Спосіб визначення реологічних властивостей жовчі у хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з неалкогольним стеатогепатитом та ожирінням

Реферат: Спосіб визначення реологічних властивостей жовчі у хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з неалкогольним стеатогепатитом та ожирінням, що включає дослідження та визначення рівня жовчних кислот, причому шляхом дуоденального зондування отримують жовч і визначають в ній вміст таурохолевої суміші, таурохенодезоксихолевої та тауродезоксихолевої кислот, концентрацію вільної холевої суміші та хенодезоксихолевої і дезоксихолевої кислот, отримані результати порівнюють з контролем і при зміні показників визначають реологічні властивості жовчі. UA 98435 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ РЕОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЖОВЧІ У ХВОРИХ З ПОРУШЕННЯМ ОБМІНУ СЕЧОВОЇ КИСЛОТИ В ПОЄДНАННІ З НЕАЛКОГОЛЬНИМ СТЕАТОГЕПАТИТОМ ТА ОЖИРІННЯМ UA 98435 U UA 98435 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, може бути використана в гастроентерології та терапії, являє собою спосіб діагностики реологічних властивостей жовчі у хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з неалкогольним стеатогепатитом та ожирінням, у який здійснюють шляхом тонкошарової хроматографії. Неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) одне з найпоширеніших хронічних захворювань, що має широке загально медичне та соціальне значення. НАЖХП включає в себе цілий каскад патологічних станів, а саме стеатоз печінки, неалкогольний стеатогепатит, фіброз, що може прогресувати в цироз печінки (2). Ризик розвитку НАЖХП на фоні ожиріння становить 30-100 %, на фоні гіпертригліцеридемії 20-92 %. У 10-15 % випадків НАЖХП взагалі не супроводжується розвитком клінічних проявів метаболічного синдрому(і). Вважається, що метаболічний синдром та стани, що його зумовлюють (ожиріння, IP, цукровий діабет 2-го типу та гіперліпідемія), є одними з провідних факторів ризику, що призводять до ураження гепатобіліарної системи із порушенням функціонального стану паренхіматозних клітин, жовчоутворювальної функції, що супроводжується розвитком неалкогольного стеатогепатиту. (2, 4, 5). НАЖХП поєднується з ожирінням, інсулінорезистентністю, що само по собі пов'язано з рядом метаболічних порушень таких як тригліцеридемія та гіперурикемія. Останнім часом все більше даних, що свідчать про те, що підвищений рівень сечової кислоти асоціюється з розвитком НАЖХП або її прогресуванням (10, 11). В дослідженні, що було проведені Afzali A, Weiss NS в 2010 (США) було підтверджено прямий зв'язок між рівнем сечової кислоти в крові та рівнем ферментів в сироватці крові. Також доведено, що гіперурикемія є незалежним чинником розвитку не тільки серцево-судинних захворювань (6, 7), а й патологічних процесів, що включають інсулінорезистентність, оксидантний стрес та системне запалення (8, 9). У результаті активації перекисного окислення ліпідів відбувається утворення більш стійких ліпідних інтермедіатів, які здатні до окисної модифікації інших біологічних структур клітини та здійснюють мембран дестабілізувальні та цитотоксичні ефекти (3). Тому саме активація процесів перекисного окислення ліпідів, що асоціюється з НАЖХП-залежною ліпотоксичністю, відповідальна за порушення проникності та пластичності мембран печінки, зниження активності мембранзалежних білків та їх комплексів, порушення їх рецепторної функції та комунікаційних зв'язків між клітинами. Це призводить до формування гігантських мітохондрій, перехресного зв'язування цитокератинів, активації тканинних трансглутаміназ, які стимулюють формування тілець Маллорі, сприяють хемотаксису нейтрофілів і розвитку системної запальної реакції та активному фіброгенезу (1, 6, 10). Досить часто гіперурикемія спостерігається у пацієнтів з метаболічним синдром або його компонентами, такими як ожиріння та тригліцеридемія (2), відзначається зворотна кореляція між інсулінорезистентністю та зниженням ниркового кліренсу сечової кислоти, що само по собі підвищує рівень сечової кислоти в крові (1, 2). Крім того, підвищення рівня тригліцеридів в крові призводить в свою чергу до гіперурикемії (5). Вищенаведені свідчення вказують, що постійне підвищення рівня сечової кислоти буде причинним фактором для розвитку ряду патологічних станів та захворювань, що супроводжуються метаболічними порушеннями. Саме це слугує вагомим чинником для вивчення спектру жовчних кислот у хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з неалкогольним стеатогепатитом та ожирінням. Жовчні кислоти є одними з найхарактерніших складових жовчі, їх біосинтез з холестерину відбувається лише в печінці людини, де вони зазнають рядперетворень. Жовчні кислоти кон'югують з амінокислотами та зазнають додаткового гідроксилювання в клітинах печінки. Визначення сумарного вмісту жовчних кислот в жовчі не дає можливості розкрити чи виявити особливості процесу перетворень жовчних кислот в печінці. І тому для з'ясування цих перетворень необхідно було застосовувати високочутливу та доступну методику хроматографічного аналізу спектру жовчних кислот в жовчі, яка забезпечувала б швидку порівняльну оцінку змін у співвідношенні жовчних кислот в жовчі. Серед наявних на той час методів хроматографічного розподілу жовчних кислот найбільш чутливими були методи газової, а пізніше і рідинної хроматографії. Варто зазначити, що собівартість аналізу жовчних кислот за допомогою цих методів досить висока, що робить майже неможливим їх використання в наших умовах. До того ж газова хроматографія не дає можливості прямого аналізу кон'югованих форм жовчних кислот. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення спектру жовчних кислот (1) шляхом застосування методу тонкошарової хроматографії, вибраний як прототип. Однак, даний спосіб має недоліки, а саме; низька інформативність, висока собівартість. 1 UA 98435 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Враховуючи, що тонкошарова хроматографія дозволяє одночасно досліджувати значну кількість проб, завдяки чому відтворюється наглядна динамічна картина змін співвідношень досліджуваних речовин в пробах в ході експерименту та забезпечує досить високу роздільну здатність. Все це забезпечується недорогим набором засобів для здійснення методики, що і визначило вибір нами цього способу аналізу. Задача корисної моделі полягає у розширенні інформативності та вдосконаленні способу діагностики спектру жовчних кислот у хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з неалкогольним стеатогепатитом та ожирінням шляхом визначення складу жовчі методом тонкошарової хроматографії у даної категорії пацієнтів. Цей спосіб діагностики забезпечує простий та достовірний шлях для отримання більшої інформації про склад жовчних кислот у даної категорії пацієнтів. Технічний результат, що досягається при вирішенні задачі, полягає у можливості за допомогою аналізу отриманих результатів про спектр жовчних кислот, виявити тих пацієнтів, у яких ризик розвитку жовчнокам'яної хвороби, значно вищий, з метою корекції лікування та профілактики можливих ускладнень. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає дослідження рівня жовчних кислот, згідно корисної моделі додатково визначають вміст таурохолевої, суміші таурохенодезоксихолевої та тауродезоксихолевої кислот, концентрацію вільної холевої та суміші хенодезоксихолевої і дезоксихолевої кислот, отримані результати порівнюють з контролем і при зміні показників визначають реологічні властивості жовчі. Нами був обстежений 69 пацієнт, критеріями включення були: відсутність HBV, HCV, HDVінфекцій, які виявлялись за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) та полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР); відсутність аутоімунного гепатиту; відсутність вживання алкоголю в гепатотоксичних дозах (20 г/добу для жінок та 40 г/добу для чоловіків). Пацієнти були статистично однорідні за віком, статтю, тривалістю хвороби та спектром супутніх захворювань, досліджувався вміст жовчних кислот у всіх пацієнтів. У всіх пацієнтів було виявлено порушення функції жовчного міхура. У хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з стеатогепатитом та ожирінням ми частіше спостерігали феномен "біліарного сладжу". При вивченні фізико-хімічних властивостей жовчі було встановлено, що рН міхурової жовчі даної групи пацієнтів зміщувалась в кислий бік, що призводить до підвищення літогенності жовчі та збільшує ризик утворення жовчних каменів. При аналізі змін спектру жовчних кислот було відмічено підвищення рівня холевої та дезоксихолевої кислоти в мухуровій жовчі, а також відмічалось зниження таурохолевої кислоти та глікохолевої кислоти в мухуровій жовчі. Визначення співвідношення тауринових кон'югатів з преципітуючими компонентами жовчі показало, що найбільший коефіцієнт літогенності був у пацієнтів зі стеатогепатитом та ожирінням, що обумовлено підвищеним рівнем сечової кислоти. Таким чином проведення комплексної порівняльної оцінки клінічних, біохімічних даних обстеження було виявлено, що у хворих з порушенням обміну сечової кислоти у більшому відсотку зустрічається біліарний сладж, порушення реологічних властивостей жовчі, порушення співвідношення холато-холестеринового індексу, що свідчить про підвищений ризик утворення жовчних каменів. Таким чином, враховуючи результати проведеного дослідження, можна об'єктивно оцінити реологічний склад жовчі у пацієнтів з гіперурикемією на тлі захворювань печінки та жовчовивідних шляхів, запропонувати своєчасне, цілеспрямоване та безпечне лікування, що буде сприяти зниженню кількості виникнення ускладнень захворювань та їх профілактики. Спосіб здійснюється наступним чином: До 50 мкл жовчі отриманої шляхом фракційного дуоденального зондування додавали до 1,8 мл охолодженої екстрагуючої суміші етанолу з ацетоном (1:3) і перемішували. Проби ставили на холодову екстракцію у морозильне відділення побутового холодильника на 25-30 хвилин при температурі 7 °C. Після цього проби центрифугували впродовж 10-12 хвилин при 3000-4000 об./хв. в центрифузі ОПН-8. Надосадову рідину зливали в центрифужні пробірки і випарювали при температурі не вище 37-40 °C до сухого залишку, котрий розчиняли в мікрооб'ємі (20-100 мкл) суміші етанолу з водою (3:2). Аліквоту від 5 до 15 мкл наносили мікропіпеткою по 5 мкл через певні інтервали часу (15-25 хв.) (для підсушування плями при кімнатній температурі) на попередньо промиті та розмічені хроматографічні пластини промислового виробництва "Silufol" (ЧССР). Вільні та кон'юговані жовчні кислоти розділяли в скляних камерах виробництва фірми "Kavalier" (ЧССР) за допомогою висхідної одномірної хроматографії в суміші розчинників, яка включала аміловий ефір оцтової кислоти, толуол, бутанол, оцтову кислоту та воду у співвідношенні (3:1:1:3:1). Фракції жовчних кислот ідентифікували за допомогою стандартних препаратів жовчних кислот по їх флуоресценції в ультрафіолетовому діапазоні світла при 2 UA 98435 U 5 10 15 20 25 30 35 40 активації їх сірчаною кислотою. Жовчні кислоти розподілялися на пластинах "Silufol" таким чином: таурохолева (ТХК), суміш таурохенодезоксихолевої і тауродезоксихолевої (ТХДХК + ТДХК), тауролітохолева (ТЛХК), глікохолева (ГХК), суміш глікохенодезоксихолевої та глікодезоксихолевої (ГХДХК + ГДХК), гліколітохолева (ГЛХК), холева (ХК), суміш хенодезоксихолевої і дезоксихолевої (ХДХК + ДХК), літохолева (ЛХК). Після хроматографічного розділення жовчних кислот необхідно позбавитися випарюванням залишків суміші розчинників із пластин, для чого їх потрібно помістити у витяжну шафу на 2,5-3 години при кімнатній температурі. Після цього "фарбують" жовчні кислоти, обробляючи хроматограму за допомогою пульверизатора розчином, який вміщував 1 г фосфорномолібденової кислоти в 15 мл льодяної оцтової кислоти, 1 мл концентрованої сірчаної кислоти та 5 мл 50 %-ного розчину трихлороцтової кислоти. Хроматограми витримували при 60-70 °C впродовж 5 хвилин і визначали вміст жовчних кислот за допомогою денситометра ДО-1М при довжині хвилі світла 620 нм. Заздалегідь будували калібрувальні криві на окремі стандартні зразки жовчних кислот. Чутливість цього методу становить 0,25-0,35 мкг жовчної кислоти в хроматографічній плямі. На базі кафедри внутрішньої медицини № 3 Національного медичного університету імені О.О. Богомольця по способу, що заявляється, було обстежено 69 пацієнтів. Отримані позитивні результати дозволяють рекомендувати його для впровадження в практичну медицину. Джерела інформації: 1. Соломенцева Т.А. Неалкогольный стеатогепатит: механизмы развития, диагностика, лечение //Сучасна гастроентерологія. -2004. - № 6. - С. 25-29. 2. Фадеенко Г.Д., Колесникова Е.В. Неалкогольная жировая болезнь печени при метаболическом синдроме: как лечить //Там само. -2009. - Вип. 45, № 1. -С. 75-81. 3. Catalá A., Gutiérrez А.М., Reboredo G.R. et al. High resistance to lipid peroxidation of bird heart mitochondria and microsomes: Effects of mass and maximum lifespan //Соmp. Biochem. Physiol. А Моl. Integr. Physiol. -2009. -Vol. 154, N3. -P. 409-416. 4. Cua I. H., George J. Non-alcoholic fatty liver disease //Hosp med. -2005. -Vol. 6, N2.-P. 106111. 5. Friis-Liby I., Aldenborg F., Jerlstad P. et al. High prevalence of metabolic complications in patients with non-alcoholic fatty liver disease //Scand. J. Gastroenterol. -2004. - Vol. 39, N 9. - P. 864869. 6. Gambino M., Musso R. Non-alcoholic fatty liver disease from pathogenesis to management: an update //Obesity Reviews. -2010. - Vol. 11. - P. 430-445. 7. Hwang I.C., Suh S.Y., Suh A.R. et al. The relationship between normal serum uric acid and nonalcoholic fatty liver disease //J. of Korean Med. Science. -2011.-Vol. 26, N3.- P. 386-391. 8. Miyaaki H., Ichikawa Т., Nakao K. et al. Clinicopathological study of nonalcoholic fatty liver disease in Japan: the risk factors for fibrosis //Liver Int.- 2008. - Vol. 28, N 4. - P. 519-524. 9. Patterson R.A., Horsley T.M., Leake D.S. Prooxidant and antioxidant properties of human serum ultrafiltrates toward LDL: important role of uric acid //J. of Lipid Research. -2003. - Vol. 44, N3. P. 512-521. 10. Ryu S., Chang Y., Kim S.G. et al. Serum uric acid levels predict incident nonalcoholic fatty liver disease in healthy Korean men //Metabolism. -2011. -Vol. 60, N6.- P. 860-866. 11. Xu С.F., Yu С.H., Xu L. et al. Hypouricemic therapy: a novel potential therapeutic option for nonalcoholic fatty liver disease //Hepatology.- 2010. -Vol. 52, N5.-P. 1865-1866. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 Спосіб визначення реологічних властивостей жовчі у хворих з порушенням обміну сечової кислоти в поєднанні з неалкогольним стеатогепатитом та ожирінням, що включає дослідження та визначення рівня жовчних кислот, який відрізняється тим, що шляхом дуоденального зондування отримують жовч і визначають в ній вміст таурохолевої суміші, таурохенодезоксихолевої та тауродезоксихолевої кислот, концентрацію вільної холевої суміші та хенодезоксихолевої і дезоксихолевої кислот, отримані результати порівнюють з контролем і при зміні показників визначають реологічні властивості жовчі. 55 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3