Пептид, що стимулює регенерацію нейронів центральної нервової системи, фармацевтична композиція на його основі і спосіб її застосування

1. Пептид глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули H-Glu-Asp-Arg-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1]. 2. Пептид глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули H-Glu-Asp-Arg-OH послідовності 1 [SEQ IDNO:1], що має здатність стимулювати регенера C2 2 (19) 1 3 ність, що проявляється в стимулюванні регенерації нейронів і фармацевтичної композиції, що містить цей пептид як активне начало, а також способу її застосування. Технічний результат винаходу полягає в створенні нового пептиду, що стимулює регенерацію нейронів, а також фармацевтичної композиції, що містить цей новий пептид як активне начало, використання якого стимулює регенерацію нейронів за рахунок відновлення синтезу тканиноспецифічних білків, антиоксидантної дії, нормалізації метаболізму і біоелектричної активності нейронів. Даний винахід стосується пептиду глутаміласпартил-аргінін загальної формули: H-Glu-AspArg-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1]. Пептид глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули: H-Glu-Asp-Arg-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1] має здатність стимулювати регенерацію нейронів. Інший аспект даного винаходу стосується фармацевтичної композиції, що стимулює регенерацію нейронів, що містить як активне начало ефективну кількість пептиду глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули: H-Glu-Asp-Arg-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1] і фармацевтично прийнятний носій. При цьому фармацевтична композиція знаходиться у формі, що підходить для парентерального введення. Наступний аспект даного винаходу стосується способу стимулювання регенерації нейронів, що полягає у введенні пацієнту фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули: H-GIuAsp-Arg-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1] у дозі 0,01-100мкг/кг маси тіла, принаймні, один раз на день протягом періоду, необхідного для досягнення терапевтичного ефекту. При цьому введення здійснюють парентерально. Пептид глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули: H-Glu-Asp-Arg-OH одержують класичним методом пептидного синтезу в розчині. Можливість об'єктивного прояву технічного результату при використанні винаходу підтверджена достовірними даними, наведеними в прикладах, що містить відомості експериментального характеру, отримані в процесі проведення досліджень по методиках, прийнятих у даній галузі. Стимулююча дія пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH на регенерацію і інтегративні функції нейронів виявлена при його експериментальному вивченні. Вивчення біологічної активності пептиду проводили на експлантатах кори головного мозку, в експериментальних моделях травматичного ушкодження головного і спинного мозку, гіпоксії й у хворих з віддаленими наслідками черепно-мозкової травми. Поняття «фармацевтична композиція», має на увазі різні лікарські форми, що містять пептид HGlu-Asp-Arg-OH, що можуть знайти лікувальне застосування в медицині як засіб, що стимулює регенерацію нейронів. Для одержання фармацевтичних композицій, що відповідають винаходу, ефективну кількість пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH, як активне начало, 91136 4 змішують з фармацевтично прийнятним носієм згідно з прийнятими у фармацевтиці способами компаундування. Поняття "ефективна кількість", має на увазі використання такої кількості активної речовини, що відповідно до її кількісних показників активності і токсичності, а також на підставі знань фахівця повинна бути ефективною у даній лікарській формі. Носій може мати різні форми, що залежать від лікарської форми препарату, бажаної для введення в організм. Для парентерального введення носій звичайно включає фізіологічний розчин або стерильну воду, хоча можуть бути включені інші інгредієнти, що сприяють стабільності, або для збереження стерильності. Сутність винаходу пояснюється фігурою і таблицями. У Таблиці 1 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Arg-OH на морфологічні і біохімічні показники периферичної крові морських свинок при вивченні токсичності. У Таблиці 2 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Arg-OH на процеси перекисного окислення ліпідів і пероксидацїї білків у корі головного мозку щурів при гіпоксії. У Таблиці 3 представлений вплив пептиду HGIu-Asp-Arg-OH на тривалість життя ізольованих нейронів річкового рака У Таблиці 4 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Arg-OH на показники виконання хворими коректурної проби. У Таблиці 5 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Arg-OH на зміну в хворих альфа-індексу ЕЕГ. На Фігурі показаний вплив пептиду H-Glu-AspArg-OH на розвиток експлантатів кори головного мозку. Винахід ілюструється прикладом синтезу пептиду глутаміл-аспартил-аргінін загальної формули: H-GIu-Asp-Arg-OH (приклад 1), прикладами вивчення токсичності й випробовування біологічної активності пептиду (приклади 2, 3, 4, 5, 6, 7), а також прикладом результатів клінічного застосування пептиду, що демонструє його фармакологічні властивості і підтверджує можливість досягнення лікувального ефекту (приклад 8). Приклад 1. Синтез пептиду H-GIu-Asp-Arg-OH 1. Назва сполуки: глутаміл-аспартил-аргінін. 2. Структурна формула: 3. Брутто-формула без протиіона: C15H26N6O8. 4. Молекулярна вага без протиіона: 418,40. 5 5. Протиіон: ацетат. 6. Зовнішній вигляд: білий аморфний порошок без запаху. 7. Спосіб синтезу: пептид отриманий класичним методом синтезу в розчині за схемою: BOC - трет.бутилоксикарбонільна група, OSu - N-оксисукцинімідний ефір, DCC - N,N'-дипиклогексилкарбодіімід, OBzI - бензиловий ефір, TFA - трифтороцтова кислота, HOBt - N-оксибензотриазол, Z - бензилоксикарбонільна група. 6. Характеристики готового препарату: - вміст основної речовини: 98,01% (по ВЕРХ, 220нм), - TШX - індивідуальний, Rf=0,65 (ацетонітрилвода 1:3), - вміст вологи: 6%, - рН 0,01% розчину: 4,88, - Питоме оптичне обертання: [ ]D22: -33° (с=1, H2O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад синтезу: 1) BOC-GIU(OBZI)-OSU, N-оксисукцинімідний ефір N-трет.бутилоксикарбоніл-( -6ензил)глутамінової кислоти (І). N-трет.бутилоксикарбоніл-( бензил)глутамінову кислоту BOC-GIU(OBZI)-OH (33,7г, 0,1моль) розчиняли в 50мл N,N'диметилформаміду, охолоджували до температури -10°C, додавали при перемішуванні охолоджені (4-6°C) розчини N,N'-дипиклогексилкарбодііміду (23,0г, 0,11моль) у 30мл N,N'-диметалформаміду і N-гідроксисукциніміду (13,0г, 0,11моль) у 20мл N,N'-диметилформаміду. Реакційну суміш перемішували протягом 12 год. при охолодженні льодом і далі протягом 1 доби при кімнатній температурі. N,N'-дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували й отриманий розчин активованого ефіру використовували без виділення на наступній стадії. 2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, Nтрет.бутилоксикарбоніл-(7-бензил)глутаміл-( бензил)аспартат(II). ( -Бензил)аспарагінову кислоту H-Asp(OBzl)OH (28,0г, 0,12моль) і 36мл (0,12моль) триетиламіну суспендували в 50мл N,N'-диметилформаміду і перемішували протягом 1 год. Потім додали порціями розчин активованого ефіру BOC-GIU(OBZI)OSU (І), отриманого на попередній стадії. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2 діб. Потім підкисляли 0,5н сірчаною кислотою до рН 2-3 і екстрагували етилацетатом 4x50мл. Витяжки поєднували і послідовно промивали 0,5н H2SO4 3x50мл, водою 2x50мл, 5% розчином NaHCO3 2x50мл, водою 2x50мл, насиченим розчином NaCl 2x50мл. Органічний шар сушили 91136 6 над Na2SO4, упарювали розчинник у вакуумі, залишок кристалізували під гексаном. Отримано 50г продукту (92%). Rf = 0,34 (бензол-ацетон 2:1). 3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg-OH (III), Nтрет.бутилоксикарбоніл-( -бензил)глутаміл-( бензил)аспартиларгінін (ІІІ). 2,4г (10ммоль) гідрохлориду аргініну HCl HArg-OH суспендували в 10мл диметилформаміду і перемішували протягом 24 год. Окремо 2,4г (4,4ммоль) захищені пептиди (II) і 0,8г (6ммоль) оксибензотриазолу розчиняли в 10мл диметилформаміду і охолоджували до температури -10 C. Потім додавали охолоджений до цієї ж температури розчин 1,25г (6ммоль) дициклогексилкарбодііміду в 5мл диметилформаміду. Активований ефір одержували протягом 20хв., далі до отриманого реагенту додавали суспензію аргініну і перемішували протягом 2 діб при кімнатній температурі. Дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували, фільтрат підкисляли 0,5н сірчаною кислотою до рН 3. Екстрагували 3x20мл н-бутиловим спиртом, насиченим водою. Об'єднані витяжки промивали водою й органічний розчинник упарювали у вакуумі. Залишок кристалізували під ефіром. Перекристалізація з ізопропілового спирту, сушили у вакуумі над КОН. Отримано 800мг продукту (26%). Rf=0,87 (н-бутанол-вода-оцтова к-та 4:1:1). 4) H-GIu-Asp-Arg-OH (IV), глутаміл-аспартил-аргінін. Захищений трипептид BOC-Glu(OBzl)Asp(OBzl)-Arg-OH (ІІІ) (0,80г) розчиняли в суміші метиловий спирт - вода (4:1) і гідрували над каталізатором Pd/C (5%) протягом 4 год. Каталізатор відфільтровували, розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над KOH і P2O5. Далі продукт розчиняли в 2мл суміші хлористий метилен-трифтороцтова кислота (5:1) і витримували при кімнатній температурі протягом 2 год. Повноту проходження реакції деблокування контролювали по ТШХ у системі ацетонітрил-вода (1:3). Розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над КОН. Для очищення 300мг препарату розчиняли в 4мл 0,01% трифтороцтової кислоти і піддавали високоефективній рідинній хроматографії на колонці з оберненою фазою 50x250ММ Diasorb-130C16T, 7мкм. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Умови хроматографування: A: 0,1% TFA; В: MeCN/0,1% TFA, градієнт B 0 50% за 100хв. Об'єм проби 5мл, детекція при 215нм, сканування 190-600нм, швидкість потоку 10мл/хв. Відбирали фракцію 37,0-42,0хв. Розчинник упарювали у вакуумі при температурі не вище 40°С, упарювання багаторазово (5 разів) повторювали з 10мл 10% розчину оцтової кислоти. Остаточно залишок розчиняли в 20мл деіонізованої води і ліофілізовували. Отримано 120мг очищеного препарату у вигляді аморфного білого порошку без запаху. 5) Аналіз готового препарату. - Вміст основної речовини визначали методом ВЕРХ на колонці Phenomenex C 18 LUNA 4,6x150mm. А: 0,1% TFA, В: MeCN; grad.B 0-100% in 10 min. Швидкість потоку 1мл/хв. Детекція при 7 220нм, сканування 190-600нм, проба 20 l. Вміст основної речовини 98,01%. - ТШХ: індивідуальний, Rf=0,65 (ацетонітрилвода 1:3, пластинки ПТШХ-П-В-УФ Sorbfil, силікагель CTX-1BE 8-12мкм, проявлення хлор/бензидин). - Вміст волога: 6% (гравіметрично по втраті маси при сушінні 20мг при 100°С). - рН 0,01% розчину: 4,88 (потенціометрично). - Питоме оптичне обертання: [a]D22: -33° (с=1, H2O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад 2. Вивчення токсичності пептиду HGlu-Asp-Arg-OH Загальнотоксичну дію пептиду H-Glu-Asp-ArgOH досліджували відповідно до вимог «Посібника з експериментального (доклінічного) вивчення нових фармакологічних речовин» (2000): гострої токсичності при однократному введенні препарату, а також підгострої і хронічної токсичності при тривалому введенні пептиду. Дослідження з вивчення гострої токсичності проведене на 72 білих безпородних мишах-самцях з масою тіла 20-22г. Тварини були рандомізовано розділені на 6 рівних груп. Препарат вводили тваринам однократно внутрішньом'язово в дозах 1мг/кг, 2мг/кг, 3мг/кг, 4мг/кг, 5мг/кг у 0,25мл стерильного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи в тому ж обсязі вводили 0,9% розчин NaCl. Дослідження з вивчення підгострої токсичності проведене на 65 білих безпородних щурах-самцях з масою тіла 160-210г. Щодня однократно тваринам піддослідних груп уводили препарат внутрішньом'язово протягом 90 днів у дозах 1мкг/кг, 0,1мг/кг, 1мг/кг у 0,5мл стерильного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи вводили в тому ж об'ємі стерильний 0,9% розчин NaCl. До введення препарату, на 30, 60 і 90 добу після початку введення препарату у тварин досліджували морфологічний склад і властивості периферичної крові. При завершенні експерименту досліджували біохімічні і коагулологічні показники крові. Дослідження з вивчення хронічної токсичності проводили протягом 6 місяців, виходячи з тривалості клінічного призначення препарату, що рекомендується, на 84 морських свинках-самцях масою 270-310г. Тварини піддослідних груп одержували щодня однократно внутрішньом'язово пептид протягом 6 міс. у дозах 1мкг/кг, 0,1мг/кг, 1 мг/кг у 0,5мл стерильного 0,9% розчину NaCl. У контрольній групі тваринам вводили за аналогічною схемою стерильний 0,9% розчин NaCl у тому ж об'ємі. У тварин у периферичній крові загальноприйнятими методами визначали: кількість еритроцитів, гемоглобіну, ретикулоцитів, тромбоцитів, лейкоцитів, лейкоцитарну формулу, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ), резистентність еритроцитів. Поряд з цим визначали вміст у сироватці крові загального білка по методу Лоурі, калію і натрію методом плазменної спектрофотометрії. Після завершення експерименту проводили патоморфологічне дослідження головного і спинного мозку, спинномозкових гангліїв, щитовидної залози, паращитовидних залоз, наднирникових залоз, сім'яників, гіпофіза, серця, легень, аорти, печінки, нирки, сечового міхура, підшлункової залози, шлу 91136 8 нка, тонкої кишки, товстої кишки, тимусу, селезінки, лімфатичних вузлів, кісткового мозку. При вивченні гострої токсичності встановлено, що однократне введення досліджуваного пептиду тваринам в дозі, що перевищує терапевтичну, рекомендовану для клінічного застосування, більше, ніж у 5000 разів, не викликає токсичних реакцій, що свідчить про велику терапевтичну широту препарату. Вивчення підгострої і хронічної токсичності пептиду свідчить про відсутність побічних ефектів при тривалому застосуванні препарату в дозах, що перевищують терапевтичну в 100-1000 разів. При дослідженні впливу пептиду на морфологічний склад і біохімічні показники периферичної крові морських свинок через 3 і 6 місяців після початку введення препарату достовірної зміни показників не виявлено (Таблиця 1). При оцінці загального стану тварин, морфологічних і біохімічних показників периферичної крові, морфологічного стану внутрішніх органів, стану серцево-судинної і дихальної систем, функції печінки і нирок патологічні зміни в організмі не виявлені. Відсутність загальнотоксичної дії дозволяє рекомендувати фармацевтичну композицію, що містить як активне начало пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, для проведення клінічних іспитів. Приклад 3. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH на розвиток експлантатів кори головного мозку Експерименти проведені на 32 фрагментах кори головного мозку щурів лінії «Wistar», масою тіла 150-200г. Поживне середовище для культивування експлантатів складалося з 35% розчину Ігла, 25% фетальної сироватки теляти, 35% розчину Хенкса, 5% курячого ембріонального екстракту, у середовище додавали глюкозу (0,6%), інсулін (0,5од./мл), пеніцилін (100од./мл), глютамін (2мм). Фрагменти кори головного мозку поміщали в це середовище і культивували в чашках Петрі в термостаті при температурі 36,7°С протягом 2 діб. В експериментальне середовище додавали пептид H-GIu-Asp-Arg-OH до кінцевих концентрацій 1, 10 і 100нг/мл. Критерієм біологічної активності служив індекс площі (ІП) - співвідношення площі усього експлантата разом із зоною росту до вихідної площі фрагмента кори головного мозку. Вірогідність розходження порівнюваних середніх значень ІП оцінювали за допомогою t-критерію Ст'юдента. Значення ІП виражали у відсотках, контрольне значення ІП приймалося за 100%. Зону росту контрольних експлантатів кори складали короткі нейрити, а також клітини глії, що виселяються, і фібробластоподібні клітини. На Фігурі показаний вплив пептиду H-Glu-AspArg-OH на розвиток експлантатів кори головного мозку. Установлено, що через 1 добу культивування відбувалося розпластування експлантатів на колагеновій підкладці і починалося виселення клітин, що проліферують і мігрують по периферії експлантата. На 3-тю добу культивування при концентрації пептиду H-GIu-Asp-Arg-OH 10нг/мл спостерігалося достовірне підвищення ІП експлантатів на 37%, у 9 порівнянні з контрольними значеннями ІП. При дослідженні експлантатів кори на більш тривалих термінах культивування - 7 днів - виявилися ті ж ефекти нейрит-стимулюючого дії, у тих же концентраціях. Іноді спостерігалося статистично не достовірне зменшення ІП експлантатів, очевидно, за рахунок ретракції нервових волокон при збільшенні термінів культивування. Отримані результати свідчать про нейритстимулюючу дію пептиду H-GIu-Asp-Arg-OH. Приклад 4, Вплив пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH нарепаративні процеси в головному мозку щурів після черепно-мозкової травми Вплив пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH на репаративні процеси в головному мозку оцінювали в моделі гострої важкої черепно-мозкової травми. Динаміку відновлення функцій центральної нервової системи визначали шляхом тестування координації рухів і м'язового тонусу тварин, а також їхньої здатності до навчання і відтворення умовнорефлекторної навички. У 24 білих безпородних щурів викликали важку компресійну черепно-мозкову травму свинцевим вантажем, що падає. Через 1, 12, 48 і 96 годину 15 тваринам піддослідної групи вводили внутрішньом'язово пептид H-Glu-Asp-Arg-OH у дозі 10мкг/кг у 0,5мл стерильного фізіологічного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильний фізіологічний розчин у тому ж об'ємі. Оцінку здатності щурів до навчання і відтворення навичок проводили за допомогою тесту умовного рефлексу активного уникання (УРАУ). Для оцінки м'язового тонусу і координації рухів щурів обертали на стрижні зі зростаючою швидкістю і вимірювали час утримування. Через 48 годин після травми усі тварини, що вижили, не були здатні до навчання. Через 96 годин після травми в групі щурів, що одержували пептид H-GIu-Asp-Arg-OH, здатних до навчання тварин було в 2 рази більше, ніж у контрольній групі. Через 30 доби показники навченості в щурів, яким уводили пептид H-GIu-Asp-Arg-OH, були також вище, ніж у контролі. Важка черепно-мозкова травма викликала у тварин виражений астеноневротичний синдром, зниження координації і м'язового тонусу. Дослідження з методу "обертового стрижня" показало, що пептид H-Glu-Asp-Arg-OH сприяв відновленню координації рухів і м'язового тонусу через 48 годину після травми (час утримання на стрижні було більш ніж у 2 рази вище, ніж у контрольній групі). Таким чином, застосування досліджуваного пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH приводило до значного поліпшення здатності тварин до навчання і відтворення умовнорефлекторної навички, а також до нормалізації м'язового тонусу і координації рухів. Властивість пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH, що проявляється в стимулюванні регенерації нейронів, відзначалася вже на 5 добу після травми, а до 14 доби показники навченості тварин були близькі до нормальних величин. При гострій важкій черепно-мозковій травмі відбувається ушкодження і загибель популяцій нейронів сірої речовини головного мозку. Прискорене 91136 10 відновлення функцій центральної нервової системи в ранньому посттравматичному періоді під дією пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH свідчить про те, що пептид викликає стимуляцію репаративних процесів у головному мозку. Приклад 5. Вплив H-Glu-Asp-Arg-OH на морфологічні зміни в центральній нервовій системі щурів при травмі спинного мозку Дослідження проведене на дорослих щурах «Wistar», обох статей, з масою тіла 180-200г. У тварин піддослідної групи, що складається з 27 щурів, була відтворена модель травми спинного мозку. Тваринам наносилася травма в поперековому відділі спинного мозку за наступною методикою. Анестезованому щуру на рівні останнього ребра через шкірні покриви проводився короткочасний стиск бокових поверхонь хребців корнцангом із силою на робочих браншах 15кг. Через 24 год. після нанесення травми серед щурів, що вижили, виділялося 2 групи. Тваринам першої групи вводили внутрішньом'язово щодня однократно пептид H-GIu-Asp-ArgOH у дозі 10мкг/кг у 0,5мл стерильного фізіологічного 0,9% розчину NaCl протягом 10 днів, щурам другої (контрольної) групи по такій же схемі вводили стерильний фізіологічний розчин у тому ж об'ємі. Тваринам обох груп на 30 добу проводилися нейрогістологічні дослідження. Для дослідження були узяті спинномозкові ганглії на рівні і вище рівня ураження, поперекові і шийні сегменти спинного мозку, ділянки моторної кори і пірамідних шляхів головного мозку. Нейрогістологічне дослідження проводилося методами електронної і світлової мікроскопії. Матеріал, узятий для вивчення за допомогою світлової мікроскопії, фіксували в 96% спирті і 10% формаліні, потім заливали в целоїдин з наступним фарбуванням гематоксилін-еозином, а також методами Нісля, Ван-Гізон, Вейгерта, Шпільмейера. Фіксацію і різання робили відповідно до умов методів гістологічної обробки, що застосовувалися, і забарвлення матеріалу. Матеріал для електронномікроскопічних досліджень фіксували 2% осмієвої кислотою з какодилатним буфером, заливали в епон-812 і контрастували в азотнокислому свинці по Рейнольдсу. Попередню оцінку матеріалу проводили на напівтонких зрізах. Ультратонкі зрізи вивчали на електронному мікроскопі УЕМ-100СХ. У всіх щурів із травмою спинного мозку виявлялися патоморфологічні зміни нейронів у вогнищі ураження. Ступінь виразності цих змін була різною. У частини нейронів визначалася картина аксональної реакції. При цьому клітини набухали, контури їх згладжувалися. Ніслевські глибки виглядали здрібненими аж до пилоподібних, із блідим профарбовуванням основними барвниками. Визначалося просвітління каріоплазми, ядро було зрушене до периферії. Значна частина нейронів знаходилася в стані зморщування. При цьому клітини здобували подовжено-звужену форму з різкими кутастими обрисами. Глибки хроматину, як і ядро інтенсивно профарбовувалися. Були ледь 11 помітні ядерця. Частина нервових клітин знаходилася в стані ішемічних змін. У них визначалося значне збідніння цитоплазми тигроїдною речовиною, гіперхроматичне, злегка зменшене ядро, що розпалося в деяких клітинах на окремі глибки. Іноді по периферії нейрона, біля тіла і відростків виявлялися частинки у вигляді інтенсивно пофарбованих дрібних зерен (перицелюлярна інкрустація сіток Гольджі). У більшості випадків виявлялися нейрони в стані набрякових змін. Ніслевська речовина в них проглядалася у вигляді вузького обідка по периферії цитоплазми. Контури тіл клітин виглядали розмитими. Навколо ядра визначалися ділянки розплавлювання цитоплазми у вигляді світлих обідків. Окремі нейрони знаходилися в стані важких змін. Тіла клітин виглядали набряклими з нерівномірним хроматолізом. Відростки нейронів профарбовувалися на великому протязі. Деякі клітини були ніби «поїдені». У них виявлялися незабарвлені ділянки у вигляді вакуолей нерівномірної величини і неправильної форми. Рідше в нейронах виявлялися гіпертрофовані гліальні елементи, що свідчило про явища нейронофагії. Для даного типу змін було характерне ураження ядра, що зменшувалося в розмірах, з різким гіперхроматозом, через який практично не вдавалося розрізнити ядерця. Виявлялися зміни нейронів по типу гострого набухання. При цьому тіла клітин виглядали набряклими. Визначалося збільшення ядер з дифузійним їх профарбовуванням. У цитоплазмі відзначалася дрібна зернистість, гомогенно пофарбована в ясно-синій колір. В окремих зонах вогнища ураження визначалася картина важкого деструктивного процесу, що виражалося в розрідженості клітинних елементів, наявності вогнищ випадання нервових клітин, особливо в передніх рогах спинного мозку, де досить часто виявлялися дрібні порожнини. У деяких місцях зникнення нейронів відзначалося розростання гліальної тканини. У більшому ступені зберігалися нервові клітини задніх рогів спинного мозку. У вентральній частині задніх і в передньобокових стовпах спинного мозку спостерігалися ознаки дифузної демієлінізацїї нервових волокон, зустрічалися вогнища спонгіозності у вигляді набряку білої речовини. Описана морфологічна картина спостерігалася в щурів обох експериментальних груп. Однак у тварин контрольної групи значно частіше зустрічалися «важкі» і ішемічні зміни нейронів, на відміну від щурів, що одержували ін'єкції пептиду H-GluAsp-Arg-OH, у спинному мозку яких в основному виявлялися клітини в стані «первинного подразнення». У всіх тварин спостерігалася активна проліферативна реакція астроцитарної глії, особливо фіброзних астроцитів. Клітини були деформовані, з пікноморфними ядрами і гомогенізованою цитоплазмою, позбавленою відростків. У тварин піддослідної групи відзначалася більш активна гіперплазія олігодендроглії. Серед її клітин малася безліч набряклих форм. Елементи мікроглії знаходилися в стадії помірної проліферації з явищами фрагментації гліальних відростків. У відділах спинного мозку, що лежать вище, у головному мозку тварин контрольної групи вияв 91136 12 лялися клітинні зміни по типу аксональної дегенерації. При електронномікроскопічному дослідженні в щурів із травмою спинного мозку спостерігалися виражені зміни нейронів, їхніх відростків, гліальних елементів і судин. У цитоплазмі нейронів визначалося зменшення числа канальців ендоплазматичної мережі, набрякання цистерн апарата Гольджі, велика кількість облямованих пухирців, дрібних і великих лізосом. Характерним була наявність темних мітохондрій із щільним матриксом, у якому не розрізнялися кристи. По периферії тіл нервових клітин спостерігалися великі темні ліпіди зі смугастою смугастістю і значних розмірів вакуолі, що представляють собою мультивезикулярні тільця, утворені, імовірно, з набряклих канальців гранулярної ендоплазматичної мережі, що втратили рибосоми. У ядрах деяких нейронів визначалася дезінтеграція хроматину, що утворював скупчення чудернацької форми, розташовані в щільної ядерної мембрани. У щурів, що одержували пептид HGlu-Asp-Arg-OH, у цитоплазмі нейрональних клітин відзначалися ознаки відновлення. Спостерігалася поява великої кількості вільних рибосом і полірибосом, коротких профілів цистерн гранулярної ендоплазматичної мережі. Визначалося збільшення числа дрібних цистерн апарата Гольджі з відсутністю в ньому ознак набрякання. По периферії клітин зустрічалися лише одиничні прозорі вакуолі і темні тільця. У всіх тварин виявлялися значні зміни мієлінових волокон. Так, виявлялося розщеплення мієліну, його скривлення, стискання внутрішніх осьових циліндрів і поява, внаслідок цього, світлих просторів великого розміру. У щурів дослідної групи структура мієліну частини волокон відновлювала свою гомогенність. Зміни, що виявляються, у синапсах, виявлялися у філаментозній дегенерації постсинаптичних утворень. У щурів піддослідної групи значно частіше спостерігалися синапси звичайної структури (дендро-дендригачні). У відділах, що лежать вище, у тварин експериментальних груп виявлялися подібні зміни нервових клітин і їхніх відростків. У нейронах визначалися ознаки функціонального напруження. У цитоплазмі клітин відзначалася значна кількість лізосом, у частини мітохондрій не виявлялися кристи. Спостерігалося помірне набрякання апарату Гольджі. Виявлялося ущільнення каріоплазми внаслідок занадто компактного розташування хроматину в ядрах клітин. У нервових волокнах виявлялося помірно виражене розшарування мієліну, стискання осьових циліндрів. У щурів після застосування пептиду H-GluAsp-Arg-OH описані зміни виявлялися в меншому ступені. Каріоплазма мала звичайний вигляд, більш упорядковані були цистерни апарату Гольджі. Канальці ендоплазматичної сітки утворювали великі вакуолі, що містять залишки відпрацьованих органоїдів, для їхньої утилізації. Однак у цитоплазмі клітин як і раніше виявлялася надлишкова кількість лізосом, визначалися набряклі мітохондрії з безладно розташованими кристами. Мієлінові волокна набагато частіше мали нормальний ви 13 гляд. Таким чином, застосування пептиду H-GluAsp-Arg-OH тваринам з травмою спинного мозку чинило стимулюючу дію на регенерацію нейронів спинного мозку. Приклад 6. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH на інтенсивність реакцій вільнорадикального окислювання в корі головного мозку щурів при гіпоксії Дослідження проведене на 18 білих безпородних щурах. Пептид H-Glu-Asp-Arg-OH вводили тваринам внутрішньоочеревинно в дозі 1мкг у 1,0мл стерильного фізіологічного 0,9% розчину NaCl однократно щодня протягом 10 днів. Через 24 години після закінчення введення пептиду тварини піддавалися впливу гіпоксичної гіпоксії. Гіпоксію викликали в барокамері проточно-витяжного типу при атмосферному тиску в барокамері 0,029Мпа, що відповідає підйому на висоту 9000м над рівнем моря. Швидкість компресії і декомпресії складала 0,005МПа в хвилину. У барокамеру поміщали поглинач вуглекислоти і вологи. Тварини знаходилися в барокамері в умовах вільної поведінки під постійним спостереженням протягом 3 годин. Про інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) судили за рівнем вмісту початкових продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів і кінцевих продуктів - основ Шиффа, що грають істотну роль в ушкодженні нейронів. Рівень пероксидації білків оцінювали по вмісту карбонілпохідних амінокислот у білках після взаємодії з 2,4динітрофенілгідразином. Встановлено, що пептид H-Glu-Asp-Arg-OH пригнічував утворення продуктів ПОЛ в корі головного мозку. Під впливом пептиду статистично вірогідно знижувався вміст дієнових кон'югатів і спостерігалася тенденція до зниження основ Шиффа. Застосування пептиду також інгібувало, поряд з ПОЛ і пероксидацію білків (Таблиця 2). Отримані дані свідчать про те, що застосування пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH у тварин при впливі гіпоксії пригнічує утворення продуктів перекисного окислення ліпідів і пероксидації білків у корі головного мозку. Приклад 7. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH на тривалість життя ізольованих нейронів річкового paку Astacus leptodactilus Для вивчення in vitro впливу пептиду H-GluAsp-Arg-OH на тривалість життя ізольованих нейронів річкового раку Astacus leptodactilus останні виділяли шляхом аксотомії, оскільки прийнято вважати, що таке виділення є моделлю загибелі клітин шляхом апоптозу. Нейрони рецептора розтягання річкового раку за своїми електрофізіологічними, біологічними і структурними властивостями дуже близькі до центральних нейронів хребетних. Вони генерують спайки з майже постійною швидкістю протягом 1015 годин. Два симетричних нейрони (контроль і дослід), ізольованих з абдомінального сегмента, поміщали в камери об'ємом 2мл, наповнені розчином Harreveld's. Потенціали дії нейронів реєструвалися екстраклітинно з аксонів скляними піпетковими електродами, що присмоктуються, підсилювалися і записувалися за допомогою са 91136 14 мопису Н-338. Одночасно за допомогою двоканального аналогового частотоміра і самописів Н-339 реєструвалася частота потенціалів дії. На початку експерименту частота імпульсації експериментальних і контрольних нейронів була встановлена на оцінці 10-15Гц шляхом натягнення м'яза. Після 1 години стабільної генерації спайків з постійною швидкістю в експериментальну ємність додавали пептид H-GIu-Asp-Arg-OH у концентрації 10мкг/мл. Активність нейронів безупинно записувалася до спонтанного припинення генерації спайок. Час життя нейронів порівнювався в кожній парі. Усього використовували 10 пар нейронів. При спонтанному припиненні імпульсації ізольованого нейрона після 8-10 годин порівняно стабільної роботи з заданою частотою з'являлися спочатку невеликі флуктуації частоти тривалістю кілька секунд, потім з'являлися більш повільні ритми з періодом у кілька хвилин. Середня частота потенціалів дії знижувалася, потім починалося випадання окремих імпульсів, імпульсація набувала хаотичного характеру і швидко загасала. Установлено, що пептид H-Glu-Asp-Arg-OH подовжував тривалість життя ізольованих нейронів на 15%, в середньому з 11,9 до 13,7 годин (Таблиця 3). Уповільнення загибелі нейронів під впливом пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH свідчить про нейропротекторний ефект пептиду, пов'язаний з його впливом на електрофізіологічні мембранні процеси і внутрішньоклітинний метаболізм у нейронах. Приклад 8. Ефективність застосування пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH у хворих з віддаленими наслідками черепно-мозкової травми Дослідження проведене на 25 хворих у віці 3160 років з віддаленими наслідками черепномозкової травми, розділених на 2 групи методом рандомізації. Давність перенесених хворими черепно-мозкових травм складала від 1 до 10 років. Хворих основної групи розділили на 3 підгрупи по ступеню виразності наслідків черепно-мозкової травми. Хворим основної групи з найбільш вираженими наслідками черепно-мозкової травми вводили фармацевтичну композицію, що містить пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, щодня однократно внутрішньом'язово в дозі 5,0мг у 1мл стерильного фізіологічного 0,9% розчину NaCl протягом 10 днів. Хворим основної групи з наслідками черепномозкової травми середнього ступеня важкості вводили фармацевтичну композицію, що містить пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, щодня однократно внутрішньом'язово в дозі 10,0мкг у 1мл стерильного фізіологічного 0,9% розчину NaCl протягом 10 днів. Хворим основної групи з віддаленими наслідками черепно-мозкової травми легкого ступеня тяжкості вводили фармацевтичну композицію, що містить пептид H-GIu-Asp-Arg-OH, щодня однократно внутрішньом'язово в дозі 1,0мкг у 1мл стерильного фізіологічного 0,9% розчину NaCl протягом 10 днів. Хворим контрольної групи за аналогічною схемою вводили в тому ж об'ємі стерильний фізіологічний 0,9% розчин NaCl. Після застосування фармацевтичної композиції, що містить пептид H-GIu-Asp-Arg-OH, у хворих 15 91136 гарний клінічний результат спостерігався в 59,4% випадків, задовільний - у 31,9%, відсутність позитивного ефекту - 8,7%. Негативного впливу фармацевтичної композиції, що містить пептид H-GluAsp-Arg-OH, на стан хворих не відзначено. Хворі відзначали поліпшення пам'яті, зменшення інтенсивності і тривалості головного болю, появу емоційної урівноваженості, відчуття відпочинку після нічного сну. Оцінка впливу фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, на інтегральну функцію головного мозку - увагу і на біоелектричну активність головного мозку досліджувалися за допомогою коректурної проби і електроенцефалографії. У хворих основних груп після лікування з застосуванням фармацевтичної композиції, що містить пептид H-GIu-Asp-Arg-OH у різних дозах, вірогідно зросла кількість переглянутих знаків і зменшилася кількість помилок при виконанні коректурної проби (Таблиця 4). У групі хворих, що одержували лікування з застосуванням фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Arg-OH у різних дозах, отримані кращі результати при аналізі динаміки Показник Еритроцити, х1012/л Гемоглобін, г/л Ретикулоцити, % Тромбоцити, х109/л Лейкоцити, х109/л Нейтрофіли паличкоядерні, % Нейтрофіли сегментоядерні, % Еозинофіли, % Базофіли, % Моноцити, % Лімфоцити, % ШОЕ, мм/год. Резистентність еритроцитів, % NaCl - максимальна - мінімальна Загальний білок у сироватці крові, г/л Натрій у сироватці крові, ммоль/л Калій у сироватці крові, ммоль/л 16 виконання коректурної проби до і після лікування. Це виражалося у відсутності різких коливань у кількості переглянутих знаків за рівні проміжки часу, наявності періоду "впрацьовування" до середини виконання завдання і поступовому зниженні кривої до кінця завдання, що свідчить про більшу стійкість уваги в хворих основної групи. Для оцінки впливу фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, на біоелектричну активність головного мозку проводився розрахунок альфа-індексу до і після лікування. Найбільш виражені зміни біоелектричної активності головного мозку спостерігалися в хворих основної групи після лікування з застосуванням фармацевтичної композиції, що містить пептид H-GIu-AspArg-OH: у них під впливом лікування відбулося достовірне збільшення альфа-індексу (Таблиця 5). Таким чином, результати проведеного дослідження свідчать про вплив фармацевтичної композиції, що містить як активне начало ефективну кількість пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH, на інтегративну функцію клітин головного мозку в хворих після перенесеної черепно-мозкової травми за рахунок стимуляції регенерації нейронів. Введення пептиду H-Glu-Asp-Arg-OH (1мкг/кг) 3 місяці 6 місяців Контроль (n=24) Пептид (n=24) Контроль (n=24) Пептид (n=24) 5,3±0,6 5,4±0,4 5,4±0,3 5,3±0,6 14,2±1,4 143±1,6 14,5±13 14,5±1,7 1,3±0,07 13±0,1 1,1±0,05 1,2±0,04 143,7±7,9 145,1±7,8 144,5±8,6 145,2±8,3 9,4±0,5 10,0±0,5 9,6±0,5 9,4±0,8 031±0,04 0,32±0,05 0,33±0,04 0,34±0,07 45,8±2,1 46,4±2,1 46,2±3,5 44,7±2,7 0,69±0,05 0,71±0,06 0,72±0,04 0,68±0,05 0,61±0,04 0,65±0,07 0,72±0,03 0,67±0,08 2,5±0,02 2,4±0,07 2,6±0,06 2,4±0,03 48,9±2,5 51,4+2,1 51,3±2,7 50,5±1,9 1,69±0,05 2,07±0,04 2,01±0,05 1,88±0,03 0,41±0,02 0,32±0,05 72,9±3,1 0,43±0,06 0,30±0,01 71,4±2,6 0,42±0,04 0,34±0,04 73,1±3,4 0,42±0,03 0,31±0,05 72,6±3,2 153,9±5,7 155,2±5,9 155,5±6,2 153,2±7,4 5,1±2,3 5,1±2,4 5,2±2,1 5,3±1,8 Таблиця 2 Показник Дієнові кон'югати (нмоль/г тканини) Основи Шиффа (ум. од./г тканини) Рівень пероксидації білків (мкмоль/мг білка) * - P < 0,01 у порівнянні з контролем. Контроль (гіпоксія) 42,15±2,35 317,0±24,7 9,69±0,32 Група тварин Пептид H-GIu-Asp-Arg-OH + гіпоксія 28,57±1,84* 255,4±26,8 4,68±0,07* 17 91136 18 Таблиця 3 Контроль 11,9±0,3 Тривалість життя ізольованих нейронів річкового раку (год.) Пептид H-Glu-Asp-Arg-OH 13,7±0,2* * - P < 0,05 у порівнянні з контролем. Таблиця 4 Група хворих Здорові Хворі до лікування Хворі після лікування із застосуванням загальноприйнятих засобів Хворі основних груп після лікування із застосуванням пептиду H-GIu-Asp-Arg-OH Кількість переглянутих знаків 2874,6±93,4 1519,1±141,7 Кількість помилок 2,7±0,3 12,6±1,3 1967,5±122,4* 9,7±1,2* 2429,6±105,3*# 6,4±1,1*# * - P