Спосіб отримання вірусобезпечного імуноглобуліну для внутрішньовенного введення

Реферат: Спосіб отримання вірусобезпечного імуноглобуліну для внутрішньовенного введення шляхом суспендування осаду ІІ+ІІІ, одержаного за методом Кона, осадження високомолекулярних агрегатів поліетиленгліколем, відокремлення осаду баластних білків. В якому вводять суміш сольвенту (0,3 % маси три-н-бутилфосфату) і детергенту (1 % маси полісорбату 80) та витримують 8-10 год., очищають методом аніоно-та катіонообмінної хроматографії, діа- та ультрафільтрації, концентрують білок до 5-10 %, стабілізують гліцином або мальтозою, проводять стерилізуючу фільтрацію. UA 99135 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ВІРУСОБЕЗПЕЧНОГО ІМУНОГЛОБУЛІНУ ДЛЯ ВНУТРІШНЬОВЕННОГО ВВЕДЕННЯ UA 99135 U UA 99135 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до біотехнології виробництва лікарських білкових препаратів плазми крові, придатних для внутрішньовенного введення. Імуноглобуліни для внутрішньовенного введення (ІГВВ) - це очищені і концентровані препарати гаммаглобулінової фракції сироваткових білків, отриманих із плазми крові людини, які містять високі титри антитіл (AT) - переважно імуноглобулінів класу G (IgG). За час своєї тривалої історії ця група біопрепаратів еволюціонувала від низькоефективних із частково зруйнованими молекулами AT (ІГВВ І покоління) до нативних препаратів імуноглобулінів (III-IV покоління), які мають високий рівень очищення та вірусної безпечності, а також високий клінічний ефект під час лікування вроджених та набутих імунодефіцитних станів і тяжких бактеріальних інфекцій. На теперішній час існує широкій вибір препаратів ІГВВ, які відрізняються фізико-хімічними параметрами, вмістом специфічних і неспецифічних AT (IgG, IgA, IgM), ступенем інфекційної безпеки, терміном циркуляції в організмі та ін. Всі ці параметри суттєво впливають на лікувальний ефект препарату ІГВВ і можливе виникнення ускладнень при його застосуванні [1]. При виробництві ІГВВ велику увагу приділяють безпечності отриманої лікарської форми. Частіше за все, фракцію, що містить IgG, отримують методом фракціонування за Коном з використанням різних концентрацій етилового спирту, яку в подальшому піддають різним технологічним стадіям обробки для отримання високоочищеного препарату [2, 3]. Відомі способи отримання препарату ІГВВ із плазми крові людини. Вони включають фракціонування етиловим спиртом за Коном з наступним включенням до технологічного процесу стадій очищення, концентрування, стерилізуючої фільтрації. Недоліками відомих способів є відсутність у технологічному процесі виробництва ІГВВ стадії вірусінактивації [4-6]. Найближчим аналогом є спосіб, який полягає в отриманні імуноглобуліну шляхом концентрування фракції III, отриманої за спиртовим методом Кона, ультрафільтрації, відмивання від етанолу, кінцевого концентрування розчину препарату, додавання стабілізатора, встановлення вмісту імуноглобуліну в розчині 5 % і величини рН 3,5-5,0, стерилізуючої фільтрації і висушування. При отриманні імуноглобуліну за цим способом перед додаванням стабілізатора проводять відновлення гідратних оболонок молекул імуноглобуліну методом молекулярної фільтрації протягом 18-20 год. [4]. Поступове підвищення концентрації водневих іонів у розчині імуноглобуліну призводить до неконтрольованої конформації молекул білка і коливання антикомплементарної активності (АКА). У препараті міститься висока концентрація IgA. В основу корисної моделі поставлена задача забезпечення високого ступеня чистоти та вірусної безпеки ІГВВ. Поставлена задача вирішується тим, що суспендування осаду ІІ+lll, одержаного за методом Кона, у буферному розчині при рН 3,0-5,0, осадження високомолекулярних агрегатів 2-5 % розчином поліетиленгліколю (ПЕГ), відокремлення осаду баластних білків шляхом центрифугування [4, 5]. Після цього вводять суміш сольвенту (0,3 % маси три-н-бутилфосфату) і детергенту (1 % маси полісорбату 80) та витримують протягом 8-10 год. для інактивації вірусів. Далі очищають методом аніоно- та катіонообмінної хроматографії, діа-та ультрафільтрації, концентрують по білку до 5-10 %, уводять стабілізатор (гліцин або мальтоза) і доводять величину рН до 4,0-4,5. Наприкінці проводять освітлюючу і стерилізуючу фільтрацію. В отриманому препараті показник прозорості повинен коливатися від 0,001 до 0,01, електрофоретична однорідність мономірного імуноглобуліну повинна бути від 97 до 100 %, частка полімерів не повинна перевищувати 0,1 %. Отриманий ІГВВ не містить пошкоджених при фракціонуванні молекул IgG і не утворює їх агрегатів. Заявлений спосіб підтверджується конкретними прикладами його виконання. Приклад 1. 20 кг фракції ІІ+ІІІ, отриманої методом фракціонування за Коном, суспендують у 100 л 50 мМ ацетатного буферного розчину при рН 4,0 і температурі 4 °C. Суспензію перемішують впродовж 4-х год. для повної екстракції розчинних білків. Суміш розбавляють водою для ін'єкцій до об'єму 400 л і продовжують перемішування протягом 3 год. У суміш вводять 30 % розчин ПЕГ до кінцевої концентрації 3 % і перемішують ще 5 год. Температуру поступово піднімають до 15 °C. Проводять центрифугування на проточній центрифузі при оборотах ротора 14-16 тис. об./ хв. Центрифугат приймають у реактор, вносять суміш С/Д (0,3 % маси три-н-бутилфосфату та 1 % маси полісорбату 80) і нагрівають до температури 20-25 °C. Проводять експозицію впродовж 810 год. для інактивації потенційно присутніх вірусів. Після цього розчин пропускають через дві послідовно з'єднані хроматографічні колони, перша з яких упакована аніонообмінним сорбентом (діетиламіноетил), друга - катіонообмінним (сульфопропіл). Колони попередньо урівноважені 1 UA 99135 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ацетатним буферним розчином (рН 4,0). При проходженні розчину імуноглобуліну через колони, елюат направляють у відходи. Після проходження всього об'єму розчину, хроматографічну систему промивають тим же буферним розчином (об'єм - 500 л), що використовувався для урівноваження колон. Після цього першу колону з аніонообмінним сорбентом від'єднують і промивають тільки другу колону тим же розчином (об'єм - 700 л). Для десорбції імуноглобуліну використовують ацетатний буферний розчин рН 4,0, що містить 0,5 Μ натрій хлориду. Збирають фракцію елюату, що дає поглинання при довжині хвилі 280 нм не менше 0,1 од. абс. Одержаний елюат за допомогою ультрафільтрації на касетах з відсіченням 50 кДа концентрують до об'єму 100 л, після чого розбавляють водою для ін'єкцій до 500 л. Після чого знову концентрують і розбавляють. Процес повторюють до того стану, поки електропровідність розчину не опуститься нижче 0,2 мСм/ см. Після цього розчин імуноглобуліну концентрують до концентрації білка 11 % і вносять гліцин до кінцевої концентрації 1,5 %. рН середовища доводять до 4,5 1 Μ розчином кислоти хлористоводневої. При необхідності, розбавляють водою для ін'єкцій до концентрації білка 10 %. Розчин імуноглобуліну в асептичних умовах фільтрують через стерилізуючий фільтр з поліефірсульфону (розмір пор - 0,2 мкм). Приклад 2. Те ж саме, в іншому об'ємі, з кінцевою концентрацією білка 5 % і використанням як стабілізатора мальтози. При отримані вірусобезпечного ІГВВ використовуються лише м'які, неденатуруючі умови переробки плазми крові та проміжних продуктів, завдяки чому молекули імуноглобуліну не пошкоджуються, не агрегують, не фрагментуються і не мають високої спонтанності АКА. Крім того, цей спосіб дозволяє суттєво (до 5 г на 1 л плазми) підняти вихід цільового білка, а також зберегти його в нативному стані. Завдяки нативному стану імуноглобуліну активність Fc-функції його молекули близька до 100 %. Використання аніонообмінної хроматографії дозволяє отримувати імуноглобулін високої чистоти (100 % - при визначенні методом електрофорезу на плівках з ацетату целюлози) із низькою (не більше 25 мкг/мл) концентрацією IgA. Використання стадії катіонообмінної хроматографії дозволяє звільняти імуноглобулін від С/Д до концентрацій, нижче гранично допустимих (2 мкг/мл три-н-бутилфосфату і 5 мкг/мл полісорбату 80). Переваги способу отримання вірусобезпечного імуноглобуліну для внутрішньовенного введення: 1. Високий вихід цільового білка (5 г/л). 2. Висока чистота імуноглобуліну. 3. Високий вміст мономеру IgG (96-98 %). 4. Низька антикомплементарна активність. 5. Висока активність Fc-функції (90-100 %). 6. Інактивація вірусів С/Д способом. 7. Стабільність препарату в концентрації 10 %. Джерела інформації: 1. Румянцев А.Г. Основные свойства внутривенных иммуноглобулинов и показания к их применению / А.Г. Румянцев // Вопросы гематологии/ онкологии и иммунологии в педиатрии. 2011. - Т. 9, № 4. - С. 39-50. 2. Русанов В.М. Фракционирование белков плазмы крови в производстве препаратов крови / Русанов В.М., Скобелев Л.И. - М.: Медицина, 1983.-224 с. 3. Мостовская Е.В. Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения: автореф. дис. … канд. біол. наук: спец. 14.00.36 "Аллергология и иммунология", 14.00.29 "Гематология и переливание крови" / Мостовская Елена Викторовна; филиал ФГУ предприятия "НПО по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" МЗ РФ "Иммунопрепарат". - М., 2004. - 22 с. 4. Патент № 2122864, RU, МПК А61К 39/395, С07К 1/34. Препарат иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения / Алешкин В.А., Лютов А.Г. (RU); заявитель и патентообладатель Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского (RU). - № 96124332/14; заявл. 26.12.1996; опубл. 10.12. 1998. 5. Патент № 2261112, RU, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Антонян Р., Былов К.В. (RU); заявители и патентообладатели Антонян Р, Былов К.В. (RU). - № 2004120478/15; заявл. 06.07.2004; опубл. 27.09.2005. 6. Патент № 2302427, RU, МПК С07К 16/06, А61К 39/395, А61Р 37/00. Способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и препарат, получаемый этим способом (варианты) / Лютов А.Г. (RU); заявители и патентообладатели Лютов А.Г., Решетник В.В. (RU). - №2005115752/13; заявл. 24.05.2005.; опубл. 10.07.2007. 60 2 UA 99135 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб отримання вірусобезпечного імуноглобуліну для внутрішньовенного введення шляхом суспендування осаду ІІ+ІІІ, одержаного за методом Кона, осадження високомолекулярних агрегатів поліетиленгліколем, відокремлення осаду баластних білків, який відрізняється тим, що вводять суміш сольвенту (0,3 % маси три-н-бутилфосфату) і детергенту (1 % маси полісорбату 80) та витримують 8-10 год., очищають методом аніоно- та катіонообмінної хроматографії, діа- та ультрафільтрації, концентрують білок до 5-10 %, стабілізують гліцином або мальтозою, проводять стерилізуючу фільтрацію. 10 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3