Спосіб діагностики ускладнень і триместра у жінок, вагітність у яких наступила після допоміжних репродуктивних технологій

Реферат: Спосіб діагностики ускладнень І триместра у жінок, вагітність у яких наступила після допоміжних репродуктивних технологій включає дослідження клітин в цервікальному слизу матері шляхом імуногістохімічного дослідження та ідентифікації трофобластичних клітин в цервікальному слизу матері шляхом використання моноклональних антитіл (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласту. Скло кожної пацієнтки додатково обробляють моноклональними антитілами SC-21733, що ідентифікують фетальний ядерноспецифічний маркер, - матричну металопептидазу ММр9, для підрахунку ядер застосовують забарвлення гематоксиліном, HLA-G позитивні клітини і вільні ядра фарбуються у коричневий колір. При виявленні великої кількості забарвлених клітин діагностують благополучний перебіг 1 триместра вагітності. Препарат приготований із слизу жінок з вагітністю, що не розвивається, в 1 триместрі, та з трубною вагітністю в 1 триместрі містить незначну кількість трофобластичних елементів (клітин і ядер). UA 91588 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ УСКЛАДНЕНЬ І ТРИМЕСТРА У ЖІНОК, ВАГІТНІСТЬ У ЯКИХ НАСТУПИЛА ПІСЛЯ ДОПОМІЖНИХ РЕПРОДУКТИВНИХ ТЕХНОЛОГІЙ UA 91588 U UA 91588 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до генетики, і може бути використана для діагностики ускладнень 1 триместра при вагітностях, які були отримані за допомогою допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ). В даний час вагітності, отримані за допомогою ДРТ складають 1 % від всіх вагітностей. Вагітність, отримана за допомогою ДРТ, зв'язана з ризиком ускладнень у зв'язку з тим, що поперше, початково жінки і/або їх подружжя має порушення здоров'я (ендокринні, інфекційнозапальні, спадкові та інші), по-друге, методики ДРТ асоційовані з ризиком ВПР ембріонів і плодів. Існуючі методи діагностики ускладнень в І триместрі засновані на визначенні -субодиниці хоріонічного гонадотропіну (-ХГЧ) і ультразвуковій (УЗ) діагностиці. Проте часто пацієнтки з репродуктивними ускладненнями в анамнезі побоюються частих УЗ-досліджень, небезпідставно пов'язуючи їх з ризиком переривання вагітності, а визначення рівня -ХГЧ у ряді випадків недостатньо інформативно для диференціальної діагностики нормального і ускладненого І триместру. Досліджували альтернативні шляхи діагностики ранніх гестаційних ускладнень - вагітності, що не розвивається і ектопічну. Найбільш близьким та вибраним за прототип є спосіб діагностики хромосомних аномалій у ембріона, при якому здійснюють забір трансцервікальних проб (І), приготування мазків на склі (II), імуногістохімічний (ІГХ) етап (III) для ідентифікації трофобластичних клітин в цервікальному слизу матері використовуються моноклональні антитіла (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласту (Anthony N. Imudia, Yoko Suzuki et all / Retrieval of trophoblast cells from the cervical canal for of abnormal pregnancy: apilot study // Human Reproduction, vol. 24, № 9 pp. 2086-2092, 2009). Методика не дозволяє виявити достатньої кількості плодових елементів, оскільки вільних ядер трофобластичних клітин в цервікальних мазках міститься невелика кількість. Дана методика застосовується для загальної популяції жінок. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу діагностики ускладнень I триместра у жінок, вагітність у яких наступила після ДРТ, в якому за рахунок додаткового використання моноклональних антитіл, досягається визначення частоти трофобластичних клітин в цервікальному слизу матері, за рахунок чого визначають ускладнення 1 триместрі вагітності. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики ускладнень І триместра у жінок, вагітність у яких наступила після допоміжних репродуктивних технологій, який здійснюють шляхом дослідження клітин в цервікальному слизу матері шляхом імуногістохімічного дослідження та ідентифікації трофобластичних клітин в цервікальному слизу матері шляхом використання моноклональних антитіл (mAbs), які розпізнають HLA-G, що експресуються на клітинах ектравілезного трофобласту, згідно з корисною моделлю, скло кожної пацієнтки додатково обробляють моноклональними антитілами SC-21733, що ідентифікують фетальний ядерно-специфічний маркер, - матричну металопептидазу ММр9, для підрахунку ядер застосовують забарвлення гематоксиліном, HLA-G позитивні клітини і вільні ядра фарбуються у коричневий колір, і при виявленні великої кількості забарвлених клітин діагностують благополучний перебіг 1 триместру вагітності, препарат, приготований із слизу жінок з вагітністю, що не розвивається, в 1 триместрі, та з трубною вагітністю в 1 триместрі містить незначну кількість трофобластичних елементів (клітин і ядер). У корисній моделі використовується як mAbs, що розпізнають HLA-G, які експресуються на клітинах ектравілезного трофобластуі, так і моноклональні SC-21733, що ідентифікують фетальний ядерно-специфічний маркер. Ця особливість дозволяє виявити більше плодових елементів, оскільки вільних ядер трофобластичних клітин в цервікальних мазках за даними літератури в 10 разів більше, ніж клітин. Дана методика нами застосована в групі жінок високого ризику по невиношуванню вагітності і вродженим вадам розвитку - у жінок, вагітність у яких наступила після ДРТ. На Фіг. 1-4 зображені ілюстрації наведених прикладів. Спосіб, що заявляється, здійснюють таким чином. Обстеження включає чотири етапи: забір трансцервікальних проб (І), приготування мазків на склі (II), імуногістохімічний (ІГХ) етап (III), підрахунок трансцервікальних трофобластичних клітин (IV). На І етапі після отримання інформованої згоди пацієнток проводять забір матеріалу цервікального слизу, з якого готують препарати-слайди. Забір слизу проводять ендоцервікальною щіточкою, що вводиться на глибину 2 см шляхом її обертання на 360°, 1 UA 91588 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 уникаючи контакту із стінками цервікального каналу для запобігання материнській контамінації і кровотечі. Зібраний слиз занурюють в 2-3 мл середовища М-199 з додаванням антибіотика. Матеріал надають в лабораторію протягом 6 годин з моменту отримання матеріалу. На II етапі для очищення від слизу зразки обробляють 3 % 600 1 оцтової кислоти, після 10 хвилин інкубації, клітини відмивають 3 рази шляхом центрифугування при 190 g і ресуспендують у фосфатно-буферному розчині. Для ІГХ 1 мл рідини розміщують в цитоцентрифузі Shandon Cytospin 3 (Thermo Shandon Inc., США). Для кожної пацієнтки готують 3 препарати на склі, які потім висушують і до проведення ІГХ зберігають в 95 % етиловому спирті. При такій методиці приготування мазків на препараті діаметром 1 см було від 15000-50000 клітин. Третій етап включає проведення ІГХ. В ході ІГХ скло кожної пацієнтки обробляють 2 видами моноклональних антитіл (mAbs): MCA2043 (Serotec, США), що розпізнають HLA-G, які експресуються на клітинах ектравілезного трофобласту, в розведенні 1:150; SC-21733, що ідентифікують фетальний ядерно-специфічний маркер, - матричну металопептидазу ММр9 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, США). Комплекс трофобластспецифічний маркер-антитіла визначають з використанням ABC Staining System (sc-2017, Santa Cruz, США). HLA-G позитивні клітини і вільні ядра забарвлюються в коричневий колір, надалі ми умовно їх об'єднали однією назвою - трансцервікальні трофобластичні клітини (ТТК). Для підрахунку ядер застосовують забарвлення гематоксиліном. Всі ТТК на кожному препараті підраховують при збільшенні 200х з використанням мікроскопа Nikon Eclipse 80i (Японія), зображення фіксують цифровою камерою (CCD-1300QB, VDS, Німеччина) (IV етап). Загальну кількість клітин підраховують при збільшенні 400х у трьох полях зору, в середньому кожне поле зору містить близько 35 клітин. Далі розраховують частоту ТТК, що зустрічається, шляхом ділення кількості HLA-G-позитивних клітин на загальну кількість клітин. Було обстежено 86 жінок у віці 24-37 років в термінах гестації 5-6 тижнів. З них у 56 була нормальна, у 12 - що не розвивається, у 18 - трубна вагітності. Як контрольна група нами обстежено 21 невагітну жінку з числа пацієнток з первинним безпліддям. Результат: Найбільша кількість ТТК зустрічається у жінок з благополучним перебігом 1 триместра вагітності. У невагітних жінок, що мають первинне безпліддя в анамнезі ТТК не виявлені ні в жодному випадку. Трофобластичні клітини виявлені у 52 (92,9 %) з нормальною, у 9 (75,0 %) з вагітністю, що не розвивається, у 10 (55,6 %) з трубною вагітністю. Частота ТТК, що зустрічається в категоріях жінок, що вивчаються, була наступною: серед -5 -5 пацієнток з нормальною гестацією - 36,5×10 ; при з вагітності, що не розвивається, 9,2×10 ; при -5 трубній вагітності 7,2×10 . Частота ТТК (HLA-G позитивних клітин і вільних ядер) при прогресуючій матковій вагітності склала близько 1 на 3000 клітин, і це було в 4 рази частіше, ніж середня кількість ТТК при матковій вагітності, що не розвивається і в 5 разів частіше, ніж при трубній вагітності (Р