Спосіб зневоднення та парафінування ікри риб для виготовлення гістологічних зрізів

Реферат: Спосіб зневоднення та парафінування ікри риб для виготовлення гістологічних зрізів включає пробопідготовку зразків ікри з метою створення парафінових блоків для гістологічних зрізів. Дослідні зразки гонад риб зневоднюють та парафінують з використанням абсолютизованого ізопропілового спирту 99,7 %-ї концентрації з додаванням октилфеноксиполіетоксіетанолу (Тритон X15) в співвідношенні 1:10000, в розчині яких проби витримують по декілька годин, після чого їх переносять до парафіну для заливки. UA 96885 U (12) UA 96885 U UA 96885 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біології, а саме іхтіології та гістології, зокрема до способу виготовлення гістологічних зрізів гонад риб з метою використання їх для вивчення репродуктивних показників та розроблення шкали зрілості статевих продуктів риб і може бути використана в гістологічних лабораторіях при пробопідготовці. Існує багато методик виготовлення зрізів різних тканин та органів тварин, кожна з яких відповідає властивостям та будові досліджуваної тканини [Р. Лилли Патогистологическая техника и практическая гистохимия [Текст] / Р. Лилли. - М., 2012. - 146 с.; Hauser J. Ausshaltung des xylols in der histologischen technik [Text] / J. Hauser // Mikroskopie. 1952. - №7. - P. 208-210]. Ікра риб має досить пухку будову, особливо на останніх стадіях гаметогенезу, тому після зневоднення та парафінування вона часто стає крихкою, також під час виготовлення зрізу деформується або руйнується [Шихшабеков М.М. Методические указания по определению стадий зрелости яичников и семенников рыб [Текст] / М.М. Шихшабеков. - М., 1984. - 22 с.; Микодина Е. В. Гистология для ихтиологов: Опыт и советы [Текст] / Е. В. Микодина, М. А. Седова, Д. А. Чмилевский, А. Е. Микулин, С. В. Пьянова, О. Г. Полуэктова. - М.: Изд-во ВНИРО, 2009. - 112 с.]. Для усунення існуючої проблеми необхідно розробляти нові або удосконалювати існуючі способи пробопідготовки фіксованих тканин ікри риб. Для досягнення мети можна використовувати, нові, більш ефективні суміші реактивів. Найбільш близьким за суттю до способу, що заявляється, є спосіб проведення зневоднення попередньо зафіксованих проб ікри з використанням різних концентрацій етилового спирту [Шихшабеков М.М. Методические указания по определению стадий зрелости яичников и семенников рыб [Текст] / М.М. Шихшабеков. - М., 1984. - 22 с.; Микодина Е. В. Гистология для ихтиологов: Опыт и советы [Текст] / Е. В. Микодина, М. А. Седова, Д. А. Чмилевский, А. Е. Микулин, С. В. Пьянова, О. Г. Полуэктова. - М.: Изд-во ВНИРО, 2009. - 112 с.]. Реалізація цього методу ґрунтується на тому, що етиловий спирт зростаючої концентрації поступово витісняє воду з тканини, потім етиловий сприт створює умови для проникнення органічних речовин, які заміщуються парафіном, що в подальшому дозволяє зробити парафінові блоки, придатні для виготовлення гістологічних зрізів та довготривалого зберігання зразків ікри. З використанням класичних методик парафінування зразків ікри риб виникає ряд складнощів, пов'язаних з тривалістю процесу проведення зневоднення ікри, який може розтягнутися майже на тиждень. Також використання етилового спирту робить проби ікри крихкими, що часто веде до втрати дослідних зразків. До того ж використання етилового спирту та дорогих або часто обмежених для використання органічних речовин (хлороформ, ксилол) робить процес проведення зневоднення досить дорогим. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб зневоднення та парафінування ікри риб для виготовлення гістологічних зрізів, який має ряд суттєвих переваг під час виготовлення гістологічних зрізів та скорочує час проведення парафінування проб. В гістології позитивних результатів досягнуто шляхом застосування ізопропілового спирту [Печкуренко А.Л. Метод обезвоживания и заливки гистологического материала в парафин и окраска срезов с применением изопропилового спирта / Печкуренко А.Л., Куликов И.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 1998. -№1. - С. 69-70]. Спосіб базується на зневодненні дослідних тканин під час пробопідготовки за допомогою абсолютизованого ізопропанолу (ізопропілового спирту) 99,7 %-ої концентрації, до якого додається октилфеноксиполіетоксіетанол (Тритон X15). При проведенні зневоднення на основі ізопропанолу не застосовується використання ксилолу, хлороформу та інших проміжних розчинів, що значно спрощує і здешевлює процес. Для уникнення появи артефактів після цього процесу (слабке розшарування колагенової тканини і невеликі зміни жирової тканини) на відміну від класичної методики, через етилові спирти з використанням проміжних розчинів, до ізопропілового спирту необхідно додавати невелику кількість неіоногенних поверхнево активних речовин (Тритон X15) у співвідношенні 1:10000. Спосіб здійснюється наступним чином. 1. Риб препарують скальпелем або ножицями з черевної сторони, статеві залози повністю виймають та зважують. Після цього з однієї половинки яєчника беруть три шматочки (по краях 3 та з середини) об'ємом не більше як 1 см , кожен фіксують в 10 %-му нейтральному розчині формаліну. 2. Перед парафінуванням фіксованого матеріалу його промивають під проточною водою протягом 24 годин та проводять його зневоднення за наступною схемою: 1 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-1 година 2 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-2 години 3 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-3 години 4 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-4 години 5 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-5 годин 1 UA 96885 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 6 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-5,5 годин 7 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-6 годин 8 зміна: 99,7 %-ий ізопропіловий спирт + Тритон X15-5,5 годин. Зневоднення фіксованого матеріалу краще всього проводити у високих скляних циліндрах з притертою пробкою, так, щоб тканина (шматочки статевих залоз) знаходилася не менш як на 1-2 см нижче рівня суміші реактивів. 3. Після зневоднення матеріал переносять до парафіну (змінюється тричі) для заливання: 1 заливання: парафін 60 °C-1,5 години 2 заливання: парафін 60 °C-1 година 3 заливання: парафін 60 °C-1 година Для парафінування зневодненої тканини і приготування блоків необхідно застосовувати фільтрований і пластифікований парафін або готові суміші. Заливання об'єктів в парафін проводять з використанням годинникового скла. До того як заливати парафін, чисте знежирене годинникове скло необхідно змастити гліцерином. Потім наливають гарячий парафін та нагрітим пінцетом переносять до нього об'єкт, що заливається. 4. Скло разом із залитим об'єктом тримають над холодною водою, яку попередньо наливають до широкої місткості, потім поступово опускають на дно. 5. Залиті в парафін об'єкти наклеюють на спеціальні дерев'яні блоки та ріжуть на мікротомі. Приклад. Заявлений спосіб випробували на базі кафедри загальної біології та водних біоресурсів Дніпропетровського національного університету імені Олеся Гончара. Для проведення гістологічних досліджень було відібрано та опрацьовано близько 100 біологічних зразків ікри різних видів риб (плітка, лящ, сазан, короп, карась сріблястий, окунь, судак, білий товстолобик, сонячний окунь), які відбирали на різних стадіях зрілості статевих продуктів протягом 2012-2013 pp. Зневоднення та парафінування матеріалів для виготовлення гістологічних зрізів проводили як класичними методами з використанням етилового спирту [Шихшабеков М.М. Методические указания по определению стадий зрелости яичников и семенников рыб [Текст] / М.М. Шихшабеков. - М., 1984. - 22 с.; Микодина Е. В. Гистология для ихтиологов: Опыт и советы [Текст] / Е. В. Микодина, М. А. Седова, Д. А. Чмилевский, А. Е. Микулин, С. В. Пьянова, О. Г. Полуэктова. - М.: Изд-во ВНИРО, 2009. - 112 с.], так і заявленим способом. В результаті досліджень встановлено, що гістологічні зрізи ікри, підготовлені з використанням заявленого способу відрізнялися кращою якістю, добре профарбовувалися та майже не мали побічних артефактів. Також відмічено, що заявлений спосіб можна використовувати на статевих продуктах риб, які майже готові до нересту (IV-V стадія зрілості гонад), коли в ікринках міститься велика кількість білків, через що ікринки розкришуються при використанні етилового спирту як зневоднювача (креслення). На кресленні гістологічна картина ікри ляща, проба відібрана 15.04.2013 р. У Запорізькому водосховищі (перед нерестом риб, на завершенні IV стадії зрілості гонад): А - зневоднення та парафінування проводилося з використанням етилового спирту, внутрішня частина ікринки повністю втрачена, клітинні елементи неможливо дослідити; Б - зневоднення та парафінування проводилося згідно з заявленим способом, ікринки цілі, добре профарбовуються, видно клітинні елементи. Таким чином, заявлений спосіб оброблення ікри риб під час виготовлення гістологічних зрізів може бути використаний в гістологічній практиці, як в умовах автоматичного оброблення проб, так і за ручного опрацювання матеріалу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 60 Спосіб зневоднення та парафінування ікри риб для виготовлення гістологічних зрізів, що включає пробопідготовку зразків ікри з метою створення парафінових блоків для гістологічних зрізів, який відрізняється тим, що дослідні зразки гонад риб зневоднюють та парафінують з використанням абсолютизованого ізопропілового спирту 99,7 %-ї концентрації з додаванням октилфеноксиполіетоксіетанолу (Тритон X15) в співвідношенні 1:10000, в розчині яких проби витримують по декілька годин, після чого їх переносять до парафіну для заливки за наступною схемою: 1 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-1 година; 2 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-2 години; 3 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-3 години; 4 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-4 години; 5 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-5 годин; 2 UA 96885 U 5 6 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-5,5 годин; 7 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-6 годин; 8 зміна: 99,7 %-й ізопропіловий спирт + Тритон X15-5,5 годин, 1 заливка: парафін 60 °C - 1,5 години; 2 заливка: парафін 60 °C - 1 година; 3 заливка: парафін 60 °C - 1 година. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3