Спосіб отримання поліплоїдних рослин міскантусу

Реферат: UA 79703 U UA 79703 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, зокрема для створення вихідних матеріалів, розмноження і отримання розсади цінних селекційних матеріалів. Поліплоїдизація - це збільшення числа хромосом в ядрі, є наслідком нерозходження хромосом в анафазі або результатом ендомітозу (закритого мітозу), що протікає всередині ядра. Замість двох ядер утворюється одне, в якому число хромосом стає в два рази більшим, ніж у вихідному ядрі. Таким чином, з диплоїдної клітини (2n) утворюється тетраплоїдна (4n). Надалі число хромосом може зростати і одне ядро може містити безліч хромосомних наборів (8n, 16n, 32n; та навіть до 4000n, 6000n, наприклад, в макронуклеус у інфузорій). Причини нерозходження хромосом різноманітні. В експериментальних умовах нерозходження хромосом можна викликати шляхом впливу на клітини мітозними отрутами. До мітозних отрут належать: колхіцин, вінбластин, аценафтен та ін. Мітозні отрути руйнують мікротрубочки веретена розподілу, що робить неможливим нормальне розходження хромосом в мітозі або мейозі. Поліплоїдні клітини можна отримувати, використовуючи рентгенівське опромінення, підвищені або знижені температури, деякі хімічні речовини (ефір, хлороформ). У той же час, зустрічається і спонтанна поліплоїдизація, яка відбувається без видимих причин. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб індукування поліплоїдії у райграсу (Пат. № 2080060. РФ, опубл. 23.05.91. Бюл. 19. А01Н 1/08. Способ индуцирования полиплоидии у рейграса). Даний метод базується на тому, що як вихідний матеріал використовують рослини, які вирощені у польових умовах в фазі переходу конуса наростання в суцвіття (III етап органогенезу). Їх поміщають в спеціальні касети (300×50 мм). Рослини у касетах зрізують на 1020 мм від конуса наростання і занурюють у розчин 0,2 % колхіцину і 0,1 % папаїну. Обробку рослин проводять в термостаті або кліматичній камері за температури 24±2 °C протягом доби. На другу добу розчин зливають з касет і рослини перевертають вниз та витримують при температурі 24±2 °C ще дві доби. В подальшому рослини висаджують у ґрунт. Вихід поліплоїдних рослин в середньому становить 62,0 %. Відомий і пропонований способи індукування поліплоїдії мають спільні ознаки: використання колхіцину, пересадка рослин у ґрунт. Проте, відомий спосіб індукування поліплоїдії у райграсу є доволі трудомістким та токсичнонебезпечним, так як обробку рослин проводять розчином колхіцину та папаїну; включає використання касет та інкубування у термостаті рослин протягом доби і ще дві доби рослини знаходяться у розчині, не забезпечує високого виходу та потребує довшого терміну отримання поліплоїдних форм. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб отримання поліплоїдних рослин міскантусу, що дасть можливість отримати 81,0 % поліплоїдних форм, зменшити затрати та удосконалити процес обробки, пришвидшити процес поліплоїдизації і отримати розсаду, яку можна пересаджувати у ґрунт. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі індукування поліплоїдії у райграсу використовують рослини у фазі переходу конуса наростання в суцвіття, які вирощують у польових умовах. Їх поміщають в спеціальні касети (300×50 мм) та зрізають на 10-20 мм від конуса наростання і занурюють у розчин (0,2 % колхіцину і 0,1 % папаїну) таким чином, щоб вузол кущіння знаходився по краю касети, а коренева система між смугами касет, щоб на неї не попадав розчин. Обробку рослин проводять в термостаті або кліматичній камері за температури 24±2 °C протягом доби. Розчин зливають з касет на другу добу і рослини перевертають вниз та витримують при температурі 24±2 °C ще дві доби для інтенсивного наростання, після якого їх висаджують у ґрунт. Вихід поліплоїдних рослин в середньому становить 62,0 %. Запропонований спосіб отримання поліплоїдних рослин міскантусу включає використання пагонів міскантусу, отриманих клональним мікророзмноженням, які висаджують на середовище за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням колхіцину 0,02 % за експозиції 12 годин, що забезпечує отримання виходу 81 % поліплоїдних форм. В подальшому пагони пересаджують на модифіковане живильне середовище без колхіцину (три пасажі), проводять їх цитологічний аналіз та відбирають цінні форми для укорінення. Укорінюють рослини на модифікованому живильному середовищі Мурасіге і Скуга з додаванням НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л. Культивування проводять за температури 24±2 °C та при довжині фотоперіоду 16 годин. Новими відмінними від існуючого найближчого аналога ознаками є: експлант - пагони міскантусу, отримані із in vitro; концентрація колхіцину - 0,02 %; експозиція - 12 годин; використання живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга; 1 UA 79703 U додавання у середовище для розмноження БА - 0,5 мг/л, кінетину - 1,0 мг/л та цукрози 30 г/л; 5 10 15 20 25 30 використання цукрози; для укорінення рослин додавання НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л; Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими дозволяють отримати високий відсоток поліплоїдних рослин, здешевити та удосконалити спосіб їх отримання, зменшити додатковий етап інкубування у термостаті, пришвидшити отримання поліплоїдних форм. Ефективність нового способу отримання поліплоїдних рослин міскантусу вивчали на таких матеріалах: New, Late, Sinensis, Sachariflorus, Early. З отриманих результатів досліджень видно, що використання культуральних рослин міскантусу дає змогу скоротити етапи, такі як: викопування рослин та висаджування їх у касети. Слід відзначити, що також не доцільно використовувати суміш речовин колхіцину і папаїну, тому що культуральним рослинам достатньо лише одного колхіцину в концентрації 0,02 % та експозиції 12 годин, а не добу, як пропонують у відомому способі. Результати досліджень свідчать, що можна знехтувати додатковим етапом індукування у термостаті рослин. Крім того, введення у склад живильного середовища колхіцину забезпечує здешевлення та зниження токсичності способу індукції поліплоїдизації і виключає обприскування матеріалу. Сукупність усіх удосконалених факторів забезпечує високий вихід поліплоїдних форм (81,0 %) та скорочує термін їх отримання. Спосіб отримання поліплоїдних рослин міскантусу здійснюється таким чином: за вихідний експлант використовують пагони міскантусу, які отримали клональним мікророзмноженням у культурі in vitro. Їх пересаджують на модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга, у яке додають колхіцин 0,02 % за експозиції 12 годин. В подальшому пагони пересаджують для розмноження (три пасажі) на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням БА - 0,5 мг/л, кінетину - 1,0 мг/л, цукрози - 30,0 г/л. Клоновані рослини культивують в термальних приміщеннях при температурі 24±2 °C, освітленні 3000-4000 лк, відносній вологості 65-70 % та фотоперіоді - 16 годин. Цитологічний аналіз, який проводять на пагонах, дає змогу відібрати цінний матеріал, який укорінюють на середовищі за прописом Мурасіге і Скуга із додаванням НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрозою 30 г/л. Даний спосіб забезпечує отримання 81,0 % поліплоїдних форм міскантусу. Таблиця Спільні та відмінні показники отримання поліплоїдних рослин Показники Експлант Відомий спосіб рослини 24 0,2 і 0,1 колхіцин і папаїн 300 × 50 20,0 24±2 1 62,0 Експозиція, години Концентрація поліплоїдизуючої речовини, % Речовина для поліплоїдизації Касети, мм БА мг/л Кінетин, мг/л ІОК мг/л НОК мг/л Цукроза, г/л Температура, °C Інкубування в темноті, доба Вихід поліплоїдних форм, % 35 Запропонований спосіб культуральні пагони 12 0,02 колхіцин 0,5 1,0 0,6 0,8 30,0 24±2 81,0 Впровадження запропонованої корисної моделі дозволить отримати високий відсоток поліплоїдних рослин, здешевити та удосконалити спосіб їх отримання, зменшити додатковий етап інкубування у термостаті, пришвидшити отримання поліплоїдних форм. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб отримання поліплоїдних рослин міскантусу, що включає використання колхіцину, пересадку рослин у ґрунт, який відрізняється тим, що використовують культуральні пагони міскантусу, які пересаджують на середовище з колхіцином в концентрації 0,02 % та експозиції 2 UA 79703 U 12 годин, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БА - 0,5 мг/л, кінетин 1,0 мг/л, цукрозу - 30,0 г/л, для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають ІОК і НОК - 0,6 і 0,8 мг/л і 30 г/л цукрози, культивування проводять при 16-годинному фотоперіоді за температури 24±2 °C з інтенсивністю освітлення 3000-4000 лк, відносній вологості 65-70 %. 5 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3