Рекомбінантні шлункові ліпази собаки (lgc) та людини (lgh), їх поліпептидні похідні, способи їх одержання за допомогою трансформації рослин та їх використання

Предметом даного винаходу є продукування рослинами рекомбінантних передуоденальних ліпаз, особливо, рекомбінантних шлункових ліпаз та інших поліпептидних похідних цих останніх, які мають ліпазну активність, а також їх застосування, особливо, як функціональних харчови х продуктів або у фармацевтичних композиціях, або у ферментативних препаративних формах для використання в індустрії або продовольчій промисловості. Шлункова ліпаза собаки (LGC) являє собою глікопротеїн з 379 амінокислот (АА) з молекулярною масою близько 50 кілодальтонів (кДа), що синтезується у вигляді попередника, який містить сигнальний пептид з кінцевою аміногрупою та секретується серединними клітинами слизової оболонки дна шлунку собаки [Саrrіèге F та ін., 1991]. Людська шлункова ліпаза (LGH) легко синтезується у вигляді попередника і описана в публікації Bodmer M.W. та ін., 1987р. Зрілий протеїн LGH складається з 379 амінокислот. Його сигнальний пептид (PSLGH) містить 19 амінокислот. Ці ферменти належать до сімейства так званих «передуоденальних» ліпаз, деякі члени якого вже одержані в очищеному вигляді, а в деяких випадках навіть клоновані [Docherty A.J.P. та ін., 1985p.; Bodmer M.W. та ін., 1987p.; Moreau Н. та ін., 1988p.; європейські патенти №№ 0191061 та 0261016). Протягом тривалого часу вважалось, що гідроліз харчових ліпідів відбувається у тонкій кишці під дією ферментів, які продукуються підшлунковою залозою [Bernanrd С. 1849p.]. Але, спостереження дозволяють припустити, що гідроліз тригліцеридів може протікати у шлунку під дією передуоденальних ферментів [Volhard F., 1901p.; Shonheyder F., Volquartz К., 1945p.]. Такі ферменти, і особливо, шлункова ліпаза собаки, характеризуються ферментативними та фізико-хімічними властивостями, які відрізняють їх від панкреатичних ліпаз ссавців. Ці різниці між шлунковими та панкреатичними ліпазами стосуються, головним чином, наступних моментів: молекулярна маса, склад амінокислот, стійкість до пепсину, специфічність субстрату, оптимальне значення pH при впливі та стабільність у кислому середовищі. Крім того, ін вітро, при певних умовах, можна спостерігати синергізм при впливі шлункових і панкреатичних ферментів на гідроліз тригліцеридів з довгими ланцюгами [Gargouri, Y. та ін., 1989p.]. Відомий ряд патологічних станів (муковісцидоз, екзокринна панкреатична недостатність), при яких у пацієнтів, повністю або частково, відсутня екзокринна панкреатична секреція та, отже, вони позбавлені ферментів, необхідних для гідролізу їди (амілази, ліпази, протеази). Відсутність абсорбції жирів і, особливо, тригліцеридів з довгими ланцюгами, у кишечнику веде до дуже значного збільшення стеатореї у цих пацієнтів, а також до дуже суттєвого уповільнення збільшення ваги у молодих хворих. З метою коректування у цих випадках цим суб'єктам вводять витяжки з підшлункової залози свині під час їжі. Терапевтичний ефект таких ви тяжок може бути суттєво посилений за рахунок одночасного призначення LGC внаслідок специфічності її впливу на тригліцериди з довгими ланцюгами. У статті Carrière та ін. (1991р.) описані очищення та визначення NН2-кінцевої послідовності шлункової ліпази собаки. Спосіб, якій забезпечує екстрагування цього ферменту з шлунків собак, також описаний у згаданій публікації. Цей спосіб полягає, в основному, в тому, що собачі шлунки піддаються мацерації у кислому середовищі (рН=2,5) у присутності водорозчинних солей, які сприяють висолюванню ліпази з вищевказаного середовища. Операції фільтрації через молекулярне сито та іонообмінної хроматографії дозволяють очистити LGC до однорідності. Очищена та одержана таким чином LGC являє собою глікопротеїн з молекулярною масою 49000 дальтонів, з яких 6000 відповідають цукрам і 43000 - протеїновій частині. Очевидні причини, пов'язані з труднощами забезпечення шлунками собак, перешкоджають усякому розвитку даного способу як на лабораторному, так і промисловому рівнях. Звідси витікає необхідність у розробці способу, який дозволяє одержувати LGC у великій кількості, не прибігаючи при цьому до використання собачих шлунків. Нуклеотидна та пептидна послідовність LGC були визначені з метою одержання LGC у промисловому масштабі за допомогою способу, при якому використовують методи генної інженерії. Такі роботи складають предмет міжнародної заявки WO 94/13816, поданої 16 грудня 1993 року. Спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки, описаний у цій міжнародній заявці, оснований на використанні Escherichia coli (E.coli) в якості трансформованої клітини-хазяїна, здатної продукувати LGC. Певні труднощі, які зустрічаються під час продукування рекомбінантної LGC за допомогою E.coli, особливо, необхідність у культивуванні значних кількостей Е.соIі у ферментері, що пов'язано з великими витратами, стали причиною пошуку винахідникам інших способів одержання цієї LGC. Клітини ссавців, апріорі, більш пристосовані до експресії генів ссавців. Однак, при їх застосуванні виникають проблеми, пов'язані з дозріванням протеїнів. Набір ферментів, за допомогою яких реалізується пост-трансляційне дозрівання, розрізняється залежно від тканини, органу і виду. Так, наприклад, повідомлялось, що пост-трансляційне дозрівання плазматичного протеїну може бути різним коли його одержують з людської крові або коли він продукується рекомбінантною клітиною, як, наприклад, клітини яєчників китайського хом'яка, або в молоці трансгенної тварини. Крім того, низькі рівні експресії, що досягаються при використанні клітин ссавців потребують культивований ін вітро в дуже великих об'ємах, що пов'язано з високими витратами. Продукування рекомбінантних протеїнів у молоці трансгенних тварин (миші, вівці та корови) дозволяє знизити виробничі витрати та подолати проблеми, пов'язані з рівнем експресії. Однак, залишаються етичні проблеми та проблеми вірусної та субвірусної (ін фекційні частини протеїну) контамінації. За цими причинами, перенос генів ссавців у рослинну клітину може відкрити шлях продукування у великих кількостях нових рекомбінантних протеїнів при зниженні виробничих витрат та без небезпеки вірусної або субвірусної контамінації. У 1983 році у декількох лабораторіях було зроблено відкриття, згідно з яким можна переносити гетерологічний ген у геном рослинної клітині [Bevan та ін.; Herrera-Estrella та ін., 1983p., a, b] та регенерувати трансгенні рослини з цих генетично модифікованих клітин. Тоді усі клітини рослин мають генетично змінений характер, якій передається потомству шля хом статевого запліднення. Завдяки цим роботам різні колективи зацікавились питанням продукування рекомбінантних протеїнів ссавців у рослинних клітинах або у трансгенних рослинах [Barta та ін., 1986p.; Marx, 1982p.]. Одним з перших, дійсно значимих результатів у цій області було одержання антитіл у трансгенних тютюнових рослинах [Hiatt та ін., 1989p.]. Для експресування гетерологічного протеїну у зерні - місце зберігання протеїнів у рослинах - колектив Вандекеркхова (Vandekerckhove) (1989p.) виконав злиття послідовності, кодуючої лей-енкефалін, з геном, кодуючим альбумін 2S Arabidopsis thaliana. За допомогою цієї конструкції були одержані види трансгенного рапсу, які специфічно експресують лейенкефалін у зернах зі ступенями експресії порядку 0,1% від загальної кількості протеїну. У 1990 році Sijmons та співробітники здійснили перенесення гену альбумінної людської сироватки у клітини тютюну та картоплі. Яким би не було походження сигнальних пептидів (людське або рослинне), кількість вміщуючої альбумін людської сироватки у листях, стеблах та бульбах картоплі складало порядку 0,02% від загальної кількості протеїнів. Також були продуковані у рослинах і інші рекомбінантні протеїни ссавців: поверхневий антиген гепатиту В [Mason та ін., 1992p.]; інтерферони [De Zoeten та ін., 1989p.; Edelbaum та ін., 1992p.; Truve та ін., 1993p.]; антитіла миші проти Streptococcus mutans; збудник карієсу зубів [Hiatt і Ма, 1992p.; Ma та ін., 1994p.], фрагменти антитіл scFV проти ракових клітин [Russel D., 1994p.], антитіло проти герпесу [Russel D., 1994p.], гірудин [Moloney та ін., 1994p.], токсин холери [Hein R., 1994р.] та фактор росту людського епідермісу (E.G.F.) [Higo та ін., 1993p.]. Сукупність даних цих досліджень дозволяє показати, що продукування рекомбінантних протеїнів ссавців у рослинних клітинах можливо і що механізми синтезу протеїнів з послідовностей ДНК схожі між собою у тваринних і рослинних клітинах. Все ж існують деякі різниці між рослинними та тваринними клітинами, особливо, на рівні дозрівання поліманнозидних гліканів до складних гліканів, або ще на рівні місць розщеплення сигнальних пептидів, що, отже, не дозволяє гарантувати одержання активних або досить активних протеїнів ссавців шля хом трансформації рослинних клітин. Авторами винаходу було встановлено, що використання рослинних клітин, трансформованих за допомогою відповідної рекомбінантної нуклеотидної послідовності, дозволяє одержати рекомбінантну LGC або рекомбінантну LGH або поліпептидні похідні цих останніх, що характеризуються ферментативною активністю, яка достатня у відношенні придатності використання у промисловому масштабі. Метою даного винаходу є розробка нового способу одержання рекомбінантних передуоденальних ліпаз ссавців, та, особливо, рекомбінантної LGC або LGH, за допомогою рослин або поліпептидних похідних LGC і LGH, що характеризуються ферментативною активністю, особливо, ліпазною активністю, яка дозволила б використовува ти у промисловому масштабі зазначені рекомбінантні ліпази та їх поліпептидні похідні. Іншою метою даного винаходу є створення інструментів для здійснення такого способу, особливо, для одержання нових рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, генетично трансформованих рослинних клітин, генетично трансформованих рослин або частин рослин (особливо, листя, стеблів, плодів, насіння або зерен, коріння) та генетично трансформованих фрагментів цих рослин або частин рослин. Метою винаходу також є одержання нових рекомбінантних передуоденальних ліпаз (ліпази) ссавців або любої поліпептидної похідної, які ферментативно активні, і таких, які одержують з генетично трансформованих рослинних клітин або рослин. Винахід, крім того, стосується одержання нових ферментативних композицій, придатних для використання у ферментативних реакціях, особливо у промисловому масштабі. Ще одною метою винаходу є одержання нових фармацевтичних композицій, призначених, головним чином, для лікування патологій, пов'язаних з дефіцитом продукування ліпази в організмі, таких як, наприклад, муковісцидоз. Ще одна мета даного винаходу полягає у створенні нових видів палива, що називаються ще біопаливом, які характеризуються тою перевагою, що вони менше забруднюють навколишнє середовище порівняно з паливом, яке одержується з нафти, та мають меншу собівартість. Нижче винахід ілюструється наступними фігурами: на Фіг.1 представлена нуклеотидна послідовність кДНК, нуклеотиди якої розташовані у позиціях 1-1137, кодують шлункову ліпазу собаки (LGC), представлену на Фіг.2 та яка відповідає послідовності №2; на Фіг.2 представлена амінокислотна послідовність шлункової ліпази собаки, яка відповідає послідовності №2; на Фіг.3 представлена нуклеотидна послідовність, яка походить від кДНК, що показана на Фіг.1 та відповідає послідовності №1, причому нуклеотиди, розташовані у позиціях 1-1137 вищезазначеної похідної послідовності, кодують шлункову ліпазу собаки, яка представлена на Фіг.2 і відповідає послідовності №2; на Фіг.4 представлена нуклеотидна послідовність кДНК, нуклеотиди якої, розташовані у позиціях 471240, кодують попередника шлункової ліпази людини (LGH), яка складається з 398 амінокислот, а нуклеотиди, розташовані у позиціях 104-1240, кодують зрілу шлункову ліпазу людини з 379 амінокислот; на Фіг.5 представлена амінокислотна послідовність шлункової ліпази людини, причому попередник LGH обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 1 і 398, а зріла шлункова ліпаза людини обмежена амінокислотами, розташованими у позиціях 20 і 398; на Фігурах 6, 7 і 8 представлені результати імунологічного аналізу типу «вестерн-блокування» рекомбінантних поліпептидів, продукованих листям та насінням тютюну Xanthi, насінням рапсу, листям і плодами томату, трансформованими шляхом рекомбінантних послідовностей згідно винаходу; на Фігурах 9 і 10 представлені, відповідно, аналіз за допомогою електрофорезу на поліакриламідному гелі та результат переносу цього гелю на нітроцелюлозну мембрану, а також виявлення, виходячи з антитіла проти шлункової ліпази собаки, очищеної шлункової ліпази собаки з листя тютюну; на Фіг.11 представлений приклад визначення на мембрані гліканових залишків рекомбінантної шлункової ліпази собаки; на Фіг.12 представлений аналіз за допомогою електрофорезу на поліакриламідному гелі шлункової очищеної ліпази собаки з насіння рапсу; Фігури 13, 14 і 15 ілюструють різні досліди, які проводилися для одержання метилового ефіру олеїнової кислоти з трансформованого насіння згідно винаходу. Предметом даного винаходу є застосування рекомбінантної нуклеотидної послідовності, яка містить, з одного боку, кДНК, кодуючу любу передуоденальну ліпазу ссавців, а саме ліпази, нуклеотидні послідовності яких, що кодують ці останні, мають між собою гомологію приблизно, принаймні, на 75%, особливо, принаймні, приблизно на 77-85% і амінокислотні послідовності яких мають між собою гомологію, принаймні, приблизно на 70%, особливо, принаймні, приблизно на 80-90%, і які є кислотостійкими та активними при значенні pH приблизно від 1 до приблизно 5, переважно при pH приблизно від 1,5 до 2, особливо, кДНК, кодуючу любу шлункову ліпазу ссавців або кДНК, кодуючу любу поліпептидну похідну згаданих вище передуоденальних ліпаз, що одержується за допомогою додавання та/або супресії та/або заміни одної амінокислоти (або декількох амінокислот), причому ця вказана поліпептидна похідна має описані вище властивості передуоденальних ліпаз, та з іншого боку, елементи, які дозволяють рослинній клітині продукувати передуоденальну ліпазу, кодовану згаданою вище кДНК, або продукувати поліпептидну похідну, як, наприклад, зазначені вище, особливо, промотор і термінатор транскрипції, які розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин, для трансформації рослинних клітин з метою одержання з цих клітин або рослин, що одержуються з цих клітин, рекомбінантної передуоденальноі ліпази ссавців у вигляді активного ферменту або поліпептидної похідної (або декількох поліпептидних похідних) цього ферменту, такого (таких), як зазначено (зазначені) вище. Переважно, предметом даного винаходу є, особливо, застосування рекомбінантної нуклеотидної послідовності, яка містить, з одного боку, кДНК, яка представлена на Фіг.1 і кодує шлункову ліпазу собаки (LGC), показану на Фіг.2, або нуклеотидну послідовність, яка походить від цієї кДНК, особливо у результаті додавання та/або супресії та/або заміни одного нуклеотиду (або декількох нуклеотидів), причому вищевказана похідна послідовність здатна кодувати поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична такій шлунковій ліпази собаки, представленої на Фіг.2, або поліпептид, який походить від шлункової ліпази собаки у результаті додавання та/або супресії та/або заміни одної амінокислоти (або декількох амінокислот), причому ця поліпептидна похідна характеризується ліпазною активністю, та, з іншого боку, елементи, які дозволяють рослинній клітині продукувати поліпептид, кодований вищевказаною кДНК або вказаною вище похідною послідовністю, особливо, як промотор та термінатор транскрипції, що розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин (а саме, РНК-полімеразами цих клітин), для трансформації рослинних клітин з метою одержання з цих клітин або рослин, одержаних з цих клітин, рекомбінантної шлункової ліпази собак у вигляді активного ферменту або поліпептидної похідної (або декількох поліпептидних похідних) цього ферменту, такого, як зазначено (зазначені) вище. Винахід стосується також любої рекомбінантної нуклеотидної послідовності, такої, як описана вище, що містить, у якості кДНК, представлену на Фіг.1 кДНК або нуклеотидну послідовність, що походить від цієї кДНК, таку, як зазначена вище. На цій підставі, предметом винаходу переважно є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, що містить кДНК, представлену на Фіг.1 і яка кодує шлункову ліпазу собаки, представлену на Фіг.2. Ще одним предметом винаходу, переважно, є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, що містить нуклеотидну послідовність, яка походить від кДНК, представленої на Фіг.1, причому вищевказана нуклеотидна похідна послідовність є описаною вище послідовністю і кодує шлункову ліпазу собаки, представлену на Фіг.2. Така похідна послідовність, переважно, є послідовністю, представленою на Фіг.3, і відповідає послідовності, представленій на Фіг.1, в якій нуклеотид А в позиції 12 замінений нуклеотидом G, нуклеотид Т у позиції 13 замінений нуклеотидом С, а нуклеотид А в позиції 15 замінений нуклеотидом Т. Переважно, рекомбінантні нуклеотидні послідовності згідно винаходу містять одну (або декілька) послідовность (послідовностей), кодуючу пептид, відповідальний за адресацію рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу (а саме, рекомбінантної шлункової ліпази собаки або згаданих вище поліпептидних похідних) у певне місце рослинної клітини, особливо, в ендоплазматичну сітку або у вакуолі, або навіть на поверхню клітини, у пектоцелюлозну перегородку або у міжклітинний простір, що називається також апоплазмою. З термінаторів транскрипції, які можуть бути використані для трансформації рослинних клітин у рамках даного винаходу, можна вказати на термінатор роlуА 33S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), описаний у статті Franck та ін., 1980p., або термінатор polyA NOS, що відповідає некодуючій ділянці 3' гену нопалінсинтази Ті-плазміди Agrobacterium tumefaciens, штаму нопаліну [Depicker та ін., 1982p.]. На цій підставі предметом винаходу є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така як описана вище, яка містить нижче вищевказаної кДНК або її похідної послідовності термінатор polyA 35S вірусу CaMV або термінатор polya NOS Agrobacterium tumefaciens. З промоторів транскрипції, які можна використовувати для трансформації рослинних клітин у рамках даного винаходу, можна назвати: - промотор 35S або, переважно, подвійний конститутивний промотор 35S (pd35S) вірусу CaMV, причому ці промотори забезпечують експресію рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу у всій рослині, одержаній з клітин, трансформованих згідно винаходу та описаних у статті Kay та ін., 1987p., - промотор pCRU гену круциферину редьки, який дозволяє протікати експресії рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу тільки у насінні (або зернах) рослини, одержаної з трансформованих згідно винаходу клітин, який описаний у статті Depigny-This та ін., 1992р.; - промотори pGEA1 та pGEA6, які відповідають некодуючій ділянці 5' генів запасного протеїну насіння GEA1 і GEA6, відповідно, Arabidopsis thaliana [Gaubier та ін., 1993p.], і які дозволяють протікати специфічній експресії у насінні; - химерний суперпромотор pSP (PCT/US94/12946), утворений у результаті злиття, при потрійному повторі транскрипційного активуючого елементу промотору гену октопін-синтази Agrobacterium tumefaciens, транскрипційного активуючого елементу промотору гену маннопінсинтази та промотору маннопінсинтази Agrobacterium tumefaciens; - актиновий промотор рису та наступний за ним актиновий інтрон рису (pAR-lAR), який міститься у плазміді pAct1-F4 та описаний авторами МсЕігоу та ін. (1991p.); - промотор гену g-зеїну кукурудзи (рg-зеїн), який міститься у плазміді рg63, описаної Reina та ін., (1990p.), та який сприяє експресії у ендоспермі кукурудзяних зерен. На цій підставі, предметом винаходу є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить вищевказаний кДНК або такої, що походить від неї послідовності подвійний конститутивний промотор 35S (pd35S) вірусу CaMV, або промотор PCRU гену круциферину редьки, або промотори pGEA1 і pGEA6 Arabidopsis thaliana, або суперпромотор pSP бактерії Agrobacterium tumefaciens, або промотор pAR-IAR рису, або промотор рg-зеїну кукурудзи. Послідовності, які кодують спрямовуючий пептид та застосовуються в рамках даного винаходу, можуть бути тваринного, людського або рослинного походження. З послідовностей, які кодують спрямовуючий пептид рослинного походження, можна вказати: - нуклеотидну послідовність з 69 нуклеотидів (надається у нижче приведених прикладах), кодуючу препептид (сигнальний пептид) з 23 амінокислот спораміну А батату, причому цей сигнальний пептид дозволяє вводити рекомбінантні поліпептиди, згідно винаходу, в секреторну систему рослинних клітин, трансформованих згідно винаходу (а саме, у ендоплазматичну сітку); - нуклеотидну послідовність з 42 нуклеотидів (надається у нижче приведених прикладах), яка кодує Nкінцевий пропептид з вакуолярною адресацією з 14 амінокислот спораміну А батату та дозволяє акумулювати рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу у вакуолях рослинних клітин, трансформованих згідно винаходу; - нуклеотидну послідовність зі 111 нуклеотидів (надається у нижче приведених прикладах), кодуючу препропептид з 37 амінокислот спораміну А, утворений N-кінцевою частиною у напрямку до С-кінцевої частини з 23 амінокислот згаданого вище сигнального пептиду, за яким йдуть 14 амінокислот вищезгаданого пропептиду, причому цей препропептид дозволяє вводити рекомбінантні поліпептиди, згідно винаходу, у секреторну систему та накопичувати їх у вакуолях рослинних клітин, трансформованих згідно винаходу, причому три вищевказані послідовності описані у роботах Murakami та ін., 1986p., Matsuoka TaNakamura, 1991p.; - карбокси-кінцевий пропептид лектину ячменя описаний особливо у роботах Schroeder та ін., 1993p., та Bednarek та Ralkhel, 1991p. З послідовностей, кодуючих спрямовуючий пептид людського або тваринного походження, можна назвати такі, кодуючі сигнальний пептид шлункової ліпази людини (LGH), такий як описаний у європейському патенті №0191061, або такої шлункової ліпази кролика (LGL), як описаний у європейській заявці на патент №0542629, послідовність яких вказана у нижче приведених прикладах, або такої панкреатичної ліпази людини (LPH) або ще такої шлункової ліпази собаки (LGC). З кодуючих спрямовуючий пептид послідовностей також можна назвати послідовність , яка кодує тетрапептид KDEL та забезпечує адресацію у плазматичну сітку. На цій підставі, предметом винаходу є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить послідовність, кодуючу весь або частину сигнального пептиду, такого, як сигнальний пептид спораміну А батату або сигнальний пептид шлункової ліпази людини або шлункової ліпази кролика або шлункової ліпази собаки, причому ця послідовність, кодуюча сигнальний пептид, знаходиться, у вищевказаній рекомбінантній нуклеотидній послідовності, вище кДНК або послідовності, що походить від неї послідовності, та нижче використовуваного промотору, таким чином, що остання С-кінцева амінокислота сигнального пептиду зв'язана з першою N-кінцевою амінокислотою поліпептиду, кодованого за допомогою вищевказаної кДНК або послідовності, що походить від неї, у протеїні, кодованому вищезазначеною рекомбінантною нуклеотидною послідовністю. Предметом винаходу також є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить послідовність, кодуючу весь або частину вакуолярного спрямовуючого пептиду, особливо, як пептид спораміну А батату, причому ця послідовність, кодуюча вакуолярний спрямовуючий пептид, знаходиться у ви щезазначеній рекомбінантній нуклеотидній послідовності, між послідовністю, кодуючою сигнальний пептид, та послідовністю, кодуючою вищевказану кДНК або послідовність, що походить від неї, таким чином, що перша N-кінцева амінокислота вакуолярного спрямовуючого пептиду виявляється зв'язаною з останньою С-кінцевою амінокислотою сигнального пептиду та остання С-кінцева амінокислота згаданого спрямовуючого пептиду виявляється зв'язаною з першою N-кінцевою амінокислотою поліпептиду, кодованого кДНК або її похідною послідовністю, у протеїні, кодованому зазначеною рекомбінантною нуклеотидною послідовністю. Предметом винаходу також є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить послідовність, кодуючу весь або частину вакуолярного спрямовуючого пептиду, зокрема, як пептид лектину ячменю, причому ця послідовність, кодуюча вакуолярний спрямовуючий пептид, розташовується у ви щевказаній рекомбінантній нуклеотидній послідовності, нижче послідовності, кодуючої вищезазначену кДНК або її похідну послідовність таким чином, що перша N-кінцева амінокислота вакуолярного спрямовуючого пептиду виявляється зв'язаною з останньою С-кінцевою амінокислотою поліпептиду, кодованого вищезгаданою кДНК або її похідною послідовністю, у протеїні, кодованому вищевказаною рекомбінантною нуклеотидною послідовністю. Предметом винаходу є особливо наступні рекомбінантні нуклеотидні послідовності: - послідовність (що позначається як pd35S-PS-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pd35S CaMV, послідовність, яка кодує сигнальний пептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор polyA 35S вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pd35S-PPS-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pd35S CaMV, послідовність, яка кодує препропептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор polyA 35S вір усу CaMV; - послідовність (що позначається як pd35S-PSLGL-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pd35S CaMV, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (LGL) (а саме, послідовність, що складається з 19 перших амінокислот та зазначена у наведених нижче прикладах, при цьому 9 нуклеотидів, кодуючих 3 останні С-кінцеві амінокислоти, виключаються), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1, потім - термінатор polyA 35S вір усу CaMV; - послідовність (що позначається як pCRU-PS-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pCRU круциферину, послідовність, яка кодує сигнальний пептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор polyA 35S вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pCRU-PPS-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pCRU круциферину, послідовність, яка кодує препропептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор polyA 35S вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pCRU-PSLGL-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pCRU круцефірину, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази (LGL) (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор polyA 35S вір усу CaMV; - послідовність (що позначається як pGEA1-PSLGL-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pGEAl Arabidopsis thaliana, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази LGL (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор polyA 35S вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pGEA6-PSLGL-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pGEA6 Arabidopsis thaliana, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (LGL) (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1, або 3, потім - термінатор polyA 35S вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pAR-IAR-PSLGL-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pARIAR рису, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази LGL) (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор polyA 35S CaMV або термінатор polyA NOS бактерії Agrobacterium tumefaciens; - послідовність (що позначається як рg-зеїн-PSLGL-LGC), яка містить у напрямку 5'®3' рg-зеїновий промотор кукурудзи, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази LGL (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор polyA 35S вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як рg-зеїн-PSLGL-LGC-KDEL), яка містить у напрямку 5'®3' рgзеїновий промотор кукурудзи, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази LGL (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім послідовність, яка кодує тетрапептид KDEL, і потім - термінатор polyA 35S вір усу CaMV. Рекомбінантні нуклеотидні послідовності згідно винаходу, переважно, містять також нуклеотидну послідовність, що використовується як маркер вищевказаних рекомбінантних послідовностей, особливо, для диференціації (і, отже, селекціонування) рослинних клітин, які трансформовані вищевказаними рекомбінантними послідовностями, від ти х, які не містять цього маркера. Переважно, таку нуклеотидну послідовність, що використовується як маркер вищевказаних рекомбінантних послідовностей, вибирають зі стійких до антибіотиків генів, як особливо ген стійкості до канаміцину. Предметом винаходу є також любий вектор, особливо, плазмідний, якій містить рекомбінантну нуклеотидну послідовність згідно винаходу, включену в сайт, що не є необхідним для її реплікації. Винахід стосується також любої клітини-хазяїна, особливо, любої бактерії, такої як Agrobacterium tumefaciens, трансформованої вектором, таким як описаний вище. Предметом даного винаходу є також любий спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки (LGC) у вигляді активного ферменту та/або одного або декількох поліпептидних похідних цього ферменту, зокрема, у результаті додавання та/або супресії та/або заміни одної амінокислоти (або декількох амінокислот), причому така поліпептидна похідна (поліпептидні похідні) має (мають) ліпазну активністю, який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію рослинних клітин для інтеграції у геном цих клітин одної або декількох рекомбінантних нуклеотидних послідовностей згідно винаходу; - при необхідності, одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих клітин; - виділення рекомбінантної шлункової ліпази собаки (LGC) та/або згаданої вище поліпептидної похідної (або поліпептидних похідних), продукованої (продукованих) у вищевказаних трансформованих клітинах або вищевказаних трансформованих рослинах, особливо, шляхом екстракції з наступним, при необхідності, очищенням. Згідно з варіантом здійснення вказаного вище способу відповідно до винаходу, трансформація рослинних клітин може виконуватись шляхом переносу рекомбінантної нуклеотидної послідовності, згідно винаходу, у протопласти, зокрема, після інкубації цих останніх у розчині поліетиленгліколю (ПЕГ) у присутності двовалентних катіонів (Са2+) за методом, описаним у статті Krens та ін., 1982р. Трансформацію рослинних клітин можна також здійснювати за допомогою електропорації, зокрема, методом, описаним у статті Fromm та ін., 1986р. Трансформацію рослинних клітин можна також здійснювати за допомогою генної пушки, що забезпечує викид з дуже великою швидкістю металевих часток з покриваючими їх рекомбінантними нуклеотидними послідовностями згідно винаходу, доставляючи таким чином гени всередину ядра клітини, зокрема, за допомогою методу, описаного у статті Sanford, 1988p. Іншим методом трансформації рослинних клітин є метод нуклеарної або цитоплазматичної мікроін'єкції, як, наприклад, метод, описаний у статті De La Penna та ін., 1987p. Відповідно до найбільш переважного варіанту здійснення вказаного вище способу, згідно винаходу, рослинні клітини трансформують шляхом сполучення їх з клітиною-хазяїном, трансформованою вектором, згідно винаходу, наприклад, описаним вище вектором, причому вищевказана клітина-хазяїн здатна інфікувати вищевказані рослинні клітини, забезпечуючи інтеграцію у геном цих останніх рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, згідно винаходу, які містяться попередньо у геномі вищевказаного вектору. Переважно, вищевказаною використовуваною клітиною-хазяїном є Agrobacterium tumefaciens, зокрема, згідно з методами, описаними у статтях Be van, 1984p., і An та ін., 1986p., або ж Agrobacterium rhizogenes, зокрема, згідно методу, описаному у статті Jouanin та ін., 1987р. З рослинних клітин, здатних до трансформації у рамках даного винаходу, можна вказати клітини рапсу, тютюн у, кук урудзи, гороху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, салату-латуку, рису та люцерни. Відповідно до варіанту здійснення вказаного вище способу згідно винаходу, рослинні клітини, трансформовані згідно винаходу, культивують ін вітро, особливо, у біореакторах, за методом, описаним у роботі Brodelius, 1988р., у рідкому середовищі або згідно методу, описаному у роботі Brodelius та ін., 1979р., в іммобілізованій формі або ще згідно методу, описаному у роботі Deno та ін., 1987p., шляхом культивування трансформованих корнів ін вітро. Вищевказані культуральні середовища ін вітро потім витягають для екстрагування з них та, при необхідності, очищення, особливо, за допомогою хроматографії, рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептидної похідної (поліпептидних похідних), описаної (описаних) ви ще, продукованих вищевказаними трансформованими клітинами, культивованими ін вітро. Відповідно до переважного варіанту здійснення вищевказаного способу одержання рекомбінантної LGC та/або поліпептидної похідної (поліпептидних похідних) згідно винаходу, трансформація рослинних клітин супроводжується стадією одержання трансформованих рослин шляхом культивування зазначених трансформованих клітин у відповідному середовищі. Рекомбінантна LGC та/або поліпептидна похідна (поліпептидні похідні), продуковані у клітинах рослин, що одержані таким чином, витягають шляхом екстракції з цілих рослин або частин цих рослин (особливо з листя або стебла, або плодів) або ще з насіння цих рослин, причому за цією екстракцією, при необхідності, йде стадія очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки (LGC) та/або поліпептидної похідної (поліпептидних похідних). Трансформованими рослинами, що використовуються для витягання рекомбінантноі LGC та/або поліпептидної похідної (поліпептидних похідних) у рамках вищевказаного способу, є рослини генерації ТО, а саме, рослини, одержані шляхом культивування трансформованих клітин, згідно винаходу, на відповідному середовищі або, переважно, рослини наступних генерацій (Т1, Т2 і т.д.), одержаних внаслідок самозапилення рослин попередньої генерації, в яких рекомбінантні нуклеотидні послідовності, згідно винаходу, розмножуються за законом Менделя. З поліпептидних похідних шлункової ліпази собаки (LGC), які можуть бути одержані у рамках здійснення способу згідно винаходу, можна вказати: - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 55 і 379 на Фіг.2, що називається ще поліпептидом (D54) та представлений послідовністю №4, причому вищевказаний поліпептид кодований нуклеотидною послідовністю, представленою послідовністю №3; - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 5 і 379 на Фіг.2, що називається ще поліпептидом (D4) та представлений послідовністю №6, причому даний поліпептид кодований нуклеотидною послідовністю, представленою послідовністю №5; Особливо, предметом винаходу є будь-який спосіб, такий як вищеописаний, одержання рекомбінантноі шлункової ліпази собаки (LGC), представленої на Фіг.2, і, при необхідності, одержання поліпептидного похідного (або декількох поліпептидних похідних), особливо згаданих вище поліпептиду (D54) та/або поліпептиду (D4), причому вищевказаний спосіб відрізняється тим, що стадію трансформації рослинних клітин реалізують за рахунок інтеграції у геном цих клітин рекомбінантноі послідовності, такої, як описана вище, що містить з одного боку, кДНК, представлену на Фіг.1, та, з іншого боку, послідовність, що кодує сигнальний пептид з 22 амінокислот шлункової ліпази кроля (LGL), переважно таку, яка кодує 19 перших амінокислот сигнального пептиду шлункової ліпази кроля. Більш прийнятно, винахід стосується способу, такого, як описаний вище, одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки, представленої на Фіг.2, при необхідності, у сполученні з поліпептидом (D54) та/або (D4), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів листя рослини за рахунок сполучення цих останніх зі штамом Agrobacterium tumefaciens, трансформованим за допомогою плазміди, наприклад, описаною вище плазмідою, що містить вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність pd35S-PSLGL-LGC, у відповідному культуральному середовищі; - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, що містить канаміцин, - одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих експлантатів шля хом їх культивування на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки, та при необхідності, поліпептиду (D54) та/або поліпептиду (D4), за допомогою гомогенізації' листя, та/або насіння, та/або плодів вищезгаданих трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що утворює рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки, виходячи з екстракту, одержаного під час попередньої стадії, особливо, шляхом хроматографії надосадовою рідиною, в результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки, по суті, у чистому вигляді. Предметом винаходу також є застосування вказаного способу для одержання поліпептиду (D54) або (D4), по суті, у чистому вигляді шляхом очищення цих останніх, виходячи з екстракту, одержаного вказаним вище способом, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини після екстракції. Предметом винаходу, більш переважно, є спосіб одержання вищезгаданого поліпептиду (D4), при необхідності, по суті, у чистому вигляді, за допомогою здійснення описаного вище способу, при якому клітини, трансформовані послідовністю pd35S-PSLGL-LGC, являють собою клітини експлантатів листя пасльонових, зокрема, тютюну або томату. Згідно варіанту здійснення згаданого способу, поліпептид (D4), може бути специфічно одержаний шляхом екстракції з листя вищевказаних трансформованих тютюнових рослин, особливо, шляхом гомогенізації цього листя у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини. Потім поліпептид (D4) може бути очи щений, ви ходячи з екстракту вказаного листя, що містить вказаний поліпептид (D4), зокрема, за допомогою хроматографії вказаної надосадової рідини. Предметом винаходу є, більш переважно, любий спосіб, як, наприклад, описаний вище спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептидного похідного (або декількох поліпептидних похідних) вказаної ліпази, таких як, описані вище, який відрізняється тим, що стадію трансформації рослинних клітин здійснюють шляхом інтеграції у геном цих останніх, послідовності, яка містить, з одного боку, нуклеотидну послідовність, представлену на Фіг.3, і, з іншого боку, послідовність, що кодує описаний вище сигнальний пептид спораміну А. З поліпептидних похідних рекомбінантної шлункової ліпази собаки, які можуть бути одержані описаним вище способом, можна вказати вищезгадані поліпептиди (D54) та/або (D4). Винахід, особливо, стосується способу одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або згаданого вище поліпептиду (D54) та/або (D4), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів рослини (зокрема, експлантатів листя) шляхом сполучення вказаних клітин зі штамом Agrobacterium tumefaciens, трансформованим плазмідою, наприклад, описаною вище плазмідою, яка містить вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність pd35S-PS-LGC та/або pd35S-PPS-LGC; - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, що містить канаміцин; - одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих експлантатів шляхом культивування цих експлантатів на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54) та/або поліпептиду (D4), зокрема, за допомогою гомогенізації листя та/або насіння, та/або плодів вищезазначених трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що являє собою рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54) та/або поліпептиду (D4), виходячи з одержаного у попередній стадії екстракту, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини, у результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54) та/або поліпептид (D4), по суті, у чистому вигляді. Винахід переважно стосується способу одержання вищезгаданих поліпептидів (D54) та/або (D4), при здійснені описаного вище способу, в якому трансформованими клітинами є клітини експлантатів листя пасльонових, зокрема, тютюну або томату. Відповідно до особливого варіанту здійснення згаданого вище способу згідно винаходу, поліпептид (DА54) може бути специфічно одержаний шляхом екстракції з насіння згаданих трансформованих тютюнових рослин, зокрема, шляхом гомогенізації цього насіння у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини. Потім поліпептид (D54) можна очищувати, ви ходячи з екстракту вказаного насіння, що містить зазначений поліпептид (D54), зокрема, за допомогою хроматографії вказаної надосадової рідини. Винахід, особливо, стосується способу одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або згаданого вище поліпептиду (D54) та/або (D4), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів листя рослини в результаті сполучення цих останніх зі штамом Agrobacterium tumefaciens, трансформованим за допомогою плазміди, наприклад, описаною вище плазмідою, що містить вказану ви ще рекомбінантну нуклеотидну послідовність pCRU-PPS-LGC та/або послідовність pCRU-PS-LGC, та/або послідовність pGEAl-PSLGL-LGC, та/або послідовність pGEA6-PSLGLLGC, та/або послідовність pAR-IAR-PSLGL-LGC, та/або послідовність pg-зеїн-PSLGL-LGC, та/або послідовність рg-зеїн-PSLGL-LGC-KDEL; - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, що містить канаміцин; - одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих експлантатів шля хом їх культивування на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54) та/або поліпептиду (D4), особливо, за допомогою гомогенізації насіння згаданих вище трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що утворює рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантноі шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54), та/або поліпептиду (D4), виходячи з одержаного у попередній стадії екстракту, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини, у результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки, по суті, у чистому вигляді. Винахід, більш переважно, стосується способу одержання згаданого вище поліпептиду (D54) шляхом здійснення описаного вище способу, при якому трансформованими клітинами є клітини експлантатів рапсу або тютюну, а екстрагування поліпептиду (D54) здійснюють, зокрема, шляхом гомогенізації трансформованого насіння. Рослинні клітини, трансформовані згідно описаним вище способам, переважно, вибирають з клітин тютюн у, рапсу, кукур удзи, гороху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, салатулатуку, рису та люцерни. Винахід, переважно, стосується способу одержання рекомбінантноі шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54), і/або поліпептиду (D4), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин калюсів кукурудзи шляхом бомбардування цих клітин з пушки плазмідами з рекомбінантною нуклеотидною послідовністю pAR-IAR-PSLGL-LGC і/або послідовністю ру-зеїн-PSLGL-LGC, і/або послідовністю рg-зеїн-PSLGL-LGC-KDEL; - селекцію трансформованих калюсів при використанні середовища, що містить селективний агент, наприклад, канаміцин; - одержання трансформованих рослин кукурудзи з вищевказаних трансформованих калюсів шляхом їх культивування на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54), і/або поліпептиду (D4), зокрема, за допомогою гомогенізації насіння згаданих трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що створює рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду (D54), і/або поліпептиду (D4), виходячи з одержаного у попередній стадії екстракту, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини, у результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54), і/або поліпептид (D4), по суті, у чистому вигляді. Винахід стосується також любої трансгенної рослинної клітини, такої як описана вище, яка містить рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно з винаходом, такі, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (D54), і/або поліпептид (D4), причому зазначена рослинна клітина називається ще рослинною клітиною з ферментативною активністю, переважно, з ліпазною активністю, такою як описується нижче. Предметом винаходу також є генетично трансформоване насіння, що містить одну рекомбінантну нуклеотидну послідовність (або декілька рекомбінантних нуклеотидних послідовностей), таку як описана (описані) вище послідовність (послідовності), згідно винаходу стабільно інтегровану у геном. Винахід стосується також описаного вище трансгенного насіння, що містить один рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, наприклад, рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54), і/або поліпептид (D4), причому вказане насіння називається ще насінням з ферментативною активністю, переважно, з ліпазною активністю, такою як описується нижче. Трансформованим згідно винаходу насінням є насіння,одержане від генетично трансформованих, згідно винаходу, рослин, причому цими трансформованими рослинами є або рослини вищевказаної генерації Т0, одержані шляхом культивування трансформованих, згідно винаходу, клітин, або рослини наступних генерацій (Т1, Т2 і т.д.), одержані самозапиленням або схрещенням рослин попередніх генерацій (як було вказано вище). Предметом винаходу також є генетично трансформовані рослини або частини рослин (особливо експлантати, стебла, листя, плоди, коріння, пилок тощо), які відрізняються тим, що вони містять одну або декілька рекомбінантних нуклеотидних послідовностей таких, як описані вище, стабільно інтегрованих, згідно винаходу, в їх геном. Винахід стосується також описаних вище трансгенних рослин або їх частин, які містять один або декілька рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (D54) і/або поліпептид (D4), причому названі рослини або їх частини ще називаються рослинами або частинами рослин з ферментативною активністю, переважно, з ліпазною активністю, такою, як описується нижче. Предметом винаходу, переважно, є згадані вище трансформовані рослини, такі, які одержують шляхом культивування клітин або насіння, згідно винаходу, такі як описані вище. Трансформовані згідно винаходу рослини або їх частини, переважно, вибирають з рапсу, тютюн у, кукурудзи, горо ху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, рису, салату-латук у, люцерни та буряка, або з частин цих рослин. Предметом даного винаходу є любий рослинний екстракт з ферментативною активністю, більш конкретно, з ліпазною активністю, що описується нижче, наприклад, екстракт, який одержується за одним з описаних вище способів згідно винаходу та який містить як активні ферменти один рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (D54) і/або поліпептиду (D4). Ліпазну (або ліполітичну) активність рослин або їх частин, а також рослинних екстрактів з ферментативною активністю згідно винаходу, можна, особливо, визначати методом Гаргурі [Gargouri та ін., 1986p.], при якому використовують тригліцерид з коротким ланцюгом (наприклад, трибутирин) як субстрат. Ферментативна активність виражається в одиницях (од.), при цьому одна одиниця (од.) відповідає кількості ферменту, необхідної для виділення 1мкмоль вільних жирних кислот на хвилину при температурі 37°С при оптимальному значенні pH. Рослинними екстрактами з ферментативною активністю згідно винаходу, переважно, є такі, де масовий відсоток ферментативно активних рекомбінантних поліпептидів складає приблизно від 0,1 до 20%мас, особливо, від близько 1 до близько 15%мас, від загальної маси присутніх у цих екстрактах протеїнів, що відповідає величині ферментативної активності близько 0,5-1000од./г сирої маси листя, особливо, близько 10-300од./г сирої маси листя або ще близько 1-5000од./г сирої маси насіння, особливо, приблизно 101000од./г сирої маси насіння. Предметом винаходу, особливо, є наступні рослинні екстракти з ферментативною активністю: екстракти з листя і/або плодів, і/або насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів цих рослин за допомогою послідовності pd35S-PSLGL-LGC або послідовності pd35S-PS-LGC, або послідовності pd35S-PPS-LGC, за одним з описаних вище способів і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54), і/або поліпептид (D4), особливо: - екстракт з листя тютюн у, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів листя тютюн у, за допомогою послідовності pd35S-PS-LGC або послідовності pd35S-PPS-LGC, по описаному вище способу і який містить поліпептид (D54) у сполученні з поліпептидом (D4), причому масовий відсоток суміші цих обох поліпептидів по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті протеїнів складає приблизно від 0,1 до 20%мас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 100-300од./г сирої маси; - екстракт з листя або плодів томатів, таких як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів з листя томату, за допомогою послідовності pd35S-PS-LGC або послідовності pd35S-PPS-LGC, по описаному вище способу і які містять поліпептид (D54) у сполученні з поліпептидом (D4), причому масовий відсоток суміші цих обох поліпептидів по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до 20%мас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 100-300од./г сирої маси; - екстракт з листя тютюну, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з листя тютюн у, за допомогою послідовності pd35S-PSLGL-LGC по описаному вище способу і який містить поліпептид (D4), причому масовий відсоток цього поліпептиду по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до 20%мас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 100-300од./г сирої маси; - екстракт з насіння тютюну, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з листя тютюн у, за допомогою послідовності pd35S-PS-LGC або послідовності pd35S-PPS-LGC, за описаним вище способом і який містить поліпептид (D54), причому масовий відсоток поліпептиду (D54) по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до 1%мас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 10-300од./г сирої маси, екстракти з насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів цих рослин за допомогою послідовності pCRU-PS-LGC або послідовності pCRU-PPS-LGC, або послідовності pGEA1PSLGL-LGC, або послідовності pGEA6-PSLGL-LGC, за одним з описаних вище способів і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54), і/або поліпептид (D4), особливо: - екстракт з насіння рапсу, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів листя рапсу, за допомогою послідовності pCRU-PS-LGC або послідовності pCRU-PPS-LGC, або послідовності pGEAl-PSLGL-LGC, або послідовності pGEA6-PSLGL-LGC, описаним вище способом і який містить поліпептид (D54), причому масовий відсоток поліпептиду (D54) по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті протеїнів, складає приблизно від 0,1 до близько 1%мас, ферментативна активність цього екстракту складає від приблизно 10 до приблизно 1000од./г сирої маси; екстракти з насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів цих рослин за допомогою послідовності pAR-IAR-PSLGL-LGC і/або послідовності рg-зеїн-PSLGL-LGC, і/або послідовності рg-зеїн-PSLGL-LGC-KDEL, за одним з описаних вище способів і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54), і/або поліпептид (D4), особливо: - екстракт з зерен кукурудзи, такий, як одержуваний шляхом трансформації клітин кукурудзи (зокрема, калюсів кукурудзи) за допомогою послідовності pAR-IAR-PSLGL-LGC і/або послідовності рg-зеїн-PSLGLLGC, і/або послідовності рg-зеїн-PSLGL-LGC-KDEL, за описаним вище способом і яка містить поліпептид (D54), причому масовий відсоток поліпептиду (D54) по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до приблизно 1%мас, ферментативна активність цього екстракту складає від приблизно 10 до приблизно 1000од./г сирої маси. Предметом даного винаходу також є будь-яка ферментативно активна рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, амінокислотною послідовністю якої є така, представлена на Фіг.2 або її поліпептидні похідні, що одержуються, особливо, за допомогою додавання та/або супресії, та/або заміни одної або декількох амінокислот, причому ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, такі, які одержують, по суті, у чистому вигляді одним з описаних вище способів згідно винаходу, причому ці способи включають стадію очищення рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, особливо, шля хом хроматографії описаних вище ферментативних екстрактів. Предметом винаходу, більш конкретно, є поліпептиди (D54) і (D4), зазначені вище як поліпептидні похідні вищевказаної рекомбінантної LGC, молекулярні маси яких складають відповідно близько 37кДа та близько 49кДа. Під ферментативно активною рекомбінантною шлунковою ліпазою собаки або поліпептидними похідними з ліпазною активністю, такими, як вказані вище, розуміють любий рекомбінантний поліпептид, який характеризується ліпазною активністю, такою, яку визначають за вказаним вище методом Гаргурі. У якості ілюстрації, рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу характеризуються ліпазною активністю приблизно від 10 до приблизно 1000од/мг рекомбінантних поліпептидів, переважно, приблизно 100600од./мг. Винахід стосується, особливо, рекомбінантної шлункової ліпази собаки, такої, яку одержують шляхом очищення ферментативного екстракту з листя або насіння тютюну, причому зазначені листя або насіння одержують від трансформованих тютюнови х рослин, які, в свою чергу, одержують з клітин тютюну, трансформованих за допомогою послідовності pd35S-PSLGL-LGC за описаним вище способом, причому вказана рекомбінантна шлункова ліпаза собаки характеризується ліпазною активністю, такою, як описана вище. Предметом винаходу також є поліпептид (D54) і поліпептид (D4), які одержують очищенням ферментативного екстракту з листя та/або насіння, та/або плодів рослин, зокрема, пасльонових, таких як трансформовані тютюн або томат, причому ці останні самі одержують з клітин рослин, трансформованих за допомогою послідовності pd35S-PS-LGC або послідовності pd35S-PPS-LGC, або послідовності pd35SPSLGL-LGC, за описаним вище способом, причому вище вказані рекомбінантні поліпептиди (D54) і (D4) характеризуються ліпазною активністю, наприклад, такою, як вказана вище. Винахід стосується також поліпептиду (D54), такого, який одержують очищенням ферментативного екстракту з насіння тютюну або насіння рапсу, причому зазначене насіння одержують відповідно від трансформованих рослин тютюну або рапсу, які, у свою чергу, одержують відповідно з клітин тютюну або рапсу, трансформованих за допомогою послідовності pCRU-PS-LGC та/або послідовності pCRU-PPS-LGC, за описаними вище способами, причому рекомбінантний поліпептид (D54) характеризується ліпазною активністю, такою, як описана вище. Предметом винаходу також є поліпептид (D54) і поліпептид (D4), що одержуються шляхом очищення ферментативного екстракту з насіння рапсу, причому це насіння походить від трансформованих рослин рапсу, які, у свою чергу, одержують з клітин рапсу, трансформованих за допомогою послідовності pGEA1PSLGL-LGC і/або послідовності pGEA6-PSLGL-LGC, за описаними вище способами, причому рекомбінантні поліпептиди (D4) і (D54) характеризуються ліпазною активністю, такою, як описана вище. Предметом винаходу також є поліпептид (D54) і поліпептид (D4), що одержуються шляхом очищення ферментативного екстракту з зерен кукурудзи, причому ці зерна походять від трансформованих кукурудзяних рослин, які, у свою чергу, одержують з клітин кукурудзи, трансформованих за допомогою послідовності pAR-IAR-PSLGL-LGC і/або рg-зеїн-PSLGL-LGC, і/або рg-зеїн-PSLGL-LGC-KDEL, за описаними вище способами, причому рекомбінантні поліпептиди (D4) і (D54) характеризуються ліпазною активністю, такою, як описана вище. Уявні молекулярні маси поліпептидів (D54) і (D4) згідно винаходу складають, відповідно, 37кДа і 49кДа, коли їх визначають шляхом аналізу при використанні поліакриламідного гелю та шляхом імунологічного аналізу після електрофоретичного перенесення на нітроцелюлозу (ці методи детально розглянуті у прикладах здійснення винаходу, які наведеш нижче). Винахід стосується антитіл, направлених проти рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, особливо, таких, направлених проти рекомбінантної шлункової ліпази собаки згідно винаходу та/або проти вищезазначених поліпептиду (D54) і/або поліпептиду (D4), і здатних розпізнавати шлункову ліпазу людини. Такі антитіла можна одержувати у результаті імунізації тварини вказаними поліпептидами з наступним виділенням антитіл, що утворились. Зрозуміло, що це продукування не обмежується поліклональними антитілами. Його можна застосовувати і для будь-якого моноклонального антитіла, що продукується любою гібридомою, яка може бути одержана класичними методами з селезінкових клітин тварини, особливо миші або пацюка, імунізованих проти одного з очищених поліпептидів згідно винаходу, з одного боку, а також з клітин відповідної мієломи, з іншого боку, і може бути селекціонована завдяки своїй здатності до продукування моноклональних антитіл, що розпізнають зазначений вище поліпептид, який використовується початково для імунізації тварин, також, як шлункова ліпаза людини. Винахід стосується також застосування рослин, їх частин, рослинних клітин або насіння, трансформованих згідно винаходу, для одержання рекомбінантного поліпептиду (або декількох рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки або її поліпептидні похідні, такі, як вказані вище, особливо шляхом здійснення одного з приведених вище способів згідно винаходу, причому вищевказані рекомбінантні поліпептиди знаходяться, по суті, у чистому вигляді або містяться у рослинних екстрактах з ферментативною активністю, таких, як описані вище. Предметом винаходу також є застосування, в області харчування людини або тварини, рослин або їх частин з ферментативною активністю згідно винаходу, або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки або її поліпептидні похідні, такі, як описані вище. Винахід, переважно, стосується застосування як продуктів харчування рослин, їх частин, особливо, листя, плодів, насіння, з ферментативною активністю згідно винаходу. На цій підставі предметом винаходу є, особливо, будь-який харчовий продукт, який одержується з рослини з ферментативною активністю, такої, як описана вище або з її частин, особливо з листя або плодів, або ще насіння цієї рослини, що є їстівним для людини або тварини. Винахід також стосується любої харчової композиції, що містить рослину (або декілька рослин) з ферментативною активністю, таку (такі), як описана (описані) вище та/або частини такої рослини (таких рослин), особливо, листя та/або насіння, та/або плоди цієї рослини (цих рослин), та/або рослинний екстракт (рослинні екстракти) з ферментативною активністю, як, наприклад, описаний (описані) вище, та/або рекомбінантний поліпептид (або рекомбінантні поліпептиди) згідно винаходу, у випадку необхідності, у сполученні з іншою їстівною сполукою (або декількома іншими їстівними сполуками). Переважно, рослини або їх частини, які містяться у вказаній харчовій композиції, знаходяться у вигляді гомогенату. Харчові продукти згідно винаходу, що називаються також функціональними харчовими продуктами, або харчові композиції згідно винаходу, призначені, особливо, для полегшення абсорбції рослинних або тваринних жирів, які потрапляють у шлунок індивідууму, здорового або ураженого одною або декількома патологіями, що впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази. На цій підставі продукти харчування або харчові композиції згідно винаходу, переважно, використовують як харчові добавки. Предметом винаходу також є застосування рослин або їх частин, особливо, листя та/або плодів, і/або насіння, або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу, або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, або її поліпептидні похідні, такі, як описані вище, для одержання медикаментів (або фармацевтичних композицій), призначених для полегшення абсорбції рослинних або тваринних жирів, які потрапляють у шлунок індивідууму, здорового або враженого одною або декількома патологіями, які впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази. Зокрема, такі фармацевтичні композиції, переважно, використовують для індивідуумів, які піддаються лікуванню, що приводить до погіршення механізму абсорбції жирів або ще для осіб похилого віку. Фармацевтичні композиції згідно винаходу також, переважно, призначені для лікування патологій, пов'язаних з недостатністю ліпаз (особливо шлункової та/або панкреатичної ліпаз) в організмі, та більш конкретно, патологій, таких, як муковісцидоз або екзокринна панкреатична недостатність. Предметом винаходу, більш конкретно, є люба фармацевтична композиція, яка містить описаний вище рослинний екстракт (рослині екстракти) з ферментативною активністю та/або рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, при необхідності, у сполученні з фармацевтично прийнятним ексципієнтом. Предметом винаходу, особливо, є люба вказана вище фармацевтична композиція, що містить рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54) і/або поліпептид (D4), по суті, у чистому вигляді або у вигляді ферментативних екстрактів, таких, як описані вище. Фармацевтичні композиції згідно винаходу, переважно, вводять перорально і, переважно, знаходяться у вигляді желатинових капсул, таблеток або порошків, що розбавляються. Добова доза для людини, переважно, складає приблизно 200-1000мг, яку вводять частинами, переважно, у момент основних прийомів їжі, у тому випадку, коли вищевказані фармацевтичні композиції містять ферментативні екстракти, такі, як описані вище, і близько 100-500мг у тому випадку, коли вищевказані фармацевтичні композиції містять рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу переважно у чистому вигляді. Предметом винаходу також є застосування рослин або їх частин, особливо листя, та/або плодів, і/або насіння, або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, такі як, рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, або її поліпептидних похідних, таких, як описані вище, для проведення ферментативних реакцій в області індустрії, продовольчої промисловості або агропромисловості, особливо, у промисловості з виробництва жирів, ліпохімй та молочної промисловості. На цій підставі винахід стосується любого способу, особливо ферментативної біоконверсії або біокаталізу, шляхом здійснення одної або декількох ферментативних реакцій в області індустрії, продовольчої промисловості або у агропромисловості, особливо, у промисловості по виробництву жирів, ліпохімії та молочної промисловості, причому ці ферментативні реакції проводяться за допомогою рослин, або їх частин, зокрема, листя, і/або плодів, і/або насіння, і/або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, як, наприклад, рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, або її поліпептидні похідні, такі, як описані вище. Предметом винаходу, зокрема, є ферментативні препарати, призначені для використання в області індустрії, продовольчої промисловості та у агропромисловості, які можна застосовувати у рамках здійснення способу, такого як описані вище та які містять рослинний екстракт (або декілька рослинних екстрактів) з ферментативною активністю, як, наприклад, описані вище, і/або один або декілька рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, зокрема, рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (D54) та/або поліпептид (D4), при необхідності, у сполученні з одною або декількома добавками або одним або декількома іншими ферментами, придатними для застосування у промисловому масштабі. Винахід стосується також застосування рослин або їх частин, зокрема, листя, та/або плодів, та/або насіння, або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу, для здійснення у промисловому масштабі реакцій ферментативних біоперетворень або біокаталізів, таких, як ферментативний гідроліз або ферментативна переетерифікація. Рослини з ферментативною активністю або частини цих рослин, зокрема, листя, та/або плоди, та/або насіння, або рослинні клітини згідно винаходу, переважно, використовують одночасно як ферментативне джерело та реакційний субстрат. Предметом винаходу також є любий спосіб біокаталізу, при якому використовують рослини або їх частини, зокрема, листя, та/або плоди, та/або насіння, або рослинні клітини, з ферментативною активністю згідно винаходу, та, зокрема, рослини, які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (D54) та/або поліпептид (D4), причому вищевказані рослини або їх частини застосовують одночасно як ферментативне джерело та реакційний субстрат. Винахід стосується переважно застосування рослин з ферментативною активністю. Або частин цих рослин, згідно винаходу, з метою одержання біопалива. На цій підставі, предметом даного винаходу є любий спосіб одержання біопалива шляхом добавлення спирту, особливо метанолу або етанолу, до гомогенату з цілих або частин рослин, трансформованих згідно винаходу, переважно, до гомогенату з насіння рапсу, соняшника або сої, трансформованих відповідно до винаходу, та шляхом рекуперації біопалива, особливо, шляхом фільтрації. Винахід стосується також ефірів рослинних жирних кислот, які одержують зазначеним вище способом, особливо, як метиловий ефір олеїнової кислоти. Предметом винаходу також є любе біопаливо, наприклад, біопаливо, яке одержується способом, таким, як описаний вище, і, особливо, любе вищевказане біопаливо, яке містить ефіри рослинних жирних кислот. Винахід, зокрема, стосується любого біопалива, такого, яке одержують шляхом здійснення вищевказаного способу з насіння рапсу і яке містить метиловий ефір олеїнової кислоти. Винахід також стосується застосування зазначених вище антитіл, спрямованих проти рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, для здійснення методу виявлення або кількісного аналізу шлункової ліпази собаки або людини у біологічній пробі, яка може містити таку ліпазу. Винахід стосується, особливо, застосування зазначених антитіл для здійснення методу діагностики ін вітро патологій, пов'язаних з надпродукуванням або навпаки з недостатністю, навіть з відсутністю продукування ліпази в організмі. Такий метод діагностики ін вітро, що реалізується на відібраній у пацієнта біологічній пробі, включає стадію співставлення вказаної проби з одним або декількома антитілами згідно винаходу, за якою йде стадія виявлення можливих комплексів антитіло-LGH, що утворилися під час попередньої стадії. На цій підставі винахід стосується також набору для здійснення згаданого вище методу виявлення або діагностики ін вітро, який включає: - антитіла, такі як описані вище, переважно, радіоактивно або ферментативно маркіровані, а також реактиви для створення сприятливого середовища при проведенні імунологічної реакції між цими антитілами та шлунковою ліпазою людини; - реактиви для виявлення імунологічних комплексів, що утворюються між цими антитілами та шлунковою ліпазою людини. Предметом даного винаходу, особливо, є застосування рекомбінантної нуклеотидної послідовності, яка містить з одного боку, кДНК, представлену на Фіг.4 і кодуючу шлункову ліпазу людини, представлену на Фіг.5, або нуклеотидну послідовність, що походить від цієї кДНК, особливо, в результаті добавки та/або супресії та/або заміни одного або декількох нуклеотидів, причому ви щевказана похідна послідовність здатна кодувати поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична такій шлункової ліпази людини, наведеної на Фіг.5, або поліпептидну похідну шлункової ліпази людини, що одержується шляхом добавки, та/або супресії, та/або заміни одної, або декількох амінокислот, причому ця поліпептидна похідна характеризується ліпазною активністю, та, з іншого боку, елементи, які сприяють рослинній клітині продукувати поліпептид, кодований за допомогою вищевказаної кДНК або вищевказаної похідної послідовності, особливо, промотор та термінатор транскрипції, що розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин (особливо, за допомогою РНК-полімераз цих клітин), з метою трансформації рослинних клітин для одержання з цих клітин або рослин, одержаних з цих клітин, рекомбінантної шлункової ліпази у вигляді активного ферменту або одної, або декількох поліпептидних похідних цього ферменту, таких, як описані вище. На цій підставі винахід стосується любої рекомбінантної нуклеотидної послідовності, такої як, описана вище, в рамках трансформації рослин з метою одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки, в якій нуклеотидна послідовність, кодуюча шлункову ліпазу собаки та наведена на Фіг.1 або 3, замінена нуклеотидною послідовністю, що кодує шлункову ліпазу людини та наведена на Фіг.4. Предметом винаходу є, особливо, наступні рекомбінантні нуклеотидні послідовності: - послідовність (що позначається як pSP-PSLGH-LGH), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pSP бактерії Agribacterium tumefaciens, послідовність, яка кодує сигнальний пептид шлункової ліпази людини, за якою безпосередньо йде представлена на Фіг.4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роІуА S35 вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pSP-PSLPH-LGH), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pSP, бактерії Agribacterium tumefaciens, послідовність, яка кодує сигнальний пептид шлункової ліпази людини, за якою безпосередньо йде представлена на Фіг.4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор polyA S35 вірусу CaMV; - послідовність (що позначається як pSP-PSLGL-LGH), яка містить у напрямку 5'®3' промотор pSP бактерії Agribacterium tumefaciens, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду LGL (такої, як описана вище), за якою безпосередньо йде представлена на Фіг.4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор polyA S3 5 вірусу CaMV. Винахід стосується також векторів і клітин-хазяїв, трансформованих вказаними векторами, таким як описані вище, та які містять вищевказані рекомбінантні нуклеотидні послідовності, що кодують шлункову ліпазу людини та/або її поліпептидні похідні. Предметом даного винаходу є також любий спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази людини у вигляді активного ферменту та/або одної або декількох її поліпептидних похідних, що одержуються, особливо, за допомогою додавання та/або супресії, та/або заміни одної, або декількох амінокислот, причому ця або ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію рослинних клітин для інтеграції у геном цих клітин одної або декількох рекомбінантних нуклеотидних послідовностей згідно винаходу, - при необхідності, одержання трансформованих рослин з вказаних вище трансформованих клітин, - виділення рекомбінантної ліпази людини та/або одної, або декількох вищевказаних поліпептидних похідних, продукованих у вказаних вище трансформованих клітинах або рослинах, особливо шляхом екстракції з наступним, при необхідності, очищенням. Предметом винаходу є, особливо, любий спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази людини шляхом здійснення способу, такого, як описаний вище, у рамках одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або її поліпептидних похідних за допомогою вищевказаної рекомбінантної послідовності, яка включає представлену на Фіг.4 послідовність. З поліпептидів, що є похідними рекомбінантної шлункової ліпази людини, які можна одержувати в рамках здійснення способу згідно винаходу, можна вказати: - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 74 і 398 Фіг.5, що називається також поліпептидом (D54LGH); - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими в позиціях 24 і 398 Фіг.5, що називається також поліпептидом (D4LGH). Винахід стосується, особливо, способу одержання, такого, як описаний вище, рекомбінантної шлункової ліпази людини та/або поліпептиду (D54LGH), та/або поліпептиду (D4LGH), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів з листя рослин за рахунок поєднання цих останніх зі штамом Agrobacterium tumefaciens, трансформованим за допомогою плазміди, такої, як описана вище, яка містить вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність pSP-PSLGH-LGH і/або pSP-PSLPH-LGH, і/або pSPPSLGL-LGH, у відповідному культуральному середовищі; - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, яке містить канаміцин, - одержання трансформованих рослин з трансформованих експлантатів, вказаних вище, шляхом їх культивування у відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази людини та/або поліпептиду (D54LGH), і/або поліпептиду (D4LGH), особливо, за допомогою гомогенізації листя та/або зерен, і/або плодів згаданих трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадовоі рідини, що являє собою рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази людини та/або поліпептиду (D54LGH), і/або поліпептиду (D4LGH), виходячи з одержаного під час попередньої стадії, екстракту, особливо, шляхом хроматографії надосадовоі рідини, в результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу людини та/або поліпептид (D54LGH), і/або поліпептид (D4LGH), по суті, у чистому вигляді. Винахід стосується також всієї рослини або її частини, як листя та/або плодів, та/або насіння, що містять одну або декілька рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, таких, як описані вище, згідно винаходу, стабільно інтегровані в їх геном. Предметом даного винаходу є любий рослинний екстракт з ферментативною активністю, особливо, з ліпазною активністю, що описується нижче, який одержується шляхом здійснення одного з описаних вище способів, згідно винаходу, якій місить у якості активних ферментів один або декілька рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза людини та/або поліпептид (D54LGH), і/або поліпептид (D4LGH). Предметом винаходу є, особливо, екстракти з листя та/або насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів з цих рослин за допомогою послідовності pSP-PSLGH-LGH або послідовності pSP-PSLPH-LGH, або послідовності pSP-PSLGL-LGH одним з описаних вище способів, і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу людини та/або поліпептид (D54LGH), і/або поліпептид (D4LGH), зокрема: - екстракт з листя або насіння тютюну, такого як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з тютюнового листя, за допомогою послідовності pSP-PSLGH-LGH, або послідовності pSPPSLPH-LGH, або послідовності pSP-PSLGL-LGH, згідно вищеописаному способу, та який містить поліпептид (D54LGH) у сполученні з поліпептидом (D4LGH), причому масовий відсоток суміші з цих двох поліпептидів по відношенню до загальної маси присутніх у даному екстракті протеїнів складає від близько 0,1 до близько 20%мас, а ферментативна активність вказаного екстракту досягає від близько 100 до близько 300од./г сирої маси; - екстракт з листя тютюну, такого як, одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з тютюнового листя, за допомогою послідовності pSP-PSLGL-LGH, та який містить поліпептид (D4LGH), причому масовий відсоток цього поліпептиду по відношенню до загальної маси присутніх у даному екстракті протеїнів складає від близько 0,1 до близько 20%мас, а ферментативна активність вказаного екстракту досягає від близько 100 до близько 300од./г сирої маси. Предметом даного винаходу є також люба ферментативно активна рекомбінантна шлункова ліпаза людини, амінокислотною послідовністю якої є така, представлена на Фіг.5 або її поліпептидні похідні. Одержувані, особливо, за допомогою додавання та/або супресії, та/або заміни одної, або декількох амінокислот, зокрема, поліпептиди (D54LGH) та (D4LGH), причому ці поліпептидні похідні характеризуються ліпазною активністю, такі, як одержувані, переважно, у чистому вигляді одним з описаних вище способів згідно винаходу, причому ці способи включають стадію очищення рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, зокрема, шляхом хроматографії описаних вище ферментативних екстрактів. Як вже зазначалось вище стосовно рекомбінантної шлункової ліпази собаки, предметом винаходу також є: - полі- або моноклональні антитіла, спрямовані проти рекомбінантної шлункової ліпази людини або її поліпептидних похідних згідно винаходу та їх застосування, як описано вище; - харчові продукти або харчові композиції, або фармацевтичні композиції, або ферментативні препарати, призначені для промислового застосування, на основі рослин або їх частин, особливо листя, та/або плодів, та/або насіння, та/або рослинних клітин, або рослинних екстрактів, з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантної шлункової ліпази людини, або її поліпептидних похідних згідно винаходу; - любий спосіб ферментативної біоконверсії або біокаталізу або одержання біопалива, як описані вище, що здійснюються при використанні рекомбінантної шлункової ліпази людини або її поліпептидних похідних згідно винаходу або рослин, або частин рослин, зокрема, листя та/або плодів, і/або насіння, та/або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище. Далі винахід пояснюється шляхом наведеного нижче детального опису одержання рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, таких, як описані вище, а також трансформованих рослин, які продукують рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу, та способу одержання біопалива. І. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантний протеїн шлункової ліпази собаки та забезпечують експресію у листі та насінні пасльонових (І-А) Констр укція химерних генів, які кодують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та забезпечують експресію у тютюні. Для експресії у листі та насінні тютюну ген у, що кодує шлункову ліпазу собаки потрібні наступні регулюючі послідовності: 1. Подвійний конститутивний промотор 35S (pd35S) вірусу мозаїки цвітної капусти CaMV. Він відповідає подвоєнню послідовностей, що активують транскрипцію та розташовані вище елементу ТАТА природного промотору 35S [Kay та ін., 1987p.]. 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор poly 35S, який відповідає некодуючій ділянці 3' послідовності вірусу з дволанцюговою кільцевою ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт S35 [Frank та ін., 1980p.]. Конструкції різних плазмід при використанні прийомів, пов'язаних з рекомбінантною ДНК [Sambrook та ін., 1989p.], утворюються з рВІОС4. Дана бінарна плазміда походить від pGA492 (An, 1986p.), яка містить між лівим і правим краями, наступні послідовності, що походять від плазміди рТіТ37 Agrobacterium tumefaciens у її переносимій ДНК: конститутивний промотор гену nos, кодуючого нопалінсинтазу [Depicker та ін., 1982p.]; кодуюча послідовність гену nptll, кодуючого неоміцинфосфотрансферазу ІІ [Berg і Berg, 1983p.], одержана у результаті делеції ділянки перших 8 кодонів, у числі яких ініціюючий кодон метіонін ATG, та злиття з послідовністю з 14 перших кодонів кодуючої послідовності гену nos [Depicker та ін., 1982p.]; кодуюча послідовність гену nos, позбавлена ділянки з 14 перших кодонів; термінатор nos [Depicker та ін., 1982p.]; ділянка з множинними сайтами клонування (що називається також "полілінкер") (Hindni-Xbal-Sacl-Hpal-KpnlClal-Bgiir), попередній гену cat, кодуючому хлорамфеніколацетилтрансферазу [Close та Rodriguez, 1982p.], а також кінцеві послідовності гену 6 плазміди рТіА6 Agrobacterium tumefaciens [Liu та ін., 1993p.]. Для майже повного видалення кодуючої послідовності гену cat, плазміду pGA492 подвійно перетравлюють за допомогою Sad (сайт рестрикції полілінкеру) і за допомогою Seal (сайт рестрикції, присутній у послідовності гену cat), після чого піддають впливу ферменту Т4 ДНК полімерази (New England Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника Легування модифікованої плазміди (20нг) проводять у 10мкл реакційного середовища, що містить 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігази х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігази (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, які попередньо роблять компетентними, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих при використанні середовища, що містить 12 мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення. Потім сайт рестрикції HindІІІ плазмідної ДНК утриманого клону модифікують у сайті рестрикції EcoRI за допомогою фосфорильованого адаптеру HindІІІ-EcoRI (Stratagene Cloning Systems). Для проведення такої модифікації, 500нг плазмідної ДНК утриманого клону переварюють за допомогою HindllІ дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази телячого кишечнику (Boehringer Mannheim), відповідно до рекомендацій виробника, та співосаджують у присутності 1500нг ДНК адаптеру HindlІІ-EcoRI, 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію, pH 4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30хв. Після центрифугування з прискоренням 1200g протягом 30хв. ДНК, що випала в осад, промивають 70%-им етанолом, сушать. Обробляють за допомогою 8мкл води, витримують при 65°С протягом 10 хвилин, потім легують у присутності 1мкл буферу Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°C протягом 16 годин. Після інактивації Т4 ДНК лігази при 65°С протягом 10 хвилин, реакційну суміш після легування переварюють за допомогою EcoRI, очищують шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30хв., центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-им етанолом, сушать, потім легують, як описано вище. Бактерії Escherichia coli DH5a, які попередньо роблять компетентними, трансформують [Наnаhаn, 1983р.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих при використанні середовища, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення, особливо, за допомогою Ніndlll і EcoRI. Результуючу бінарну плазміду, що містить не більше 9 останніх кодонів кодуючої послідовності гену cat і сайт EcoRI, який є єдиним, позначають як рВІОС4. Касету експресії, утворену промотором pd35S та термінатором polyA 35S, виділяють з плазміди рЛТ163D. Плазміда рЛТ163D походить від плазміди рЛТ163, яка, в свою чергу, сама утворюється з плазміди рЛТ60 [Guerineau і Mullineaux, 1993p.]. Плазміда рЛТ163 містить кодон ATG, розташований між сайтами HindllІ і Sall полілінкера. Для видалення згаданого кодону ATG та одержання плазміди рЛТ163D, плазмідну ДНК рЛТ163 подвійно переварюють за допомогою HindllІ і Sall, очищують за допомогою електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об’єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-им етанолом, сушать, піддають впливу ферменту Кленова (New England Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника, видаляють протеїн шляхом екстракції за допомогою 1 об’єму суміші фенол:хлороформ:ізоаміловий спирт у співвідношенні 25:24:1, потім одного об'єму суміші хлороформ:ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:1, осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-им етанолом, сушать, і, нарешті, легують у присутності 1мкл буферу Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) та 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, які попередньо роблять компетентними, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Для виділення касети експресії, утвореної промотором pd35S і термінатором polyA 35S (фрагмент Sacl-Xhol), плазмідну ДНК утриманого клону рЛТ163D перетравлюють за допомогою SacI та Xhol. Фрагмент Sacl-Xhol, що міститься у касеті експресії, очищують за допомогою електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають70%-им етанолом, суша ть, потім піддають впливу ферменту Mung Bean Nuclease (New England Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника. Цю очищену вставку (200нг) клонують у плазмідній ДНК рВIOС4 (20нг), перетравлюють за допомогою EcoRI, обробляють ферментом Mung Bean Nuclease та дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Реакцію легування проводять у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігази х 10 (Amersham), 2мкл 50%го поліетиленгліколю 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, які попередньо роблять компетентними, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих при використанні середовища, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВIOС21. Шлункову ліпазу собаки (LGC) легко синтезують у вигляді попередника. Зрілий протеїн шлункової ліпази собаки складається з 379 амінокислот. Комплементарну ДНК шлункової ліпази собаки клонують у сайтах BgIII і SaIl вектору експресії pRU303, одержуючи вектор pDGL5.303, який описаний у міжнародній заявці 94/13816. Його використовують для конструкції бінарних плазмід рВIOС25, що містить PS-LGC і рВIOС26, що містить PPS-LGC, де послідовність, що кодує зрілу LGC, передує такій, що кодує сигнальний пептид (PS) або препропептид (PPS, тобто сигнальний пептид, за яким йдуть N-кінцеві вакуолярні спрямовуючі послідовності відповідно рослинного походження. Послідовностями PS і PPS, утвореними відповідно 23 і 37 амінокислотами, є такі запасного протеїну бульбоподібних коренів батату: спорамін A [Murakami та ін., 1986p.; Matsukoa і Nakamura, 1991p.]. Для спрощення злиття послідовності зрілої шлункової ліпази собаки з такою сигналів адресації, PS або PPS, плазміду pDGL5.303 модифікують за допомогою введення додаткового сайту рестрикції Hindlll у четвертий і п'ятий кодони послідовності зрілої шлункової ліпази собаки шляхом мутагенезу, що спрямовується за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (ПЦР) з використанням двох олігодезоксинуклеотидів: 5' caggagatc TTG ТТТ GGA AAG СТТ C AT ССС 3' (що містить єдиний сайт BglII у плазміді та дає додатковий сайт HindllІ) і 5' CAT ATT ССТ CAG CTG GGT АТС 3' (що містить єдиний сайт PvuII у плазміді). Ампліфікацію шляхом ПЦР фрагменту BgIII-PvuII здійснюють у 100мкл реакційного середовища, що містить 10мкл буфер у Taq ДНК полімераза х 10 (500мМ КСI, 100мМ Tris-НСI, рН=9,0 і 1% Triton х 100), 6мкл 25мМ MgCI2, 3мкл 10мМ dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 100пМ кожного з описаних вище дво х олігодезоксинуклеотидів, 5нг матричної ДНК (вектор експресії pRU.303, що включає комплементарну ДНК шлункової ліпази собаки), 2,5од. Taq ДНК полімерази (Промега) та 2 краплі вазелінового масла. ДНК денатурують при 94°С протягом 5 хвилин, піддають 30 циклам, кожний з яких включає: 1 хвилина денатурації при 94°С; 1 хвилина гібридизації при 50°С та 1 хвилина елонгації при 72°С, потім елонгацію при 72°С продовжують протягом 5 хвилин. Цю реакцію ПЦР проводять в апараті "DNA Thermal Cycler" фірми "Perkin Elmer Cetus". Масло видаляють шляхом екстракції хлороформом. Потім фрагменти ДНК, що містяться у реакційному середовищі, осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-им етанолом, сушать і перетравлюють за допомогою двох ферментів рестрикції BgIII і PvuII. Перетравлені фрагменти ДНК, що походять з ПЦР, очищують шляхом електрофорезу на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають70%-им етанолом, сушать, потім легують з плазмідною ДНК вектору pDGL.303, подвійно перетравлюють за допомогою Bglll і PvuII, очищують шля хом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють, осаджують за допомогою спирту, сушать і дефосфорилюють ферментом лужної фосфа тази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють зі 100нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 50нг перетравлених ферментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР і описаних вище у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4-ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, попередньо зроблені компетентними, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують по методу лужного лізису [Bimboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. При введенні цього сайту рестрикції HindllІ генетичний код шлункової ліпази собаки не змінюється. Насправді, послідовність природної шлункової ліпази собаки ААА ТТА (L ys-Leu) перетворюється в AAG СТТ (L ys-Leu). Одержану в результаті плазміду позначають як рВIOС22, причому вона включає послідовність протеїну зрілої шлункової ліпази собаки, яка відповідає: а. Конструкція бінарної плазміди рВІОС25, що містить PS-LGC Плазміду рВIOС22 перетравлюють повністю за допомогою Bglll і, частково, за допомогою HindllІ з метою видалення послідовності, що кодує поліпептид Leu-Phe-Gly-Lys (4 перші амінокислоти) протеїну зрілої шлункової ліпази собаки. Цю послідовність заміняють такою, що кодує сигнальний пептид PS з 23 амінокислот (ATG ААА GCC ТТС АС А СТС GCT СТС ТТС ТТА GCT СТТ ТСС СТС ТАТ СТС CTG ССС ААТ CCA GCC CAT ТСС), здійснюють злиття з послідовністю з 4 перших кодонів послідовності, що кодує протеїн зрілої шлункової ліпази собаки ("PS-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки"). Послідовність "PS-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки" ампліфікують за допомогою ПЦР, виходячи з плазміди Рмат103 [Matsuoka та Nakamura, 1991р.] за допомогою наступних дво х олігодезоксинуклеотидів: 5' caggagatctgATG ААА GCC ТТС АС А СТС GC 3' і 5' G ATG AAG СТТ ТСС ААА С АА GGA ATG GGC TGG ATT GGG C AG G 3', слідуючи протоколу ампліфікації ПЦР, як описано вище, у розділі 1. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою Bglll і Hindlll, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шля хом електрофорезу на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3 М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом, сушать, потім легують з плазмідною ДНК рВІОС22, яку подвійно перетравлюють за допомогою Bglll і HindllІ, очищують шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, сушать та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують зі 100нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 50нг перетравлених фрагментів ДНК, одержаних після ампліфікації за допомогою ПЦР та описаних вище, у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) та 2,5од. ферменту Т4ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Послідовності PS і зрілої шлункової ліпази собаки клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування. Розщеплюваною послідовністю, розташованою між послідовностями PS і зрілою шлунковою ліпазою собаки, є Ser-Leu. Одержану в результаті цього плазміду позначають як рВIOС23. Фрагмент BglII-Xbal, що включає послідовність PS-LGC, виділяють з рВIOС23 шляхом подвійного ферментативного перетравлення за допомогою BgIII і Xbal, очищення шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелюації [Sambrook та ін., 1989p.], осадження спиртом, висушування Після цього цей фрагмент обробляють ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК рВIOС21, перетравлюють у сайті HindllІ, обробляють ферментом Кленова та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять PS-LGC, у 20 мкл реакційного середовища у присутності 2 мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го поліетиленгліколя 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Bimboim і Doly, 1979p.] і аналізують шля хом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС25. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн PSLGC, аналізують шля хом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Плазмідну ДНК бінарного вектору рВІОС25 вводять шляхом прямої трансформації у штам LBA4404 Agrobacterium tumefaciens за методом Holsters та ін. (1978p.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням плазмідної ДНК. Б. Конструкція бінарної плазміди рBIOC26, що містить PPS-LGC Плазміду рВІОС22 перетравлюють повністю з допомогою BglIIта, частково, за допомогою HindllІ з метою видалення послідовності, що кодує поліпептид Leu-Phe-Gly-Lys протеїну зрілої шлункової ліпази собаки. Цю послідовність замінюють такою, що кодує сигнальний пептид PPS з 37 амінокислот (ATG ААА GCC ТТС АСА СТС GCT СТС ТТС ТТА GCT СТТ ТСС СТС ТАТ СТС CTG ССС ААТ CCA GCC CAT ТСС AGG ТТС ААТ ССС АТС CGC СТС ССС АСС АСА САС GAA ССС GCC), піддають злиттю з послідовністю з 4 перших кодонів протеїну зрілої шлункової ліпази собаки ("PPS-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки"). Послідовність "PPS-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки" ампліфікують шляхом ПЦР, виходячи з плазміди рМАТ103 [Matsuoka та Nakamura, 1991p.] за допомогою наступних дво х олігодезоксинуклеотидів: 5' caggagatctgATG ААА GCC ТТС АС А СТС GC 3' та 5' G ATG AAG СТТ ТСС ААА САА GGC GGG ТТС GTG TGT GGT TG 3', слідуючи протоколу ампліфікації шляхом ПЦР, як описано вище, у розділі 1. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою BglІІ і HindllІ, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шля хом електрофорезу на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають70%-им етанолом, суша ть, потім легують з плазмідною ДНК рВІОС22, подвійно перетравлюють за допомогою BgІІІ та HindІІІ, очи щують шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, суша ть та дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують зі 100нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 50нг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації шляхом ПЦР, у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) та 2,5од. ферменту Т4ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Послідовності PPS і зрілої LGC клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування. Розщеплюваною послідовністю між двома послідовностями є Ala-Leu. Одержану в результаті цього плазміду позначають як рВІОС24. Фрагмент BgІІI-Xbal, що включає послідовність PPS-LGC виділяють з рВІОС24 подвійним ферментативним перетравленням за допомогою Bglll і Xbal, очищують шля хом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують етанолом і сушать. Потім цей фрагмент оброблюють ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК рВІОС21, перетравлюють у сайті HindllІ, оброблюють ферментом Кленова та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфа тази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять PPS-LGC, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%го розчину поліетиленгліколя 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують ферментативним перетравленням за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС26. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн PPS-LGC, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Плазмідну ДНК бінарного вектору рВІОС26 вводять прямою трансформацією у штам LBA4404 Agrobacterium tumefaciens за методом Holsters та ін. (1978p.). Придатність одержаного клону контролюють шляхом ферментативного перетравлення введеної плазмідної ДНК. В. Конструкція бінарної плазміди рВІОС41, що містить PSLGL-LGC Шлункову ліпазу кроля синтезують у вигляді попередника, що включає сигнальний пептид з 22 амінокислот, який розташований на NН2-кінці та передує поліпептидній послідовності зрілої ліпази; клон pJ0101, що містить повну кДНК, кодуючу шлункову ліпазу кроля, описаний у європейський заявці на патент №92403055.4, поданій 12.11.92 дослідницьким інститутом "Institut de Recherche Jouveinal" та яка називається "Нуклеїнові кислоти, що кодують шлункову ліпазу кроля та поліпептидні похідні, їх застосування для продукування цих поліпептидів та фармацевтичні композиції на їх основі". Вистроювання поліпептидних послідовностей шлункової ліпази собаки та попередника шлункової ліпази кроля показує, що послідовність LFGK присутня в обох протеїнах. У поліпептидній послідовності ліпази кроля, що винайдена у природному очищеному протеїні [Moreau та ін., 1988p.], перші три залишки L, F, G відсутні та входять у склад сигнального пептиду з 22 амінокислотами шлункової ліпази кроля (LGL). Тому сигнальний пептид шлункової ліпази кроля, позбавлений вказаних трьох загальних амінокислот, злився зі зрілою протеїновою послідовністю шлункової ліпази собаки. Її поліпептидна послідовність складається з 19 наступних амінокислот: MWVLFMVAALLSALGTTHG. Плазміду рВІОС22, отже, перетравлюють повністю за допомогою BgllI та, частково, за допомогою HindllІ з метою видалення послідовності, що кодує поліпептид Leu-Phe-Gly-Lys (4 перші амінокислоти) протеїну зрілої шлункової ліпази собаки. Цю послідовність замінюють такою, що кодує сигнальний пептид PSLGL шлункової ліпази кроля з 19 амінокислот (ATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG GC A GCT TTG СТА ТСТ GC A СТТ GGA ACT АСА CAT GGT), піддають злиттю з послідовністю з 4 перших кодонів протеїну зрілої шлункової ліпази собаки ("PSLGL-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки"). Послідовність "PSLGL4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки" ампліфікують за допомогою ПЦР, виходячи з плазміди pJ0101, за допомогою наступних двох олігодезоксинуклеотидів: 5' aggagatctcaacaATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG 3' і 5' G ATG AAG СТТ ТСС ААА САА АСС ATG TGT AGT ТСС AAG TG 3', слідуючи протоколу ампліфікації ПЦР, який описаний вище, у розділі 1. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою BgllI І HindllІ, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують електрофорезом на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 та 2,5об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-им етанолом, сушать, потім легують з плазмідною ДНК, що входить до складу рВIOС22, подвійно перетравлюють за допомогою BglII і HindIII, очищують електрофорезом на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, сушать і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують зі 100нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 50нг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, що по ходять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) та 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Послідовності PSLGL та зрілої шлункової ліпази собаки клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування (тобто таким чином, що вони утворюють одну відкриту рамку зчитування). Розщеплюваною послідовністю, розташованою між двома послідовностями PSLGL і зрілою LGC, є Gly-Leu. Одержану в результаті плазміду позначають як рВIOС40. Фрагмент BglII-Xbal, що несе послідовність PSLGL-LGC виділяють з рВIOС40 подвійним ферментативним перетравленням за допомогою BgIII та Xbal, очищенням шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелюацією [Sambrook та ін., 1989p.], осадженням спиртом, висушуванням. Після цього цей фрагмент ДНК оброблюють ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК рВIOС21, перетравлюють у сайті HindllІ, оброблюють ферментом Кленова та дефосфорилюють ферментом лужної фосфа тази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять PSLGL-LGC, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%го поліетиленгліколя 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВIOС41. Нуклеотидну послідовність фрагментів, що кодує рекомбінантний протеїн PSLGL-LGC, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОС41 вводять шляхом прямої трансформації у штам LBA4404 Agrobacterium tumefaciens за методом Holsters та ін. (1978p.). Придатність одержаного клону контролюють шляхом ферментативного перетравлення введеної плазмідної ДНК. І-Б. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та забезпечують експресію у томаті. Використані конструкції є такими ж, що і конструкції, вказані для генетичної трансформації тютюну, а саме плазміди рВІОС25, рВІОС26 та рВІОС41. II. Констр укція химерних генів, що кодують рекомбінантний протеїн шлункової ліпази собаки та забезпечують експресію у насінні рапсу а) Конструкція бінарної плазміди рВIOС28, що містить промотор pCRU. Експресія шлункової ліпази собаки (LGC) у насінні рапсу викликає необхідність вставки кДНК, що кодує LGC, між наступними регулюючими послідовностями: 1. промотор pCRU, що відповідає некодуючій ділянці 5' гену запасного протеїну насіння, круциферин А редьки [Depigny-This та ін., 1992р.] та сприяє специфічній експресії у насінні; 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA 35S, що відповідає некодуючій ділянці 3' послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскриптор S35 [Franck та ін., 1980p.]. Для одержання подібної рВIOС21 бінарної плазміди, у якої, однак, промотор pd35S замінений на промотор pCRU, фрагмент "EcoRI, оброблений ферментом Кленова та ВатHI", що містить промотор pCRU, виділяють з плазміди pBI221-CRURSP, що походить від рВІ221 (випускається у продаж фірмою "Clontech") шляхом заміни промотору S35 промотором pCRU. Фрагмент "EcoRI, оброблений ферментом Кленова та ВатHI", що містить промотор pCRU, очищують шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, сушать та легують з плазмідною ДНК рЛТ163 (описано у розділі 1), перетравлюють за допомогою КрnІ, оброблюють за допомогою Т4 ДНК полімерази (New England Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника, потім перетравлюють за допомогою ВатНІ, очищують шля хом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, сушать та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК "EcoRI, оброблений ферментом Кленова та ВатHI" у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчина Т4 ДНК лігази х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколю 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВIOС27. Касету експресії, що складається з промотору pCRU та термінатору роIуА S35, виділяють з плазміди рВІОС27, шляхом перетравлення повністю за допомогою Xhol, з наступним частковим перетравленням EcoRI. Її очищують електрофорезом на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, сушать, оброблюють ферментом Кленова (New England Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника та легують з плазмідною ДНК рВІОС24 у сайті EcoRI, обробленому ферментом Кленова, та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК XhoI-EcoRI у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколю 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Harahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції Одержану плазміду позначають як рВІОС28. б) Конструкція бінарної плазміди рВІОС29, що містить PPS-LGC Виділення фрагменту Bglll-Xbal, що містить послідовність PPS-LGC, з рВІОС24 було вже описано у розділі І-А-б. Цей фрагмент легують з плазмідною ДНК рВІОС28 у сайті EcoRI, обробленому ферментом Кленова, і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК BglІІ-Xhol, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігази х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколю 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОС29. Нуклеотидну послідовність рекомбінантного протеїну PPS-LGC, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977р.]. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОС29 вводять прямою трансформацією у штам LBA4404 Agrobacterium tumefaciens за методом Holsters та ін. (1978p.). Придатність одержаного клону контролюють шляхом ферментативного перетравлення введеної плазмідної ДНК. в) Конструкція бінарних плазмід рВІОС90 та рВІОС91, що містить промотор pGEAlD. Для експресії у насінні рапсу тваринного гену, що кодує шлункову ліпазу собаки, необхідні наступні регулюючі послідовності: 1. Промотор pGEA1, що відповідає некодуючій ділянці 5' гену запасного протеїну насіння, GEA1 Arabidopsis thaliana [Gaubier та ін., 1993р.] та забезпечує специфічну експресію у насінні; 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA 35S, що відповідає некодуючій ділянці 3' послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт S35 [Franck та ін., 1980p.]. Для одержання подібної рВІОС21 бінарної плазміди рВІОС90, у якої, однак, промотор pd35S, замінений на промотор Pgea1D, фрагмент Hindlll-BamHI, що оброблений по Кленову і містить промотор pGEA1, виділяють з плазміди pGUS2-pGEA1. Клон pGUS-2-pGEA1, що походить від рВІ221 в результаті заміни промотору p35S промотором pGEA1, містить у рамці зчитування 2 ATG: ATG гену GEA1 (Еm2) і ATG гену gus. ATG гену GEA1 видаляють. Фрагмент ДНК, що знаходиться між сайтом Sall та послідовностями вище ATG гену GEA1 клону pGUS-2-pGEA1, ампфліфікують за способом ПЦР за допомогою двох олігонуклеотидів: 5' CAAACGTGTAC AATAGCCC 3' і 5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3'. Підбирають температуру гібридизації. Ампліфікований шляхом ПЦР фрагмент перетравлюють за допомогою SaІl і ВатНІ, очищують шля хом електрофорезу на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3 М розчину ацетату натрію з Рн=4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-им етанолом, суша ть, потім легують з плазмідною ДНК, що входить до складу pGUS-2pGEA1, подвійно перетравлюють за допомогою SaІl та ВатНІ, очищують шляхом електрофорезу на 0,8%ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом і сушать. Легують зі 100нг вектору та 50нг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) та 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису [Вirnboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою Pharmacia, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Одержаний клон позначають як pGUS-2-Pgea1D. Фрагмент HindllІ-BamHI, який містить промотор pGEA1D, виділений з pGUS-2-pGEA1D і оброблений ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника (Biolabs), очищують шляхом електрофорезу на 0,8%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, сушать та легують з плазмідною ДНК рВІОС21 у сайтах КрnІ і HindllІ, оброблених ферментом Т4 ДНК полімераза (Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг дефосфорильованого рВІОС21 та 200нг описаних вище фрагментів ДНК XhoI-EcoRI, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколю 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису [Biraboim і Doly, 1979р.] та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВIOС90. Для одержання бінарної плазміди рВIOС91, касету експресії "pGEAlD-tNOS", виділену з pBSII-Pgea1D, вводять у бінарну плазміду pSCV1.2, яку, в свою чергу, одержують шляхом клонування фрагменту HindllІ, що містить касету експресії "p35S-nptII-tNOS", описану Fromm та ін. (1986p.), у сайті HindllІ pSCV1, створеному Edwards G.A. у 1990р., при використанні звичайних способів клонування. Плазміду pBSll-pGEA1D одержують у два етапи: - по-перше, фрагмент SacI-EcoRI, що несе tNOS (термінатор гену нопалінсинтази), бактерії Agrobacterium tumefaciens, оброблений фрагментом Т4 ДНК полімераза (Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника та очищений, клонують у сайті EcoRV pBSllSK+ (випускається у продаж фірмою Stratagene), дефосфорилюють ферментом лужна фосфатаза кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника Легують з 20нг дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять tNOS, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколю 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham), при 14°С протягом 16 годин Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надають компетентність, трансформують [Hanahan, 1983р.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] і аналізують шля хом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шля хом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977р.]. Одержану плазміду позначають як pBSll-tNOS, - по-друге, фрагмент, що несе pGEA1D, двічі перетравлений за допомогою HindllІ, оброблений ферментом Кленова і ВатHI та очищений, клонують в сайтах "Xbal, оброблений ферментом Кленова і ВатHI" плазміди pBSII-Tnos. Легують зі 100нг вектора і 50нг описаних вище фрагментів ДНК у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції Одержану плазміду позначають як pBSII-pGEA1D. Потім, касету експресії "pGEA1D-tNOS", яка містить фрагмент Xbal-HindllІ, оброблений ферментом Кленова, клонують в сайті Smal pSCV1.2, дефосфорильованому ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника Легують з 20нг дефосфорильованого вектора pSCV1.2 і 200нг фрагментів, що несуть касету експресії "pGEA1D-tNOS", у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОС91. г) Конструкція бінарної плазміди рВIOС92, що містить промотор pGEA6D. Для експресії у насінні рапсу тваринного гена, що кодує шлункову ліпазу собаки, необхідні наступні регулюючі послідовності: 1. Промотор pGEA6, що відповідає некодуючій ділянці 5' гену запасного протеїну насіння, GEA6 Arabidopsis thaliana [Gaubier та ін., 1993p.] і забезпечує специфічну експресію в насінні; 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA 35S, що відповідає некодуючій ділянці 3' послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт S35 [Franck та ін., 1980p.]. Для одержання подібної рВІОС21 бінарної плазміди рВІОС92, в якій, однак, промотор pd35S замінений на промотор pGEA6D, фрагмент EcoRI-ВатHI, оброблений ферментом Кленова, що містить промотор pGEA6, виділяють з плазміди pGUS2-pGEA6. Клон pGUS-2-pGEA6, що походить від pUC18, містить у рамці зчитування 2 ATG: ATG гену GEA6 (Еm6) і ATG ген у gus. ATG ген у GEA6 р уйнують. Фрагмент ДНК, що знаходиться між сайтом АссІ і послідовностями вище ATG ген у GEA6 клону pGUS-2-pGEA6, ампліфікують за допомогою ПЦР за допомогою двох олігонуклеотидів: 5' AAGTACGGCC ACTACCACG 3' і 5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3'. Температуру гібридизації підбирають. Амплифікований за допомогою ПЦР фрагмент перетравлюють за допомогою АссІ і ВатНІ, очи щують шляхом електрофорезу на 2-% гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом, висушують, потім легують з плазмідною ДНК, що входить до складу pGUS-2-GEA6, подвійно перетравленої за допомогою АссІ і ВатНІ, очищують шляхом електрофорезу на 0,8-% гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом і висушують. Легують зі 100нг описаного вище вектора і 50нг описаних вище перетравлених ферментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Одержаний клон позначають як pGUS-2-pGEA6D. Фрагмент EcoRI-ВатНІ, що містить промотор pGEA6D, виділений з pGUS-2-pGEA6D і оброблений ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника (Biolabs), очищують шляхом електрофорезу на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, висушують і легують з сайтом Xhol, обробленим ферментом Кленова, плазмідною ДНК модифікованої рВІОС21. Модифіковану плазміду рВІОС21 одержують подвійним перетравленням за допомогою HindllІ, обробленого ферментом Кленова і КрnІ рВІОС21 для видалення фрагмента, що несе промотор pd35S, з заміною його фрагментом Kpnl-EcoRV, що несе полілінкер, утворений сайтами Kpnl-Xhol-Sall-Clal-Hindlll-BamHI-Smal-EcoRI-EcoRV, що відносяться до pBSIISK+. Легують з 20нг модифікованої дефосфорильованої рВІОС21 і 200нг описаних вище фрагментів ДНК EcoRI-BamHI у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham), при 14°С протягом 16 годин. Попередньо підготовлені бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надають компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p. і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОС92. д) Конструкція бінарних плазмід рВIOС93, рВIOС94, рВIOО5, рВІОС96 і рВІОС97, що містять PSLGLLGC. Плазміда рВIOС40 описана вище. Ця плазміда містить фрагмент Bglll-Xbal, що несе послідовність PSLGL-LGC. Цей фрагмент виділяють подвійним ферментативним перетравленням за допомогою BgIII та Xbal, очищують шля хом електрофорезу на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють, осаджують спиртом, висушують, обробляють ферментом Кленова і легують з рВIOС28 (описана вище), перетравленою за допомогою EcoRI, обробленою ферментом Кленова і дефосфорильованою; з рВIOС90, перетравленою за допомогою EcoRI, обробленою ферментом Кленова і дефосфорильованою; з рВІОС91, перетравленою за допомогою Smal і дефосфорильованою; з рВІОС92, перетравленою за допомогою HindllІ, обробленою ферментом Кленова і дефосфорильованою, з метою одержання, відповідно рВІОC93, рВІОС94, рВIOС95 і рВIOС96. Плазміду рВIOС97 одержують в результаті клонування фрагмента Kpnl-EcoRV, що несе касету експресії "pGEA6D-PSLGL-LGC-tSSS", обробляють ферментом Т4 ДНК полімераза, очищують шляхом електрофорезу на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють, осаджують спиртом, висушують і легують з pSCV1.2, перетравленою за допомогою Smal і дефосфорильованою. Касету експресії "pGEA6D-PSLGLLGC-t35S" одержують з рВІОС92. IIІ. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбшантний протеїн шлункової ліпази людини і забезпечують конститутивну експресію, наприклад, у листі та насінні тютюну а) Конструкція бінарної плазміди рВIOС82, що містить химерний промотор СУПЕРПРОМОТОР pSP. Для експресії гену, що кодує шлункову ліпазу людини (LGH), у тютюновому листі необхідні наступні регулюючі послідовності: 1. Химерний промотор (надпромотор; pSP; заявка PST/US94/12946). Його утворює потрійний повтор транскрипційного активуючого елементу промотору гену октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens, транскрипційного активуючого елементу промотору гену маннопінсинтази та промотору маннопінсинтази бактерії Agrobacterium tumefaciens; 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA 35S, що відповідає некодуючій ділянці 3' послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт S35 [Franck та ін., 1980p.]. Для одержання подібної рВIOС21 бінарної плазміди рВIOС92, у випадку якої, однак, промотор pd35S замінений на промотор pSP, фрагмент pvull-Sall підданий впливу ферменту Кленова, що містить промотор pSP, виділяють з плазміди pBISN1, [заявка PST/US94/12946], очищують шляхом електрофорезу на 1%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом, висушують і легують з плазмідною ДНК рВІОС81, підданою подвійному перетравленню за допомогою КрnІ та ЕсоRI, впливу Т4 ДНК полімерази і дефосфорильованою ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Плазміда рВІОС81 відповідає рВІОС21, сайт якої ХbаІ видалений. Для досягнення цього плазміду рВIOС21 перетравлюють за допомогою ХbаІ, потім піддають впливу ферменту Кленова і легують з Т4 ДНК лігазою. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що несуть pSP, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham), при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВIOС82. Шлункову ліпазу людини (LGH) легко синтезують у вигляді попередника, описаного в публікації Bodmer та ін., 1987р. Зрілий протеїн шлункової ліпази людини складається з 379 амінокислот. Його сигнальний пептид (PSLGH) містить 19 амінокислот Сайтом розщеплення між PSLGH і LGH є Gly-Leu. Послідовність, що кодує попередника шлункової ліпази людини, використовують для конструкції бінарних плазмід рВIOС85, що містить PSLGH-LGH, рВIOС87, що містить PSLPH-LGH і рВIOС89, що містить PSLGL-LGH, де послідовність, що кодує шлункову ліпазу людини, передує послідовностям, що кодують, відповідно, його природний сигнальний пептид PSLGH, сигнальний пептид панкреатичної ліпази людини [PSLPH, Giller та ін, 1992р.] і сигнальний пептид шлункової ліпази кроля [PSLGL, вище вже описано, європейський патент №92.403055.4]. Послідовність, що кодує попередника шлункової ліпази людини, виділяють подвійним перетравленням за допомогою PstI і Dral, очищують шля хом електрофорезу на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рH=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом і сушать. Потім її клонують у сайтах PstI і SpeI (піддають впливу ферменту Т4 ДНК полімераза (Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника) плазміди pBSIISK+, що випускається у продаж фірмою Stratagene. Легують зі 100нг вектора і 50нг описаних вище фрагментів ДНК, що несе послідовність, кодуючу попередника шлункової ліпази людини, в 10мкл реакційного середовища у присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983р.]. Плазмідну ДНКодержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції Одержану плазміду позначають як рВІОС83. Послідовність, що кодує зрілу ліпазу людини, модифікують введенням сайту BamHI, до цього відсутнього, у дев'ятий і десятий кодони шляхом спрямованого за допомогою ПЦР мутагенезу, використовуючи 2 олігодезоксинуклеотиду: 5' aaactgcaggctcgag TTG ТТТ GGA ААА ТТА C AT ССТ GGA ТСС ССТ GAA GTG ACT ATG 3' (що містить єдині сайти PstI, Xhol і BamНІ) і 5' ААТ GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG С 3' (що містить один сайт MscI у плаз міді рВІОС83). ПЦР-ампліфікацію фрагменту Pstl-Mscl здійснюють у 100мкл реакційного середовища, що містить 10мкл буферного розчину Taq ДНК полімерази х 10 (500мМ Трис-НСІ, рН=9,0, і 1% Тритона х 100), 6мкл 25мМ MgCI2, 3мкл 10мМ dNTR (dATR, dCTP, dGTP, dTTP), 100нм кожного з двох описаних вище олігодезоксинуклеотидів, 5нг матричної ДНК (вектор рВІОС83), 2,5од. Taq ДНК полімерази (Promega) і 2 краплі вазелінового масла. ДНК денатурують при 94°С протягом 5хв., піддають 30 циклам, кожний з яких містить: 1 хвилина денатурації при 94°С; 1 хвилина гібридизації при 65°С і 1 хвилина елонгації при 72°С, потім елонгацію при 72°С проводять протягом 5 хвилин. Цю полімеразно-ланцюгову реакцію здійснюють в апараті "DNA Thermal Cycler" фірми PERKIN ELMER CETUS. Масло видаляють екстракцією за допомогою хлороформу. Потім, фрагменти ДНК осаджують з реакційного середовища у присутності 1/10 об'єму 3 М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом, сушать і перетравлюють за допомогою двох фрагментів рестрикції PstI і Mscl. Перетравлені фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шляхом електрофорезу на 2%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом, сушать і легують з плазмідною ДНК плазміди рВІОС83, підданої подвійному перетравленню за допомогою PstI і Mscl, очищенню шляхом електрофорезу на 0,8%-му гелі агарози, електроелюацІЇ, осадженню спиртом та висушуванню. Легують зі 100нг вектора і 50нг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, в 10мкл реакційного середовища в присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надають компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і DoІу, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Введення сайту рестрикції ВатНІ не змінює зміни генетичного коду шлункової ліпази людини. Насправді, природна послідовність шлункової ліпази людини GGA AGC (Gl ySer) перетворюється на GGA ТСС (Gly-Ser). Одержану плазміду позначають як рВІОС84. б) Конструкція бінарної плазміди рВІОС85, що містить PSLGH-LGH Фрагмент Pstl-Xbal, що несе послідовність PSLGH-LGH, виділяють шляхом подвійного ферментативного перетравлення за допомогою Pstl-Xbal з рВІОС83, очищують електрофорезом на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом і сушать. Потім зазначений фрагмент ДНК обробляють ферментом Т4 ДНК полімераза (Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК плазміди рВІОС82, перетравленої у сайті ХbаІ, обробленої ферментом Кленова (Biolabs) і дефосфорильованої за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять PSLGH-LGH, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколю 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надають компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВIOС52. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн PSLGH-LGH, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Послідовністю розщеплення між послідовностями PSLGH і зрілою LGH є Gly-Leu. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОС85 вводять прямою трансформацією в штам LBA4404 бактерії Agrobacterium tumefaciens за методом Holsters та ін. (1978p.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням введеної плазмідної ДНК. в) Конструкція бінарної плазміди рВIOС86, що містить PSLGH-LGH. Плазміду рВІОС84 піддають подвійному перетравленню за допомогою PstI і ВатНІ з метою видалення послідовності, що кодує сигнальний пептид PSLGH і 8 перших амінокислот зрілого протеїну LGH (Leu-PheGly-L ys-Leu-His-Pro-Gly) Цю послідовність заміняють такою, що кодує сигнальний пептид PSLGH з 16 амінокислот (ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT ТС А CTG CTG CTG GGA GC A GTA GC A GGA) і здійснюють злиття з послідовністю, що кодує 8 перших кодонів зрілого протеїну LGH ("PSLPH-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини"). Послідовність "PSLPH-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини" ампліфікують за допомогою ПЦР, виходячи з матриці 5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GC A GTA GC A GGA TTG TTT GGA AAA TTA C AT CCT GGA tcc CCT G 3' за допомогою двох олігодезоксинуклеотидів: 5' aaactgcaggctcgagaacaATG С 3' і 5' С AGG gga ТСС AGG ATG TAA TTT ТСС 3', слідуючи протоколу ампліфікації за допомогою ПЦР, як описано вище (див. вище розділ І). Температуру гібридизації підбирають. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою PstI і ВатHI, фрагменти ДНК, одержані шляхом ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шляхом електрофорезу на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом, сушать і легують з плазмідною ДНК плазміди рВIOС84, подвійно перетравленої за допомогою PstI і ВатHI, очи щеної електрофорезом на 0,8%-му гелі агарози, підданої електроелюації [Sambrook та ін., 1989p.], осадженої спиртом та висушеної. Легують зі 100нг вектора і 50нг описаних вище, перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, в 10мкл реакційного середовища в присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яких попередньо роблять компетентними, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977р.]. Послідовності PSLGL і зрілої шлункової ліпази людини клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування (тобто, таким чином, що вони утворюють одну відкриту рамку зчитування). Послідовністю розщеплення між послідовностями PSLGL і зрілою LGH є Gly-Leu Одержану в результаті плазміду позначають як рВIOС86. З плазміди рВІОС86 виділяють фрагмент Pstl-Xbal, що несе послідовність PSLPH-LGH, подвійним ферментативним перетравленням за допомогою PstI і ХbаІ, очищують електрофорезом на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін, 1989p.], осаджують спиртом і висушують. Потім цей фрагмент ДНК обробляють ферментом Т4 ДНК полімераза (Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК плазміди рВIOС82, перетравленої у сайті ХbаІ, обробленої ферментом Кленова (Biolabs) і дефосфорильованої ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять PSLGH-LGH, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яких попередньо роблять компетентними, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС87. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн PSLPH-LGH, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що вип ускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін, 1977р.]. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВIOС87 вводять прямою трансформацією в штам LBA4404 бактерії Agrobacterium tumefaeiens за методом Holsters та ін (1978p.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням введеної плазмідної ДНК. г) Конструкція бінарної плазміди рВІОС89, що містить PSLGL-LGH Плазміду рВІОС84 піддають подвійному перетравленню за допомогою PstI і Ваml з метою видалення послідовності, що кодує сигнальний пептид PSLGH і 8 перших амінокислот зрілого протеїну шлункової ліпази людини (Leu-Phe-GlyLys-Leu-His-Pro-Gly). Цю послідовність заміняють послідовністю, що кодує сигнальний пептид PSLGL, що складається з 19 амінокислот (ATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG GC A GCT TTG СТА ТСТ GC A СТТ GGA ACT АС А CAT GGT), і піддають злиттю з послідовністю, що кодує 8 перших кодонів протеїну зрілої шлункової ліпази людини ("PSLGL-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини"). Послідовність "PSLGL-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини" ампліфікують шляхом ПЦР, ви ходячи з матриці 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG GCA GCT TTG СТА ТСТ GC A СТТ GGA ACT АС А CAT GGT TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' за допомогою двох олігодезоксинуклеотидів: 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3' і 5' С AGG gga ТСС AGG ATG TAA TTT ТСС 3', слідуючи протоколу ампліфікації за допомогою ПЦР, як описано вище (див. вище, розділ І). Підбирають температуру гібридизації. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою PstI І ВатHI, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують електрофорезом на 2%-ому гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують у присутності 1/10 об'єму 3М розчину ацетату натрію з рН=4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -80°С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 12000g протягом 30 хвилин, промивають 70%-м етанолом, сушать і легують з плазмідною ДНК плазміди рВIOС84, подвійно перетравленої за допомогою PstI і ВатHI, очищеної електрофорезом на 0,8%-му гелі агарози, підданої електроелюації [Sambrook та ін., 1989p.], осадженої спиртом і висушеної. Легують зі 100нг вектора і 50нг описаних вище, перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 10мкл реакційного середовища в присутності 1мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham), при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5 a, яких попередньо роблять компетентними, трансформують [Hanahan, 1983p.] Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Послідовності PSLGL і зрілої шлункової ліпази людини клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування (тобто таким чином, що вони утворюють одну відкриту рамку зчитування). Послідовністю розщеплення між послідовностями PSLGL і зрілою LGH є GlyLeu. Одержану в результаті плазміду позначають як рВIOС88. З плазміди рВIOС88 виділяють фрагмент Pstl-Xbal, що несе послідовність PSLGL-LGH, подвійним ферментативним перетравленням за допомогою PstI і ХbаІ, очищують електрофорезом на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють [Sambrook та ін., 1989p.], осаджують спиртом і висушують. Потім цей фрагмент ДНК обробляють ферментом Т4 ДНК полімераза (Biolabs) відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК плазміди рВIOС82, перетравленої у сайті ХbаІ, обробленої ферментом Кленова (Biolabs) і дефосфорильованої ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять PSLGL-LGH, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яких попередньо роблять компетентними, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують ферментативним перетравленням за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВIOС89. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн PSLGL-LGH, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7Ô , що випускається у продаж фірмою Pharmacia, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів [Sanger та ін., 1977p.]. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОС89 вводять прямою трансформацією в штам LBA4404 бактерії Agrobacterium tumefaciens за методом Holsters та ін. (1978p.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням введеної плазмідної ДНК. IV. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантний протеїн шлункової ліпази собаки i забезпечують експресію в насінні кукурудзи а) Конструкція плазмід рВІОС98 і рВIOС99, що містять PSLGL-LGC і забезпечують структурну експресію в насінні кукурудзи. Для конститутивної експресії в насінні кукурудзи тваринного гена, що кодує шлункову ліпазу собаки (LGC), потрібні наступні регулюючі послідовності: 1. один з двох промоторів, що забезпечують конститутивну експресію: - актиновий промотор рису, наступний за актиновим інтроном (pAR-IAR), що міститься в плазміді pAct1F4, описаній МсЕlrоу та ін. (1991p.); - подвійний конститутивний промотор 35S (pd35S) вірусу Ca MV (вір ус мозаїки цвітної капусти). Він відповідає подвоєнню послідовностей, активуючи х транскрипцію і розташованих вище елементу ТАТА природного промотору 35S (Кау та ін., 1987p.]. 2. один з двох термінаторів: - кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA 35S, що відповідає некодуючій ділянці 3' послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскриптор 35S [Franck та ін., 1980p.]; - кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA NOS, що відповідає некодуючій ділянці 3' гену нопалінсинтази плазміди Ті бактерії Agrobacterium tumefaciens штаму з нопаліном [Depicker та ін., 1982p.]. Плазміду рВІОС98, в якій послідовність, що кодує PSLGL-LGC, знаходиться під контролем pAR-IAR, одержують клонуванням фрагменту BglІІ-Xbal, що несе послідовність, яка кодує PSLGL-LGC в сайтах "Ncol і SaІl" pBSD-pAR-IAR-tNOS. З плазміди рВІОС40 (описана вище) виділяють фрагмент BglІІ-Xbal, що несе кодуючу PSLGL-LGC послідовність, подвійним ферментативним перетравленням під дією Bglll і Xbal, очищують електрофорезом на 0,8%-му гелі агарози, електроелююють, осаджують спиртом, сушать і потім обробляють ферментом Кленова Плазміду pBSII-pAR-l AR-tNOS піддають подвійному перетравленню під дією SaІl і Ncol, очищують ферментом Mung Bean Nuclease (Biolabs) і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Boehringer Mannheim) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище, фрагментів ДНК, що містять кодуючу PSLGL-LGC послідовність, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4-ДНКлігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од ферменту Т4-ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС98. Плазміду pBSH-pAR-IAR-tNOS одержують клонуванням в сайтах "Есо01091, оброблений ферментом Кленова і Kpnl", pBSU-tNOS фрагменту SnaBI-Kpnl, що несе послідовність, що відповідає "pAR-IAR-початку послідовності, що кодує ген gus", виділену з плазміди pActl-F4. Легування здійснюють зі 100нг вектора і 50нг перетравлених фрагментів ДНК, описаних вище, в 10мкл реакційного середовища в присутності 1мкл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Amersham), і 2,5од. ферменту Т4 ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення під дією ферментів рестрикції. Плазміду pBSІІ-tNOS одержують клонуванням у де фосфорильованому сайті EcoRV pBSnSK+, що випускається у продаж фірмою Stratagene, фрагменту SacI-EcoRI, що несе послідовність tNOS, виділеного з рВІ121, що випускається у продаж фірмою Clontech, в результаті подвійного ферментативного перетравлення під дією Sad і EcoRV, очищують електрофорезом на 2%-му гелі агарози і обробляють ферментом Т4-ДНК-полімераза. Легування здійснюють з 20нг дефосфорильованого вектора і 200нг фрагментів ДНК, що містить послідовність tNOS, описаних вище, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4-ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983р.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979р.] і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції. Плазміду рВІОС99, в якій кодуюча PSLGL-LGC послідовність знаходиться під контролем pd35S, одержують шляхом клонування, в сайтах "КnрІ і ВатHI" плазміди pBSII-t35S, фрагмента КnрІ і ВатHI, що несе послідовність, яка відповідає "pd35S-PSLGL-LGC", виділеному з описаної вище плазміди рВІОС41. Легування здійснюють зі 100нг вектора і 50нг перетравлених фрагментів ДНК, описаних вище, в 10мкл реакційного середовища в присутності 1мл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Amersham), і 2,5од. ферменту Т4 ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Bimboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення під дією ферментів рестрикції. Плазміду pBSH-t35S одержують клонуванням у дефосфорильованому обробленому ферментом Кленова сайті Spei плазміди pBSIISK+, що випускається у продаж фірмою Stratagene, фрагменту SmalEcoRV, що несе послідовність t35S, виділеного з рЛТ163 (описаний вище) в результаті подвійного ферментативного перетравлення під дією Smal і EcoRV, очищеного електрофорезом на 2%-му гелі агарози. Легування здійснюють з 20нг дефосфорильованого вектора і 200нг фрагментів ДНК, що містить послідовність t35S, описаних вище, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Amersham), 2мкл 50%-го розчину поліетиленгліколя 8000 і 5од. ферменту Т4-ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Hanahan, 1983р.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції. б) Конструкція плазмід рВІОС100 і рВІОС101, що містять, відповідно, PSLGL-LGC і PSLGL-LGC-KDEL і забезпечують експресію в ендоспермі насіння кукурудзи. Для експресії в ендоспермі зерен кукурудзи тваринного гена, що кодує шлункову ліпазу собаки (LGC), потрібні наступні регулюючі послідовності: 1. Промотор гену g-зеїна кукурудзи (рg-зеїн), що міститься у плазміді рg63, описаній Reina та ін., 1990р. Плазміду рg63 одержують клонуванням ру-зеїна в сайтах HindllІ та Xbal плазміди pUC18, що містить, між сайтами Hindlll та Xbal, касету експресії "p35S-gus-tNOS" рВІ221, що випускається у продаж фірмою Clontech. Він забезпечує експресію в ендоспермі кукурудзяних зерен. 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор polyA NOS, що відповідає некодуючій ділянці 3' гену нопалінсинтази плазміди Ті бактерії Agrobacterium tumefaciens штаму, що містить нопалін [Depicker та ін., 1982p.]. Плазміду рВІОС100, в якій кодуюча PSLGL-LGC послідовність знаходиться під контролем рg-зеїна, одержують шляхом клонування, в сайтах "Sad, оброблений ферментом Т4-ДНК-полімераза і ВатНІ" плазміди рg63, фрагмента "Xbal, оброблений ферментом Кленова і BgllІ", виділеного з рВІОС40 (описана вище). Легування здійснюють зі 100нг вектора і 50нг перетравлених фрагментів ДНК, описаних вище, в 10мкл реакційного середовища у присутності 1мл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Amersham) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК-лігаза (Amersham) при 14°С протягом 16 годин. Бактерії, Escherichia coli DH5a, яким попередньо надана компетентність, трансформують [Наnаhаn, 1983p.]. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 50мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису [Birnboim і Doly, 1979p.] і аналізують шляхом ферментативного перетравлення під дією ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС100. Плазміду рВІОС101 одержують шляхом заміни фрагмента Ncol-АfIII плазміди рВІОС100 фрагментом Ncol-Aflll, що несе послідовність, кодуючу те трапептид KDEL (що забезпечує адресацію в ендоплазматичну сітку), що знаходиться перед стоп-кодоном, одержаним шляхом ПЦР-ампліфікаціі згідно описаним вище способам. Двома олігодезоксинуклеотидами, що використовуються в цій реакції, є 5' ААТ САС TTG GAC ТТТ АТС TGG Gcc atg Gat gcc 3' (один сайт Ncol) і 5' ААТ ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT C AT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (послідовність, що кодує KDEL і один сайт AfIll). Температура гібридизації складає 70°С. Клонування проводиться як описано вище. V. Приклад одержання трансгенних рапсових рослин Насіння ярового рапсу (Brassica napus cv WESTAR або ліній Limagrain) дезінфікують протягом 10 хвилин в 15%-ому розчині Domestos. Після 4-ри кратного промивання стерильною водою, насіння пророщують, з розрахунку по 20 насінин на горщик діаметром 7см і висотою 10см, у мінеральному середовищі Murashige і Skoog (Sigma M 5519) з вмістом 30г/л сахарози, затверділої гелем агара в кількості 5г/л. Ці горщики приміщують в камеру для культивування з температурою 26°С і з чергуванням освітленості і темряви 16г/8г і при освітленості приблизно 80мкЕ.м-2с-1. По закінченні 5 діб проростання стерильно відбирають сім'ядолі, зрізуючи кожний черешок приблизно на 1мм вище сім'ядольного вузла. Паралельно, в колбі Ерленмейєра ємністю 50мл протягом 36г при 28°С в 10мл бактеріального середовища 2YT [Sambrook та ін., 1989p.], що доповнена антибіотиками, придатними для селекції використовуваного штаму, одержують передкультуру бактерії Agrobacterium tumefaciens штаму LBA4404, що містить плазміду рВIOС29 (або рВІОС25), а саме плазміду pGAZE, в яку вбудована послідовність, що кодує шлункову ліпазу собаки, злита з послідовністю, що кодує сигнал адресації PPS (або PS) під контролем промотору pCRu (або pd35S). Таку передкультуру використовують для обсіменіння 1% нової бактеріальної культури, що одержується в аналогічних умовах. По закінченні 14 годин, культур у центрифугують протягом 15 хвилин при прискоренні 3000g і бактерії обробляють еквівалентним об'ємом рідкого середовища пророщування. Цю суспензію розподіляють по чашках Петрі діаметром 5см з розрахунку по 5мл на чашку. Відрізаний кінець черешка занурюють на декілька секунд в розчин таким чином одержаних агробактерій, потім черешок занурюють на глибину в декілька міліметрів в регенераційне середовище. Це середовище має такий же основний склад, що й середовище пророщування, однак, додатково містить 4мг/л бензиламінопурина (ВАР), який є фітогормоном, що сприяє новоутворенню бруньок. Культивують по десять експлантатів (сім'ядоля з черешком) на чашку Петрі діаметром 9см (Грейнер, номер за каталогом 664 102). Після сумісного культивування протягом двох днів в тих же умовах, що і умови для пророщування, експлантати пересаджують на фітопланшети (Сігма, номер за каталогом Р 1552), що містять таке ж, як і попереднє, середовище, доповнене селективним агентом: 45мг/л сульфату канаміцину (Сігма, номер за каталогом К 4000) і бактеріостатичним агентом: суміш з 1/6 (по масі) калієвої солі клавулінової кислоти і 5/6 натрієвої солі амоксициліну (аугментин для ін'єкцій), з розрахунку 600мг/л. Далі, два рази, з інтервалом в 3 тижні, проводять пікіровку експлантатів, стерильно, на нове середовище в ти х же умовах. Зелені бруньки, що з'явилися в кінці другої і третьої пікіровки, відділяють від експлантата та індивідуально культивують в прозорих горщиках діаметром 5см і висотою 10см, що містять середовище, аналогічне попередньому, але не містить ВАР. По закінченні трьох тижнів культивування, стебло трансформованої бруньки відрізають, а бруньку приміщують в горщик зі свіжим середовищем. Через тричотири тижні коріння розвивається в достатній мірі, що дозволяє акліматизувати росток у фітотроні. Бруньки, які не позеленіли або не вкоренились, видаляють. Ці ростки тоді пересаджують в чашки зі стороною розміром 7см, заповнені насиченим водою гумусом (норма NF U44551: 40% коричневого торфу, 30% просіяного верескового перегною і 30% піску). Після двох тижнів акліматизації у фітотроні (температура: 21°С, чергування освітленості і темряви: 16г/8г, відносна вологість: 84%) ростки пересаджують в горщики діаметром 12см, наповнені тим же гумусом, збагаченим добривом уповільненої дії (Osmocote, з розрахунку 4г/л перегною), потім переносять в оранжерею (класу S2) з температурою 18°С і з двократним зрошуванням водою щоденно протягом 2 хвилин. Після появлення квітів, їх забезпечують мішечками (Crispac, стандарт SM 570у 300мм*700мм) з метою попередження перехресного запилення. Після дозрівання стручків, їх збирають, висушують і луща ть. Одержане насіння використовують для кількісного визначення біохімічної активності. Селекцію трансгенного потомства проводять шляхом пророщування на середовищі, що містить сульфат канаміцину з розрахунку 100-150мг/л (залежно від генотипів). Умови пророщування аналогічні вищеописаним умовам, за виключенням того, що пророщення відбувається у пробірках, в кожній з яких знаходиться тільки одна насінина. I тільки ростки, що розвили вторинне коріння, перші три тижні акліматизують у фітотроні перед переносом до оранжереї. VI. Приклад одержання трансгенних пасльонових а) Одержання трансгенних рослин тютюну. Тютюнові рослини, що використовуються у експериментах з трансформації (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC і PBD6) культивують ін вітро в основному живильному середовищі [Murashige і Skoog (1962р )] з добавками вітамінів [Gamborg та ін. (1968p.); Сігма, номер за каталогом МО404], сахарози у кількості 20г/л і агара (Мерк) у кількості 8г/л. Значення pH середовища доводять до 5,8 за допомогою розчину гідроксиду калію перед автоклавуванням при температурі 120°С протягом 20 хвилин. Пікіровку тютюнових рослин здійснюють за рахунок черешку міжвузля кожні 30 діб на цьому середовищі для розмноження MS20. Всі культивування ін вітро здійснюють у кліматичній камері при наступному режимі: - освітленість: 30мкЕ.м -2.с-1, тривалість освітлення: 16 годин; - температурний режим: 26°С удень та 24°С уночі. Використовуваний спосіб трансформації оснований на способі Horsch та ін. (1985p.). Передкультивування бактерії Agrobacterium tumefaciens штаму LBA4404, що містить плазміди рВІОС29 або рВIOС26, або рВIOС25, здійснюють протягом 48 годин при 28°С при перемішуванні у середовищі LB [Sambrook та ін., 1989р.] з добавками адекватних антибіотиків (рифампіцин і тетрациклін). Передкультуру потім розріджують у 50 разів у тому ж середовищі та культивують у тих же умовах. По закінченні ночі, культур у центрифугують (10хв., 3000g), бактерії оброблюють еквівалентним об'ємом рідкого середовища MS30 (30г/л са харози) і цю суспензію розріджують у 10 разів. Експлантати розміром близько 1см 2 вирізають з листя описаних вище ростків. Потім їх вводять у контакт з бактеріальною суспензією протягом 1 години, після цього швидко висушують на фільтрованому папері та приміщують на середовище для спільного культивування (MS30, тверда). Через два дні експлантати переносять у чашки Петрі на середовище для регенерації MS30, що містить селективний агент, канаміцин (200мг/л), бактеріостатичний агент, аугментин (400мг/л) та гормони, необхідні для індукції бруньок (ВАР, 1мг/л і ANA, 0,1мг/л). Пересадку експлантатів проводять на теж середовище після 2-х тижнів культивування. Після 2-х додаткових тижнів бруньки пересаджують у чашки Петрі на середовище для розвитку, що складається з середовища MS20 з додаванням у нього канаміцину і аугментину Через 15 днів пересаджують половину бруньок. Укорінення продовжується близько 20 днів, після чого ростки можна клонувати черешком міжвузля або висаджувати в оранжерею. б) Одержання трансгенних рослин томату. Насіння томату cv.UC82B стерилізують за допомогою 10%-го Domestos протягом 15 хвилин та тричі промивають стерильною водою. Останню промивку проводять протягом 10 хвилин при струшуванні. Стерилізоване таким чином насіння пророщують на середовищі MSSV/2 (основне живильне середовище Murashige і Skoog, 1962p., Сігма, номер за каталогом М6899)/2 з добавкою вітамінів Nitsch [Thomas і Pratt, 1981p.], сахарози у кількості 30г/л, агара (Merck) у кількості 8г/л, рН=5,9, протягом 7 або 8 діб у кліматичній камері (освітленість: 30мкЕ.м-2.с-1, тривалість освітлення і темряви: 16год/8год, 26°С). Використовуваний спосіб трансформації оснований на способі Fillatti та ін. (1987p.). Передкультивування бактерії Agrobacterium tumefaciens, штам LBA4404, що містить плазміди рВІОС25 або рВIOС26, здійснюють протягом 24 годин при 28°С при струшуванні у середовищі LB, доповненому адекватними антибіотиками (рифампіцин і тетрациклін). Перед-культуру потім розріджують у 50 разів у тому ж середовищі та культивують у тих же умовах протягом ночі. Вимірюють оптичну щільність при 600нм, центрифугують агробактеріі (10хв., 3000g) і оброблюють їх у рідкому середовищі KCMS [описане в публікації Fillatti та ін., 1987p.], з таким розрахунком, щоб одержати оптичну щільність при 600нм=0,8). У деякі стадії способу згідно протоколу Fillatti та ін. (1987р.) внесені технічні удосконалення. Передкультивування експлантатів та спільне культивування здійснюють способом, описаним Fillatti та ін. (1987р.), за виключенням того, що середовище KC MS доповнюють ацетосирингоном (200мМ). Промивальне середовище 2Z відрізняється добавкою у нього 500мг/л цефотаксима замість карбеніциліна. Застосовне середовище вирощування складається з основного живильного середовища Murashige і Skoog (Сігма, MS6899) з добавкою вітамінів Nitsch, 20г/л сахарози, 50мг/л канаміцину, 200мг/л аугментина, 1мг/л ANA (антинуклеарне антитіло) та 0,5мг/л зеатина. VII. Одержання трансгенних рослин кукурудзи а) Одержання та застосування калюсу кукур удзи як мішені для генетичної трансформації. Для генетичної трансформації кукурудзи, яким би не був при цьому застосовний метод (електропорація, агробактерії, мікроволокна, пушка для обстрілу частками), як правило, потрібно використання недиференційованих клітин зі швидким діленням, що зберігають здатність до регенерації цілих рослин. Такий тип клітин утворює ембріогенний калюс кукурудзи, що легко кришиться (так званий тип II). Такі калюси одержують з незрілих зародків генотипу Н1 II або (AI88 х В73) методом та на середовищах, які описані Armstrong [довідник Malze; (1994p.) вид. M.Freeling, V.Walbot; cтop.665-671]. Одержані таким чином калюси розмножують та зберігають шляхом послідовних пересадок через кожні 15 днів на початковому середовищі. Потім регенерують ростки з вказаних калюсів, змінюючи гормональну та осмотичну рівновагу клітин методом, описаним Vain та ін. [Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989, 18:143-151)]. Ці рослини потім акліматизують у оранжереї, де вони можуть схрещуватися або самозапилюватися. б) Застосування пушки для бомбардування частками з метою генетичної трансформації кукурудзи У попередньому розділі було описано одержання та регенерація ліній клітин, необхідних для трансформації; тут описується метод генетичної трансформації, що забезпечує стійке вбудовування видозмінених генів у геном рослини. Даний метод базується на використанні пушки для бомбардування частками, ідентичної з пушкою, описаною J.Finer [Plant Cell Report (1992) 11, 323-328]; клітинами-мішенями виступають фрагменти калюсів, описані у розділі 1. Ці фрагменти з площею поверхні від 10 до 20мм 2 за 4 години до їх бомбардування приміщують, у кількості 16 фрагментів на чашку, у центр чашки Петрі, в якій містилося культуральне середовище, ідентичне вихідному середовищу, з добавкою 0,2М маніту + 0,2М сорбіту. Плазміди, що несуть вводимі гени, очищують на колонні QiagenÒ з додержанням вказівок виробника. Потім їх осаджують на вольфрамових частках (M10), слідуючи методиці, описаній Klein [Nature, (1987) 327: 70-73]. З таким покриттям частини за допомогою пушки та згідно методиці, описаній J.Finer [Plant Cell Report (1992) 11: 323-328]; вистрілюють у клітини-мішені. Піддані таким чином бомбардуванню чашки з калюсами потім запечатують за допомогою ScellofraisÒ, після чого культивують у темряві при 27°С. Першу пересадку проводять через 24 години, потім через кожні два тижні протягом 3-х місяців на середовище, ідентичне вихідному, з додаванням селективного агенту, природа та концентрація якого можуть змінюватись залежно від використовуваного гену (див. розділ 3). Використовуваними селективними агентами є, як правило, активні сполуки деяких гербіцидів (BastaÒ, Round upÒ) або деякі антибіотики (гігроміцин, канаміцин...). Через 3 місяці, а іноді і пізніше, одержують калюси, ріст яких не гальмується агентом селекції, звичайно і частіше за все утворені клітинами, що походять від ділення клітини, у генотип якої інтегровано одна або декілька копій гена селекції. Частота одержання таких калюсів складає приблизно 0,8 калюсу на піддану бомбардуванню чашку. Ці калюси ідентифікують, індивідуалізують, ампліфікують, потім культивують з таким розрахунком, щоб регенерувати ростки (див. розділ "а"). Для уникання любої інтерференції з нетрансформованими клітинами всі зазначені операції проводяться на культуральних середовищах, що містять селективний агент. Регенеровані таким чином рослини акліматизують та культивують потім в оранжереї, де вони можуть схрещуватися або самозапилюватися. VIII. Аналіз експресії шлункової ліпази собаки у трансгенних тютюнових рослинах А) Протокол. Протоколом екстрагування ліпази з тютюнового листя, взятого від оранжерейних рослин, є наступний: 1г листя (сира маса) гомогенізують у рідкому азоті, потім при 4°С у 5мл буфера Трис-НСl, 25мМ, рН=7,5, з додаванням 1мМ ЕДТУ і 10мМ меркаптоетанолу (буфер А) або буфера гліцин-НСІ, 25мМ, рН=3, з додаванням 1Мм ЕДТУ, 10мМ b-меркаптоетанола, 0,2% Тритона Х-100 та 250мМ NaCl (буфер Б). Всю кількість гомогенату піддають негайному центрифугуванню при 4°С протягом 15 хвилин при прискоренні 10000g. Для насіння тютюну екстрагування проводять у буфері Б з розрахунку 0,1г насіння на 4мл буфера. Ліпазну активність визначають за допомогою pH-STAT тітрометичним методом Gargouri та ін. (1986р.), при якому використовуваним субстратом є трибутирин. Емульсію трибутирину (4мл на 30мл емульсії) одержують у приладі для струшування і перемішування у присутності жовчних солей (1,04г/л), бичачого альбуміну (0,1г/л) і NaCl (9г/л). Аналіз полягає у нейтралізації бутанової кислоти, що виділяється під дією ліпази, розчином гідроксиду натрію з заданим значенням рН=5,5 при 37°С. Одна ліпазна одиниця відповідає кількості ферменту, яка провокує виділення одного мікромолю жирних кислот на хвилину при 37°С і при оптимальних значеннях pH (5,5). Природна (очищена) шлункова ліпаза собаки характеризується питомою активністю, що становить 570 одиниць на мг протеїну. Ліпазну активність можна визначати при використанні всього гомогенату, осаду після центрифугування або надосадової рідини після центрифугування. При використанні надосадової рідини після центрифугування (буфер А), кількісний аналіз всіх розчинних протеїнів виконують по методу Bradford (1976p.). Сендвіч-імуноферментний аналіз [Саrrіèге та ін., 1993р.] проводять також при використанні надосадової рідини після центрифугування та при застосуванні двох популяцій моноклональних антитіл проти природної шлункової ліпази собаки. Перша популяція включає антитіла, що реагують з шлунковою ліпазою людини та піддані афінному очищенню, ви ходячи з повної антисироватки, на шлунковій ліпазі людини, прищепленій до колонки Affigel 10 [Aoubala та ін., 1993p.]. Ці антитіла використовують для покриття ямок планшетів для імуноферментного аналізу (ELISA) при концентрації 1мкг/мл. Друга популяція включає антитіла, якими не розпізнають шлункову ліпазу людини. Їх очищають потім на колонці з сефарозою, зв'язують з протеїном А, а потім з біотином. Фіксування антитіл визначають по зміщенню кон'югату стрептавідин/пероксидаза, ферментативну активність яких виявляють за допомогою субстрату на основі о-фенілендіаміну. Одержані результати мають якісне значення та їх позначають символами + та -. Ефективність екстракції може бути збільшена за рахунок додавання у буфер для екстракції детергенту типа CHAPS (3-(3-холамідопрогал)диметиламоній-1-пропансульфонат) (СlГМА). У цьому випадку дійсно вихід екстракції з надосадової рідини збільшується приблизно до 100% (див. таблицю 1). Таблиця 1 Ліпазна активність (од./г сирої маси) у екстрактах 4 тютюнови х рослин. Одержані шляхом генетичної трансформації з використанням рВІОС25 у присутності 1% детергенту CHAPS Рослини 1 2 3 4 NaCl 0,2М/ЕДТУ 1мМ рН=3,0 80 40 43 54 NaCl 0,2М/ЕДТУ 1мМ рН=3,0+1% CHAPS 112 104 109 92 б) експресія за допомогою рослинних сигнальних пептидів; кількісні аналізи при використанні листя та насіння тютюну, трансформованих за допомогою рВІОС25 та рВIOС26; імуноферментний аналіз. Результати, які одержані на 98 рослинах ТО генотипу Xanthi (стадія 15-20 листків) наведені у таблиці 2. Кількісні аналізи проводять на гомогенатах листя або насіння перед центрифугуванням. Для кожної конструкції, виміряні активності значно змінюються залежно від трансформантів. Приблизно 20% рослин не мають ніякої активності або вони мають дуже слабку активність для того, щоб її можна було виявити. Середні та максимальні активності наведені у таблиці 2. Загальні кількості протеїнів схожі для 3-х конструкцій з середніми значеннями 7 і 8мг/г сирої маси листя та 34, 31 і 38мг/г сирої маси у насінні. Середня ліпазна активність у трансформованому за допомогою конструкцій рВІОС25 листі складає 34од./г сирої маси, тобто 0,8% експресії від загальної кількості протеїнів. У насінні середня активність складає 36од./г сирої маси, тобто 0,2%. Досягнута максимальна активність одного з трансформантів складає 146од./г сирої маси (листя; 2,5% експресії) та 148од./г сирої маси (насіння; 0,7% експресії). Ферментативні активності, одержані на трансформованих за допомогою конструкції рВІОС25 рослинах подібні. Середня активність у листі складає 34од./г сирої маси (0,8% експресії), а максимальна активність 134од./г сирої маси (3% від загальної кількості протеїнів). У насінні середня активність досягає 42од./г сирої маси (0,3%), максимальна активність - 159од./г сирої маси (1%). Для трансформованих за допомогою конструкції рВІОС29 рослин, у листі (специфічний промотор насіння) не виявляє ніякої активності. У насінні середня активність складає 12од./г сирої маси (0,1% експресії), а максимальна активність - 137од./г сирої маси (0,7%). Експресія у листі та зернах одного і того ж випадку трансформації, як правило, добре корелює. Результати імуноферментних аналізів також узгоджуються з результатами кількісних аналізів по визначенню ферментативної активності, тобто рослина з ліпазною активністю дає позитивний результат в імуноферментному аналізі. Одержані потім результати у випадку тих же самих рослин показують, що ліпазна активність може змінюватись у процесі розвитку рослини. Насправді, рослина, експресія якої по відношенню до загальної кількості протеїнів складає 3% на стадії 12-15 листків, показує експресію 6% при наступному кількісному аналізі (більш доросла рослина, з квітами). Таблиця 2 Експресія ліпази у листі та насінні тютюну Xanthi Загальна кількість протеїнів мг/г сирої маси Конструкт рВІОС26 рВІОС25 рВІОС26 рВІОС29 Орган мін.-макс (серед.) Листя (n=34) Насіння (n=34) Листя (n=35) Насіння (n=35) Листя (n=34) Насіння (n=34) Насіння (n=29) 3-15 (7) 24-43 (34) 3-18 (8) 17-35 (31) 3-15 (7) 24-43 (34) 29-55 (38) Ліпазна активність Од./г сирої маси Експресія (% від загальної кількості мін.-макс. (серед.) протеїнів )мін.-макс. (серед.) 0-145,6 0-2,5 (34,4) (0,8) 0-147,6 0-0,7 (36,3) (0,2) 0-133,5 0-3 (34) (0,8) 0-158,5 0-1 (41,9) (0,3) 0-145,6 0-2,5 (34,4) (0,8) 0-147,6 0-0,7 (36,3) (0,2) 0-137,4 0-0,7 (11,8) (0,1) мін. - величина, одержана у випадку трансформації, з мінімумом експресії; макс. - величина, одержана у випадку трансформації, з максимумом експресії; n - число проаналізованих випадків трансформації. в) Експресія за допомогою сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (LGL); кількісні аналізи ліпазної активності у тютюновому листі. Результатами, одержаними на 44 рослинах ТО генотипів Xanthi та pBD6 (стадія 15-20 листгів) є наступні: Всі кількісні аналізи проводять на гомогенатах листя перед центрифугуванням. Проаналізовані активності характеризуються великим розкидом залежно від трансформантів. Близько 20% рослин не мають ніякої активності або мають дуже незначну активність для того, щоб її можна було виявити. Середня ліпазна активність у трансформованих за допомогою конструкції рВІОС41 складає 38од./г сирої маси для генотипу Xanthi та 48од./г сирої маси для генотипу PBD6. Максимальні активності складають, відповідно, 152 та 226од./г сирої маси. IX. Аналіз експресп шлункової ліпази собаки у трансгенних томатних рослинах а) Методика. Методика екстракції ліпази з листя та плодів томату подібна тій, що описана для тютюнового листя, за виключенням того, що 1г свіжого матеріалу оброблюють у 4мл буферу В. Ліпазну активність визначають подібно тому, як описано для листя тютюну. б) Кількісний аналіз плодів томатів. Проаналізовані плоди перших тридцяти трансформантів. Ліпазна активність, визначена в плодах, різна залежно від плодів у випадку одного і того ж трансформанту. Вона складає в середньому 5од./г сирої маси для спілих плодів і 35од./г сирої маси для зелених плодів, при цьому незалежно від досліджуваного конструкта (рВIOС25 або рВIOС26). Необхідно відзначити, що у процесі дозрівання плоду активність знижується. Так, наприклад, для даного першого трансформанту ліпазна активність складає 132од./г сирої маси для зеленого плоду діаметром 10 мм; 44од./г сирої маси для червоно-зеленого плоду діаметром 33 мм і 36од./г сирої маси для червоного плоду діаметром 45мм. X. Імунологічний аналіз типу "вестерн-блотування" LGC а) Шлункова ліпаза собаки LGC, що експресується у листі та насінні трансгенних тютюну та рапсу а.1) Експресія за допомогою рослинних сигнальних пептидів; імунологічний аналіз листя та насіння тютюн у та рапсу, трансформованих за допомогою рВIOС25, рВIOС26 і рВIOС29. Імунологічний аналіз типу "вестерн-блотування" [Renart і Sandoval, 1984p.] шлункової ліпази собаки проводять на протеїнах листя та насіння тютюну і рапсу, екстрагованих за допомогою буферів А і В (див. вище протокол екстрагування). Для проведення цього аналізу перш за все екстраговані протеїни (30мг всіх протеїнів у пробі) розділяють на поліакриламідному гелі, що денатур ує на 12,5%, згідно способу Laemmli U.K. (1970p.), потім переносять їх на нітроцелюлозну мембрану. Поліклональне антитіло проти ліпази собаки, одержане у випадку морської свинки, використовують як зонд, і виявлення здійснюють за допомогою антитіла проти IgG морської свинки, маркірованого лужною фосфатазою. Контрольним протеїном є природна шлункова ліпаза собаки (LC, Фіг.6), яка переміщується у формі одної смуги з уявною молекулярною масою близько 50кДа. Міграція шлункової ліпази собаки трохи затримується у присутності екстракту з нетрансформованого тютюнового листя (Фіг.6, LC+T). У протеїнових екстрактах з нетрансформованого листя і насіння тютюну і рапсу ніякої смуги не виявляють. Продукована у тютюновому листі ліпаза виявляється у вигляді двох смуг. Найбільш значна у кількісному відношенні смуга має уявну молекулярну масу близько 37кДа і відповідає згаданому вище поліпептиду (D54). Менша смуга має уявн у молекулярну масу приблизно 49кДа і відповідає вказаному вище поліпептиду (D4) (Фіг.6, F). У протеїнових екстрактах з насіння простежується тільки одна смуга з меншою молекулярною масою (Фіг.6, GT і GC). а.2) Експресія за допомогою сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (LGL); імунологічний аналіз у листі та насінні тютюну, трансформованих за допомогою рBIOC41. Вестерн-блотування [Renart і Sandoval, 1984р.] здійснюють на протеїнах тютюнових листя і насіння, екстрагованих буфером В (див. ви ще протокол екстрагування). Екстраговані протеїни перш за все розділяють на денатуруючому поліакриламідному гелі, (SDS-PAGE) відповідно до методу Laemmli (1970p.), потім переносять на нітроцелюлозну мембрану. Поліклональне антитіло проти ліпази собаки, одержане від морської свинки, використовують як зонд, і, виявлення здійснюють за допомогою антитіла проти IgG морської свинки, маркірованого лужною фосфатазою. Вестерн-блотування тютюнового листя наведено на Фіг.7. Контрольним протеїном є шлункова ліпаза собаки, що мігрує у вигляді єдиної смуги з уявною молекулярною масою близько 50кДа. У протеїнових екстрактах з нетрансформованого листя тютюну (Т) ніякої смуги не виявляють. Продукована у тютюновому листі ліпаза знаходиться у вигляді великої смуги з уявною молекулярною масою близько 49кДа і відповідає згаданому вище поліпептиду (D4). У трансформованому за допомогою конструкції рВІОС41 насінні тютюну рекомбінантна ліпаза виявляється у тій же формі, що і в листі. б) Шлункова ліпаза собаки в екстракті протеїнів з трансформованого листя тютюну: деглікозилювання. Методика екстракції протеїнів для деглікозилювання наступна: 0,5г листя (сира маса) гомогенізують у рідкому азоті, потім при 4°С в 1мл денатуруючого буферного розчину (100мМ фосфатний буфер, рН=7,5, з добавкою 1% b-меркаптоетанола, 25мМ ЕДТУ та 1% додецилсульфату натрію (SDS). Гомогенат піддають центрифугуванню при 4°С протягом 15 хвилин при прискоренні 10000g. Надосадову рідину інкубують протягом 5 хвилин при 100°С з метою денатурації протеїнів, потім центрифугують протягом 2 хвилин при 1000g. Надосадову рідину потім розріджують в 10 разів буфером для деглікозилювання (100мМ фосфа тний буфер, рН=7,5, з добавкою 1% b-меркаптоетанола, 25мМ ЕДТУ та 1% SDS і 1% октилглікозиду). Фермент (N-глікозидаза F, PNGase, Boehringer) додають з розрахунку 1од. на 100мкл надосадової рідини. Для кожної проби здійснюють контроль без ферменту. Деглікозилювання контрольного протеїну (шлункова ліпаза собаки або кроля) здійснюють за тих же умов. Різні протеїнові проби інкубують при кімнатній температурі протягом 8 годин. Після цього протеїни розділяють шляхом електрофорезу на поліакриламідному гелі та переносять на мікроцелюлозну мембрану, як описано у попередньому розділі. Згідно результатам "вестерн-блотування" шлункова ліпаза, що використовується як контроль, має уявн у молекулярну масу близько 50кДа. Після деглікозилювання її уявна молекулярна маса складає тільки близько 43кДа. Продукована у тютюновому листі ліпаза, після інкубації без PNGase при описаних вище умовах, проявляється у формі трьох смуг з уявними молекулярними масами 49 (поліпептид D4), 37 (поліпептид D54) і 28кДа Смуга з молекулярною масою 28кДа є, без сумніву, результатом протеолізу, що пройшов при інкубації протягом 8 годин при кімнатній температурі. Після деглікозилювання молекулярні маси трьох смуг зменшуються приблизно на 1-2кДа, що свідчить про глікозилювання протеїнів, продукованих у тютюновому листі. в) Шлункова ліпаза собаки, експресована у трансгенних листях та плодах томату. Імунологічний аналіз типу "вестерн-блотування" шлункової ліпази собаки проводять на протеїнах листя і плодів томату, екстрагованих за допомогою буферного розчину В (див вище протокол екстрагування). Для проведення експериментів екстраговані протеїни (15мкг і 6мкг всіх розчинних протеїнів, відповідно, у випадку листя та плодів томату) розділяють на денатуруючому поліакриламідному гелі, як описано у розділі Х.а. Контрольним протеїном є природна шлункова ліпаза (слід 4 на Фіг.8), що мігрує у вигляді єдиної смуги з уявною молекулярною масою близько 50кДа. У протеїнових екстрактах з нетрансформованих листя та плодів томату ніякої смуги не виявляють. Продукована у листі та плодах томату ліпаза проявляється у вигляді двох смуг, яку б конструкцію (рBIOC25 або рВІОС26) при цьому не застосовували. Найбільш значна у кількісному відношенні смуга має уявн у молекулярну масу близько 37кДа та відповідає згаданому вище поліпептиду (D54). Менша смуга має уявн у молекулярну масу близько 49кДа та відповідає вказаному ви ще поліпептиду (D4) (Фіг.8). XI. Очищення шлункової ліпази собаки з рослин а) Очищення шлункової ліпази собаки з тютюнового листя. Активність шлункової ліпази собаки, продукованої у тютюновому листі, визначають титриметричним способом, при цьому за допомогою РН-стату (Mettler-Toledo-DL25) величину pH фіксують при 5,5, температуру при 37°С, використовуючи трибутирин як субстрат: 1мл трибутирину емульгують у 29мл водного 0,15М розчина NaCl в апараті для струшування і перемішування. Аналіз полягає у нейтралізації бутанової кислоти, що виділяється під дією ліпази, шляхом додавання 0,02н розчину гідроксиду натрію, при цьому підтримують інтенсивне механічне струшування емульсії. Одна ліпазна одиниця відповідає 1 мікромолю жирної кислоти, що виділяється при даних величинах pH і температури. Після першої стадії хроматографування, при відборі проби у кількості 0,5мл, визначають ліпазну активність в емульсії, що складається з 1мл трибутирину в 29мл 0,15М розчину NaCl, 2мМ тауродезоксихоляту натрію, та 1,5мкМ бичачого альбуміну, згідно аналізу, описаному Gargouri та ін., (1986p.). 1г ліофілізованого листя гомогенізують при 4°С у 30мл 20мМ гліцинового буферного розчину, рН=2,5 і слабо струшують протягом 15 хвилин. Під час мацерації значення pH підтримують рівним 2,5 добавкою 1н соляної кислоти. Продукт мацерації центрифугують при прискоренні 15000g протягом 5 хвилин. Значення pH надосадовоі рідини доводять до 4 добавкою 1н розчину NaOH. Після фільтрації через MIRACLOTH (Calbiochem) всю кількість надосадовоі рідини вносять у колонку з катионообмінною смолою (смола: SSèpharose Fast Flow-Pharmacia) об'ємом 10мл (діаметр 1,6см), урівноважену буферним розчином 20мМ ацетату натрію, рН=4,0, 20мМ NaCl при витраті 1мл/хв. Збирають фракції по 2мл. Після проходження надосадовоі рідини, колонку промивають 40мл врівноважуючого буферного розчину. Утримані в колонці протеїни елююють за наступною методикою: - лінійний градієнт буферного розчину 20мМ ацетату натрію, рН=4,0, з 20мМ¸210мМ NaCl за 30 хвилин для елюювання першої сукупності протеїнових піків, що не характеризуються ліпазною активністю; тест проводять на пробах по 1мл; - плато при 210мМ NaCl протягом 20 хвилин; - лінійний градієнт буферного розчину 20мМ ацетату натрію, рН=4,0, з 210мМ¸500мМ NaCl за 30 хвилин при елююванні другої сукупності протеїнових піків. Ліпазну активність, виміряну на пробах по 0,5мл, елююють під час другого градієнту при іонній силі 300-400мМ Активні фракції збирають і концентрують за допомогою концентратора OMEGACELL з обмеженням молекулярної маси 30кДа (Filtron Technology Corporation). Проводять діаліз концентрату протягом 12 годин проти 10мМ буферного розчину Tris-HCl, pH=8, потім вносять його в колонку з аніонообмінною смолою (MonoQ HR5/5 діаметром 0,5см та висотою 5см; Pharmacia), врівноважений 10мМ буферним розчином Tris-HCl, pH=8. Ліпазну активність визначають на пробі 0,5мл. Витрати підтримують рівними 1мл на хвилину при тиску 2,0Мла. Після елюювання не утриманої фракції та промивки колонки за допомогою 10мл 10мМ буферного розчину Tris-HCl, рН=8, застосовують лінійний градієнт з іонною силою 0-400мМ NaCl за 60 хвилин. Ліпазну активність елююють при іонній силі 100мМ-200мМ. Активні фракції збирають та концентрують за допомогою концентратора OMEGACELL до границі молекулярної маси 30кДа. Концентрат утворює очищена шлункова ліпаза собаки, екстрагована з листя тютюн у. Концентрацію протеїнів визначають методом Bradford M. (1976р.) у концентрованих надосадових рідинах і методом Lowry O.H. (1951р.) у розчинах після першої іонообмінної хроматографії. На різних стадіях очищення проводять аналізи електрофорезом на денатур уючому поліакриламідному гелі (SDS-PAGE 12,5%) методом Laemmli U.K. (1970p.). Протеїни, таким чином розділені на поліакриламідному гелі, виявляють, по-перше, забарвлюванням за допомогою кумасі-синього та, по-друге, переносять на нітроцелюлозну мембрану методом трансфекції електрошоком у напівсухому стані (Transblot SD, BIORAD) у буферному розчині 20мМ Tris-основа, 150мМ гліцин і 20% етанол, при 2,3мА/см 2 мембрани. Перенесену на нітроцелюлозну мембрану рекомбінантну шлункову ліпазу собаки виявляють шляхом імунологічного аналізу за наступною методикою: - маркування протеїна-мішені поліклональним антитілом проти шлункової ліпази собаки, одержаним від морської свинки та розрідженим у 5000 разів у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (ЗФР), що містить добавку знежиреного порошкового молока у кількості 5% і Твін 20 у кількості 0,1%, протягом 1год. при кімнатній температурі, - промивка мембрани послідовно у трьох послідовних ваннах з буфера ЗФР, що містить добавку 1% знежиреного порошкового молока та 0,1% Твіну 20, протягом 10 хвилин у кожній ванні, - маркування за допомогою антитіла пероксидази (Сігма) морської свинки, розрідженого у 2000 разів у ЗФР, що додатково містить +1% знежиреного порошкового молока та 0,1% Твіну, протягом 1 години при кімнатній температурі, - промивка мембрани послідовно у трьох послідовних ваннах з буфера ЗФР, що містить добавку 1% знежиреного порошкового молока та 0,1% Твіну 20, протягом 10 хвилин у кожній ванні, - проявлення шляхом впливу пероксидази на 4-хлоро-1-нафтол (Сігма) у присутності Н 2О2 блакитного, стійкого у часі фарбування. Продукована у листі ліпаза, проявляється у вигляді двох смуг з молекулярною масою близько 49кДа (поліпептид D4) і 37кДа (поліпептид D54). б) Варіант очищення шлункової ліпази собаки з тютюнового листя. Активність шлункової ліпази собаки, продукованої у тютюновому листі, визначають титриметричними способами, описаними Gargouri та ін. (1986р.) за допомогою рН-стату (Mettler-Toledo-DL25). Визначення тригліцеридів з короткими ланцюжками проводять при використанні трибутирину як субстрату: 1мл трибутирину емульгують у 29мл водного розчину 0,15М NaCl, 15мкМ сироватки бичачого альбуміну (BSA), та 2мМ тауродезоксихоляту натрію (NaTDC). Значення pH складає 5,0, температура становить 37°С. Аналіз полягає у нейтралізації бутанової кислоти, що виділяється під дією ліпази, шляхом додавання 0,02н розчину гідроксиду натрію, причому здійснюють інтенсивне механічне струшування для збереження емульсії. Кількісний аналіз тригліцеридів з довгими ланцюжками проводять при використанні як субстрату водної емульсії з 30% очищеного соєвого масла, 1,2% очищених фосфоліпідів яйця, 1,67% безводного гліцерину (30% IntralipidÔ -PHARMACIA AB, Стокгольм, Швеція). 10мл вказаної суспензії емульгують у 20мл водного розчину, що містить 0,15М NaCl, 30мкМ сироватки бичачого альбуміну (BSA) і 3,5мМ СаСІ2. Значення pH складає 4,0, температура становить 37°С. Аналіз полягає у нейтралізації жирних кислот, що виділяються під дією ліпази, шляхом додавання 0,02М розчину гідроксиду натрію по стрибку значення pH з 4 до 9, причому здійснюють інтенсивне