Штам бактерій photobacterium phosphoreum sq3 imb-7071 як тест-культура для визначення біологічної дії електромагнітного випромінювання

Реферат: Штам бактерій Photobacterium phosphoreum Sq3 IMB 7071 як тест-культура для визначення біологічної дії широкого спектра електромагнітного випромінювання, депонований у депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під № IMB B-7071. UA 96184 U (12) UA 96184 U UA 96184 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології і може бути використана при санітарногігієнічних дослідженнях з оцінки дії на біологічні об'єкти електромагнітного випромінювання. Штам Photobacterium phosphoreum Sq3 ІМВ-7071 характеризується високою чутливістю до дії неіонізуючого електромагнітного випромінювання (ЕМВ) у широкому частотному діапазоні. Відомий штам бактерій Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford, що рекомендований для біотестування води [КНД 211.1.4.060-97 Визначення токсичності води на бактеріях Photobacterium phosphoreum (Cohn)Ford.21.05.97] дозволяє встановити наявність токсичних речовин у концентраціях які перевищують ПДК. Для детектування біологічної дії фізичних факторів він не використовується. Як найближчий аналог слід відзначити бактерії Photobacterium leognathi штам 54, який запропоновано використовувати для визначення біологічного впливу електромагнітного випромінювання частотою 42 ГГц (патент РФ №2291196). Зазначено, що при збільшенні тривалості експозиції ця тест-система бактерій змінює характер світіння. Біотестування здійснюється при визначенні зміни інтенсивності біолюмінесценції бактерій під впливом ЕМВ. Недоліком відомого штаму є обмеженість його використання тільки на фіксованій частоті 42 ГГц та довготривалість зберігання зміненого світіння після опромінення (100 год.). Це не дає можливість багаторазового використання цієї тест-системи. Запропонований спосіб підготовки бактерій для тестування кожен раз включає декілька етапів їх культивування на твердому та рідкому середовищі, що потребує певних умов для мікробіологічної роботи та тривалості у часі. Крім того, у патенті не обговорюється діапазон температурної, кислотно-лужної дії цього тестоб'єкта та не визначена оптимальна концентрація клітин для проведення експериментів. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму бактерій з високою чутливістю біолюмінесценції до широкого частотного діапазону електромагнітного випромінювання та можливістю багаторазового використання цього чутливого елемента в біосенсорному пристрої. Поставлена задача вирішується запропонованим штамом Photobacterium phosphoreum Sq3 1MB-7071, що вилучений з катрана Squalus acanthias у Чорному морі. Ідентифікація штаму проведена на основі вивчення його культурально-морфологічних та фізіолого-біохімічних характеристик, відповідно до даних визначення бактерій (Bergey's manual systematic bacteriology. - Baltimore etc.:Williams and Wilkins, 1984. - Vol.1-964р.) та рекомендаціям по швидкій ідентифікації люмінесцентних бактерій (Светящиеся бактерии./Гительзон И.И., Родичева Є.К., Медведева С.Е. и др., Новосибирск: Наука, 1984, 279с). Результати ідентифікації були підтверджені генетичними дослідженнями. Проведено секвенування гена 16S рРНК. Дані порівняльного аналізу за допомогою програми BLASTN виявили 100 % схожість з послідовностями гену 16S рРНК, занесеними до бази даних GenBank. Нуклеотидна послідовність фрагмента розміром 1360 п.н. була депонована у GenBank під номером KF 656787. Штам зареєстрований у депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України під №7071. Даний штам характеризується наступними ознаками: на агаризованому середовищі штам утворює безбарвні, прозорі колонії, розміром 0,5-Змм. При мікроскопіюванні спостерігається поліморфізм культури: найбільш характерна форма кокобацили. Штам оксидазонегативний, не ферментує Д-маніт. Росте при температурі 4-25 °C, оптимальна температура 15-20 °C Проведені дослідження підтвердили дані про відсутність патогенності і вірулентності штаму для теплокровних тварин, що характерно для морських люмінесцентних бактерій (Sado P.N., 1998). Штам зберігається у ліофільному стані або під мінеральним маслом на 2 % агаризованому середовищі наступного складу г/л: пептон – 5,0, дріжджовий екстракт – 1,0; NaCl – 30,0; Na2HPO4 – 5,3; КН2РО4 × 2Н2О – 2,1; (NH4)2HPO4 – 0,5; MgSO4 × Н2О – 0,1; гліцерин – 3,0 мл/л (Малыгина И.Ю., Кацев A.M., 2003). Для реєстрації інтенсивності біолюмінесценції використовували Біолюмінометр HIDEX (Фінляндія) та експериментальну установку на основі фотопомножувача ФЕП-115. Рівень біолюмінесценції представляли в значеннях біолюмінесцентного індексу. Світіння фіксувалося у діапазон 460-510 нм. Джерелами електромагнітного випромінювання (ЕМВ) були: апарат для УВЧ-терапії УВЧ-62; аппарат для СМВ-терапії СМВ-150-1 ЛУЧ- 11 та MRTA-02. Було встановлено, що бактеріальна біолюмінесценція реєструється при певній концентрації 7 клітин 10 кл/мл. Інтенсивність біолюмінесценції при різних значеннях кислотності середовища культивування фіксувалася в діапазоні рН від 2,0 до 12,0. Максимальный рівень світіння зберігався постійним в області значень рН від 5,5 до 9,1. Зміни кислотності середовища як у кислу, так і в лужну зони 1 UA 96184 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 супроводжувалися різким зниженням люмінесценції майже до повного зникнення при рН менше ніж 4,0 та більше 10,0. Встановлено, що максимальний рівень світіння для P.phosphoreum Sq3 ІМВ-707 спостерігався в діапазоні від 2 до8 % NaCl та температур від 10 до 28 °C. При підвищенні температури вище 28 °C спостерігалось значне зниження світіння, а при 35 °C незворотна втрата люмінесценції. Порівняльний аналіз фізіологічних та емісійних характеристик штаму P.phosphoreum Sq3 1MB 7071 з P.phosphoreum KM МГУ №331 вилученого з Білого моря (Куц В.В., Исмаилов А.Д, 2009), показав, що запропонований нами штам має більш широкий діапазон активності рН 5,59,0 і температури 10°-28 °C, проти 7,0-9,0 та 10-20 °C для P.phosphoreum KM КМ МГУ №331 та характеризувався стійкою біолюмінесценцією при концентрації хлориду натрію (від 2 до 8 % проти 0,2-3,8 % для штаму P.phosphoreum KM МГУ №331). Тривалість люмінесцентного циклу P.phosphoreum Sq3 1MB В-7071 на зазначеному вище рідкому середовищі при температурі 21 °C після 8 год. культивування на качалках (160 об/хв.) була біля 100 год. В той же час цей показник при культивуванні бактерій на агаризованому середовищі - складав більш ніж 30 діб. Тривалість релаксації культури після опромінення (до рівня світіння у контролі) залежала від величини поглиненої енергії та коливалась від 0 до 40 год. Приклад 1. Опромінення культури P.phosphoreum Sq3 ІМВ-7071 електромагнітними хвилями (ЕМВ) з частотою 40,68 МГц, потужністю 15 Вт тривалістю 5 хв. викликало збільшення інтенсивності світіння на 26 %. При опромінюванні протягом 15 хв. інтенсивність люмінесценції зменшувалася на 65 % у порівнянні з контролем. При збільшенні потужності до 30 Вт інтенсивність люмінесценції зменшувалася протягом всього часу опромінювання. Приклад 2. При використанні для опромінювання ЕМВ надзвичайно високої частоти 61,22 ГГц була отримана прямо пропорційна залежність рівня біолюмінесценції від потужності і тривалості опромінення. Так опромінювання мікротермальною потужністю 1 мкВт тривалістю 30 хв. викликало збільшення інтенсивності світіння на 36 %. При збільшенні середньої потужності до 100 мкВт збільшення інтенсивності світіння склало відповідно 59 %. Приклад 3. При опромінюванні ЕМВ ультрависокої частоти 2,45 ГГц потужністю 15 Вт на протягом перших 5 хв. спостерігалося збільшення світіння бактерій на 45 %. При подальшому опроміненні культури через 15 хв. біолюмінесценція зменшувалася на 67 % у порівнянні з контролем. Через 30 хвилин після опромінення світіння зникало. Збільшення середньої потужності ЕМВ СВЧ до 30 Вт при тих же умовах призводило до пригнічення світіння на 55 % через 5 хв., до повної відсутності через 15 хв. Таким чином, виходячи з експериментальних даних, запропоновано новий штам P.phosphoreum ИМВ В-7071, що характеризується високим рівнем світіння у широкому діапазоні фізико-хімічних умов, тривалим циклом люмінесценції та високою чутливістю до широкого частотного діапазону електромагнітного випромінювання. Штам не патогенний та не токсичний, що дозволяє рекомендувати його для вирішення широкого кола біотехнологічних завдань, зокрема для створення біосенсора на дію ЕМВ. Джерела інформації: 1. КНД 211.1.4.060-97 Визначення токсичності води на бактеріях Photobacteriumphosphoreum (Cohn)Ford.21.05.97. 2. патент РФ №2291196 (найближчий аналог) 3. Bergey's manual systematic bacteriology. - Baltimore etc.: Williams and Wilkins, 1984. - Vol.1964p. 4. Светящиеся бактерии./Гительзон И.И., Родичева Є.К., Медведева С.Е. и др., Новосибирск: Наука, 1984, 279с. 5. Sado P.N., Glowing seafood./California Journal of Environmental Health, .1998 v.21, Nl.pp.1518. 6. Малыгина И.Ю., Кацев A.M., Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей // Экология моря.-2003.-64. - С. 18-23. 7. Куц В.В., Исмаилов А.Д. Физиологические и эмиссионые характеристики PHOTOBACTERIUMPHOSPHOREUM из Белого моря. // Микробиология.-2009.-78,№5.-С.612617. 2 UA 96184 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Штам бактерій Photobacterium phosphoreum Sq3 IMB 7071 як тест-культура для визначення біологічної дії широкого спектра електромагнітного випромінювання, депонований у депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під № IMB B-7071. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3