Спосіб кріоконсервування перевитих клітин нирки ембріона свині

Спосіб кріоконсервування перевитих клітин нирки ембріона свині, який включає культивування клітин в живильному середовищі, що містить се 3 консервування клітин СПЕВ, який включає культивування клітин в живильному середовищі, що містить середовище 199 і 10 % сироватки ВРХ, і заморожування в кріозахисному середовищі, що містить середовище 199 і кріопротектор ДМСО, до -70 °С з послідуючим зануренням у рідкий азот, згідно з корисною моделлю, при культивуванні концентрацію сироватки в живильному середовищі знижують послідовно після ряду пасажів від 10 % до 5, 2.5, 1.0 і 0.5 %, при цьому, починаючи з концентрації 2.5 %, при кожному пересіві в живильне середовище додають по 0.1 % метилцелюлози (МЦ), в кріозахисне середовище також додають 0.1 % МЦ, а ДМСО використовують в концентрації 5 %. МЦ в концентраціі 0.1 % широко застосовується у фармацевтичній практиці і в біотехнології [4, 5]. Використання 0.1 % МЦ в середовищі культивування сприяє прискоренню росту клітин, дозволяє адаптувати клітини СПЕВ до культивування на живильному середовищі 199 при зниженні вмісту сироватки до 0.5 %. Адаптовані клітини далі можна заморожувати у безсироваточному середовищі і зберігати в умовах низькотемпературного банку як інокулят з високим рівнем життєздатних клітин. Введення 0.1 % МЦ в середовище консервування дозволяє також знизити концентрацію ДМСО до 5 %. Заморожування клітин без сироватки забезпечує можливість одержання стабільних показників збереженості клітин після відігріву і їх ростового потенціалу, а також зменшує небезпеку контамінації культури клітин. Спосіб здійснюють таким чином. Попередньо готують стерильний 2 % розчин МЦ і зберігають його в холодильнику при 4 °С . Клітини СПЕВ культивують в середовищі 199 з 10 % сироватки ВРХ, послідовно знижуючи її концентрацію через декілька пасажів до 5.0, 2.5, 1.0 і 0.5 %. Починаючи з 2.5 %, в живильне середовище додають 0.1 % МЦ. Після формування клітинами повноцінного щільного моношару клітини пересівають. Сформований дводобовий моношар клітин знімають зі скла відкріплюючим розчином, ресуспендують в середовищі 199 і до отриманої суспензії клітин поступово додають у співвідношенні 1:1 кріоконсервуюче середовище, що містить середовище 199, 10 % ДМСО і 0.2 % МЦ. Суспензію клітин в кріоконсервуючому середовищі по 1 мл вміщують в ампули і після 15 хв. еквілібрації заморожують по оптимальній для клітин програмі: охолоджують до -70 °С зі швидкістю 1 °С/хв, після чого швидко занурюють у рідкий азот і зберігають при температурі рідкого азоту. Приклад Попередньо готували стерильний 2 % розчин МЦ: точне навішення сухої МЦ стерилізували в автоклаві, асептично розчиняли в живильному середовищі 199, перемішували, залишали на добу при кімнатній температурі, потім зразки залишали в холодильнику при 4 °С до повного розчинення. Клітини СПЕВ культивували в середовищі 199 з 10 % ембріональної сироватки великої рогатої худоби (ЕС), послідовно знижуючи концентрацію сироватки у 2 рази через декілька пасажів: 5, 2.5, 43203 4 1.0, 0.5 %. Починаючи з концентрації 2.5 %, при кожному пересіві в живильне середовище додавали по 0.1 % МЦ. В Табл. 1 наведені результати вивчення впливу складу живильного середовища на проліферацію клітин, з яких видно, що під час культивування клітин на середовищі 199 з низьким вмістом EC, починаючи з 2.5 %, без введення МЦ припинялось формування моношару клітин, що супроводжувалось його деструктивними змінами. Додавання ж МЦ при вирощуванні клітин стимулювало їх зростання і забезпечувало збереженість повноцінного моношару протягом 3-х діб для подальшого культивування. Адаптування клітин протягом 4-х місяців на цих середовищах сприяло збереженню їх проліферативної активності. Клітини формували щільний моношар через 48-72 годин при посіві 0.8-1.2 105 кл/мл, який зберігався без змін протягом 3-х діб. Після формування дводобового повноцінного моношару клітин, адаптованих до зростання з 0.5 % ЕС, їх знімали зі скла відкріплюючим розчином 0.02 % версену. Суспензію клітин центрифугували 5 хв. при 1000 об/хв., ресуспендували живильним середовищем 199 з 0.1 % МЦ, доводячи тільність клітин до 1 107 кл/мл. До отриманої суспензіїї поступово у співвідношенні 1:1 додавали кріозахисне середовище, що містило середовище 199, 10 % ДМСО і 0.2 % МЦ і помішували по 1 мл в ампули "Nunc". Після 15 хв. інкубації зразки охолоджували до -70 °С зі швидкістю 1 °С/хв., після чого швидко занурювали у рідкий азот. Зберігали у рідкому азоті протягом місяця. Потім кріоконсервовану культуру клітин відігрівали в водяній бані при +37 °С і переносили із ампул в культуральний флакон об'ємом 0.2 л з 10 млживильного середовища 199, що містило 0.5 % ЕС, 0.1 % МЦ і 100 ОД/мл канаміцину. Культивування проводили при 37 °С, здійснюючи через добу заміну живильного середовища для усунення кріопротектора. Збереженість клітин оцінювали за фарбуванням 0.4 % розчином суправітального барвника трипанового синього, а також за характером і динамікою утворення моношару. Контролем були клітини, що не піддавали заморожуванню. Кількість життєздатних клітин після розморожування становила 90-94 %. Після терміну культивування протягом 4-х діб клітини формували моношар на 100 % поверхні культурального флакону (Таблиця 2). Клітини мали властивий їм полігональний вигляд з добре означеними межами, в цитоплазмі були відсутні характерні ознаки цитопатології їх росту. Адаптована лінія клітин СПЕВ добре відновлювалась, не знижувала потенції до росту і добре пересівалась. Повне відновлення швидкості формування суцільного моношару відмічалось на 3-му пасажі. Для порівняння клітини СПЕВ кріоконсервували заявленим способом без сироватки і за прототипом. Результати збереженості клітин після заморожування-відігріву наведені в Таблиці 2. Після відігріву кількість життєздатних клітин становила 74-80 %, а після культивування протягом 4-х діб моношар відновлювався клітинами на 90 % поверхні культурального флакону. Повне відновлення швидкості формування суцільного моношару від 5 43203 мічалось на 3-му пасажі. Таким чином, з приведених в Таблиці 2 даних видно, що збереженість клітин після заморожу 6 вання за заявленим способом не нижче ніж у прототипі. Таблиця 1 Влив складу живильного середовища на проліферацію клітин СПЕВ (п=3) Додаток до середовища 199 Динаміка формування моношару за добу, % 2 3 4 5 95 100 100 100 Щільність популяції, кл/см2 10 % ЕС 1 45 5 % ЕС 40 85 100 100 100 2,2 × 105 2.5 % ЕС 30 85 95 95 80 1.25 % ЕС 20 10 2.5 % ЕС+0.1 % МЦ 40 75 Окремі прикріплені клітини 100 1,2 × 105 100 100 2,4 × 105 1.25 % ЕС+0.1 % МЦ 30-35 75-80 95-98 100 100 2,0 × 105 2,5 × 105 Таблиця 2 Збереженість клітин СПЕВ після заморожування - відігріву (п=6) Вміст середовища культивування Вміст середовища крікон- Життєздатність клітин після Формування моношасервування відігріву, % ру клітинами, % 4 доба 5 доба Середовище 199+10 % 10 % ДМСО+10 % ЕС 98.0±1.0 (контроль до заморожування) EC 76.4±2.5 90 100 Середовище 199+ 0.5 % 5 % ДМСО + 0.1 % МЦ 98.0±1.2 (контроль до заЕС+0.1 % МЦ морожування) 92.2±2.3 100 100 Джерела інформації 1. Криоконсервирование клеточных суспензий. Сб. научных трудов / Под общ. ред. А. А. Цуцаевой. - К.: Наук, думка, 1983. - С. 175-181. 2. Л. П. Дьяконов, В. Ф. Глухов и др. Культура клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие. 1980. - С. 34-86. 3. Р. Адаме. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983. - С. 98-99. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 4. М. Т. Алюшин, А. И. Артемьев, Ю. Г. Тракман. Синтетические полимеры в отечественной фармацевтической практике. - М.: Медицина, 1974. - С. 7-9. 4. Д. Б. Голубев, А. А. Соломин, М. Н. Медведева. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - М.Медицина, 1976. - С. 79-82. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601