Спосіб підвищення виживання сперміїв

Реферат: Спосіб підвищення виживання сперміїв полягає у розбавленні сперми із додаванням до лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача L-карнітину в кількості 0,25 мг/мл разом із відновленою формою глутатіону в концентрації 2,5 мМ. UA 98071 U (12) UA 98071 U UA 98071 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, безпосередньо до штучного осіменіння великої рогатої худоби, і може бути використана на станціях штучного осіменіння сільськогосподарських тварин для забезпечення збереженості, тривалого виживання та підвищення запліднювальної здатності сперміїв. Відомо, що одним із перспективних напрямків біотехнології останніх десятиріч є дослідження властивостей еякульованої сперми та її збереження. При обробці еякулятів порушується фізіологічний перебіг біохімічних процесів у сперміях — активуються мембранозв'язані ферменти, зростає вільнорадикальне окиснення жирних кислот, руйнуються ліпопротеїнові комплекси і, як наслідок, мембрани статевих клітин [4]. Вказані зміни призводять до окисного навантаження і, як результат, зниження резистентності та рухливості сперміїв, втрати їхньої запліднювальної здатності. За цих умов важливе значення у збереженні структурної цілісності і виживання сперміїв має ефективне функціонування антиоксидантної системи захисту [7]. У спермі тварин функцію антиоксидантного захисту виконує плазма сперми, яка вміщує значну кількість ферментних (супероксиддисмутазу, каталазу, глутатіонпероксидазу) та неферментних (глутатіон, вітаміни С і Е) антиоксидантів, серед яких відмічають карнітин, які захищають спермії від окислювального стресу [2, 8]. Оскільки в процесі технологічної обробки сперми антиоксидантний захист послаблюється, а окремі його ланки втрачаються [6], тому, цілком логічним є використання таких речовин, як карнітин та глутатіон у складі розріджувачів сперми, що компенсує нестачу ендоплазматичних ензимів. Відомий спосіб обробки сперми бугаїв, взятий за найближчий аналог, згідно з яким, свіжоотриману сперму розбавляють синтетичним лактозо-жовтково-гліцериновим середовищем, яке складається, мас. %: глюкоза медична безводна - 2,412, натрій лимоннокислий тризаміщений п'ятиводний - 1,125, жовток курячих яєць - 16,077, вода дистильована - решта [1]. Недоліком даного способу є зниження біологічної повноцінності сперми при зберіганні у зв'язку з порушенням мембранних структур сперміїв, що спричиняє загибель сперміїв і низьке їх виживання. За виробничими даними сперма, розбавлена відомим середовищем, використовується на 70 % її об'єму. Нетривалий період життєздатності сперміїв знижує показник використання сперми високоцінних плідників і призводить до зайвих витрат реактивів на приготування середовища. Близьким за суттю найближчим аналогом є спосіб покращення якості сперми шляхом використання середовища для заморожування сперми бугаїв, що містить - 5 мМ відновленої форми глутатіону, 78 % збираного молока, 15 % курячого жовтка, 7 % гліцерину, 2 г фруктози, пеніцилін і стрептоміцин [5]. Використання молока у такому середовищі є не виправданим, оскільки воно має змінний біохімічний склад, який залежатиме від багатьох екзогенних факторів. Крім того, таке середовище не забезпечує збалансованості обмінних процесів у розбавленій спермі, високої життєздатності і запліднювальної здатності сперміїв. Відомий спосіб підвищення виживання сперміїв (Van Den El shout W. Method for improving the fertility of animals, EP 1714674 Al, 1PC A61K 31/715), за яким у середовище розрідження сперми додають суміш амінокислот - аланіну та тирозину. Недоліком даного способу є відсутність даних про дозу сполуки, яка могла б забезпечити підвищення тривалості існування й запліднювальної здатності сперміїв. Використання вищезазначених середовищ призводить до загибелі великої кількості сперміїв уже на етапі технологічної обробки еякулятів і не забезпечує високої запліднюваності корів. Запропонований нами спосіб підвищення виживання сперміїв передбачає використання в складі середовища для розбавлення і заморожування еякулятів протекторної добавки, яка містить L-карнітину в кількості 0,25 мг/мл разом із відновленою формою глутатіону в концентрації 2,5 мМ. Спосіб забезпечує підвищення виживання статевих клітин в процесі обробки, зберігання та після розморожування, що позитивно впливає на запліднювальну їх здатність, у порівнянні з найближчим аналогом. Причиною позитивного впливу поєднання Lкарнітину та відновленої форми глутатіону у запропонованому співвідношенні на якість статевих клітин є широкийспектр їх біохімічної дії на перебіг окисно-відновних процесів у спермі, а також їх антиоксидантні властивості. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб захисту сперміїв бугаїв, який би зменшував пошкодження їх мембранних структур при зберіганні сперми, забезпечував високе виживання і запліднювальну здатність статевих клітин. Поставлена задача вирішується тим, що за рахунок додавання до сперми речовин, що мають антиоксидантні властивості, зменшується накопичення агресивних форм Оксигену - NO , O2, ОН , НО2 та інших високотоксичних речовин, які руйнують клітинні структури, порушують обмінні процеси та знижують життєздатність статевих клітин. Біологічно активні речовини різної хімічної природи у складі розріджувача здатні знешкоджувати сперміцидальні продукти, які 1 UA 98071 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 утворюються під час технологічної обробки сперми, підтримувати функціональний стан НАДзалежної і термінальної ланок основного шляху дихання, нормалізуючи енергетичний обмін та зберігаючи оптимальний перебіг обмінних процесів, що й забезпечує високу ефективність захисної дії. Використання ж окремо, будь-якої із вищеназваних сполук як компонентів середовищ для розбавлення еякулятів бугаїв має дещо нижчу ефективність захисної дії. Технічне рішення по розробці способу підвищення виживання сперміїв основане на результатах досліджень. Приклад 1 В експерименті використовували проби сперми бугаїв, які належать Українській Генетичній Компанії "UGC", отримуваної на штучну вагіну. Еякуляти оцінювали за об'ємом (мл), 9 концентрацію (10 клітин/мл) і активністю сперміїв (бали). Для виявлення впливу компонентів розріджувача еякулят ділили на частини: контрольну розріджували лактозо-жовтковогліцериновим розріджувачем (ЛЖГР) 1:5 та дослідні - розріджені аналогічно, але у склад розріджувача першої дослідної групи додавали L-карнітину в кількості 0,25 мг/мл, а у розріджувач другої групи 0,25 мг/мл L-карнітину та відновлену форму глутатіону в концентрації 2,5 мМ. У розріджених еякулятах вивчали активність каталази та глутатіонпероксидази, активність окисних ферментів: сукцинатдегідрогенази (СДГ) та цитохромоксидази (ЦХО), дихальну активність сперми полярографічно (нг-атом О/хв…0,1 мл сперми) у термостатованій комірці (температура 38 °C) та виживання сперміїв при температурі 2-4 °C до припинення прямолінійного поступального руху (год.). [3]. Для встановлення частки спожитого Оксигену сперміями аеробним гліколізом використовували інгібітор натрію фторид, НАД-залежною ланкою ланцюга дихання мітохондрій - амітал і термінальною - натрію азид, а для визначення інтенсивності вільнорадикального окиснення ненасичених жирних кислот – Na2EDTA. Встановлено, що еякуляти бугаїв характеризуються об'ємом 4,1±0,21 мл, концентрацією 9 сперміїв 1,09±0,14 × 10 клітин/мл та рухливістю 7,2±0,18 бали. Додавання до розріджувача Lкарнітину стимулює активність каталази та глутатіонпероксидази у розбавленій спермі, які є вищими показників контролю, відповідно, на 42 % та 17 %. Інші зміни активності вищевказаних ферментів виявлені при додаванні до розріджувача L-карнітину разом із відновленою формою глутатіону, при чому спостерігалось зниження активності каталази та глутатіонпероксидази на 22 % та 25 %, порівняно із контролем. Очевидно, що у поєднанні із відновленим глутатіоном здійснюється потужніший антиоксидантний ефект і знижується навантаження на ферменти антиоксидантного захисту. Цей факт підтверджує гальмування вільнорадикального окиснення ненасичених жирних кислот у спермі розрідженій із антиоксидантами, на що вказують витрати Оксигену на вказаний процес. За дії доданих до розріджувача речовин вдвічі збільшується інтенсивність споживання Оксигену сперміями. Зокрема, при розбавленні еякулятів бугаїв розріджувачем "ЛЖГР + карнітин + глутатіон" величина спожитого Оксигену аеробним гліколізом знижується на 22 %, проте збільшується інтенсивність споживання Оксигену за рахунок НАД-залежної ланки мітохондрій та термінальною ланкою ланцюга дихання (цитохромокидазою). Отже, використання запропонованого розріджувача, порівняно з ЛЖГР, покращує транспорт електронів через термінальну ланку ланцюга дихання статевих клітин на акцептор - Оксиген та гальмує вільнорадикальне окиснення ненасичених жирних кислот. Виявлені відмінності транспорту електронів у ланцюгу дихання мітохондрій сперміїв підтверджуються активністю окисних ферментів. Висновки з проведеної роботи було зроблено за результатами виживання сперміїв при температурі 2-4 °C. Так, найвищі показники виживання статевих клітин встановлено у спермі, розбавленій середовищем "ЛЖГР + карнітин + глутатіон", що становило на 41 год. або на 35 % більше даного показника у контролі та на 7 год. більше, у порівнянні із виживанням у середовищі "ЛЖГР+ карнітин". Аналіз даних результатів щодо використання в розріджувачах сперми екзогенних антиоксидантів засвідчив, що додавання у складі лактозо-жовтково-гліцеринового середовища L-карнітину в кількості 0,25 мг/мл разом із відновленою формою глутатіону в концентрації 2,5 мМ чинить антиоксидантну дію, пригнічує інтенсивність продукування активних форм Оксигену, нормалізує активність ферментів, сприяє зростанню метаболічної активності гамет та підвищує виживання сперміїв. Джерела інформації: 1. Інструкція з організації і технології роботи станцій та підприємств по штучного осіменіння сільськогосподарських тварин. - М.: Колос.-1981.-159 с. 2 UA 98071 U 5 10 15 2. Кондратова Ю.А., Клепко А.В., Андрейченко С.В. Порівняльний аналіз якості сперми та вмісту L-карнітину, фруктози, цинку і аскорбату в сім'яній рідині чоловіків з різних регіонів України // Фізика живого. - Т. 18, №3.-2010. – С. 70-74. 3. Лабораторні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицини: довідник / за редакцією В. В. Влізло. - Львів: СПОЛОМ, 2012.-761 с. 4. Наук В.А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации//Кишинев. - „Штиинца".-1991.-198 с. 5. Славета Р., Ласковська Т. Вплив гяутатіону на активність і запліднювальну здатність сперміїв розмороженої сперми бугаїв // Відтворення тварин.-1887. -№ 13.-С. 249-253. 6. Donnelly E.T. Differences in nuclear DNA fragmentation and mitochondrial integrity of semen and prepared human spermatozoa / E.T. Donnelly, M. O'Connell, N. McClure//Human Reproduction2000.-V. 15.N.7.-P. 1552-1561. 7. Ford W.C. Regulation of sperm function by reactive oxygen species // Human eproduction.2004. - Vol. 10-N.5. - P.387-399. 8. Potts R. J., Notarianni L. J., Jefferies T. M. // Mutation Research / Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis.-2000.-447, N 214. - P. 249-256. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб підвищення виживання сперміїв полягає у використанні L-карнітину в кількості 0,25 мг/мл разом із відновленою формою глутатіону в концентрації 2,5 мМ у складі лактозо-жовтковогліцеринового середовища для розбавлення сперми. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3