Живильне середовище для бактерій vibrio fischeri та photobacterium phosphoreum

Винахід належить до мікробіології та може бути використаним для вирощування бактерій що світяться, а саме бактерій Vibrio fischeri та Photobacterium phosphoreum. Відомо живильне середовище для вирощування бактерій роду Photobacterium для отримання люциферази з біомаси цих бактерій, яка містить наступні компоненти: NaCl (натрій хлористий), Na2HPО4* 12Н2О (натрій фосфорнокислий двозаміщений дванадцятиводний, КН2РО4 д (калій фосфорнокислий однозаміщений), (NH4 )2HPО4 (амоній фосфорнокислий ), MgSО4*7H2О (магній сірчанокислий семиводний), гліцерин, бактопептон. (Т.И.Воробьева,Е.С.Высоцкий,В·В.Заворуев и др. Регуляция синтеза люцеферазы у Photobakterium mandapamensis. - Микробиология, 1980г. т.49 N4 С.517-520) Однак, це середовище не забезпечує достатньо високий рівень світіння бактерій та швидкість їх росту. Також відомо середовище для вирощування бактерій роду Photobacterium, яке забезпечує, за даними авторів, достатньо добру швидкість росту та світіння. Склад цього середовища наступний: NaCI, Na2HPO4, КН2РO4, (NH4)2HPO4, MgSO4*7H2O, гліцерин, пептон, Na цитрат. (А.М.Кузнецов, Э.К.Родичева, Л.П.Рожаева. Полусинтетическая среда для светящихся бактерий рода Photobacterium. - Известия СО АН СССР(серия билогическая),вып.1, 1978 С.37-3. Недоліком цього середовища є те, що воно не дає достатнього росту бактерій Vibrio fischeri. Існує "середовище Егоровой" для Vibrio fischeri, яке містить NaCI, KH2PO4, MgSO4, аспаргін, пептон, рибну витяжку, воду водопровідну. Це рішення може бути прототипом .Але його використовують тільки для Vibrio fischeri. В основу винаходу, що передбачається поставлено задачу розробити живильне середовище для бактерій Vibrio fischeri та Photobacterium phosphoreum , що містить NACI (хлористий натрій), KH2PО4 (калій фосфорнокислий однозаміщений) шляхом додавання Na2НРО4 (натрій фосфорнокислий двозаміщений) екстракту дріжджів ,гліцерину та панкреотичного гідролізату кільки, при слідуючому співвідношенні компонентів, мас. % Натрій хлористий 2,9-3,1 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,1-0,2 Натрій фосфорнокислий двозаміщений 0,4-0,6 Екстракт дріжджів 4,0-6,0 Гліцерин 0,2-0,4 Панкреотичний гідролізат кільки 150-250мг% в готовому 92,4-89,7 середовищі, щоб забезпечити ефективність живильного середовища Vibrio fischeri та Photobacterium phosphoreum. Приготування середовища складається з трьох етапів. Перший етап. Приготування панкреатичного гідролізату кільки. До 1кг. фаршу рибного додається 1,5л. демінералізованої води, 8-10г. двовуглекислого натру, щоб довести рН до 7,4-7,6. Після цього на кожен кілограм фаршу додають 200-300 г. подрібненої підшлункової залози великої рогатої худоби та 10мл. хлороформу на кожен літр суміші. Все ретельно перемішують. Гідроліз проводять при температурі 42-43°С протягом 6-7 діб. Перед застосуванням його для поживного середовища визначають вміст амінного азоту. Амінний азот - показник , який вказує кількість азоту амінокислот в поживному середовищі і вимірюється в мг%. Другий етап. Приготування екстракту дріжджів. 1кг. пресованих дріжджів розводять в 1 літрі дистильованої води та кип'ятять протягом 30 хвилин, фільтрують крізь фільтрувальний папір. Третій етап. Приготування середовища. В колбу відміряють панкреатичний гідролізат кільки, додають гліцерин та екстракт дріжджів, розчиняють наважки солей у вказаній послідовності. Встановлюють рН7,2-7,4 додаючи 20% розчин їдкого натру, фільтрують крізь паперовий фільтр. Стерилізують при 0,5атм. протягом 30 хвилин. Для приготування агарового середовища до рідкого середовища під час приготування додають 2% агар-агару мікробіологічного. Приклад 1 .Живильне середовище готують як вказано вище, при наступному співвідношенні компонентів: NaCl -3,0 Na2HPO4 -0,5 КН2РО4 -0,1 Екстракт дріжджів -5,0 Гліцерин -0,3 Панкреатичний гідролізат кільки, який містить 150мг % амінного азоту в готовому середовищі -91,1 Приклад 2.Живильне середовище готують як вказано вище, при наступному співвідношенні компонентів: NaCl -3,0 Na2HPO4 -0,5 КН2РО4 -0,1 Екстракт дріжджів -5,0 Гліцерин -0,3 Панкреатичний гідролізат кільки, який містить 200мг % амінного азоту в готовому середовищі -91,1 Приклад 3. Живильне середовище готують як вказано вище, при наступному співвідношенні компонентів: NaCl -3,0 Na2HPO4 -0,5 КН2РО4 -0,1 Екстракт дріжджів -5,0 Гліцерин -0,3 Панкреатичний гідролізат кільки, який містить 250 мг % амінного азоту в готовому середовищі -91,1 Перед посівом культури Vibrio fischeri та Photobacterium phosphoreum вирощували на середовищі наступного складу: вода м'ясна 600мл., вода морська 375мл., вода дистильована 25мл., пептон 10г., агар- агар 20г., рН7,4. Для випробування була використана добова культура. Проводили засів змивом який робили середовищем, що досліджували. Щільність бактеріальної маси, яку використовували для засіву становила 0,5млрд мікробних клітин в см3" Доза , яку використовували для засіву становила 0,1см3. Ефективність середовищ, які досліджували оцінювали за методичними рекомендаціями. Тест-штами находились в типовій для даних організмів формі. Пробірки з посівами закривали ватно-марлевими пробками та розміщували в термостаті при температурі 25°С. Облік росту проводили через 20 годин культивування. Інтенсивність світіння визначали на люмінометрі EMILITE 1003А. Результати досліджень наведені у таблиці. Аналіз отриманих даних засвідчив, що середовище яке пропонується забезпечує кращі умови для росту та світіння бактерій Vibrio fischeri та Photobacterium phosphoreum. Таблиця Середовище №1 Культура Photobacterium phosphoreum Накопичення бак светіння, маси, млрд/см3 відн/од. 1,2 37,47 Середовище №2 Накопичення бакмаси, млрд/см3 * Vibrio fischeri * за рахунок помутніння середовища результат не достовірний. Середовище, яке пропонується светіння, Накопичення бак светіння, відн/од. відн/од. маси, млрд/см3 37,68 2,2-3,0 134,5-228,2 1,9-2,8 13,15-170,0