Спосіб отримання гаплоїдних рослин міскантусу

Реферат: UA 80647 U UA 80647 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, зокрема для створення, розмноження і отримання розсади цінних селекційних матеріалів. Роль гаплоїдних рослин в селекції дуже велика. Застосування їх дозволяє швидше знайти потрібну цінну комбінацію, скорочує час для створення сорту. Гаплоїди використовуються для отримання стабільних гомозиготних ліній. Для мутагенезу також зручніше використовувати гаплоїди, оскільки на гаплоїдному рівні полегшується відбір рецесивних мутацій. У диплоїдних рослин мутації рідко зачіпають обидва алельних гени в гомологічних хромосомах. Рослина зазвичай гетерозиготна (два гени розрізняються), при цьому виявляється дія тільки домінантного (але не рецесивного) гена. Оскільки мутації частіше рецесивні, ніж домінантні, їх досить складно виявити. У гаплоїдних же рослинах, які містять тільки одну з кожної пари гомологічних хромосом, мутації проявляються негайно. Селекція на гаплоїдному рівні дозволяє вести прямий відбір не тільки домінантних, але і рецесивних ознак. Гаплоїдні рослини стерильні, але можна штучно подвоїти набір їх хромосом за допомогою колхіцину і отримати дигаплоїдні гомозиготні рослини. Гаплоїди можуть виникати спонтанно, але частота їх спонтанного виникнення дуже мала. Найчастіше гаплоїдизація викликана саме штучним шляхом з використанням методів in vitro вдається отримати великі кількості гаплоїдних рослин. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб (Редько В.І., Роїк М.В., Недяк Т.М., Бех Н.С. Одержання гаплоїдних рослин цукрових буряків з ізольованих недозрілих зачатків // Цукрові буряки. - К.: № 6.-2006. - С. 23-26). За цього відомого способу проводять попередню холодову обробку квіткових пагонів при температурі +4 °C до 8 діб. Для стерилізації пагонів з пуп'янками використовують 5-10 % розчином хлораміну протягом 30 хвилин, потім промивають стерильною водою. Ізолювання насіннєвих зачатків із закритих пуп'янків проводять в асептичних умовах під стереоскопічним мікроскопом МБС-1 або збільшуваною лупою, відриваючи пінцетом пуп'янок від пагона і руйнуючи голкою шар паренхімних клітин нижньої частини зав'язі та висаджують їх на модифіковане живильне середовище Гамборга і Евелега (В5), доповнене біотином 10,0 мг/л, НОК 0,5 мг/л, дропом 1,0 мг/л. Культивування незапліднених насіннєвих зачатків відбувається упродовж 2-3 тижнів у темряві за температури 27-33 °C, а потім при 16-годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк. Відомий і пропонований способи отримання гаплоїдних рослин мають спільні ознаки: попередня холодова обробка вихідного матеріалу при температурі +4 °C, стерилізація матеріалу, вилучення незапліднених насіннєвих зачатків, приготування живильних середовищ. Однак, відомий спосіб одержання гаплоїдних рослин цукрових буряків з ізольованих недозрілих зачатків не дає можливості отримати достатньої кількості стерильних життєздатних проростків та не забезпечує індукції гаплоїдних рослин у міскантусу. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб отримання гаплоїдних рослин міскантусу, що дозволить отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу та удосконалити стерилізацію рослинного матеріалу і склад живильного середовища. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі стерилізують пагони з пуп'янками 5-10 % розчином хлораміну протягом 30 хвилин, потім промивають стерильною водою. Попередньо проводять холодову обробку квіткових пагонів при температурі +4 °C до 8 діб. Ізолювання насіннєвих зачатків із закритих пуп'янків проводять в асептичних умовах під стереоскопічним мікроскопом МБС-1 або збільшуваною лупою, відриваючи пінцетом пуп'янок від пагона і руйнуючи голкою шар паренхімних клітин нижньої частини зав'язі, та висаджують їх на модифіковане живильне середовище Гамборга і Евелега (В 5), доповнене біотином 10,0 мг/л, НОК 0,5 мг/л, дропом 1,0 мг/л. Культивування відбувається упродовж 2-3 тижнів у темряві за температури 27-33 °C, а потім при 16-годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 20003000 лк. У запропонованому способі використовують сегменти волоті, із яких вилучають незапліднені насіннєві зачатки міскантусу, яким попередньо проводять холодову обробку при температурі +4 °C до 2 діб та стерилізують їх 35 % розчином Білизни за експозиції 40 хвилин і промивають дистильованою водою, що дозволяє отримати 82 % стерильного матеріалу. Використовують модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з доданням БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, дроп - 0,5 мг/л та цукрози 30 г/л. Культивування за температури 24±2 °C у темряві упродовж 2 тижнів, а потім при 16-годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк. Новими відмінними від існуючого найближчого аналога ознаками є: введення в стерильну культуру сегментів волоті міскантусу; використання для стерилізації Білизни - 35 %; експозиція 40 хвилин; 1 UA 80647 U 5 10 15 20 додавання у середовище для морфогенезу БА - 0,5 мг/л та цукрози 30 г/л, ІОК - 0,5 мг/л, дроп - 0,5 мг/л; використання цукрози; культивування у темряві упродовж 2 тижнів. Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими дозволяють отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу, удосконалити та знизити затрати на стерилізацію вихідного матеріалу і склад живильного середовища. Ефективність нового способу отримання гаплоїдних рослин міскантусу вивчали на п'яти сортах: New, Late, Sinensis, Sachariflorus, Early. Згідно результатів досліджень видно, що використання розчину Білизни 35 % за експозиції 40 хвилин забезпечує стерильність експлантів на 82 %. Застосування розчину Білизни в такій концентрації та експозиції перевищили показники, які були отримані у відомому способі. Зміна та модифікування живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, дроп - 0,5 мг/л та цукрози 30,0 г/л дозволили отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу. Спосіб отримання гаплоїдних рослин міскантусу здійснюється таким чином: вихідним матеріалом слугують сегменти волоті міскантусу, які піддають холодовій обробці при температурі +4 °C до 2 діб. Стерилізують їх 35 % розчином Білизни за експозиції 40 хвилин і промивають дистильованою водою, що дозволяє отримати 82 % стерильного матеріалу. Пересаджують стерильні зачатки на модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга (БА 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, дроп - 0,5 мг/л, цукроза - 30,0 г/л) та культивують за температури 24±2 °C у темряві упродовж 2 тижнів, а потім культивують при довжині фотоперіоду 16 годин і інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк (табл.). Таблиця Показники ефективності використання запропонованого способу отримання гаплоїдних рослин міскантусу Показники Стерилізація, % Експозиція, хвилин Експлант Холодова обробка, діб Стерильність експлантів, % Мінеральна основа середовища БА мг/л ІОК мг/л НОК мг/л Дроп, мг/л Біотин, мг/л Індукція гаплоїдів, % Цукроза, г/л Температура холодової обробки, °C Довжина фотоперіоду, годин Температура культивування, °C Відомий спосіб Хлорамін - 5-10 % 30 пагони 8 53,0 В5 0,5 1,0 10,0 63,0 4 16 24±2 Запропонований спосіб Білизна - 35 % 40 сегменти волоті 2 82,0 MS 0,5 0,5 0,5 72,0 30,0 4 16 24±2 25 Впровадження запропонованої корисної моделі дає можливість отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу, удосконалити та знизити затрати на стерилізацію вихідного матеріалу і склад живильного середовища. 30 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання гаплоїдних рослин міскантусу, що включає попередню холодову обробку вихідного матеріалу при температурі +4 °C, стерилізацію матеріалу, вилучення незапліднених насіннєвих зачатків, приготування живильних середовищ, який відрізняється тим, що як експлант використовують сегменти волоті міскантусу, які стерилізують 35 % розчином Білизни за експозиції 40 хвилин, проводять культивування у темряві упродовж 2 тижнів, для індукції морфогенезу на модифікованому живильному середовищі за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням БА - 0,5 мг/л, IOК - 0,5 мг/л, дропу - 0,5 мг/л і 30 г/л цукрози. 2 UA 80647 U Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3