Спосіб кріоконсервування суспензії клітин плаценти

Спосіб кріоконсервування суспензії клітин плаценти, що включає поєднування її з 3 31175 розчині з програмним заморожуванням до 0°С скорочується тривалість токсичної дії кріопротектора на клітини, а також тим, що поступове нашаровування суспензії плаценти на кріоконсервуючий розчин, замість перемішування, скорочує час осідання клітин на дно кріоампули і сприяє більш рівномірному їх розподілу у кріоконсервуючому розчині. Спосіб пояснюється прикладами. Приклад 1 Виділену за стерильних умов плаценту тричі відмивали від слизу та крові фізіологічним розчином, після чого готували суспензію клітин плаценти методом механічної дисоціації у гомогенізаторі Понтера у співвідношенні плаценти і фізіологічного розчину 1:2 до отримання гомогенної маси. Одержану суспензію пропускали через капроновий фільтр та голки діаметру, що зменшується. Кількість клітин у суспензії підраховували у камері Горяєва. Для визначення морфологічного складу клітин плаценти робили мазки, фіксували їх метанолом та фарбували за методом Романовського [3]. Як кріоконсервуючий розчин використовували "Пропандіосахароль", що містив 370,0мл кріопротектора пропіленгліколь, 32,0мл сахарози безводної, 6,0мл хлориду натрію і води бідистильованої до 1000мл. Консервуючий розчин розливали у кріоампули (фірма "Nunk") об'ємом 1,8мл. Суспензію клітин плаценти поступово нашаровували на кріоконсервуючий розчин у співвідношенні 1:1, відразу ж поміщували у програмний заморожувач і о холоджували до 0°С. При цьому швидкість охолодження підбирали таким чином, щоб час проходження цього температурного інтервалу співпадав з рекомендованим терміном еквілібрації клітин із кріоконсервуючим розчином. Далі зразки заморожували зі швидкістю 1 град/хв. до температури -40°С, після чого занурювали у рідкий азот. Відігрівання здійснювали у водяній бані при температурі 42°С протягом 45-50с при постійному перемішуванні до повного зникнення кристалів льоду. Схоронність клітин суспензії плаценти після кріоконсервування, яку оцінювали загальноприйнятим експрес-методом за допомогою 0,2% водного розчину трипанового синього, складала 94±2,8%. Приклад 2 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що перед зануренням у рідкий азот зразки охолоджували до різної кінцевої температури: -20°С, -40°С, -60°С. Схоронність суспензії клітин плаценти після відігріву складала 90±2,3%, 94±2,8%, 94±3,0%, відповідно. Із наведених даних видно, що при заморожуванні до -20°С відмічалась найнижча схоронність. Зниження кінцевої температури охолодження до 60°С не впливає на збереженість клітин суспензії плаценти, але вимагає додаткового часу на охолодження та збільшує витрати рідкого азоту, тому оптимальною кінцевою температурою охолодження перед зануренням у рідкий азот є 40°С. Приклад 3 4 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що умови еквілібрації з кріоконсервуючим розчином були різними: в першому випадку еквілібрацію клітин суспензії плаценти з кріоконсервуючим розчином проводили протягом 20хв при кімнатній температурі, а в другому - процедуру еквілібрації суміщали з охолодженням зразків у програмному заморожувачі до температури 0°С. Схоронність клітин суспензії плаценти була 86,0± 2,27% і 91,0± 2,31%, відповідно. Приклад4 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що поєднування кріоконсервуючого розчину з суспензією клітин плаценти здійснювали різними способами. У першому випадку суспензію плаценти перемішували з розчином кріопротектора у співвідношенні 1:1, а другому клітини суспензії плаценти замість перемішування поступово нашаровували на кріоконсервуючий розчин у співвідношенні 1:1. Схоронність суспензії клітин плаценти після заморожування та відігріву, в залежності від способу поєднування суспензії клітин плаценти з кріоконсервуючим розчином, була 91,0±2,31% і 94,0±2,8%, відповідно. Джерела інформації: 1. Грищенко B.I., Юрченко Т.М., Прокопюк О.С., Строна B.I., Козлова В.П., Прокопюк В.Ю. Спосіб консервування тканин фетоплацентарного комплексу. Патент України №30808А, А01N1/02, 15.12.2000. 2. Грищенко B.I., Морозова Т.Ф., Воротилі О.М. та ін. Приготування та зберігання кріоконсервованої суспензії плаценти для клінічного використання // Метод, рекомендації. Харків. - 1997. - С.9. 3. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая П.Н. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. - М: Медицина, 1987. - С.112.