Спосіб розмноження рослин міскантусу з насіння з низькою схожістю та життєздатністю

Реферат: UA 97957 U UA 97957 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільського господарства та біоенергетики і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології та селекції для отримання цінних селекційних матеріалів міскантусу з насіння з низькою схожістю та життєздатністю. Рослини родини міскантус належать до рослин короткого дня, які починають цвісти у вересні - жовтні місяцях. Насіння, яке утворюється в цей період, характеризується дуже низькою схожістю та життєздатністю. Насіння, що отримують за вирощування рослин у теплицях, досить дороге та швидко втрачає життєздатність та схожість. Насіння з низькою життєздатністю проростає, але проростки дуже маленькі, слабкі, рослини з них не розвиваються і через деякий проміжок часу гинуть Таке насіння не може забезпечити відтворення та розмноження рослин. Традиційне розмноження міскантусу шляхом висіву кондиційного насіння в ґрунт не забезпечує високого коефіцієнта розмноження тому, що з одного насіння отримують тільки одну рослину. Найбільш близьким до пропонованої корисної моделі є відомий спосіб регенерації міскантусу китайського із калусу [Eun Soo Seong, Ji Hye Yoo, Hyun Young Kil, Jae Geun Lee, and Chang Yeon Yu Establishment of a Regeneration System by Callus Induction from Explants of Miscanthus sinensis // J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 2010. - 53 № 6. - P. 661-667], де як рослинні експланти для отримання калусних культур використовують різні експланти бруньки, гілочки, квітки та, зокрема, дозріле насіння міскантусу китайського, яке стерилізують за допомогою 6 % гіпохлориду натрію протягом 10 хвилин, промивають тричі стерильною водою. Експланти інкубують при 16 годин світла 8 годин темряви фотоперіоді, температурі 25 °C з -2 освітленням 45 μmol м білими флуоресцентними лампами. Найбільшу кількість калусів отримують, використовуючи середовища Гамборга - В5 або Чу, модифіковані за вмістом регуляторів росту, а саме - з додаванням 2,4-Д - 2 мг/л. Як регенераційне середовище використовують середовище Мурасіге-Скуга модифіковане - сахарози - 20 г/л + гельриту - 3 г/л + БАП-5 мг/л + НУК - 0,24 мг/л або 2,4Д - 1 мг/л [Holme, I.B. and K.K. Petersen, Callus induction and plant regeneration from different explant types of Miscanthus-ogiformis Honda Giganteus. Plant Cell Tissue Organ Cult., 1996. - 45: 43-52], на якому через 4 тижня отримують 50 рослин з кореневою системою. Відомий та пропонований способи розмноження в культурі in vitro мають спільні суттєві ознаки: - використання гіпохлориду натрію для стерилізації насіння міскантусу; - отримання калусів з насіння міскантусу в культурі in vitro, що передбачає висаджування експлантів на живильне середовище з макро-мікроелементами, вітамінами та додаванням регуляторів росту 2,4-Д, НОКу певних дозах; - культивування калусів на регенереційному живильному середовищі з макромікроелементами, вітамінами, з додаванням регуляторів росту - 6-БАП, НОК, 2,4-Д та у певних дозах та регенерація мікророслин. Але відомий спосіб не забезпечує отримання морфогенних калусів міскантусів in vitro з насіння з низькою схожістю та життєздатністю, тому що призначений для отримання калусів з дозрілого якісного насіння, яке для ініціації та розвитку калусних тканин потребує певного складу та співвідношення інгредієнтів, зокрема регуляторів, у живильному середовищі; В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб розмноження мискантусів з насіння з низькою життєздатністю in vitro шляхом висаждування насіння на живильні середовища певного складу, стимуляції отримання морфогенних калусів та мікророслин. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, отримання калусів та мікророслин міскантусів в умовах in vitro, що включає стерилізацію насіння, висажування його на живильне середовище певного складу, отримання калусів та відтворення мікророслин. Згідно з корисною моделлю, як експланти використовують насіння з низькою схожістю та життєздатністю, яке в інших умовах не спроможне забезпечити відтворення рослин міскантусу, яке висаджують на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням вітамінів: тіамін - 1 мг/л, піридоксин - 1 мг/л, нікотинової кислоти - 1 мг/га та аскорбінової кислоти - 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тірозину - 1-10 мг/л, аргініну - 220 мг/л, гідроксипроліну - 1-5 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л, БАП - 0,2-0,8 мг/л та АБК 0,1-0,4 мг/л, культивують за температури 24-30 °C та відносній вологості повітря 50-70 %; після появи калусу його пересаджують на середовище з іншим складом і залишають до тих пір, поки не з'являться пагони з корейцями та утворені мікророслини не підростуть до 1-3 см. Тоді їх обережно відокремлюють від калусної маси та пересаджують на інше живильне середовище для підрощування. Новими суттєвими ознаками корисної моделі є: - отримання рослин міскантусу з насіння з низькою схожістю та життєздатністю; 1 UA 97957 U 5 10 15 20 25 30 35 40 - використання гіпохлориду натрію у більш низькій концентраціях 1-2 % замість 6 % для запобігання ушкодження слабких проростків міскантусу; - склад живильного середовища для стимуляції утворення калусів з насіння з низькою схожістю та життєздатністю - модифіковане середовище Мурасиге-Скуга (1/2 дози макроелементів, мікроелементи у повній дозі) з додаванням амінокислот: глютамінової - 250500 мг/л, аспарагінової - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 24 мг/л, регуляторів росту: 6-БАП - 0,5-0,8 мг/л, 2,4-Д - 1,0-2,0 мг/л, або НОК - 0,1-1,0 мг/л, та АБК 0,1-0,4 мг/л, без мальтози. - склад живильного середовища для регенерації мікророслин з калусу - модифіковане агаризоване середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та мікроелементи у повній дозі, до складу якого додатково вводять: тіамін - 0,1-0,5 мг/л, піридоксин - 0,1-0,5 мг/л, нікотинову кислоту - 0,5 мг/л, аскорбінову кислоту - 1 мг/л, глютамінову амінокислоту - 250300 мг/л, 6-БАП - 1,0-3,0 мг/л, НОК 0,3-1,0 мг/л; Відмінні від прототипу (нові суттєві ознаки) при взаємодії з відомими дозволяють отримати рослини міскантусу з насіння з низькою схожістю та життєздатністю в умовах in vitro. Спосіб отримання рослин міскантусу з насіння з низькою схожістю та життєздатністю здійснюється таким чином. Насіння стерилізують розчином 1-2 % гіпохлориду натрію протягом 15-25 хвилин. Стерильне насіння міскантусу висаджують на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів, вітаміни: тіамін - 0,1-0,5 мг/л, піридоксин 0,1-0,5 мг/л, нікотинову кислоту - 0,5 мг/л, - 1,0 мг/л та аскорбінову кислоту - 1 мг/л, з додаванням амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової - 30-50 мг/л, тирозину - 110 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та 6БАП - 0,3-0,8 мг/л. Культивують насіння після висаджування на живильне середовище за температури 22-30 °C та відносній вологості повітря 50-80 %. Після появи калусу його переносять на друге середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить вітаміни: тіамін 10,0 піридоксин - 1,0 мг/л, нікотинову та аскорбінову кислоти по 1 мг/л та регулятор росту 6-БАП - 0,5-1,5 мг/л і витримують до появлення первинних корінців, бруньок та пагонів. Після того, як пагони досягнуть заввишки 2-3 см їх відокремлюють від калусної маси і пересаджують на середовище для розмноження або депонування. Дані, що наведені в таблиці, свідчать, що модифікація живильних середовищ за вмістом макро-мікроелементів, вітамінів, амінокислот, регуляторів росту та інших домішок надала змогу отримати мікророслини з насіння з низькою схожістю та життєздатністю, сприяла підвищенню як кількості отриманих калусів, так і частоті регенерації рослин з калусу. Зокрема, кількість отриманих калусів з насіння, що проросло, зросла до 100 %, а частота регенерації залежно від виду міскантусу - китайський чи цукроквітковий, до 50-100 %, тоді як ці показники за використання середовищ відомого способу для стимуляції калусогенезу у зрілого насіння міскантусу китайського складали 13, 3-31,2 % та 20 % відповідно. Збільшилась також кількість мікророслин, отриманих через 4 тижня культивування калусу на регенераційному середовищі, яка зросла з 50 шт. до 60-70 або на 10-20 %. Таблиця Вплив складу живильного середовища на калусогенез, частоту регенерації та кількість отриманих мікророслин Вид Міскантус китайський Міскантус китайський Міскантус цукроквітковий Склад живильних середовищ для отримання калусів та регенерації рослин Відомий спосіб Кількість Кількість мікророслин, отриманих отриманих через 4 тижня Частота калусів, в % від культивування калусу на регенерації, % насіння, що регенераційному проросло середовищі, шт. 13,3±0,120±0,3 % 50 31,2±0,2 Пропонований 100,0 50,0±0,7 % 60-70 Пропонований 100,0 100,0 60-70 Таким чином, для міскантусів китайського та цукроквіткового показник регенерації рослин зріс як за рахунок підвищення індукції калусогенезу, так і регенерації рослин з калусу. 2 UA 97957 U Впровадження запропонованої корисної моделі забезпечить отримання цінних селекційних матеріалів міскантусу з насіння з низькою схожістю і життєздатністю та високий коефіцієнт їх розмноження, що значно прискорить селекційний процес. 5 10 15 20 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб розмноження рослин міскантусу з насіння з низькою схожістю та життєздатністю, що включає використання як експлантів насіння міскантусу, застосування гіпохлориду натрію для його стерилізації насіння, висаджування насіння на тверде живильне середовище з макромікроелементами та додаванням регуляторів росту 2,4-Д, НОК у певних дозах, отримання калусів міскантусу в культурі in vitro, культивування калусів на регенереційному модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга з 6-БАП, НОК або 2,4Д, сахарозою, та регенерацію мікророслин, який відрізняється тим, що як експлантів використовують насіння з низькою схожістю та життєздатністю, для запобігання ушкодження слабких проростків міскантусу для його стерилізації застосовують гіпохлорид натрію в знижених концентраціях 12 % замість 6 %, калуси отримують використовуючи модифіковане середовище Мурасіге-Скуга (1/2 дози макроелементів, мікроелементи у повній дозі) з додаванням амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової - 30-50 мг/л, тірозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, вітамінів: тіаміну, піридоксину, нікотинової та аскорбінової кислот по 1 мг/л, регуляторів росту: 6-БАП - 0,5-0,8 мг/л, АБК - 0,1-0,4мг/л, 2,4-Д - 1-2,5 мг/л, або 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та НОК - 0,1 - 1 мг/л, або 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та ІОК - 0,5-1 мг/л, сахарози - 40 г/л, агару - 8 г/л, середовище не містить мальтозу та гельрит, для регенерації мікророслин з калусу використовують модифіковане агаризоване середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та мікроелементи у повній дозі, до складу якого додатково вводять: тіамін - 0,10,5 мг/л, піридоксин - 0,1-0,5 мг/л, нікотинову кислоту - 0,5 мг/л, аскорбінову кислоту - 1 мг/л, глютамінову амінокислоту - 250-300 мг/л, 6-БАП - 1,0-3,0, НУК 0,3-1,0 мг/л, сахарозу - 40 г/га, агар - 8 г/л, на якому через 4 тижні отримують 60-70 мікророслин. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3