorescence in situ hybridisation (FISH) хромосом ембріона. UA 91589 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНИХ АНОМАЛІЙ У ЕМБРІОНА ПРИ ВАГІТНОСТЯХ, ЯКІ БУЛИ ОТРИМАНІ ЗА ДОПОМОГОЮ РЕПРОДУКТИВНИХ ТЕХНОЛОГІЙ UA 91589 U UA 91589 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до генетики, і може бути використана для діагностики хромосомних аномалій у ембріона при вагітностях, які були отримані завдяки допоміжним репродуктивним технологіям (ДРТ). В даний час вагітності, отримані за допомогою ДРТ, складають 1 % від всіх вагітностей. Вагітність, отримана за допомогою ДРТ, зв'язана з ризиком ускладнень, зокрема з хромосомною патологією. Зараз розроблена система пренатального скринінгу, що включає послідовний аналіз даних анамнезу, вікові чинники, біохімічні і ультразвукові параметри, яка визначає ризики хромосомної патології у плоду і формує рекомендації для інвазивної пренатальної діагностики. Проте, інвазивні методи діагностики хромосомної патології супроводжуються 1,0-1,5 % ризиком втрати вагітності, можливо, здоровим плодом. На тлі того, що вагітності у жінок після ДРТ взагалі є вагітностями високого ризику, перш за все переривання вагітності, багато вагітних цієї категорії відмовляються від проведення інвазивної пренатальної діагностики. У зв'язку з цим актуальним є пошук неінвазивних методів пренатальної діагностики хромосомної патології. Відомим є спосіб діагностики хромосомних аномалій у ембріона, при якому для ідентифікації трофобластичних клітин в цервікальному слизу матері використовуються моноклональні антитіла (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласту (US 2004/0197832, Pub. Date Oct. 7, 2004). Методика не дозволяє виявити достатньої кількості плодових елементів, оскільки вільних ядер трофобластичних клітин в цервікальних мазках міститься невелика кількість. Дана методика застосовується для загальної популяції жінок. Найближчим аналогом є спосіб діагностики хромосомних аномалій у ембріона, при якому для ідентифікації трофобластичних клітин в цервікальному слизу матері використовують моноклональні IGG, що ідентифікують фетальний ядерно-специфічний маркер (US2010/0035246, Pub. Date Feb. 11,2010). Спосіб не дозволяє виявити достатньої кількості клітинних елементів для точної діагностики. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу діагностики хромосомних аномалій у ембріона, в якому за рахунок зміни ідентифікації трофобластичних клітин плоду, досягається виявлення більшої кількості вільних трофобластичних клітин, за рахунок чого підвищується якість діагностики. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики хромосомних аномалій у ембріона при вагітностях, які були отримані за допомогою допоміжних репродуктивних технологій, який здійснюють шляхом забору трансцервікальних проб та їх ідентифікації, згідно з корисною моделлю, для ідентифікації трофобластичних клітин проводять імуногістохімічне дослідження, для якого використовують mAbs, що ідентифікує як фетальний ядерноспецифічний маркер, так і моноклональні антитіла (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласта з наступним аналізом в fluorescence in situ hybridisation (FISH) хромосом ембріона. В способі використовують як mAbs, що розпізнають HLA-G, які експресуються на клітинах ектравілезного трофобласта, так і моноклональні IgG, що ідентифікують фетальні ядерноспецифічний маркер. Ця особливість дозволяє виявити більше плодових елементів, оскільки вільних ядер трофобластичних клітин в цервікальних мазках за даними літератури в 10 разів больше, ніж клітин. Спосіб, що заявляється, здійснюють таким чином. Обстеження включає забір трансцервікальних проб, приготування мазків на склі, імуногістохімічний етап (ІГХ-етап) і FISH. 1. На першому етапі проводять забір матеріалу - цервікального слизу, з якого готують препарати-слайди. Забір матеріалу проводять у пацієнток в термінах вагітності 6-12 тижнів з одноплідною вагітністю після отримання їх інформованої згоди. Забір слизу проводять ендоцервікальною щіточкою, яку вводять на глибину 2 см в шийку матки шляхом обертання на 360, уникаючи контакту із стінками цервікального каналу для запобігання материнській контамінації і кровотечі. 2. Приготування мазків. Зібраний слиз занурюють в 2-3 мл середовища М-199 з додаванням антибіотика. Матеріал направляють до лабораторії протягом 6 годин з моменту забору матеріалу. Далі для очищення від слизу зразки обробляють 3 % 600 1 оцтової кислоти, після 10 хвилин інкубації, клітини відмивають 3 рази шляхом центрифугування при 190 g і ресуспензування у фосфатнобуферному розчині. Зразки поміщають до 10 мл 0,05 % азиду натрію і зберігають при температурі 4 °С. 1 UA 91589 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Для імуногістохімії 1 мл рідини поміщають в цитоцентрифугу Shandon Cytospin 3 (Thermo Shandon Inc., USA). Щільність клітин складає 50000-20000 на площу діаметром 1 см (0,79 см2). Приготовані на склі мазки (всього по 3 на кожну пацієнтку) висушують і до проведення ІГХ зберігають в 95 % етиловому спирті. 3. Третій етап включає проведення ІГХ. В ході ІГХ скло кожної пацієнтки обробляють 2 видами моноклональних антитіл (mAbs) залежно від етапу дослідження: МСА2043 (Serotec, США), що розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравелезного трофобласту, в розведенні 1:150; моноклональні IGG, що ідентифікують фетальний ядерно-специфічний маркер матричну металопептидазу ММР9 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA). Комплекс трофобластспецифічних маркер-антитіл визначають з використанням ABC Staining System (sc-2017, Santa Cruz, США). Для підрахунку ядер застосовують забарвлення гематоксиліном. Препарати оглядають при збільшенні 400 (іммерсії 100 з використанням мікроскопа Nikon Eclipse 80i (Японія), зображення фіксують цифровою камерою (CCD-1300QB, VDS, Німеччина). Зв'язані з mAbs клітини трофобласту і вільні ядра після ІГХ мають коричневе забарвлення різної інтенсивності, правильну овальну або полігональну форму, з різним ядерноцитоплазматичним відношенням. Після ідентифікації плодових клітин і вільних ядер, наголошуються їх координати, видаляють ІГХ-реактиви і проводять FISH, при цьому результати FISH прочитують із зареєстрованих на етапі ІГХ координат. 4. На 4-му етапі проводять дослідження статевих хромосом X та Y в реакції FISH. При виявленні сигналу, відповідного Y-хромосомі, рахують досліджувану клітину однозначно плодовою. 5. На 5-му етапі на тих же трофобластичних клітинах і вільних ядрах проводять другий тур FISH із зондами на хромосоми 13, 18 та 21. Для проведення FISH діагностики на плодових клітинах використовують спеціальні методи відмивання препарату і фіксації клітин плоду в розчинах метанолу і оцту (у співвідношенні 3:1) і 100 % метанолу. Для візуалізації аналізу використовують флуоресцентний мікроскоп Nikon Eclipse 80i, для документування результату застосовують цитогенетичну програму Lucia FISH (LIM, Чехія). Для проведення аналізу методом FISH використовують ДНК-зонд Vysis (США). При виконанні FISH-аналізу використовують стандартний протокол Vysis (США). При проведенні FISH використовують зонди СЕР X (DXZ1) Alpha Satellite DNA Spectrum Aqua; CEP Y (DYZ3) Alpha Satellite DNA Spectrum Orange; LSI 13 Spectrum Green, CEP 18 (D18Z1) Alpha Satellite DNA SpectrumAqua, LSI 21 Spectrum Orange. Приклад 1. У разі 1 при FISH на ІГХ-маркірованих клітках нами зарегистрировано два червоних і один зелений сигнал, відповідних генотипу XYY. При цьому при УЗД в термінах 4-6 тижнів не було яких-небудь відхилень від нормального перебігу ранньої вагітності. При біохімічному скринінгу 1 триместра в 10-11 тижнів закономірно не знайдено яких-небудь змін (РАРР-А - 1,2 МоМ, free -ХГЧ - 0,8 МоМ), при 1 УЗ-скринінгу маркерів хромосомної і іншої патології плоду не виявлено, діагностовано чоловічу стать плоду. У 16 тижнів даній пацієнтці був проведений амніоцентез, при FISH амніоцитів підтверджений генотип XYY, а результати цитогенетичного дослідження амніоцитів встановили каріотип 47XYY. У зв'язку з відсутністю впливу даної анеуплоїдії на соматичне здоров'я дитини сім'я ухвалила рішення доношувати вагітність. Цитогенетичне дослідження на препаратах метафазних хромосом лімфоцитів периферичної крові показало нормальний каріотип батьків, але у зв'язку з астенозооспермією у чоловіка проводився FISH сперми, що виявив більше 0,6 % сперматозоїдів з генотипом XYY. Вагітність у даної пацієнтки протікає без ускладнень, вона народила фенотипічно здорову дитину, при цитогенетичному дослідженні лімфоцитів периферичної крові підтверджений каріотип 47XYY. Приклад 2. У другому випадку в 7 тижнів вагітності в ІГХ-маркірованих клітинах при FISH була виявлена моносомія Х0, підтверджена цитогенетичним дослідженням хоріону в 9 тижнів (45Х0); забір хоріону для каріотипування проведений привискоблюванні матки у зв'язку з вагітністю, що не розвилася. Дана методика застосована в групі жінок високого ризику по невиношуванню вагітності і вродженим вадам розвитку - у жінок, вагітність у яких наступила після ДРТ. 2 UA 91589 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб діагностики хромосомних аномалій у ембріона при вагітностях, які були отримані за допомогою допоміжних репродуктивних технологій, який здійснюють шляхом забору трансцервікальних проб та їх ідентифікації, який відрізняється тим, що для ідентифікації трофобластичних клітин проводять імуногістохімічне дослідження, для якого використовують mAbs, що ідентифікує як фетальний ядерно-специфічний маркер, так і моноклональні антитіла (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласта з наступним аналізом в fluorescence in situ hybridisation (FISH) хромосом ембріона. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3