Спосіб підвищення резистентності клітин до заморожування-відігріву

Спосіб підвищення резистентності клітин до заморожування-відігріву шляхом додавання до суспензії клітин перед заморожуванням біологічно активного засобу, який відрізняється тим, що як такий засіб використовують екстракт плаценти людини або великої рогатої худоби в концентрації 20-40 % за об'ємом. (19) (21) a200904395 (22) 05.05.2009 (24) 25.11.2010 (46) 25.11.2010, Бюл.№ 22, 2010 р. (72) ВИСЕКАНЦЕВ ІГОР ПАВЛОВИЧ, НАРДІД ОЛЕГ АНАТОЛІЙОВИЧ, КУДОКОЦЕВА ОЛЕНА ВАЛЕНТИНІВНА, КОЩІЙ СВІТЛАНА ВОЛОДИМИРІВНА, РОЗАНОВА СВІТЛАНА ЛЕОНІДІВНА, АБРАФІКОВА ЛІЛІЯ ГЕННАДІЇВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Залюбовская Н. П., Киселев Р. И. Консервирование микробов рода Neisseria методом глубин 3 щі, яке містить кінську сироватку крові в концентраціях 60 %. А саме така концентрація, згідно з прототипом, підвищує ефект резистентності клітин до заморожування - відігріву. Крім того, в сироватці крові можуть знаходитися збудники антропозоонозних інфекційних хвороб [12]. В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб підвищення резистентності клітин до заморожування - відігріву, в якому би, шляхом використання біологічно активного засобу іншого походження, забезпечувалась можливість підвищення резистентності клітин до заморожуваннявідігріву і зниження ризику інфікування біоматеріалу мікроорганізмами. Ця задача вирішується тим, що в способі підвищення резистентності клітин до заморожування - відігріву шляхом додавання до суспензії клітин перед заморожуванням біологічно активного засобу, згідно з винаходом, як такий засіб використовують екстракт плаценти людини або великої рогатої худоби в концентрації 20-40 % за об'ємом. Використання екстракту плаценти дозволяє підвищити резистентність клітин різного походження до заморожування-відігріву на 30-80 %. Препарати екстракту плаценти при виготовленні стерилізують шляхом автоклавування, тому він не містить високомолекулярних білківалергенів та збудників інфекційних хвороб [14]. Все це дозволяє використовувати клітини, заморожені з екстрактом плаценти, в медичній практиці (клітинна трансфузіологія, репродуктивні технології, гематологія та ін.). Спосіб здійснюють таким чином. До суспензії клітин додають екстракт плаценти людини або великої рогатої худоби до кінцевої концентрації 20-40 % за об'ємом. Клітинну суспензію з екстрактом плаценти витримують при кімнатній температурі протягом 10-20 хв., після чого заморожують за програмами, розробленими для даного виду біологічних об'єктів. Відігрівають зразки в водяній бані при 37-40 °С. Спосіб пояснюється прикладами. Приклад 1 Проводили порівняльне вивчення ефективності різних кріозахисних середовищ. Клітини дріжджів Saccharomyces cerevisiae, вирощені на скошеному сусло-агарі, змивали з поверхні агару середовищами для кріоконсервування: 60 % розчин кінської сироватки крові на фізіологічному розчині, у 60 % розчин сироватки крові людини на фізіологічному розчині, 20 % та 40 % розчини екстракту плаценти людини і великої рогатої худоби на фізіологічному розчині. Після витримування при кімнатній температурі протягом 10 хв. клітинні суспензії переносили в кріопробірки і заморожували до -196 °С за двома програмами: - програма №1: охолодження до -70 °С зі швидкістю 2 °С/хв., потім занурення у рідкий азот; - програма №2: охолодження шляхом занурення кріопробірок у рідкий азот. Відігрівали зразки в водяній бані при 37 °С. Резистентність клітин до заморожуваннявідігріву оцінювали по їх життєздатності «чашковим методом» Коха [14] за кількістю макроколоній, які сформувалися на сусло-агарі. 92678 4 Після заморожування-відігріву клітин дріжджів відсоток життєздатних клітин у всіх варіантах експерименту був достовірно вище в зразках, заморожених у 20-40 % розчинах екстракту плаценти людини і великої рогатої худоби, в порівнянні зі зразками, які заморожували в 60% розчинах сироватки крові. Кількість життєздатних клітин, заморожених в екстрактах плаценти людини і великої рогатої худоби, достовірно не відрізнялась (Табл. 1). Приклад 2 Проводили порівняльне вивчення ефективності різних кріозахисних середовищ на клітинах фібробластів людини, одержаних за стандартним методом із шкіри людини, заморожених до -196 °С у 60 % розчині кінської сироватки на живильному середовищі 199, у 60 % розчині сироватки крові людини на живильному середовищі 199, у 40 % екстракті плаценти людини на живильному середовищі 199, у 40 % екстракті плаценти великої рогатої худоби на живильному середовищі 199. До суспензії фібробластів людини на живильному середовищі 199 додавали, відповідно, 60 % за об'ємом кінської сироватки, або 60 % за об'ємом сироватки крові людини, або 40 % екстракту плаценти людини, або 40 % екстракту плаценти великої рогатої худоби. Через 15 хв. отримані суспензії клітин вносили в кріопробірки. Зразки заморожували до -196 °С за таким режимом: охолодження зі швидкістю 1-3 °С/хв. до -40 °С, потім занурення кріопробірок в рідкий азот. Після зберігання зразків при -196 °С протягом місяця їх відігрівали в водяній бані при температурі 40 °С. Резистентність клітин до заморожування-відігріву оцінювали по їх збереженості стандартним методом суправітального фарбування пошкоджених клітин фарбником трипановим синім. Кількість збережених клітин фібробластів, заморожених в екстрактах плаценти людини і великої рогатої худоби, достовірно вища, ніж кількість збережених клітин, заморожених в 60 % розчинах кінської сироватки і сироватки крові людини. Кількість збережених клітин, заморожених в екстрактах плаценти людини і великої рогатої худоби, достовірно, не відрізнялась (Табл. 2). Приклад 3 Проводили вивчення резистентності клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae і клітин фібробластів людини до заморожування-відігріву у розчинах екстракту плаценти людини різної концентрації (від 5 до 40 %). Клітини дріжджів Saccharomyces cerevisiae суспендували у 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 % розчинах екстракту плаценти людини на фізіологічному розчині. Через 20 хв. суспензії клітин дріжджів вносили в кріопробірки і заморожували до -70 °С зі швидкістю 2 °С/хв., потім занурювали у рідкий азот; Клітини фібробластів людини суспендували у 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 % розчинах екстракту плаценти людини на живильному середовищі 199. Через 20 хв. суспензії клітин фібробластів вносили в кріопробірки і заморожували до -196 °С шляхом занурення у рідкий азот. Через 10 діб зра 5 зки відігрівали в водяній бані при температурі 40 °С. Резистентність клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae до заморожування-відігріву оцінювали по їх життєздатності «чашковим методом» Коха за кількістю макроколоній, які сформувалися на сусло-агарі. Резистентність клітин фібробластів людини до заморожування-відігріву оцінювали по їх збереженості стандартним методом суправітального фарбування пошкоджених клітин фарбником трипановим синім. Зразки, які заморожували у 5-15 % розчинах екстрактів плаценти, містили достовірно меншу кількість життєздатних клітин дріжджів та збережених клітин фібробластів у порівнянні з 20-40 % розчинами. Починаючи з концентрації 20 % життєздатність і збереженість клітин, відповідно, дріжджів і фібробластів, не змінювалась (Табл. 3). Приклад 4 Проводили порівняльне вивчення резистентності клітин, що перевиваються, лінії СПЕВ (ембріональна нирка свині) до заморожування-відігріву в живильному середовищі 199 з додаванням 60 % за об'ємом кінської сироватки або 60 % за об'ємом 92678 6 сироватки крові людини та в живильному середовищі 199 з додаванням 20 % за об'ємом екстракту плаценти людини або екстракту плаценти великої рогатої худоби. Перед заморожуванням культуру клітин знімали з поверхні культурального матрацу за допомогою суміші трипсину з розчином Версена. Клітини осаджували центрифугуванням і ресуспендували у відповідних середовищах для кріоконсервування. Зразки охолоджували зі швидкістю 1°С/хв. до -40 °С з подальшим занурюванням у рідкий азот. Після зберігання зразків при -196 °С протягом місяця їх відігрівали в водяній бані при температурі 40 °С. Резистентність клітин до заморожування-відігріву оцінювали по їх збереженості стандартним методом суправітального фарбування пошкоджених клітин фарбником трипановим синім. Збереженість клітин лінії СПЕВ, заморожених в 20 % розчинах екстракту плаценти людини або великої рогатої худоби, достовірно вища від збереженості клітин, заморожених в середовищі 199 з додаванням 60 % за об'ємом кінської сироватки або 60 % за об'ємом сироватки крові людини (Табл. 4). Таблиця 1 Резистентність клітин Saccharomyces cerevisiae до заморожування-відігріву в залежності від середовища заморожування, n=18. Програма охолоджен- Кількість життєздатних клітин в Р1 Р2 Р3 8 ня 1 мл x Sx 10 Контроль до заморо5,05±0,3 60 % розчин кінської сироватки на жування фізіологічному розчині Програма №1 3,0±052