Спосіб одержання та генетичної трансформації рослин beta vulgaris

1 Способ получения растения Beta vulgans, включающий культивирование устьичных клеток Beta vulgans в регенерационной среде и регенерацию целого растения из указанных клеток 2 Способ по п 1, в котором растение является сахарной свеклой 3 Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором устьичную клетку подвергают регенерации в интактном органе 4 Способ по любому из пунктов 1 или 2, в котором указанную устьичную клетку выделяют из ткани растения, содержащей такие клетки 5 Способ по любому из пунктов 1 или 2, в котором указанную устьичную клетку выделяют из эпидермиса листьев 6 Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором регенерация включает получение каллуса в безгормональной среде 7 Способ генетической трансформации растений Beta vulgans, включающий введение в устьичную клетку указанного растения наследственного материала и регенерацию целого растения из этой трансформированной клетки 8 Способ по п 7, в котором указанную трансформацию выполняют в стареющей ткани листа 9 Способ по п 8, в котором указанная ткань является эпидермисом листа 10 Способ по любому из пунктов 8 или 9, в котором указанную трансформированную устьичную ткань размачивают с получением суспензии клеток, из которой регенерируют растения 11 Способ по любому из пунктов 7-10, в котором устьичные клетки перед регенерацией превращают в протопласты 12 Способ по любому из пунктов 7-11, в котором указанный наследственный материал является ДНК-конструкцией, которая включает поддающийся селекции маркерный ген, не проявляющий устойчивости к антибиотику, а указанная трансформированная ткань подвергается воздействию приемлемого селективного агента 13 Способ по любому из пунктов 7-12, в котором указанную трансформацию проводят в клеточной популяции, обогащенной замыкающими клетками 14 Способ по любому из пунктов 7-13, в котором указанные устьичные клетки превращают в протопласты ферментативным расщеплением клеточной стенки до или после трансформации 15 Способ по любому из пунктов 7-14, включающий смешивание суспензии устьичных клеток с микроскопическим волокнистым материалом и перемешивание смеси в присутствии наследственного материала 16 Способ по любому из пунктов 7-15, в котором указанная регенерация включает получение каллуса в безгормональной среде 17 Способ по п 7, в котором указанный наследственный материал вводят в указанные устьичные клетки прямой инсерцией ДНК 18 Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный наследственный материал является ДНК-конструкцией, которая не содержит ген, определяющий устойчивость к антибиотику о (О ГО Ю З 54369 19 Способ по любому из пунктов 17 или 18, в коэпидермисе листа тором указанные устьичные клетки содержатся в Данное изобретение относится к способу культивирования растительной ткани и регенерации растений Более конкретно, изобретение относится к способу генетической трансформации клеток растения, регенерации из трансформированных клеток всего растения и к полученному в результате растению В частности, изобретение относится к способу трансформации Beta Vulgans в том числе сахарной свеклы, кормовой свеклы, столовой свеклы и магольда (листовой свеклы) В настоящее время генетическая трансформация и последующая регенерация многих видов растений не представляет особых трудностей, тем не менее, существуют отдельные виды, которые не поддаются трансформации существующими способами Одним из примеров является Beta Vulgans, для которой, несмотря на временную экспрессию в некоторых клетках и случайный успех для специфичных генотипов, для получения трансгенных растений так и не был создан простой доступный способ (Заявка на международный патент №WO 91/13159, D'Hallum К и др , Biotechnology 10, 309-314 (1992) Если более конкретно, то не существует публикаций, относящихся к способу трансформации путем прямого переноса гена с последующей регенерацией растения Неподверженность протопластов сахарной свеклы трансформации хорошо документирована Lmdsey и др Transformation in Sugar Beet (Beta Vulgans L) Biotechnology in Agriculture and Forestry, T 23, Plant protoplasts and Genetic Engineering IV" VPS Bajaj, ред , Спрингер-Ферлаг, Берлин, 1993) Деление клеток in vitro ограничено, и тотипотентные колонии, как правило, образуются с низкой частотой (0,1% или менее) Протопласты, выделенные из листьев сахарной свеклы, отличаются по размеру и по своей морфологии, указывая на высокую степень клеточной гетерогенности, характерной для источника ткани, как на физиологическом (вследствие относительного расположения клеток in vivo), так и на цитогенетическом (плоидность, фаза клеточного цикла) уровнях Таким образом, ощущается необходимость в создании простого способа трансформации, происходящей с высокой частотой, который был бы применим к свекле Для эффективной трансформации клетки должны быть выполнены определенные условия Прежде всего, встраиваемый ген должен быть включен в конструкцию, содержащую эффективные регуляторные элементы, предназначенные для ведения транскрипции гена Кроме того, должен существовать способ переноса конструкции в клетку После того, как конструкция оказывается в клеточной мембране, происходит или не происходит интеграция ее в эндогенный хромосомный материал Вероятность интеграции может быть увеличена определенными средствами, но, как правило, интеграция всего лишь дело случая И, наконец, если речь идет о растении, тип клеткимишени должен быть таким, чтобы клетки могли быть регенерированы в целое растение Клетки растений трансформируются с большим трудом, чем бактериальные клетки и клетки животных, что связано с наличием твердых клеточных стенок, создающих барьер для внедрения конструкции через стенку Таким образом, выбор способа трансформации клеток растения имеет тенденцию к ограничению только теми способами, которые приемлемы для целевого типа растения (Potrykus І в издании "Plant Breeding Principles and Prospects" ред Hayward и др, издат Чепмэн энд Халл, Лондон (1993)) Если обобщить, то двудольные растения сравнительно легко поддаются трансформации, в то время как однодольные растения поддаются с большим трудом, причем отмечены лишь немногочисленные методики, которым сопутствовал успех, и то лишь незначительный Один из способов, заявленных для трансформации растительных клеток, известный как микроин"ектирование, заключается в введении ДНК конструкции под микроскопом из полой иглы в клетку-мишень Другой вариант состоит в разрыве иглой клеточной стенки, при этом ДНК вводится в окружающую среду и диффундирует в клетку через разрыв в ее стенке Этот вариант известен под названием "микропрокола" Оба указанные методики требуют от оператора высокой квалификации и больших временных затрат В опубликованной заявке на патент Японии № 03103183, 1991 г предлагается возможность встраивания чужеродного гена в растительные клетки микроин"ектированием в замыкающие клетки, встречающиеся в эпидермальной ткани растения, с последующим культивированием этих клеток Однако физиологические исследования замыкающих клеток показали, что эти клетки обладают высоким внутриклеточным давлением, в связи с чем возникает вопрос о возможности микроин"ектирования ДНК в замыкающие клетки, также данный способ имеет принципиальный недостаток, состоящий в больших временных затратах, в силу чего в течение дня ин"ектированию может быть подвергнуто сравнительно небольшое число клеток Не представлено никаких данных, точно описывающих выделение этим путем трансгенных растений В настоящее время наиболее эффективной методикой введения генных конструкций, в частности, в случае однодольных растений является так называемый способ "биообстрела", в котором металлические частицы высокой плотности (обычно из вольфрама или золота), покрытые генной конструкцией, выстреливают в целевую клеточную культуру за счет взрывного выделения 54369 струкции гена будет способ, осуществляемый по существу нелетальным путем Важно, чтобы клетка, в которую вводится конструкция, принадлежала к типу (если необходимо получить полное растение) клеток, способных при осуществлении соответствующей методики регенерации, регенерировать растение целиком Настоящее изобретение относится к подбору определенного, способного к регенерации типа клеток Целью настоящего изобретения является создание способа трансформации растения, в частности (но не исключительно), сахарной свеклы Согласно настоящему изобретению представлен способ получения растения, состоящий в культивировании клетки растения в регенерационной среде и отличающийся тем, что культивируемая клетка является устьичной клеткой растения Рекомендуется, чтобы клетки устьица подвергались регенерации в интактном органе, содержащем такие клетки, однако указанные клетки вначале могут быть выделены Одним из рекомендуемых источников устьичных клеток растения является выделенный эпидермий листа Способ данного изобретения наиболее приемлем для растений вида Beta Vulgans, особенно для сахарной свеклы Смешивание клеток растения с плазмидной ДНК и волокнами или усами (нитевидными криРекомендуется, чтобы методика регенерации сталлами) диаметром на субмикронном уровне включала получение каллуса в среде, не содерявляется простым и недорогим альтернативным жащей гормонов способом трансформации Имеется несколько Изобретением дается также способ генетичеопубликованных сообщений о трансформации, ской трансформации растений, состоящий во ввепроведенной с применением усов из карбида дении в клетку растения наследственного матекремния Первым появилось сообщение о неусриала и регенерации из трансформированной тойчивой экспрессии р-глюкуронидазы (gus) в сусклетки целого растения Способ отличается тем, пензии клеток черной мексиканской сладкой что трансформируемые клетки являются устьич(ЧМС) кукурузы (Kaeppler и др 1990) Той же групными клетками растений пой авторов недавно опубликованы результаты Трансформация может быть проведена с инустойчивой трансформации ЧМС и табака (Kaepтактной тканью, содержащей устьица, и одной из pler и др , 1992) В системе с применением кукурурекомендуемых тканей является ткань стареющезы из каждого подвергнутого вихревой обработке го листа образца клеток (упакованные клетки в объеме В рекомендуемом воплощении клетки устьиц ЗООмкл) выделено в среднем 3,4 BASTAпредставлены клетками, находящимися в эпидерустойчивой колонии в случае использования BAR мии листьев и gus-содержащей плазмиды Шестьдесят пять Ткань, содержащая устьица, может быть разпроцентов таких устойчивых к гербициду колоний мочена с образованием клеточной суспензии, из экспрессируют gus (Kaeppler H F , Gu W , Somers которой регенерируют растения D A , Rmes H W , Cockburn A F (1990) "Silicon carРекомендуется также, чтобы устьичные клетки bide fiber-mediated DNA delivery into plant cells", перед регенерацией были превращены в протоPlant Cell Reports 9 415-418, and, Kaeppler H F , пласты Somers D A , Rmes H W , Cockburn A F (1992), В рекомендуемом воплощении изобретения "Silicon carbide fiber-mediated stable transformation указанный наследственный материал представof plant cells", TheorAppI Genet 84 560-566 ляет собой ДНК конструкцию, включающую поддающийся отбору маркерный ген, не проявляюПрименение усов для трансформации клеток щий устойчивости к антибиотику, и растений является объектом патента США № трансформированную ткань подвергают воздейст5 302 523, выданного Зенека Лимитид вию соответствующего селективного агента На успех трансформации влияют многочисТрансформация может быть проведена на ленные факторы Моделирование и строение экклеточной популяции, содержащей замыкающие зогенной конструкции гена и ее регуляторных клетки, или на клеточной популяции с повышенэлементов влияют на интеграцию экзогенной поной концентрацией замыкающих клеток следовательности в хромосомную ДНК растительного ядра и на способность клетки экспрессиТрансформацию можно осуществить и в клеровать трансген Приемлемым способом точной суспензии внедрения в ядро клетки растения экзогенной конУстьичные клетки могут быть превращены в газа Такой альтернативный подход не обладает высокоточной направленностью, характерной для микроин"ектирования и микропрокалывания, но его достоинство заключается в быстром нанесении, позволяющем за короткое время "ударить" по большому количеству клеток с образованием в результате большого числа вероятных трансформантов, которые могут быть подвергнуты отбору Каким бы эффективным не казался метод биообстрела, его проведение требует применения дорогих металлов, и, хотя по сравнению с другими испытанными способами данный способ более быстр, тем не менее, и он требует больших затрат времени И все же при каждой бомбардировке достигается большое число случаев трансформации Одной из проблем, возникающих при использовании данной технологии, является действие давления расширяющегося газа на целевую ткань Другая проблема заключается в трудности, связанной с прицельным обстрелом зарядом выбранной области в мишени Для преодоления последней проблемы сконструированы разнообразные устройства, способствующие микроприцеливанию (Leduc и ДР , Sex Plant Reprod , 7, 135-143 (1994), Iglesias и др Planta 192, 84-91 (1994)), но и по настоящий момент никакие трансгенные растения этой технологией не были получены 54369 8 любого клеточного типа Таким образом, способность замыкающих клеток табака регенерировать растение целиком не является полной неожиданностью, а тот факт, что табак обладает подобной способностью, не обязательно указывает на обладание и другими видами растений этим же свойством В литературе имеются два коротких описания, касающихся получения каллуса из эпидермальных клеток сахарной свеклы (Kotows-ka, Rogozmska Bull, of the Polish Acad Sc , 32, 11-12 (1984), Kotowska, Beitr Biol Pflanz , 67, 209-225 (1982)), и несколько коротких сообщений (например, Harms и др , Plant Cell Tissue Organ Culture, 2, 93-102 (1983), Schneider, Gunther, BiochemPhysiol Pflanzen, 1_82, 485-490 (1987)) об успешном получении почек на эпидермии черешков Но нигде не приводятся факты, указывающие на возможность деления и образования каллуса замыкающими клетками В одном из воплощений изобретения ткань листьев или их эпидермальный слой размачивают и перерабатывают с образованием культуры, содержащей замыкающие клетки, стенки клеток расщепляют с образованием протопластов, применением приемлемого способа протопласты трансформируют, трансформанты подвергают отбору и из трансформантов регенерируют растения В другом варианте клетки листьев трансформируют in situ бомбардировкой интактной ткани листьев микрочастицами, покрытых экзогенной Замыкающие клетки представляют собой неДНК конструкцией Подвергнутую бомбардировке большие клетки уникальной формы, стенки кототкань затем размачивают, выделяют более упрурых сравнительно толще, тверже и содержат гие по сравнению с клетками других типов замыбольше пектина по сравнению с другими клетками кающие клетки, из которых регенерируют целое листьев Канал устьица образован двумя замырастение кающими клетками Существуют две базовые формы замыкающих клеток эллиптическая форма И еще в одном варианте ткань листьев размаи злаковая форма Термины "устьице" и "устьиччивают и из нее получают клеточную популяцию, ный" обычно применяют для обозначения не тольобогащенную замыкающими клетками Затем обоко пор, но также для обозначения замыкающих гащенную клеточную популяцию подвергают клеток и также прилегающих клеток, образующих трансформации и из трансформантов регенерикомплекс устьица (Weyers, Meider в издании " руют целое растение Перед трансформацией Methods in Stomatal Research", стр 3, Longmans, замыкающие клетки могут быть превращены в Лондон, 1990) В данной заявке термин "замыпротопласты В альтернативном способе кусочки кающая клетка" применяется нами для обозначеэпидермия могут быть отделены вручную, после ния любой клетки, участвующей в образовании чего из них получают каллус комплекса устьица Именно заметная упругость замыкающих клеток вместе с неожиданной тотипотентностью клеДолгое время полагали, что замыкающие ток и их протопластов по сравнению с клетками клетки не способны делиться в культуре (Тгап других типов делает замыкающие клетки особенно Thanh Van К "Control of Morphogenesis or what приемлемыми для целей соматической гибридиshapes a group of cells" в издании Advansis in Bioзации, образования цитоплазматическо го гибрида chemical Engineering, т 18, Plant Cell Cultures 11, (Krens и др, Theor Appl Genet, 79, 390-396 ред A Feichter, издат Шпрингер-Ферлаг, Берлин, (1990)) или трансформации Тем не менее, такую стр 151 -171 (1980)), однако недавней работой упругость можно рассматривать и как потенциальпоказано, что в отношении по меньшей мере одный барьер для внедрения ДНК в клетку Настояного вида, а именно, Nicotiana glauca это не так щим изобретением показано, что замыкающие (Cupples W и др , Plant Cell and Environment (991), клетки и в самом деле могут быть трансформиро14, 691-697) и что растения могут быть регенериваны и что трансформированные клетки могут рованы целиком из протопластов замыкающих быть, затем регенерированы, т е изобретением клеток табака (Sahgal P и др , Plant Science, 97, дается эффективный способ получения трансген199-208 (1994)) Табак широко применяется в каных растений честве модельного растения з науке о растениях, и одной из характеристик, позволяющих примеОдним из важных аспектов данного изобретенять табак в качестве модельной системы, являния является то, что изобретение применимо для ется его способность регенерироваться почти из трансформации свеклы (Beta Vulgans), т е вида, протопласты ферментативным гидролизом стенок клеток до или после трансформции Один из рекомендуемых способов трансформации состоит в смешивании суспензии устьичных клеток с микроскопическим волоконным материалом и в перемешивании смеси в присутствии наследственного материала В эпидермальном слое листьев, стеблей и определенной репродуктивной ткани, например, пыльниках (Kendra G Phyton, 4, 83-96 (1952)) встречается определенный тип специализированных клеток, известных под названием "замыкающих клеток" Кроме того, по мере старения листьев замыкающие клетки имеют тенденцию к более позднему отмиранию, чем прочие клетки (Zeiger Е , Schwartz A Science 218, 680-682 (19Я2)) Таким образом, увядающие листья являются источником, особенно обогащенным жизнеспособными замыкающими клетками Замыкающие клетки регулируют отверстия листьевых пор или устьиц (обзор см "Stomatal Function", ред Zeiger и др , 1987) Известны способы выделения клеток устьиц (см , например, Kruse и др , Plant Physiology, 90,1382-1386 (1989)) и их превращения в протопласты (см, например, Mawson В Т , Plant Cell Environment, 1 6 207-214 (1993)), хотя эти способы _ создавались для применения в физиологических исследованиях и обычно использовались с растением Vicia faba (Mawson ВТ Planta, 191, 293-301 (1993), Talbott, Zeiger, Plant Physiology, 102, 11621169(1993)) который до настоящего времени трансформировался лишь с неприемлемо низкой частотой (Lindsey и др , Transformation in Sugar Beet (Beta Vulgans L) в издании Biotechnology in Agriculture and Forestry, 23, "Plant protoplasts and Genetic Engineering IV" V P S Bajaj, ред , Спрингер-Ферлаг, Берлин, 1993) Методика изобретения может включать некоторые из следующих стадий трансформация, выделение эпидермия, выделение замыкающих клеток, получение из замыкающих клеток протопластов, отбор трансформантов и регенерация из трансформантов целых растений Однако порядок, в котором эти стадии могут быть осуществлены, может меняться, и определенные стадии могут быть опущены, при этом каждый вариант имеет свои преимущества 1 Может быть трансформирована интактная ткань листа, после чего полученный продукт или выделенный из него эпидермий размачивают с получением клеточной суспензии, которую при необходимости обрабатывают ультразвуком Назначение этих процедур состоит в преимущественном разрушении клеточных типов, отличных от замыкающих клеток Вследствие сравнительно большей устойчивости замыкающих клеток к таким физическим нагрузкам концентрация этих клеток повышается, и они могут быть, затем выделены из суспензии флотацией или фильтрованием и регенерированы в целое растение 2 В методике 1 встраиваемая ДНК конструкция может включать поддающийся обнаружению маркерный ген, наиболее обычный маркерный ген устойчив к антибиотику, например канамицину или гигромицину, или это ген с устойчивостью к гербицидам, например BASTA Листья затем могут быть подвергнуты воздействию необходимого для отбора давления, причем в суспензию переходят только выжившие клетки, или же в альтернативном варианте, если к суспензии целиковой ткани листа добавляется необходимый для отбора агент, выделенные жизнеспособные замыкающие клетки состоят только из трансформированных клеток, и в этом случае нет необходимости в отдельной стадии отбора Тем не менее, рекомендуется, чтобы конструкция была полностью свободна от генов, обладающих устойчивостью к антибиотику Таким образом, рекомендуется, чтобы поддающийся отбору маркер для растительных клеток являлся гербицидным биалафосом Отбор на бактериальной стадии получения конструкции предпочтительно включает применение Saccharo-myces cerevisiae IGPD гена (имидазол-глицерин-фосфатдегидрогеназа), способного функционально дополнять мутантные his В штаммы Е coh с дефицитом биосинтеза гистидина с восстановлением роста этих штаммов на минимальной среде Применение такой ауксотрофной комплементарной системы для рекомбинантного отбора исключает необходимость внедрения в плазмиды, обрабатываемые в Е coh перед введением в растительные клетки, бактериального маркера с устойчивостью к антибиотику, например, бета-л актам азы 3 По методике 1 может быть получена суспензия замыкающих клеток, и суспендированные 54369 10 клетки могут быть подвергнуты трансформации В этом случае применяют обычно способ вихревой обработки с волоконным материалом, например, усами из карбида кремния Трансформация может быть осуществлена до или после получения концентрата замыкающих клеток (см выше) и в дополнение может быть использована методика 2 4 Вышеприведенными способами могут быть приготовлены суспензии замыкающих клеток или обогащенная суспензия, и перед трансформацией ферментативным расщеплением клетки могут быть превращены в протопласты И, наконец, из протопластов могут быть регенерированы растения Применение протопластов в качестве мишени для трансформации может позволить применить определенные известные методики трансформации, которые неэффективны для интактных замыкающих клеток 5 Самый простой вариант включает трансформацию интактного листа или выделенного эпидермия, приготовленного механическими средствами или вручную, с последующей регенерацией под необходимым для отбора давлением Поскольку известно, что никакие другие клеточные типы, кроме замыкающих клеток, не способны к регенерации, эти клетки будут просто пролиферировать без регенерации, не мешая регенерации трансформированных замыкающих клеток Особенно приемлемыми могут оказаться частично увядшие листья (преимущественно содержат только жизнеспособные замыкающие клетки) Специфичный способ введения экзогенной ДНК конструкции не имеет особого отношения к данному изобретению его выбор определяется только простотой применения Однако, нами при получении трансгенных растений достигнут успех применением известной методики трансформации протопластов при участии полиэтиленгликоля (ПЭГ) с последующими отбором и регенерацией Изобретение далее описывается нижеследующими примерами, приведенными в виде иллюстрации Состав различных сред, применяемых в этих примерах, приведен в нижеследующей Таблице 1 Таблица 1 Среда А MS среда половинной силы* 3% сахарозы 0,3% Гелтайта (фирменное название) рН 5,8, автоклавирование Среда В 9% маннита 3,8% СаСІ2 2Н2О 0,1 мМ н-пропилгаллата CPW соли** рН 5,8, стериализация фильтрованием Среда С 9% маннита 0,1 мМ н-пропилгаллата CPW соли** 2% Целюлозы R-10 (фирменное название) 3% Мацерозима R-10 (фирменное название) рН 5,8, стериализация фильтрованием 11 54369 12 (1,5% агара в водопроводной воде) при 22°С на свету Стерильные всходы затем культивируют 4 неСреда D 9% маннита дели на среде А перед удалением меристем для 0,1 мМ н-пропилгаллата субкультивирования на той же среде CPW соли** рН 5,8, стериализация фильтрованием Проростки субкультивируют каждые три недели и в течение этого времени удаляют и помещаСреда Е 15% сахарозы ют в свежую среду Все культуры инкубируют на 0,1 мМ н-пропилгаллата свету (16 часов в день, 3000 люкс) при 22°С CPW соли** рН 5,8, стериализация фильтрованием ПРИМЕР 2 Выделение протопласта листьев Среда F 9% маннита (По методике Krens и др , Theoretical and Ap1мМ СаСЬ 2Н2О стериализация фильтphld Genetics, 79, 390-396 (1990)) рованием Протопласты выделяют из листьев трехнеСреда G 9% маннита дельных побегов Beta vulgans культивируемых в 1мМСаС122Н2О асептических условиях, следующим образом У 2% альгината натрия, автоклавировакультивируемых побегов удаляют пластинки линие стьев и примерно 1,5 грамма (сухая масса) мелко Среда Н 7,25% маннита размельчают в 10мл Среды В, находящейся в 50мМ СаСІ2 2Н2О чашке Петри на 9см 0,9 Агарозы (фирменное название), авПосле удаления Среды В кусочки листьев токлавирование внось суспендируют в 15мл Среды С, содержащей Среда I 1,58% Агарозы, автоклавирование ферменты, осуществляющие расщепление Среда Y 6,84% глюкозы Инкубирование ведут в темноте в роторной 0,1 мМ н-пропилгаллата качалке (45об/мин, амплитуда 11 мм) примерно 0,2мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кисутки (16 часов) при 25°С слоты (2,4-Д) После осторожного прокачивания сырой сме1мг/л нафталинуксусной кислоты (НУК) си протопластов через пипетку (10 раз), суспензию 0,5мг/л бензиламинопурина (БАП) протопластов отделяют фильтрованием под дейК8р среда (без секвестрена и казамиствием силы тяжести через нейлоновые сита (297 н о кислот)*** и 55мкм меш) рН 5,8, стериализация фильтрованием Суспензию протопластов помещают в ценСреда К 3% сахарозы трифужные пробирки на 12мл, и протопласты от0,8% Агарозы деляют в виде осадка центрифугированием в те1мМ БАП чение 5 минут при 55д PGo среда**** Надосадочную жидкость отбрасывают, проторН 5,8, автоклавирование пласты промывают и центрифугируют дважды в Среда L 3% сахарозы 10мл Среды D 0,8% Агарозы И, наконец, протопласты вновь суспендируют 25мкМ индолмасляной кислоты (ИМК) в 10мл Среды Е, поверх которой осторожно поPGo среда**** мещают 1мл Среды F, и центрифугируют вышерН 5,8, автоклавирование приведенным способом *Marashiga Т, Skoog, F (1962) Physiologia Протопласты собирают из верхнего слоя в Plantarum, 15, 473-479 1мл Среды F, и с помощью гемоцитометра опре**Frearson E M , Power J В , Cocking E C/ деляют плотность популяции (1973), Developmental Biology, 33, 130-137 Все культуры протопластов инкубируют при ***Kao К N , Michayluk M К (1915), Planta, 126, 25°С в темноте 105-110 ПРИМЕРЗ ****De Greet W , Jacobs M , (1919), Plant SciЗаделка протопласта ence Letters, 17, 55-61 (По методике Hall и др , Plant Cell Reports, 12, ПРИМЕР 1 339-342(1993)) Растительный материал и условия роста Перед культивированием протопласты иммо(По методикам Hall и др Plant Cell Reports, билизуют следующим образом В полном объеме 12, 339-342 (1993) и Pedersen и др Plant Science, Среды F в 500мкл суспендируют известное число 95, 89-97(1993)) протопластов, необходимое для достижения неКультуру асептических побегов Beta vulgans обходимой плотности нанесения (обычно 30000 получают следующим образом Семена стерили125000 на чашку) зуют выдерживанием в течение 50 минут в H2SO4 После тщательного смешивания с 500мкл после чего тщательно промывают водопроводной Среды G- суспензию наносят в виде тонкого слоя водой Затем семена помещают на 15 минут в на чашку Петри размером 6см, содержащую 10мл деминерализованную воду при 55 С, после чего Среды Н выдерживают 30 минут в 5%-ном гипохлорите наПосле инкубирования в течение 2 часов при трия Стерилизующий раствор затем удаляют комнатной температуре альгинат кальция затверпромыванием еще три раза (5, 10 и 15 минут) стедевает в тонкий диск, который затем удаляют и рильной водопроводной водой переносят в пустую чашку Петри Проращивание происходит на водном агаре Продолжение таблицы 1 14 13 54369 ПРИМЕР 4 ванные, как прародители каллуса этого типа, характеризуются резко отличной морфологией, выФиксация иммобилизованных клеток и пригоражающейся в сравнительно небольшом размере товление культур для искателя клеток (15-27 (обычно 23) мкм в диаметре) при измереДля установления положения и перемещения нии после одного дня культивирования в среде с отдельных клеток культуры готовят следующим осмотичностью 510мос/кг Эти клетки содержат образом (см Фиг1) Покровное стекло размером несколько видимых цитоплазмических компонен24,5 х 40мм стерилизуют в спирте и отжигают в тов помимо небольшого числа необычно крупных пламени зерен крахмала (обычно 5 - 14 на клетку, более Одну каплю (примерно 50мкл) Среды I нанообычно 8 или 9 на клетку) Такие зерна крахмала сят на всю поверхность покровного стекла и помогут занимать примерно 50% объема клетки зволяют полностью просохнуть Острым скальпелем вырезают центральную Деление указанных клеток происходит сравчасть (10 х 25мм) диска из альгината кальция нительно поздно, через 5 - 1 0 дней после нанесения и в результате образуется каллус рыхлой На покровное стекло, в верхней части котороструктуры, состоящий из небольших клеток с бого находится вырезанный кусочек альгината кальгатой цитоплазмой, содержащей многочисленные ция, помещают одну каплю Среды G зерна крахмала различной величины и формы Грани диска альгината окружают кольцом из Никаких явных вакуоль не отмечено Среды I (35°С) таким образом, что среда контактирует и с альгинатом, и с покрытым агарозой поКаллус другого типа очень тверд и компактен кровным стеклом и, как правило, образует сферические колонии Каллус, видимо, нето-типотентен Каллус другого И, наконец, с помощью двух капель Среды I типа, как найдено, происходит из протопласта того на покровном стекле фиксируют две золотые сетипа, который характеризуется диаметром 20 - 30 точки для изучения образцов под электронным (обычно 27) мкм и богатой цитоплазмой, содермикроскопом одну - сверху в центре и другую жащей многочисленные небольшие и неодинакоснизу справа вые по размеру и форме зерна крахмала Обычно После отверждения агарозы весь ансамбль эти клетки (при рассмотрении через день после переносят в чалку Петри на 6см, содержащую 4мл нанесения) уже имеют ядро, расположенное в Среды J центре клетки Деление этих клеток происходит Остальную часть диска альгината также перерано (обычно в пределах трех дней), с большой носят в ту среду, после чего чашку герметизируют скоростью с образованием круглых компактных Парафильмом (фирменное название) колоний, состоящих из клеток с зернистой цитоПРИМЕР 5 плазмой и четко видимыми вакуолами Положение и повторное определение положения клеток На основании морфологических характеристик и проведения следующего частичного расщеплеПрименяют инверсионный микроскоп Цейс ния эпидерма подтверждено, что первый клеточ1СМ 405, снабженный микроскопным столиком со ный тип, ведущий к способному регенерироваться ступенчатым моторным приводом Для регулирокаллусу, происходит из замыкающих клеток Полавания перемещения микроскопного столика и для гают, что второй тип происходит из камбиальной калибровки системы используют прилагаемую ткани сосудистых узлов Мезофильные протоплакомпьютерную программу, позволяющую регистсты не делятся никогда рировать положение отдельных клеток в чашке Петри с точностью до 1мкм Использованием поПРИМЕР 7 ложений центров двух ЭМ сеток в качестве фикВыделение эпидермиса и регенерация сированных ссылочных точек устанавливают и Способ удаления эпидермиса регистрируют положение клеток требуемого разПолоски эпидермиса получают вручную снямера и морфологии Позднее возможно повторное тием его эпидермальной стороны листьев (in vstro определение положения этих клеток полуавтомаматериал, а также материал из теплицы) с помотическим путем после повторного введения в комщью закругленного пинцета Операция может пьютер для новой калибровки положений ЭМ себыть осуществлена в пустой чашке Петри на куске ток ратмана или в жидкой среде (реально это не влияет на фазу деления, и выбор, в основном, ПРИМЕР 6 основан на умении специалиста, получать, возТип клеток листьев сахарной свеклы, участможно, длинные полоски из одного листа в предвующих в клеточном делении почтительном для него варианте) Ни угол удалеПриготовление протопластов ния эпидермия, ни число возможно оставшихся В продуктах расщепления листьев свеклы мезофильных клеток не влияют на культивироваидентифицированы две субпопуляции протоплание клеток или на способность замыкающих клестов, обладающие способностью делиться и обраток делиться зовать жизнеспособный каллус Однако эти клетки морфологически различны и только один тип клеСразу же после удаления полоски помещают ток тотипотентен в среду культивирования Не имеет значения, какая из сторон полоски контактирует со средой Каллус способного к регенерации типа отлиБолее важное значение имеет концентрация почается мягкостью, рыхлостью и водянистостью, лосок в культуре после стадии выделения поблагодаря чему его с легкостью можно отделить верхность жидкости должна быть покрыта полосСпособность к регенерации каллуса этого типа ками примерно на 95% В ходе культивирования меняется в зависимости от условий и генотипа, но полоски загибаются и скручиваются и, соответстне превышает 30% Протопласты, идентифициро 15 54369 16 венно, погружаются в среду, но на клеточное деБиотин 2 Фолевая кислота 1 ление это не влияет Холинхлорид 2 Полоски эпидермиса культивируют в чашках Пантотенат 2 Петри (диаметром 5 и 20см) и микролунках при Гидролизат казеина 500 выполнении вышеупомянутых условий Полоски культивируют при 28°С в темноте Сахароза 30 г/литр Деление наблюдается в нескольких средах Гормоны К8р, MS, PGo и BUL Однако наилучшей средой НУК 1 является PGo среда, в которой в более чем на БАП 0,2 95% образуется белый рассыпчатый каллус САЗ 0,2 Очень важен тот факт, что данная среда не соАгар 8 г/литр держит гормонов Содержащая гормоны (БАП, ПРИМЕР 8 НУК, 2,4-Д) среда культивирования не повышает Выделение эпидермиса, способ смешивания частоту деления Однако в случае присутствия в Удаление эпидермиса вручную очень утоминей 2,4-Д (в концентрации 0,2 - 2мг/л) наблюдаеттельно и требует больших затрат времени, в то ся образование в высокой концентрации каллуса время как технология смешивания (втом виде, как твердого типа Поскольку такой каллус не спосоее применяют в методике выделения протоплабен к регенерации и частично подавляет образоста) приводит к получению больших количеств вание белого рассыпчатого каллуса, лучше прималеньких полосок эпидермиса Но такое смешименять PGo среду, в которой твердый каллус не вание менее избирательно, в нем помимо замыпоявляется или появляется очень редко кающих клеток образуется также масса мелких осколков тканей листьев (в основном клеток, обИспытано более 30 различных генотипов саразующих каллус твердого типа) харной свеклы, каждых из которых хотя бы раз образовывал белый рассыпчатый каллус ОбразоХотя в PGo среде в нескольких случаях был вание белого рассыпчатого каллуса не зависит от обнаружен каллус белого типа, его появление метипа материала (in vitro материал, проростки, манее закономерно, чем в случае применения полотериал из теплицы), как не зависит от среды, на сок эпидермиса С другой стороны, BUL-среда, которой этот материал выращивают (MS, MS/1, видимо, более приемлема PGo + БАП), не влияющий на способность замыПри выделении протопласта смешение прокающих клеток делиться водят в присутствии Фиколла Чтобы избежать стадии образования бульона и для сокращения Полоски эпидермиса культивируют в темноте времени выделения, в ходе смешивания работают при 28°С в течение 4 - 5 недель Полученный бенепосредственно с средой культивирования (PGo лый рассыпчатый каллус переносят в PGo + БАП и BUL) Хотя BUL остается все же наилучшей сре(1мг/л) среду, и культивирование продолжают в дой, хорошие результаты получены и для PGo тех же условиях 3 - 4 недели Этот каллус затем среды субкультивируют в той же среде или в PGo + БАП (1мг/л) + НУК (0,2мг/мл) среде, или в MS среде с Полоски эпидермиса, полученные способом этими же двумя гормонами при 20 - 22°С с примесмешивания, культивируют по методике, привенением цикла свет-темнота в 16 - 8 ч Спустя дведенной в Примере 3 три недели, могут быть выделены первые регенеПРИМЕР 9 р а т ы Нами найдено, что наибольшее число реВыделение и культивирование протопластов генерантов образуется в двух следующих средах замыкающих клеток BUL среда Расщепление фрагментов эпидермиса, полуМакро мг/литр ченных способом Krens и др , Plant Physiology, 90,1382-1386 (1989), проводят примерно в сутки в KNO3 2500 растворе 2% целлюлозы и 3% мацерозима, расMgSO4 7H2O 250 творенных в Среде D Тем не менее, раз личные NaH2PO4 H2O 150 генотипы могут потребовать применения несколь(NH4)2SO4 134 ко отличных смесей ферментов После промываCaCI2 2H2O 150 ния и очистки, проведенных по методике Примера Микро мг/литр 2, получают популяции протопластов, в высшей KI 1,5 степени обогащенных замыкающими клетками MnSO4 H2O 20 Этими способами получают популяции, содержаНзВОз 6 щие вплоть до 80 - 90% протопластов замыкаюZnSO4 7H2O 4 щих клеток Протопласты затем вводят в альгинат Na2MoO4 2H2O 0,5 кальция по методике , подробно изложенной в CuSo4 0,05 Примере 5, и культивируют в 4мл Среды J в чашке CoCI2 6Н2О 0,05 Петри размером 6см, герметизированной Пара№2ЭДТУК 37,25 фильмом Культуры инкубируют в темноте при FeSO4 7H2O 27,85 28°С При таком культивировании эффективность Витамины нанесения замыкающих клеток составляет обычно Тиамин 2 25 - 50% Пиридоксин 6 Никотиновая кислота 4 ПРИМЕРЮ В12 0,03 Генетическая трансформация протопластов при участии ПЭГ Рибофлавин 1 Аскорбиновая кислота 25 В данном примере вводимая ДНК происходит 54369 18 17 ких концентрациях ПЭГ также образуются устойиз плазмиды pPG5 , содержащей ген-репортер рчивые трансформанты Тип ПЭГ, как найдено, глюкоуронидазы (GUS),a также в качестве подособо важной роли не играет Устойчивые трансдающегося отбору маркерного генаформанты обнаружены при всех испытанных конпоследовательность, определяющую устойчицентрациях ДНК, но в качестве оптимальной конвость к гербициду Биалафосу или фосфинотрицицентрации выбрана концентрация 50мкг/500000 ну, к которым сахарная свекла обычно чувствипротопластов Время инкубирования составляет тельна 10 - 40 минут Применялся способ, описанный в работе В нижеследующей Таблице 2 в виде примеров Krens и др , Nature, 296, 72-74 (1982), со следуюприведены некоторые полученные результаты щими подобранными параметрами Оптимальная концентрация ПЭГ равна 20%, но и при более низТаблица 2 Частота устойчивой трансформации Линия сахарной Нанесенные прото- Устойчивый к БиаЗремя, мин свеклы пласты (% ЗС) лафосу каллус NF 10 180,000(74) 22 20 180,000(71) 23 30 83,000(54) 28 SESI 20 220,000(80) 8 30 190,000(85) 1 40 210,000(76) 4 Во всех вышеприведенных случаях концентрация ПЭГ 13,3%, и ДНК (pPG5) применялась в количестве 50мкг После трансформации протопласты переносят в среду альгината, содержащую биалафос в концентрации 0,25мг/литр, и культивируют четыре недели В течение указанного времени каллусы трансформированных замыкающих клеток (ЗС) четко идентифицируются и могут быть перенесены в регенерационную среду ПРИМЕР 11 Генетическая трансформация ткани листьев В данном примере вводимая ДНК происходит из плазмиды pPG5, содержащей ген-репортер рглюкуронидазы (GUS), а также в качестве поддающегося отбору маркерного гена, последовательность, придающую устойчивость к гербициду Биалафосу или фосфинотрицину, к которым сахарная свекла обычно чувствительна Листья выращенных в стерильных условиях растений, принадлежащих к двум генотипам сахарной свеклы (обозначенных как ВОА113 и BUM2), нарезают и помещают абаксиальной поверхностью на среду Де Грифа и Якобса, затвердевшую с 0,6% агаром На каждую чашку Петри диаметром 9см берут тридцать листьев Частички золота (диаметром 1,6мкм) покрывают плазмидой, содержащей ген, кодирующий фосфинотрицин-ацетилтрансферазу, придающую устойчивость к гербициду фосфинотрицину (биалофос, BASTA), в качестве поддающегося отбору маркера, и одну копию гена, кодирующего рглюкуронидазу (gus) в качестве поддающегося обнаруживанию маркерного гена Покрытие на частички наносят способом осаждения хлорида кальция-тимидина и повторным суспендированием в 100%-ном этаноле Аликвоты по Юмкл наносят пипеткой на отдельные макроносители для генной пушки ДюПонт Биолистик PDS 1000/Не и оставляют сушиться над кристаллами силикагеля Частота трансф (общая) 1,2x10' 4 1,ЗхЮ 4 3,4хЮ 5 2,7хЮ б 5,ЗхЮ 5 1,9хЮ Частота трансф (ЗС) 4 1,7хЮ 4 1,8хЮ 4 6,1 х Ю 5 3,4хЮ 5 6,2хЮ 5 2,5хЮ Применяют следующие параметры бомбардировки промежуток между диском разрыва и макроносителем одна шестнадцатая дюйма (1,5мм), расстояние перемещения макроносителя 6мм, давление диска разрыва 100 - 1100 фунт /кв дюйм (7 - 77кг/см2), расстояние до мишени 5, 8 или 12см и частичный вакуум в камере-мишени 28 дюймов ртутного столба (711 мм Нд) После бомбардировки листья культивируют 2 дня при 23°С, после чего окрашивают 5-бром-4хлор-З-индолил-р-О-глюкуронидом (X-Gluc) с целью гистохимической локализации экспрессии gus гена После окрашивания листья обесцвечивают обработкой 20 минут при 65°С 95%-ным этанолом Клетки, показывающие экспрессию gus, названы "цветообразующими единицами" (CFU) Частота CFU замыкающих клеток относительно полного CFU эпидермиса для обоих генотипов находится в интервале 20 - 40% ПРИМЕР 12 Культивирование и регенерация каллуса Через 21 день кусочки содержащего альгинат микрокаллуса, видимого невооруженным глазом, переносят в чашки Петри диаметром 9см, содержащие 20мл Среды К Культивирование ведут в темноте в вышеприведенных условиях Рассыпчатый каллус водянистого типа после достижения размера примерно 1 - 2мм в диаметре отбирают по отдельности и культивируют группами по 20 штук на свежей Среде К На этом этапе как ПЦР анализ, так и гистохимический анализ GUS подтверждает присутствие трансформантов С интервалом в две недели все каллусы субкультивируют на свежей среде Регенераты появляются в течение первых 8 недель культивирования отдельных каллусов После того, как становятся видимыми первые побеги, и побеги достигают размера примерно 2мм, чашку переносят на свет (3000 люкс), 25°С, продолжительность дня 15 часов 54369 20 19 Росточки длиной 4мм переносят в отдельные приведенных условиях пробирки для культивирования, содержащие 15мл Когда хотя бы один из корней достигает длины Среды К, и продолжают субкультивировать на в 1см, растеньица извлекают из пробирок для свету в вышеприведенных условиях культивирования, промывают струей водопроводной воды с удалением любых фрагментов агара и ПРИМЕР 13 высаживают в почву горшочков размером 9см, Ускорение и пересадка в почву находящихся в теплице Когда растеньица достигают стадии в четыре листа (обычно спустя 5 - 6 недель, а для одной Для создания влажной среды растеньица на субкультуры спустя три недели), их переносят в семь дней покрывают прозрачной пластиковой пробирки для культивирования, содержащие 15мл чашкой, после чего они могут выращиваться без Среды L, и культивирование продолжают в вышедополнительной защиты Покровное стекло среда Заделанные в альгинаї Йольцо атрозы Золотая сетка Чашка Петри диаметром 6 ем Фіг. Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24