Штам бактерій leptospira interrogans hardjoprajtno серогрупа sejroe, серовар hardjo для виготовлення інактивованої вакцини проти лептоспірозу тварин та діагностикумів

Реферат: Штам бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno ceporpyna Sejroe, серовар hardjo, задепонований в Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів за номером 356 для виготовлення інактивованої вакцини проти лептоспірозу тварин та діагностикумів. UA 93374 U (12) UA 93374 U UA 93374 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології і може бути використана для виготовлення діагностикумів та вакцин проти лептоспірозу тварин, що є досить поширеним на тваринницьких фермах і завдає значних економічних збитків. Серед штамів, що паразитують у великої рогатої худоби, найбільше значення на території України мають L. Sejroe (серовар polonica) та L. Hebdomadis (серовар kabura), дещо менша роль відводиться L. Icterohaemorrhagiae, L. Grippotyphosa, L. Tarassovi, L. Pomona та L. Canicola [1]. У країнах західної Європи та США ці штами також викликають захворювання, проте основним збудником лептоспірозу вважається L. Interrogans серовар hardjo, серогрупа Sejroe [2]. У тварин, інфікованих сероваром hardjo, клінічні ознаки зазвичай мають неспецифічний характер і розвиваються у результаті ураження статевої системи тварини. Часто інфекція має прихований перебіг. Захворювання завжди супроводжується тривалим персистуванням збудника у нирках та його виділенням у навколишнє середовище із сечею. Відбувається зниження репродуктивних властивостей та молочної продуктивності тварин. У вагітних корів спостерігаються аборти із 4-го (у більшості випадків 7-го) місяця вагітності, мертвонародження, муміфікація плода, народження слабких, нежиттєздатних телят, характерним є синдром зниження молочної продуктивності, подовження сервіс-періоду у корів, затримання плодових оболонок, безпліддя. Для інфікованих сероваром hardjo корів є характерними спорадичні аборти, тоді як при зараженні іншими штамами (L. Pomona, L. Grippotyphosa) спостерігається синдром "абортів бурі" (масових абортів), що виникають на 2-3,4-6, 7-9 місяцях тільності (за даними різних авторів) [1,3]. Основним ефективним методом боротьби з лептоспірозом є вакцинація тварин. Штами збудника лептоспірозу, що пропонуються для виробництва вакцин повинні мати виражені антигенні та стабільні морфологічні, культурально-біохімічні властивості, бути високо імуногенними. Аналогами корисної моделі є виробничі штами Leptospira interrogans ВГНКІ-1 серогрупа Grippotyphosa, Leptospira interrogans ВГНКІ- 2 серогрупа Icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans ВГНКІ-3 серогрупа Canicola, Leptospira interrogans ВГНКІ-4 серогрупа Tarassovi (Авторське свідоцтво № 55664, 26.01.83; Авторське свідоцтво № 828459, 30.01.83), Leptospira interrogans PSR-1 серогрупа Pomona (RU 2 030 915 Cl, 20.03.1995), Leptospira interrogans bratislava серогрупа Australis (Авторське свідоцтво №22917, 25.04.2007) Leptospira interrogans "Рябухин" серогрупи Icterohaemorrhagiae cepoeap copenhageni (RU 2 005 779 Cl, 15.01.1994), на основі яких виготовляють інактивовану полівалентну вакцину проти лептоспірозу. Найближчим аналогом корисної моделі є виробничий штам Leptospira interrogans Yez bratislava серогрупа Australis, серовар bratislava, який використовується для виробництва інактивованної вакцини проти лептоспірозу тварин (Авторське свідоцтво №22917, 25.04.2007) [4]. Використання штаму бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo в біологічній промисловості України неможливе за його відсутністю. Для розробки засобів профілактики та діагностики лептоспірозу необхідно мати вітчизняні високо імуногенні штами. В основу корисної моделі, що представлена, поставлено задачу отримати штам бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo, що має підвищену імуногенну активність, має стабільні морфологічні та культурально-біохімічні властивості, високу потенцію росту, яка сприяє отриманню великої кількості біомаси для виготовлення вакцин та діагностикумів проти лептоспірозу. Штам бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo отриманий з Королівського тропічного інституту (м. Амстердам) в 1997 році, який клоновано та селекціоновано в лабораторії лептоспірозу сільськогосподарських тварин з музеєм штамів мікроорганізмів Інституту ветеринарної медицини НААН. Штам бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo задепонований в колекції мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів 28.11.2005 року і має реєстраційний номер 356. Морфологічні властивості. Суворий аероб. Оптимальна температура для культивування 2830 °C. Грамнегативні спірохети. У темному полі мікроскопа мають вигляд матових тонких рухомих ниточок. Погано фарбуються аніліновими барвниками. Концентрація водневих іонів середовищ для культивування 7,2-7,4 [5]. Патогенні властивості. Патогенний для людини та тварин. Антигенні властивості вивчали в досліді на кроликах. Для цього прямій імунізації антигеном, з накопиченням 80-100 лептоспір у полі зору мікроскопа, одноразово піддали дорослих кролів 3 вагою 3-3,5 кг внутрішньовенно по 0,75 см . Для проведення роботи був використаний вакцинний штам бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo 1 UA 93374 U відповідно 7-10 добового віку. На 7, 14, 25 добу після введення у кролів відбирали кров з метою дослідження сироваток в РМА та наростання титрів антитіл. При цьому порівнювали титр антитіл кролів, яким вводили культуру штаму. Результати досліду наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Титри антитіл в сироватках крові кролів імунізованих дослідними антигенами, М ± m, n=5 Найменування штамів Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo Титри антитіл в сироватках крові кролів на день після вакцинації: 7 14 25 1:79,7±6,4 1:351,4±18,5 1:590±27,3 5 10 15 20 25 30 35 40 Різниця між титрами досліджуваних сероваріантів на початку та наприкінці досліду була значною з високим ступенем достовірності (Р < 0,005). Генетичні особливості штаму. Стійкий до дії фурациліну, фурагіну, 5-фторурацилу. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму. Для культивування використовуються живильні середовища Терських, Кортгофа та дві його модифікації (рН живильних середовищ 7,2-7,4) з вмістом 10 % сироватки крові овець або 7-10 % сироватки крові кролів. Середовище Терських та Кортгофа готуються в лабораторних умовах за загальноприйнятою методикою, а модифіковані середовища Кортгофа згідно розроблених та затверджених нормативних документів. Сироватка крові овець попередньо інактивується 2 години при температурі 56 С, а сироватка крові кролів - 30 хв. при температурі 56 С. Адаптація штаму до середовищ з вмістом сироватки крові овець взамін середовища з вмістом сироватки крові кролів проводиться, згідно з розробленими способами адаптації. Також використовується середовище EMJH (рН 7,6-7,8). Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового зберігання штаму. Зберігається в умовах культивування шляхом періодичних пересівів на живильні середовища з вмістом сироватки крові овець чи кролів. Періодичність пересівів 10-14 днів. Вірулентність. Вивчення вірулентності штаму проводили по загальноприйнятій методиці на морських свинках, кроленятах-сисунах і золотистих ховрашках. Визначена LD50 для золотистих 4 ховрашків складає 2 × 10 мікробних тіл. Клінічне виявлення інфекції у експериментальних тварин характеризується жовтяницею видимих слизових оболонок, тремтінням скелетних м'язів, пригніченим станом, відмовою від поїдання корму, гемоглобінурією. Імуногенність. Штаму властива виражена імуногенна активність. Інактивований 0,25 % водним фенолом або 0,25 % водним розчином формальдегіду, він захищає від загибелі і розвитку інфекції 100 % ховрашків, заражених Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo в дозі, в декілька разів перевищуючи летальну, при 100 % загибелі не вакцинованих контрольних тварин. Зі штаму Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo отримана вакцина, яка була випробувана в експерименті на тваринах. Приклад 1. У 7-10-денну лептоспірозну культуру (не менше 70-90 лептоспір в полі зору мікроскопа), інактивовану 0,25 %-им водним розчином фенолу в кінцевій концентрації, додавали 70 %-ий водний розчин ПЕГ до кінцевої концентрації його 10 %. Через 3 доби надосадову рідину зливали, концентруючи антиген в два рази. Готові зразки дослідних вакцин підлягали перевірці на нешкідливість, токсичність, стерильність, імуногенність. Готовий вакцинний препарат вводили кролям (3-3,5 кг) в латеральну вену вуха в дозі 3 0,75см . В нижченаведених таблицях наведена міра імунологічної відповіді піддослідних тварин на 25 добу після застосування вакцини, що виражена в титрах антитіл. 45 2 UA 93374 U Таблиця 2 Титри антитіл кролів у відповідь на застосування вакцини зі штаму бактерій Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo на 25 добу після застосування, М±m, n=9. Назва штаму Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo (штам з яким не проводились роботи по підвищенню імуногенної активності) Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo (клонований та селекціонований в лабораторії лептоспірозу сільськогосподарських тварин з музеєм штамів мікроорганізмів IBM HAAH) 5 10 15 20 25 30 Титри антитіл кролів 1:113±17 1:365±87 Якщо проаналізувати дані таблиці, то можна зробити висновок, що вакцина, до складу якої входить антиген штаму Leptospira interrogans Hardjoprajtno серогрупа Sejroe, серовар hardjo (клонований та селекціонований в лабораторії лептоспірозу сільськогосподарських тварин з музеєм штамів мікроорганізмів IBM HAAH), що пройшов цикл підвищення антигенної та імуногенної активності, виявився у 3,23 рази більш імуногенним з високим ступенем достовірності (Р