Собачий тімусний стромальний лімфопоетин та його застосування

1. Гібридний білок, який містить тімусний стромальний лімфопоетин (TSLP) або його антигенний фрагмент, де вказаний TSLP містить амінокислотну послідовність, яка на 90 % або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності; та де вказаний TSLP є крос-реактивним з антитілом, яке виробля 2 (19) 1 3 Перехресне посилання на подібні заявки Ця заявка є безумовною заявкою, пріоритет якої заявлено за 35 U.S.C. § 119(е) попередньої заявки США № 60/875,135, поданої 14 грудня 2006 року, вміст якої включено у даний документ як посилання. Галузь винаходу Даний винахід стосується собачого тімусного стромального лімфопоетину (собачий "TSLP"), молекул нуклеїнової кислоти, векторів та клітинхазяїнів, які кодують собачий TSLP, та способів одержання та застосування собачого TSLP. Передумови винаходу Тварини, включаючи людину, які страждають від реагін-опосередкованих розладів, таких як атопічні хвороби, мають спадкову тенденцію до розвитку миттєвих алергічних реакцій, які викликають вироблення lgЕ антитіл. Багаточисельні генетичні фактори впливають на експресію фенотипу таких тварин. Миттєва гіперчутливість, яку спостерігають при атопічних захворюваннях, з'являється внаслідок впливу специфічних алергенів, таких як домашні пилові кліщі (Dermatophagoides pteronyssinus), пилок, цвіль та подразнення. Не дивно, що індивідууми з атопічною хворобою частіше страждають від астми, атопічного дерматиту, та інших хвороб, пов'язаних з ендогенним вивільненням lgЕ. Атопічні хвороби, такі як алергічний дерматит тощо, також виникають у собак, включаючи домашніх собак. У таких собак хвороба починає проявлятись зазвичай між першим та третім роком життя. Внаслідок спадкової природи хвороби декілька порід, включаючи золотих ретриверів, більшість тер'єрів, ірландського сеттеру, Лхаса апсо, далматинців, бульдогів та старих англійських вівчарок, мають більшу тенденцію до атопії, хоча відомо, що інші породи собак, включаючи змішані породи, також страждають від цього стану. Частота зустрічальності щонайменше одного конкретного виду атопій, атопічного дерматиту, значно однаково збільшується як у людей, так і у собак. Атопічні собаки зазвичай труться, лижуть, жують, кусають або дряпають свої ноги, морду, вуха, ділянки під мишками та біля паху, що призводить до втрати шерсті, почервоніння та потовщення шкіри. У деяких випадках одночасна наявність декількох хвороб шкіри призводить до сверблячки, у той час як наявність тільки однієї алергії не призведе до такої сверблячки. Такі проблеми виникають внаслідок повітряних алергенів (пилку тощо), алергенів у їжі та алергенів з паразитів (блох тощо). Бактеріальна або грибкова інфекція також може призвести до появи сверблячки. Одним простим засобом для полегшення подразнювальних симптомів є уникнення провокуючих алергенів. Нажаль, таке уникнення зазвичай є неможливим. Раніше, ветеринари лікували атопічний дерматит у собак шляхом орального введення антигістамінів, орального або місцевого введення кортикостероїдних протизапалювальних агентів, інших пригнічувачів імунної системи, таких як циклоспорин або такролімус, додавання жирних кислот та алерген-специфічної імунотерапії (що потребує введення ідентифікованого антигену). Однак, жодне з цих лікувань не є ефективним в 95329 4 усіх випадках. Більш того, таке лікування є дорогим та/або призводить до появи побічних ефектів. Таким чином, протягом довгого часу існує потреба у безпечному, більш ефективному та більш економічному способі лікування або пригнічення симптомів атопічного дерматиту у собак. Імунна відповідь ссавців заснована на серії складних клітинних взаємодій, які називають "імунною сіткою". Більша частина імунної відповіді складається з взаємодії лімфоцитів, макрофагів, гранулоцитів та інших клітин з розчинними білками, які називають цитокінами, які відіграють значну роль у опосередкуванні/контролі/регулюванні цих клітинних взаємодій. Таким чином, цитокіни та імунні клітини є посередниками специфічних фізіологічних механізмів або шляхів, які ведуть до різноманітних запалювальних розладів. Імунне запалення є результатом каскаду складних імунних реакцій, які призводять до того, що Т-клітини нерегульовано продукують ТН2цитокіни, такі як IL-4, IL-5 та IL-13. Ці цитокіни, в свою чергу, провокують бронхіальну гіперактивність, вироблення lgЕ, еозінофілію та вироблення слизу (дивитись, наприклад, Busse and Lemanske, Jr. (2001) N. Engl. J. Med. 344:350-62; Holgate (2000) Br. Med. J. 320:231-234); and Renauld (2001) J. Clin. Pathol. 54:577-589). Тімусний стромальний лімфопоетин (TSLP) є IL-7-цитокіном, який спочатку ідентифікували у мишей як фактор, який підтримує: (і) in vitro розви+ ток поверхневих lgМ В клітин, та (іі) проліферацію В та Т клітин (Friend et al., 1994 Exp Hematology 22:321-328, see also, Levin et al., 1999, J. Immunol 162: 677 - 683). Зараз відомо, що TSLP приєднується до клітинного рецептора, який містить IL-7Rальфа субодиницю, та до унікальної рецепторної субодиниці, яку називають TSLP-R. Така взаємодія ініціює сигнальну трансдукцію завдяки активації STAT або експресії тімусних активаціюрегулюючих хемокінів (TARC) у гемопоетичних клітинах, таких як стовбурна мієлоїдна клітина, така як моноцит або дендритна клітина (дивить, наприклад, співвласник патенту США № 6,890,734, який наведено у даному документі за допомогою посилань). TSLP також може грати у мишей значну роль у патогенезі алергічних хвороб, таких як атопічний дерматит та астма. Наприклад, у трансгенних мишей, у яких спеціально викликали експресію гену TSLP на шкірі, показано наявність імунологічних та клінічних ознак атопічного дерматиту, таких як екземи, які містять запалювальні клітинні інфільт+ рати шкіри, суттєве збільшення Th2 CD4 T клітин, які експресують шкіряні «хомінг»-рецептори, підвищений рівень lgЕ у сироватці. Більш того, на легенях мишей, які експресують легеневоспецифічний трансген TSLP виявлено наявність імунологічних та клінічних ознак астми, включаючи масивну інфільтрацію лейкоцитів, гіперплазію бокаловидних клітин, субепітеліальний фіброз, збільшення цитокінів Т-хелпер типу 2 та збільшення рівня lgЕ. Сімс та ін.. отримали послідовність кДНК мишиного TSLP за допомогою клонування, проте їм не вдалось клонувати людський гомолог за допо 5 могою гібридизаційних зондів на основі мишиного TSLP (Sims et al. 2000, J exp Med, 192: 671 - 680). Після цього, людський гомолог визначили за допомогою ретельного аналізу EST. З'ясували, що нуклеотидна послідовність людського TSLP тільки на 43% гомологічна відповідній мишиній послідовності. Внаслідок цього, залишається потреба у забезпеченні новим та більш практичним лікування атопічних розладів у собак, включаючи атопічний дерматит та пов'язані з ним клінічні прояви. Більш того, потрібно визначити фактори, включені в імунологічний каскад, який призводить до атопічних розладів у собак, що допоможе розробити таке лікування. Цитування будь-яких посилань у даному документі слід розуміти як припущення, що такі посилання включені у попередній рівень техніки. Резюме винаходу Даний винахід стосується нового та більш практичного лікування атопічних розладів у собак, включаючи атопічний дерматит та пов'язані з ним клінічні прояви. Відповідно, даний винахід стосується нового ізольованого та/або рекомбінантного тімусного стромального лімфопоетину (TSLP), який входить до імунологічного каскаду, який призводить до появи атопічних розладів. Винахід також стосується антигенних фрагментів таких TSLP білків. У конкретному аспекті даного винаходу TSLP пердставлено собачим TSLP. Таким чином даний винахід стосується білку TSLP, який містить амінокислотну послідовність, яка на 80% або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності, де при введенні білку собакам у складі вакцини, у сироватці взятої з вакцинованих собак виявляють антитіла, які зв'язують TSLP собак, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. У відповідному варіанті здійснення білок TSLP містить амінокислотну послідовність, яка на 80% або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності; та кросс взаємодіє із антитілом, яке виробляється проти собачого TSLP, який містить амінокислоту SEQ ID NO: 2. Даний винахід стосується білку TSLP, який містить амінокислотну послідовність, яка на 80% або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2 (за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності), яка зв'язує епітоп-специфічне до собачого TSLP моноклональне антитіло. У більш конкретному варіанті здійснення білок TSLP містить амінокислотну послідовність, яка на 90% або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності. У іншому конкретному варіанті здійснення білок TSLP містить амінокислотну послідовність, яка на 95% або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності. 95329 6 У специфічному варіанті здійснення білок TSLP пердставлено собачим TSLP, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. У іншому варіанті здійснення білок TSLP пердставлено процесованим собачим TSLP, який містить амінокислотні залишки 29-155 SEQ ID NO: 2. Також даний винахід стосується антигенних фрагментів TSLP. Такі антигенні фрагменти включають такі, що містять один або кілька епітопів, які індивідуально відрізняються за амінокислотними послідовністями SEQ ID NOs: 8-101. У конкретному варіанті здійснення, антигенний фрагмент даного винаходу включає один або кілька епітопів, які містять амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 30, 31, 32 та/або 34. У іншому варіанті здійснення, антигенні фрагменти можуть включати амінокислотну послідовність, яка міститься у місці попкривання амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 30, 31, 32 та/або 34, тобто, NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS (SEQ ID NO: 118). У конкретному варіанті здійснення, антигенний фрагмент собачого TSLP зв'язує анти-людське TSLP моноклональне антитіло. Розмір антигенних фрагментів амінокислотної послідовності NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS (SEQ ID NO: 118) знаходиться у діапазоні від приблизно 5 до приблизно 21 амінокислотного залишку. Вакцини можуть включати ефективну кількість будь-якого білку TSLP даного винаходу, один або кілька їх антигенних фрагментів, або комбінації таких непроцесованих білків та один або кілька таких фрагментів. У одному варіанті здійснення білок TSLP представлено собачим білком TSLP, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. У конкретному варіанті здійснення, вакцина включає один або кілька антигенних фрагментів собачого TSLP, який містить від 5 до 22 сусідніх амінокислотних залишків 71-92 SEQ ID NO: 2 (зазначено у даному документі як SEQ ID NO: 118). Приклади таких антигенних фрагментів включають описані у даному документі епітопи, які містять амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 або SEQ ID NO: 34. Усі вакцини даного винаходу додатково містять фармацевтично прийнятний ад'ювант. Вакцину даного винаходу застосовують у способі викликання проти-собачих TSLP антитіл. Такий спосіб включає імунізацію ссавця ефективною кількістю вакцини. Цей спосіб необов'язково включає спосіб даун-регулювання активності TSLP у собак та/або спосіб лікування або запобігання виникнення симптомів алергії у атопічних собак, який включає імунізацію собак ефективною кількістю вакцини. Симптоми алергії включають дерматит, астму тощо. Вакцину даного винаходу вводять наступними шляхами: внутрішньом'язово, підшкірно, внутрішньовенно, інтрадермально, орально, інтраназально, скарифікацією та комбінуванням вказаних шляхів. Даний винахід також стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок TSLP даного винаходу або його антигенний фрагмент. У одному варіанті здійснення, молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. 7 У конкретному варіанті такого здійснення, молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1. Даний винахід також стосується фрагментів нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:1, які складаються приблизно з 18 сусідніх нуклеотидів, приблизно з 24 сусідніх нуклеотидів, приблизно з 36 сусідніх нуклеотидів, приблизно з 45 сусідніх нуклеотидів, приблизно з 66 сусідніх нуклеотидів, або більше. Даний винахід також стосується нуклеїнових кислот, які складаються з приблизно 18 нуклеотидів, приблизно 24 нуклеотидів, приблизно 36 нуклеотидів, приблизно 45 нуклеотидів, приблизно 66 нуклеотидів, або більше, включаючи нуклеїнові кислоти, які кодують непроцесовані TSLP білки, гібридизовані по SEQ ID NO:1 в жорстких умовах гібридизації. Усі молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу та їх фрагменти можуть додатково включати гетерогенну нуклеотидну послідовність. Даний винахід також стосується вектору експресії, який містить раніше вказані молекули нуклеїнової кислоти та/або її фрагменти. Окрім цього, даний винахід стосується клітин-хазяїнів, які містять вказані вектори експресії. Клітина-хазяїн предствлена необов'язково прокаріотичною або еукаріотичною клітиною-хазяїном. У одному варіанті здійснення, прокаріотичною клітиною-хазяїном є Escherichia coli. У конкретному варіанті такого здійснення, клітиною-хазяїном є Е. coli BL21(DE3)/pLysS, яка містить ген Т7 РНКполімерази, який контролюється ізопропіл--Dтіогалактопіранозид(ІРТG)-індукованим lacUV5 промотером. Даний винахід стосується рекомбінантних вірусних векторів та/або векторів депротеінізованої ДНК, які містять одну з вищевказаних молекул нуклеїнової кислоти, які кодують собачий TSLP, наприклад, SEQ ID NO: 1, та/або її фрагменти. Такі вектори застосoвують, наприклад, у вакцинах, придатних для введення собакам, хворим на атопічний дерматит. Даний винахід також стосується способу одержання білку TSLP даного винаходу. Такий спосіб включає культивування клітин-хазяїнів даного винаходу у придатному культуральному середовищі. Цей спосіб може додатково включати стадію ізолювання та/або очищення білку TSLP від культивованих клітин-хазяїнів або культурального середовища. Даний винахід також стосується отриманого ізольованого та/або очищеного білку TSLP. Даний винахід також стосується анти-TSLP антитіл, введених у гібридому за допомогою вакцини даного винаходу. У одному варіанті такого здійснення застосовують гібридому ссавців. У конкретному варіанті здійснення, ізолюють та/або очищають антитіла. Антитіла можуть бути як поліклональними, так і монолональними. Згідно з винаходом моноклональне антитіло, вилучене з не собачих видів, може бути необов'язково сконструйоване подібно до такого у собак, для того щоб бути мінімально антигенним при введенні собаці. У бажаних варіантах здійснення, домени зв'язування будь-якого антитіла згідно з винаходом необов'язково перетворюються на фрагменти зв'язування 95329 8 меншого розміру ніж справжнє антитіло, наприклад, шляхом розщеплення та/або як рекомбінантний Fv, Fab та F(ab')2 зв'язуючий білок. Даний винахід також стосується терапевтичних білків, отримані з антитіл, з унікальною структурою та функціональними властивостями подібними до природних антитіл з важким ланцюгом (наприклад, ® NANOBODIES ). Окрім цього, даний винахід також стосується замінників антитіл з високою афінністю для TSLP та низькою імуногенністю (наприклад, avimer-протеїни з зв'язувальних частин рецептора TSLP). Розроблені проти-собачі TSLP антитіла/avimers можна застосовувати у способі лікування симптомів алергії у атопічних собак шляхом введення ефективної кількості вказаних протисобачих TSLP антитіл. Даний винахід також стосується вакцини, яка містить ефективну кількість не-TSLP імуногену у комбінації з ефективною кількістю білку TSLP даного винаходу, один або кілька його антигенних фрагментів, або комбінації непроцесованого білка та один або кілька таких фрагментів. У конкретному варіанті здійснення, білок TSLP представлено собачим TSLP. У більш конкретному варіанті здійснення, собачий TSLP містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2. Даний винахід додатково стосується способів діагностики із застосування винайденого собачого TSLP, його фрагментів та/або антитіл викликаних собачим TSLP та їх фрагментів. У одному варіанті здійснення, даний винахід стосується способу діагностики атопічного дерматиту у собак, який включає одержання зразку шкіри собаки та визначення наявності собачого TSLP у вказаному зразку. Зазначені та інші аспекти даного винаходу можна краще зрозуміти шляхом посилання на наступні фігури та детальний опис. Детальний опис фігур На Фіг. 1 показано SDS-PAGE аналіз (електролітичний одномірний електрофорез) білка еукаріотичної безклітинної білоксинтезуючої системи, яка експресує собачий TSLP. Лінія 1: стандарт білку; Лінія 2: загальний білок; Лінія 3: розчинний білок; Лінія 4: нерозчинний білок. Галузі локалізації білка TSLP позначені стрілкою. Фіг. 2А показано аналіз білка вестерн-блоттінг з безклітинної білоксинтезуючої системи, яка експресує собачий TSLP. Білок реагував з Anti-His (C Term)/ АР Аb від Invitrogen. Лінія 1: стандарт білку; Лінія 2: загальний білок; Лінія 3: розчинний білок; Лінія 4: нерозчинний білок. Собачий TSLP визначали у загальному білку та нерозчинному білку (що позначено стрілками). На Фіг. 2В показано аналіз білка вестернблоттінг з безклітинної білоксинтезуючої системи, яка експресує собачий TSLP. Білок реагував з моноклональними антитілами пацюків специфічними до людського TSLP. Лінія 1: стандарт білку; Лінія 2: загальний білок; Лінія 3: розчинний білок; Лінія 4: нерозчинний білок. Собачий TSLP визначали у загальному білку та нерозчинному білку (що позначено стрілками). На Фіг. 3А показано експресію та очищення TSLP від клітин-хазяїнів Е. соlі, та полоса @ 61 кД наявна у розчинній фракції Е. соlі, що представляє 9 злиття між собачим TSLP та білком GST та мітки з 6 залишків гістидину. "М" означає стандарт білку (однаково на всіх Фіг. 3A-3D). На лінії 1 та лінії 2 представлено розчинні фракції Е. соlі B121(DE3)pLysS, які містять плазміду 1265-93В без або з індукцією IPTG, відповідно. Стрілочка вказує на ділянку гібридного білку GST-TSLP-His (однаково на всіх Фіг. 3А-3D). На Фіг. 3В показано, що мічений гібридний білок GST-TSLP-His можна очистити за допомогою смоли глутатіон-сефарози 4В. На лініях 1-3 представлено різні елюйовані фракції смоли глутатіонсефарози 4В. На Фіг. 3С показано, що гібридний білок лінії В можна додатковоочистити за допомогою смоли Ni-NTA. На цій фігурі показано переочищення гібридного білка GST-TSLP-His на смолі Ni-NTA після очистки на смолі глутатіон-сефароза 4В. Стовбчик 1 є потоком, лінія 2 є елюювання на смолі Ni-NTA. На Фіг. 3D показано вестерн-блоттінг гібридного білка GST-TSLP-His та підтверджено, що гібридний білок розпізнається анти-GST антитілом (GE Health Care Cat No. 27457701). На Фіг. 4 показано забарвлення флуресцинізоціанатом (ФІТЦ) зрізу зануреної у парафін пошкодженої тканини шкіри, отриманої з собаки # 10197, з діагнозом атопічний дерматит. Цей зріз обробляли анти-людськими кролячими TSLP поліклональними антитілами та реакцію забарвлювали стрептавідин-ФІТЦ. Інтенсивність флуоресценції (світлі ділянки) вказує на зв'язування кролячих TSLP поліклональних антитіл з TSLP наявним у тканині. На Фіг. 5А показано забарвлення імунопероксидазою зрізу пошкодженої тканини шкіри, зануреного у парафін, отриманого з собаки, з діагнозом атопічний дерматит. У цьому зрізі виявили розмите забарвлення (темні ділянки) поверхневого шару зразку шкіри кролячим анти-людським TSLP моноклональним антитілом. На Фіг. 5В показано контрольний зріз. Зріз робили з зануреної у парафін пошкодженої тканини шкіри, отриманої з собаки, з діагнозом атопічний дерматит, якій вводили тільки контрольний фосфатний буфер. На Фіг. 6 показано мапування епітопів собачого TSLP з кролячим анти-людським TSLP моноклональним антитілом. Потрібні піки з номером епітопів 22-26 (SEQ ID NOs 29-33). Епітопи 22-26 також дериватизували по N-кінцю (пік 55 та вище), для підтвердження, що зв'язаний епітоп не потребує N-термінального залишку. На Фіг. 7 показано порівняння собачого (SEQ ID NO: 32) та людського аналогу епітопу 25 (SEQ ID NO: 3) TSLP пептидної посліовності. На Фіг. 8А показано ДНК послідовність гену собачого TSLP (SEQ ID NO: 1). На Фіг. 8В показано прогнозований TSLP поліпептид, експресований ДНК послідовністю, яка показана на Фіг. 8А (SEQ ID NO: 2). Зірочкою помічені N-термінальний кінець початкової сигнальної послідовності (залишки 1-28), та підкреслені залишки 71-92 (SEQ ID NO: 118) складають домен, з якого визначали епітопи 22-26, що перетинаються, вказані на Таблиці 2. 95329 10 Детальний опис винаходу Атопічний дерматит ("АД") є Тh2опосередкованим алергічним запалювальним захворюванням. Ця хвороба проявляється багаточисельними подібними клінічними проявами у людини та собак. Схоже що імунопатогенез АД у собак є подібним до АД у людей відносно клітинного типу та цитокінів ураженої шкіри. Зв'язування TARC ліганду (CCL22) з СС хемокіновим рецептором 4 (CCR4), який селективно експресується Тh2 лімфоцитами, викликає селективну міграцію цих клітин до пошкоджених алергічних ділянок. Відомо, що TARC та їх рецептор CCR4 апрегулюються в уражених ділянках шкіри собак з АД. З огяду на те, що TSLP викликає вироблення TARC у людини, припустили, що TSLP також повинні бути присутніми в уражених ділянках собак з АД. Антитіла вироблені проти людського TSLP тестували на ураженій шкірі собак з АД. Імуногістохімічний аналіз цих зразків підтвердив наявність антигену реактивного до анти-людського TSLP антитіла у уражених ділянках, як показано на Фіг. 4. Однак, дуже складно ідентифікували собачий ортолог генів, які кодують мишиний та людський TSLP, внаслідок значної дивергенції нуклеїнової кислоти та амінокислотних послідовністей TSLP у ссавців, як описано у даному документі. Імунізація домашніх собак TSLP даного винаходу та/або його одним або кількома антигенними фрагментами, знижує ендогенну активність TSLP та тим самим, полегшує, убирає та/або запобігє одному або кільком атопічним симптомам, таким як ті, що з'являються при астмі та/або атопічному дерматиті, у вакцинованих собак. Окрім цього, собачий TSLP застосовують як імуноген для викликання анти-собачих TSLP антитіл для застосування як реагенту для досліджень та діагностики у домашніх собак або у інших видів ссавців. Як альтернатива, у певних обставинах, собачий TSLP та/або нуклеїнові кислоти, які кодують собачий TSLP, слугують для апрегулювання елементів імунної системи собак з послабленою імунною системою тобто, за допомогою активації STAT або експресії TARC, наприклад, у гематопоетичних клітинах. Для більш чіткого розуміння даного винаходу наведені наступні визначення. У даному описі застосовують термін™ у однині для зручності та це ніяким чином не спрямовано на обмеження. Тому, наприклад, посилання на композицію, яка містить "поліпептид" включає посилання на один або кілька таких поліпептидів. Таким чином у даному документі термін "приблизно" означає, що значення знаходиться в діапазоні 20 % від вказаного значення, наприклад, зазначення, що пептид, який містить "приблизно" 50 амінокислотних залишків, означає, що він містить від 40 до 60 амінокислотних залишків. Термін "зв'язувальна композиція" стосується молекул, які специфічно зв'язують собачий TSLP, наприклад, у антитіло-антиген взаємодії. Специфічність може бути більш або менш ємною, наприклад, специфічною до конкретного варіанту здійснення або групи пов'язаних варіантів здійснення, наприклад, собачого TSLP та/або собачих антитіл. 11 Використовуваний у даному документі термін "собачий" включає всіх домашніх собак, Cam's lupus familiaris або Canis familiaris, доки не вказано протилежне. Використовуваний у даному документі термін "поліпептид" є взаємозамінним з термінами "білок" та "пептид" та означає полімер, який містить дві або кілька амінокислот зв'язаних пептидними зв'язками. Термін "поліпептид" як зазначено у даному документі включає значний фрагмент або сегмент та містить ділянку амінокислотних залишків з щонайменше 8 амінокислот, зазвичай з щонайменше 12 амінокислот, зазвичай з щонайменше 16 амінокислот, бажано з щонайменше 20 амінокислот, та у найбільш бажаному варіанті здійснення з щонайменше 30 або більше амінокислот, наприклад, 35, 40, 45, 50 тощо. Такі фрагменти можуть містити кінці які починаються та/або закінчуються практично в усіх положеннях, наприклад, починаються з залишків 1, 2, 3, тощо, та закінчуються на, наприклад, 155, 154, 153, тощо, в усіх придатних комбінаціях. Необов'язково поліпептид може не містити певного амінокислотного залишку, який кодується геном або мРНК. Наприклад, ген або молекула мРНК може кодувати відщеплену послідовність амінокислотних залишків на N-кінці поліпептида (наприклад, сигнальна послідовність), та тому вона може не входити у склад кінцевого білку. Як зазначено у даному документі амінокислотна послідовність є 100% "гомологом" другої амінокислотної послідовності, якщо обидві амінокислотні послідовності є ідентичними, та/або відрізняються тільки проміжними або консервативними замісниками як зазначено нижче. Відповідно, амінокислотна послідовність є на приблизно 80% "гомологом" другої амінокислотної послідовності, якщо приблизно 80% другої амінокислотної послідовності є ідентичними, та/або відрізняються тільки проміжними або консервативними замісниками. Функціонально еквівалентні амінокислотні залишки часто заміняють на залишки послідовності, отриманої при заміщенні консервативної амінокислотної послідовністі. Такі зміни зазначають терміном "консервативне заміщення" як вказано у даному документі. Нарпиклад, один або кілька амінокислотних залишків всередині послідовності можуть бути заміщеними іншою амінокислотою з такою ж полярністю, яка діє як функціональний еквівалент, що призводить до мовчазної заміни. Замісники амінокислоти всередині послідовності вибирають з інших членів класу, до якого належить така амінокислота. Наприклад, неполярні (гідрофобні) амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан та метіонін. Амінокислотами, які містять ароматичні кільцеві структури, є фенілаланін, триптофан та тирозин. Полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін та глутамін. Позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають аргінін, лізин та гістидин. Негативно заряджені (кислотні) амінокислоти включають аспарагінову кислоту та глутамінову кислоту. Такі заміни не повинні впли 95329 12 нути на наявну молекулярну масу, визначену електрофорезом у поліакриламідному гелі, або ізоелектричну точку. Особливо бажаними консервативними замісниками є: Ліз для Apг та навпаки, таким чином зберігається позитивний заряд ; Глу для Асп та навпаки, таким чином зберігається негативний заряд; Сер для Тре, таким чином зберігається вільний -ОН; та Глн для Асн, таким чином зберігається вільний NH2. Амінокислоти також можна розділити на наступні подібні групи: (1) пролін, аланін, гліцин, серин та треонін; (2) глутамін, аспарагін, глутамінова кислота та аспарагінова кислота; (3) гістидин, лізин та аргінин; (4) цистеїн; (5) валін, лейцин, ізолейцин, метіонін; та (6) фенілаланін, тірозин та триптофан. У відповідному варіанті здійснення дві гомологічні послідовності ДНК ідентифікують за їх власною гомологією, або гомологією амінокислот, які вони кодують. Таке порівняння послідовностей здійснюють використовуючи стандартне програмне забезпечення, наявне у базі даних послідовностей. У конкретному варіанті здійснення дві високогомологічні послідовності ДНК кодують амінокислотні послідовності на 80% ідентичні, більш бажано на 90% ідентичні та ще більш бажано приблизно на 95% ідентичні. Більш конкретно, дві високогомологічні амінокислотні послідовності є ідентичними приблизно на 80%, більш бажано приблизно на 90% та ще більш бажано приблизно на 95%. Як зазначено у даному документі процент ідентичності білка та ДНК визначають за допомогою програмного забезпечення, такого як MacVector v9, наявного на ринку від Accelrys (Burlington, Massachusetts) та алгорітм Clustal W з вивірюванням параметрів за замовченням, та параметрами за замовченням для ідентичності. Дивитись, наприклад, Thompson, et al,. 1994. Nucleic acids Res. 22:4673-4680. Clustal W вільно завантажується для операційних систем Dos, Macintosh та Unix від, напирклад, EMBLI, Європейський інститут біоінформатики. Дане посилання наявне на сайті http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Вказані та інші доступні програми також застосовують для визначення подібності послідовностей при використанні зазначених параметрів. "Полінуклеотид" або "молекула нуклеїнової кислоти" є молекулою, яка містить нуклеотиди, які включають проте не обмежуються РНК, кДНК, геномними ДНК та навіть штучними ДНК послідовностями. Вказані терміни також включають молекули нуклеїнової кислоти, які включають будь-які відомі у галузі аналоги ДНК та РНК. Даний винахід стосується нуклеїнових кислот, гібридизованих у нуклеотидні послідовності, які кодують білки TSLP даного винаходу. Молекула нуклеїнової кислоти є "здатною до гібридизації" у іншу молекулу нуклеїнової кислоти, таку як кДНК, геномна ДНК або РНК, коли єдина зкручена форма молекули нуклеїнової кислоти перетворюється у іншу молекула нуклеїнової кислоти в певних температурних умовах та при іонній силі розчину [дивитись Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A 13 rd laboratory Manual, 3 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)]. Дуже жорсткі умови гібридизації відповідають найвищій Тm, наприклад, 50% формамід, 5Х або 6XSSC. Для гібридизації потрібно, щоб дві нуклеїнові кислоти містили комплементарні послідовності, хоча в залежності від жорсткості гібридизації, можлива невідповідність між основами. Потрібна жорсткість гібридизації нуклеїнових кислот залежить від довжини нуклеїнових кислот та рівня компліментарності, змінювальності відомих у галузі. Чим більший рівень подібності або гомології між двома нуклеотидними послідовностями, тим більше значення Тm для гібридів нуклеїнових кислот, які містять ці послідовності. Відносна стабільність гібридизації (що відповідає більшому Тm) нуклеїнової кислоти зменшується у наступному порядку: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Для гібридів, довжина яких складає більше ніж 100 нуклеотидів, рівняння для розрахування Тm є похідною інтенсивності [дивитись Sambrook and Russell, Molecular rd Cloning, A laboratory Manual, 3 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)]. Для гібридизації більш коротких нуклеїнових кислот, наприклад, олігонуклеотидів, кількість неспівпадінь є більш вагомим, та довжина олігонуклеотиду визначає його специфічність. Для гібридизації бажана довжина нуклеїнової кислоти становить щонайменше приблизно 12 нуклеотидів; більш бажано щонайменше приблизно 18 нуклеотидів; ще більш бажано довжина становить щонайменше приблизно 24 нуклеотиди; та самим бажаним варіантом є щонайменше приблизно 36 нуклеотидів. У певному варіанті здійснення, термін "стандартні умови гібридизації" стосується Тm яка дорівнює 55°С, та умов використання, зазначених вище. У іншому певному варіанті здійснення жорсткі умови означають що Тm дорівнює 65°С як для гібридизації, так і для умов промивання відповідно. ДНК "кодуюча послідовність" певний білок або пептид є ДНК послідовністю, яка транскрибується або переноситься у поліпептид in vitro або in vivo, коли її обробляють відповідними регуляторними елементами. Мікрооточення (амінокислотне) кодуючої послідовності визначають починаючи з кодону на 5'кінці та термінатору трансляції на 3'-кінці. Кодуюча послідовність включає проте не обмежується прокаріотичними послідовностями, кДНК з еукаріотичної мРНК, геномною ДНК послідовністю з еукаріотичної (напариклад, ссавців) ДНК та навіть штучними ДНК послідовностями. Термінатор транскрипції завжди знаходиться на 3' кінці кодуючої послідовності. Термін "дійсно зв'язані" стосується розташуваня елементів, де таким чином описані елементи, розташовані так, щоб виконувати свою звичайну функцію. Таким чином, контрольні елементі, дійсно зв'язані з кодуючою послідовністю, здійснюють експресію кодуючої послідовності. Потрібно щоб контрольні елементи були суміжними з кодуючою послідовністю протягом часу, коли вони спрямовують її експресію. Таким чином, наприклад, введення ще нетрансльованих транскрибованих пос 95329 14 лідовностей здійснюють між промотором та кодуючою послідовністю, та промотор все ще може бути "реально зв'язаним " з кодуючою послідовністю. "Гетерологічна нуклеотидна послідовність" як вказано у даному документі є нуклеотидною послідовністю, яку додають до нуклеотидної послідовності даного винаходу за допомогою рекомбінації з метою утворення нуклеїнової кислоти, якої не має в природі. Такі нуклеїнові кислоти кодують гібридні (тобто хімерні) білки. Таким чином гетерологічна нуклеотидна послідовність кодує пептиди та/або білки, які мають регуляторні та/або структурні властивості. У іншому варіанті здійснення гетерологічна нуклеотидна послідовність кодує білок або пептид, який функціонує як детектор білка або пептиду, який кодується нуклеотидною послідовністю даного винаходу, після експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти. У іншому варіанті здійснення гетерологічна нуклеотидна послідовність функціонує як детектор нуклеотидної послідовності даного винаходу. Гетерологічна нуклеотидна послідовність може містити некодуючі послідовності, включаючи сайти рестрикції, регуляторні сайти, промотори тощо. У даному документі терміни "гібридний білок" та "гібридний пептид" є взаємозамінними та означають «химерні білки та/або химерні пептиди». Гібридний білок містить щонайменше частину собачого TSLP даного винаходу, приєднаного пептидним зв'язком до щонайменше частини іншого білку, наприклад, не собачого TSLP, та/або містить комбінацію двох або кількох несуміжних частин собачого TSLP, наприклад, епітопів, які зазвичай не знаходяться один за іншим у собачому TSLP поліпептиді (наприклад, гібридний пептид з 10 амінокислотних залишків складається з амінокислотних залишків 71-75 та 101-105 SEQ ID NO: 2, зв'язаних пептидним зв'язком). У бажаних варіантах здійснення частина собачого TSLP є функціональною, наприклад, зберігає антигенність. Гібридні білки також можуть містить маркер або білок який допомогає у ізолюванні та/або очищенні (наприклад, FLAG tag, дивитись Приклади нижче) та/або антигенності собачого TSLP даного винаходу. Несобачі TSLP послідовності можуть бути аміно- або карбокси-термінальними до собачих TSLP послідовностей. Молекула рекомбінантної ДНК, яка кодує гібридний білок даного винаходу, наприклад, може містити послідовність, яка кодує щонайменше частину не собачого TSLP, приєднану як основу до послідовності, яка кодує собачий TSLP, та додатково кодує сайт розщеплення для спеціальної протеази, наприклад, тромбін або Фактор Ха, бажано біля або близько до місця з'єднання між послідовністю собачого TSLP та послідовністю не собачого TSLP. У певному варіанті здійснення, гібридні білки експресуються прокаріотичними клітинами. Такий гібридний білок застосовують для ізолювання собачого TSLP даного винаходу, за допомогою афінної колонки специфічної до білка та/або маркера, прищепленого до собачого TSLP (дивитись Приклади нижче). Очищений собачий TSLP, наприклад, потім очищають від гібридного 15 білка шляхом застосування протеолітичного ферменту та сайту розщеплення, на який посилались вище. "Вектор" або "вектор реплікації" є репліконом, таким як плазміда, вірус або косміда, до якого можно приєднати або включити інший сегмент ДНК з метою реплікації приєднаного сегменту. Термін також включає реплікон, який включає потрібний введений або приєднаний сегмент ДНК. Вектори, які використовують у даному винаході включають мікробні плазміди, віруси, бактеріофаги, інтегруємі фрагменти ДНК та інші засоби, які допомагають інтеграції нуклеїнових кислот у геном хазяїна. Як плазміду найчастіше викоритовують вектор, проте інші вектори, які функціонують подібно та, які відомі у галузі, також є придатними для застосування у даному винаході, [дивитись, наприклад, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 and Supplements, Elsevier, N.Y., and Rodriguez et al. (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA.]. Введення ДНК, яка кодує собачий TSLP винаходу, у вектор легко здійснити, коли кінці ДНК та вектору містять сайти рестрикції, що сполучаються. У разі, коли це неможливо, потрібно модифікувати кінець ДНК та/або вектору шляхом розщелення заднього виступу одно-ланцюгової ДНК за допомогою рестрикційної ендонуклеази з метою одержання сліпих кінців, або такий самий результат можна отримати шляхом обробки одноланцюгового кінця відповідною ДНК-полімеразою. Навпаки, потрібні сайти можна отримати, наприклад, шляхом лігування нуклеотидної послідовності (лінкери) до кінців. Такі лінкери можуть містити специфічні олігонуклеотидні послідовності, які розпізнають потрібні сайти рестрикції. Сайти рестрикції також можна отримати шляхом застосування полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Дивитись, наприклад, Saiki et al., Science 239:487 (1988). Розщеплений вектор та фрагменти ДНК також можна модифікувати, у разі потреби, шляхом гомополімерного нарощування. Рекомбінантні вектори експресії даного винаходу є звичайними самореплікуючимися ДНК або РНК, які містять нуклеїнові кислоти, які кодують собачий TSLP даного винаходу та/або його антигенний фрагмент, які зазвичай приєднані до придатних генетичних контрольних елементів, що регулюють експресію нуклеїнових кислот у сумісних клітинах-хазяїнах. Генетичні контрольні елементи включають прокаріотичну промотор систему або еукаріотичну систему контролю експресії промотору, та зазвичай включають промотор транскрипції, необов'язковий оператор для контролю за початком транскрипції, підсилювачі транскрипції для підвищення рівня експресії мРНК, послідовність, яка кодує потрібний сайт зв'язування з рибосомою та, послідовності, які зупиняють транскрипцію та трансляцію. Вектори експресії також містять ділянку реплікації, яка дозволяє реплікацію вектора незалежно від клітини-хазяїна. Експресію нуклеїнових кислот, які кодують собачий TSLP, здійснюють традиційними способами як у прокаріотичних, так і еукаріотичних клітинах. 95329 16 "Клітина-хазяїн" є клітиною, яка містить або може містити, та експресує екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, як короткочасно, так і постійно. Клітина є «трансформовано» екзогенною ДНК, коли таку екзогенну ДНК вводять у клітинну мембрану. Екзогенна ДНК може бути включеною або може бути не включеною (ковалентно зв'язаною) у хромосомну ДНК поповнюючи геном клітини. У прокаріот та грибів, наприклад, екзогенна ДНК знаходиться на епісомі, такої як плазміда. Що стосується еукаріотичних клітин, стабільно трансформованою клітиною є клітина, де екзогенна ДНК інтегрована у хромосому, успадковану дочірніми клітинами під час хромосомної реплікації. Така стабільність підтверджується можливістю еукаріотичної клітини дати початок лініям клітин або клонам, які складаються з популяції дочірніх клітин, які містять екзогенну ДНК. Прокаріоти включають як грам-негативні, так і грам-позитивні організми, наприклад, Е. соlі та В. subtilis. Еукаріоти включають адаптовані клітинні лінії культури тканин тваринних, які отримують не з ссавців, наприклад, комах та птахів, та ссавців, наприклад, людини, приматів та гризунів. Системи вектору прокаріотичного хазяїна включають велику кількість векторів різних видів. Вектори ампліфікації ДНК включають pBR322 або його багато чисельні похідні, або вектор експресії pET42b(+) (Novagen). Контрольні прокаріотичні послідовності експресії зазвичай включають промотори, включаючи ті, що отримані з систем -лактамаза-промотор та лактоза-промотор [Chang et al., Nature, 798:1056 (1977)], наприклад, pUC-серії, система триптофан (trp)- промотор [Goeddel et al., Nucleic acids Res. 8:4057 (1980)], наприклад, (pBR322-trp), система лямбда промотор PL [Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)], промотори лямбда-рР або pR (pOTS), арабінозо-індуковані промотери (InVitrogen), tac промотер [De Boer et al., Proc. Natl. АсАД. Sci. USA 292:128 (1983)], Ірр промотор (the pIN-series); або гібридні промотори, такі як ptac (pDR540). Інші багаточисельні вектори експресії, які містять такі контрольні послідовності, також відомі у галузі та є наявними у продажу. [Дивитись також, Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236.] Вектори експресії, загалом еквівалентні до векторів, придатних для Е.соlі, які застосовують для інших прокаріот, також застосовують для експресії білків TSLP даного винаходу. Гриби, також як і культури клітин тканин вищих еукаріот, також розглядають як хазяїни для рекомбінації собачого TSLP винаходу та/або антисобачих TSLP антитіл та/або фрагментів вказаних антитіл. Хоча можна використовувати будь-які клітинні лінії культури тканин вищих еукаріот, включаючи системи експресії бакуловірусу комах, проте бажано застосовувати клітини ссавців. Трансформація, або трансфекція, або відтворення таких клітин стало звичайною процедурою. Приклади придатних ліній клітин включають клітини 17 HeLa, лінії клітин яєчників китайських хом'яків (СНО), лінії клітин нирок маленьких пацюків (BRK), лінії клітин комах (наприклад, SF9), лінії клітин птиць (наприклад, DF-11), клітини нирок биків МАДіn-darby (MDBK), лінії клітин собачих нирок МАДіn-Darby (MDCK), клітини Vero, лінії клітин НЕК293 та лінії клітин мавпи (COS). Вектори експресії таких ліній клітин зазвичай включають, наприклад, сайт реплікації, промотор, сайт ініціювання трансляції, сайти сплайсингу РНК (при застосуванні геномної ДНК), сайт поліаденілування та термінатор транскрипції. Такі вектори зазвичай містять ген селекції або ампліфікації. Придатними векторами експресії є плазміди, промотори вірусів або ретровірусів, отримані, наприклад, з аденовірусу, SV40, парвовірусу або цитомегаловірусу. Прикладами придатних векторів ® експресії є pCR 3.1, pCDNA1, pCD [Okayama et а/., Моl. Cell Biol. 5:1136 (1985)], pMC1neo Poly-A [Thomas et al., Cell 51:503 (1987)], pUC19, pREP8, pSVSPORT та їх похідні, та вектори бакуловурусу, такі як рАС 373 або рАС 610. Експресований собачий TSLP винаходу очищають за стандартними у галузі способами, включаючи осадження сульфатом амонію, афінними колонками, колоночною хроматографією тощо (дивитись, R. Scopes, Protein Purification, SpringerVerlag, N.Y. (1982)). Для фармацевтичного застосування бажаними є по суті чисті композиції, які щонайменше приблизно на 90 - 95% гомогенні, та більш бажано на 98 - 99% гомогенні або більше. Очищення може бути частковим або гомогенним як описано. При терапевтичному застосуванні собачого TSLP, білок повинен бути по суті вільним від ендотоксину. Селективне очищення експерсованого TSLP на колонці для зв'язування антитіл проти TSLP, або на колонці для зв'язування рецептора TSLP, є наявними стратегіями для отримання високоочищеного собачого TSLP. Способи очищення є добре відомими у галузі. Наприклад, нуклеїнові кислоти очищають шляхом осадження, хроматографії, ультрацентрифугування та іншими засобами. Білки та поліпептиди, також як і пептиди, очищають багаточисельними способами, включаючи препаративний диск-гель електрофорез, ізоелектричне фокусування, HPLC, HPLC зворотної-фази, гельфільтрацію, іонообмінну та розділювальну хроматографію, екстракцію та розподілення в протитоці. Для деяких цілей бажано одержати поліпептид у рекомбінантній системі, у якій білок містить додаткову вільну послідовність, яка полегшує очищення, таку як, проте не обмежується, послідовністю полігістидину або послідовністю, яка специфічно приєднується до антитіла, такою як FLAG® та GST. Поліпептид очищають від неочищеного лізату клітини-хазяїну шляхом хроматографії на відповідному твердофазному матриксі. Навпаки, антитіла або їх фрагменти зв'язування, одержані замість поліпептида, використовують як реактиви для очищення. Розчиник та електроліти складають біологічно сумісний буфер, який зберігає біологічну активність, та зазвичай є фізіологічним водним розчинником. Зазвичай розчинник має нейтральну рН, значення якої знаходиться між приблизно 5 та 10, 95329 18 та бажано становить приблизно 7,5. У деяких випадках додають один або кілька детергентів, зазвичай м'який неденатеруючий детергент, наприклад, CHS (холестерин гемісукцинат) або CHAPS (3-[3 холамідопропіл)диметиламоній]-1-пропан сульфонат), або детергент у достатньо низькій концентрації, щоб уникнути значного руйнування структурних та фізіологічних властивостей білка. У інших випадках для досягнення значної денатурації використовують жорсткий детергент. Навпаки, функціонально гетерогенні білки Е. соlі або інших бактерій ізолюють з об'єктів для включення шляхом солюбілізації, використовуючи сильні денатуруючі агенти та наступне згортання. Відомі у галузі денатуруючі агенти включають тіоціанат калію, гуанадін НСІ ("GuHCI"), йодид калію та/або йодид натрію та їх комбінації. Бажано, GuHCI застосовують як відновлювальний агент, наприклад, у концентрації від приблизно 6 до приблизно 8M в лужних умовах, рН дорівнює приблизно 8. Необов'язково застосовують інший відновлювальний агент, дитіотреітол ("DTT"), як самостійно, так і у комбінації з GuHCI. Коли застосовують DTT, то концентрація змінюється в діапазоні від приблизно 50 мМ до приблизно 0,5 мМ DTT. Протягом стадії солюбілізації, яка є добре відомою у галузі, потрібна присутність відновлювального агента для розриву або денатурації дисульфідних зв'язків. Одним з таких буферів є: 0,1 М Tris рН 8,0, 6 М гуанідин, 2 мМ EDTA та 0,3 М DTE (дитіоеритритол). Ренатурація зазвичай завершується шляхом розведення (наприклад, в 100 разів) денатурованого та відновленого білка у буфері для рефолдінга, у присутності окислювача. Застосвують будьякі відомі у галузі окислювачі, які дозволяють здійснити відповідний рефолдінг з великим виходом. Наприклад, окислення та рефолдінг можна здійснити тіольними реагентами з маленькою молекулярною масою у відновленій та окисленій формах, як описано у Saxena, et аl., 1970, Biochemistry 9: 5015-5021, яке включено у даному документі як посилання, та особливо як описано Buchner, et аl.,вище. Ренатурацію зазвичай завершують шляхом розведення (наприклад в 100 разів) денатурованого та відновленого білка у буфері для рефолдингу. Одним таким буфером для рефолдингу є: Tris НСІ 100 мМ, рН 10,0, 25 мМ EDTA, NaCI 0,1 М, GSSG 551 мг/л, 0,5 М Аргінін. GSSG є окисленою формою глутатіону. Розмір та структура поліпептида повинні загалом знаходитись у стабільному стані, та зазвичай не бути денатурованими. Поліпептид може бути зв'язаний з іншими поліпептидами у четвертинній структурі, наприклад, для забезпечення розчинності, або може бути асоційованим з ліпідами або детергентами. Термін «по суті чистий», наприклад, у контексті білка, зазвичай означає, що білок не містить інших забруднюючих білків, нуклеїнових кислот або інших біологічних речовин з природного організму. Чистоту можна виміряти за допомогою стандартних способів, зазвичай по вазі, та чистота зазвичай дорівнює щонайменше приблизно 40%, зазвичай щонайменше приблизно 50%, часто що 19 найменше приблизно 60%, типово щонайменше приблизно 80%, бажано щонайменше приблизно 90%, та найбільш бажаному варіанті здійснення становить щонайменше приблизно 95%. Зазвичай додають основи або наповнювачі. Чистоту можна виміряти за допомогою хроматографії, гель електрофорезу, імунологічного аналізу, аналізу складу, біологічного аналізу та інших способів відомих у галузі. З функціонального аспекта ізольований собачий TSLP згідно з винаходом є достатньо відділеним від інших матеріалів, включаючи попередник собачого TSLP та/або процесований собачий TSLP, що таким чином дозволяє викликати імунну відповідь, специфічну до собачого TSLP. Розчинність поліпептида або фрагментів залежить від навколишнього середовища та поліпептида. На розчинність поліпептида впливає багато факторів, включаючи температуру, електролітичне середовище, розмір та молекулярні характеристики поліпептида, та природа розчинника. Зазвичай температура, при якій застосовують поліпептид, знаходиться в діапазоні від приблизно 4°С до приблизно 65°С. Зазвичай температура становить більше ніж приблизно 18° С. Для цілей діагностики температура зазвичай дорівнює кімнатній температурі або тепліша, проте менша ніж температура денатурації компонентів сироватки. Для терапевтичних цілей температура зазвичай дорівнює температурі тіла, зазвичай становить приблизно від 36 °С до 40°С (наприклад, приблизно 39°С для собак), хоча у певних умовах температуру можна підвищити або понизити in situ або in vitro. Як вказано у даному документі термін «антигенний фрагмент» по відношенню до конкретного білка є антигенним фрагментом цього білка (включаючи як відсутні великі фрагменти, так і маленькі фрагменти як одна амінокислота з непроцесованого білку), наприклад, який здатний до специфічної взаємодії з молекулою імунної системи, яка розпізнає антиген, такою як імуноглобулін (антитіло) або антигенний рецептор Т-клітин. Наприклад, антигенний фрагмент собачого TSLP даного винаходу є антигенним фрагментом собачого TSLP. Такі фрагменти повинні бути самі по собі імуногенними, наприклад, здатними викликати імунну відповідь без наявності носію, протягом часу, що їх використовують для вироблення антитіл проти TSLP, після кон'югації фрагмента та молекули носія для імунізації. Бажано, однак, щоб антигенний фрагмент даного винаходу був імунодомінантним для антитіла та/або рецептора розпізнавання Тклітини. У конкретному варіанті здійснення антигенний фрагмент собачого TSLP містить від 5 до 150 амінокислотних залишків. У конкретному варіанті здійснення антигенний фрагмент собачого TSLP містить більше ніж 120 амінокислотних залишків. У іншому варіанті здійснення антигенний фрагмент собачого TSLP містить від 10 до 120 амінокислотних залишків. У іншому варіанті здійснення антигенний фрагмент собачого TSLP містить від 20 до 100 амінокислотних залишків. У ще одному варіанті здійснення антигенний фрагмент собачого TSLP містить від 25 до 75 амінокислотних залишків. 95329 20 Антигенний фрагмент собачого TSLP отримують з рекомбінантного джерела, з білку, одержаного з природного джерела, або шляхом хімічного синтезу. Більш того, антигенний фрагмент одержують за допомогою протеолітичного розщеплення собачого TSLP, або його фрагментів, шляхом рекомбінантної експресії, або навпаки, його одержують de novo, наприклад, шляхом синтезу пептидів. Вакцини Даний винахід також стосується вакцин, які містять ефективну кількість TSLP даного винаходу, один або кілька його антигенних фрагментів, або комбінації непроцесованого білку та одного або кількох таких фрагментів. Наприклад, собачий TSLP та/або його фрагменти, такі як ті, що перелічені у таблиці 2, нижче, можуть бути включеними у будь-які білок- або пептид-сумісні композиції вакцини. Такі композиції вакцини є добре відомими у галузі та можуть необов'язково включати, наприклад, фізіологічно сумісні буфери тощо, також як і фармацевтично прийнятні ад'юванти, такі як ® ® CARBOPOL або Emulsigen . Композицію вакцини можна застосовувати для викликання ендогенних анти-TSLP антитіл у собак, які цього потребують, наприклад, з метою лікуваня клінічних ознак хвороби або розладу, який відповідає за даун-регуляцію активності TSLP у собак. Навпаки, або у зв'язку з цим, вакцину даного винаходу також застосовують для отримання антисироватки для скринінгу та/або ідентифікування собачого TSLP, наприклад, як допоміжного агенту у тестовому наборі для ідентифікування собак, які дуже сильно експресують TSLP. Пептиди TSLP, такі як вказані на Таблиці 2 нижче, та їх варіанти, можна застосовувати як імуногени, як по однині так і у різних комбінаціях. Такі пептиди можуть бути необов'язково зв'язаними одним з одним та/або більшими білками, відомими як носії, як за допомогою хімічних, так і рекомбінантних ДНК технологій. Носії потрібні для покращення розпізнавання пептиду тваринамихазяїнами, як мішені імунної відповіді, та збільшення імуногенності пептидів TSLP. У галузі відомо декілька носіїв, та вони містять правцевий анатоксин або нетоксичний С фрагмент правцевого анатоксину, дифтерійний анатоксин, PhoP білок, гемоціанін лімфи слимака (KLH), бетагалактозидазу, gD білок вірусу BHV-1, G білок вірусу сказу, F білок собачого вірусу чуми та синтетичні носії, такі як ті, що отримані шляхом полімеризації відомих "загальних" епітопів Т-клітин. Пептиди TSLP, придатні для застосування як імуногени, вибирають з пептидів, зазначених у Таблиці 2, та їх різновидів, шляхом використання відомих алгоритмів, які оцінюють такі ознаки як доступність поверхні нативного білка TSLP, гідрофільність, мобільність атомів та антигенність. Епітопи з переліку вказаних у Таблиці 2 та їх різновиди також вибирають на основі їх реактивності з поліклональними або моноклональними антитілами, які взаємодіють з нативним TSLP, та особливо з тими антитілами, які здатні нейтралізувати біоактивність TSLP. Такі антигени можуть включати синтетичні пептиди, одержані з послідовностей, 21 описаних у даному документі, з використанням стандартної технології синтезу пептидів та/або навпаки, можуть містити фрагменти, одержані з рекомбінантного або природнього TSLP. Фармацевтично прийнятні ад'юванти даного винаходу одержують з багатьох джерел, включаючи природні джерела, рекомбінантні джерела та/або можуть бути хімічно синтезованими тощо. Приклади хімічних сполук, які застосовують як ад'юванти включають, проте не обмежуються наступними: сполуки алюмінію, олії, що метаболізуються та, що не метаболізуються, блок-полімери, ISCOM's (імуностимулюючі комлекси), вітаміни та мінерали (включають, проте не обмежуються наступними: вітамін Е, вітамін А, селен та вітамін В12), та Quil А (сапоніни), повний ад'ювант Френда, полімери акрилової кислоти поперечно-зв'язані з етерами поліалкенілу або дивінілгліколем, які ® продаються під торговою маркою CARBOPOL ® (наприклад, CARBOPOL 941), та рівномірно дисперговані краплі олії розміром з мікрон у водній емульсії (наприклад, продаються під торговою ® маркою Emulsigen ). Додаткові приклади ад'ювантів, які іноді застосовують як специфічні імуностимулятори, включають компонти клітинної стінки бактерій та грибів (наприклад, ліпополісахариди, ліпопротеїни, глікопротеїни, мурамілпептиди, бета1,3/1,6-глюкани), різноманітні комплекси вуглеводнів, отриманих з рослин (наприклад, глюкани, ацеманнан), різноманітні білки та пептиди, отримані з тварин (наприклад, гормони, цитокіни, фактори спів-стимуляції), та нові нуклеїнові кислоти, отримані з вірусів та інших джерел (наприклад, дволанцюгова РНК, CpG). Окрім цього, будь-яка кількість комбінацій вищенаведених сполук може забезпечити вплив ад'юванту, та таким чином, може утворювати ад'ювант даного винаходу. Вакцини даного винаходу можна вводити будь-яким шляхом, включаючи: внутрішньомязово, підшкірно, внутрішньовенно, інтрадермально, орально, інтраназально та комбінацією вказаних шляхів. Антитіла Даний винахід також стосується поліклональних та моноклональних (mAb) антитіл, які специфічно зв'язують собачий TSLP винаходу. Як вказано у даному документі, термін "антитіло" стосується імуноглобуліну та/або його фрагментів. Природній імуноглобулін складається з одного або кількох поліпептидів, які загалом кодуються генами імуноглобуліну. Розпізнавальні гени імуноглобуліну включають kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon та mи гени константної ділянки, також як і незчислену кількість генів варіабельної ділянки імуноглобуліну. Антитіло або антитіла згідно з винаходом також включають фрагменти антитіла, наприклад, антиген-зв'язувальні фрагменти, наприклад, Fv, Fab та F(ab')2, сконструйовані одноланцюгові білки зв'язування, наприклад, Huston et al., Proc. Natl. АсАД. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) and Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), включені у даний документ як посилання), також як і біфункціональні гібридні антитіла (наприклад, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). Дивитись, загальним чином, Hood et al., 95329 22 Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986), які всі включені у даний документ як посилання. Сироватку, отриману з тварин, імунізованих собачим TSLP винаходу, за допомогою стандартних способів, можно застосовувати безпосередньо, або від сироватки відділяють фракцію IgG за допомогою стандартних способів, таких як плазмафорез або адсорбційна хроматографія з lgGспецифічними адсорбентами, таким як імобілізований Білок А або Білок G. Алтернативно, можна одержати моноклональні антитіла, та необов'язково, фрагменти зв'язування антигену або рекомбінантні білки зв'язування, отримані з таких mAbs. Такі MAbs або їх фрагменти необов'язково гуманізують, або перетворюють на собачі шляхом застосування відомих у галузі способів, або їх безпосередньою модифікацією, відповідно. Як вказано у даному документі, "епітопспецифічне" антитіло проти собачого TSLP є антитілом, яке виробляється проти фрагменту собачого TSLP, який містить епітоп, що містить один або кілька з наступних п'яти амінокислотних послідовностей: SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 та SEQ ID NO: 34; та додатково зв'язує білок з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2, та/або білок з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності. У конкретному варіанті здійснення, епітоп-специфічне антитіло проти TSLP є моноклональним антитілом. Гібридоми, які продукують mAbs, що селективно зв'язують собачий TSLP даного винаходу, одержують за відомими способами. Зазвичай спосіб включає злиття іморталізованої лінії клітин з Влімфоцитом, який виробляє потрібне антитіло. Альтернативно, для отримання іморталізованої лінії клітин, яка продукує антитіла, можна застосовувати способи, що не включають злиття, наприклад, трансформацію викликану вірусами [Casali et al., Science 234:476 (1986)]. Імортилізованими лініями клітин зазвичай є трансформовані клітини ссавців, зокрема клітини мієломи гризунів, биків та людей. Найбільш часто застосовують лінії клітин мієломи мишей та пацюків, завдяки зручності їх використання та доступності. Способи одержання лімфоцитів, які продукують антитіла, з тварин, яким вводили антигени, є добре відомими. Зазвичай застосовують лімфоцити периферійної крові (PBLs) у разі, коли беруть клітини людини, або клітини селезінки або лімфовузлів з джерел не людського походження. Тварині хазяїну вводять дози, що повторюються, очищеного антигену (людські клітини синтезують in vitro), та дозволяють тварині виробити потрібні антитіло продукуючі клітини, перед тим як їх зберуть для злиття з імморталізованою лінією клітин. Технології злиття також є відомий у галузі, та загалом включають змішування клітин з фактором, який викликає злиття клітин, таким як поліетиленгліколь. Гібридоми вибирають за стандартними способами, такими як ГАТ (гіпоксантин-аміноптерин 23 тимидин) відбір. Ті гібридоми, які виробляють потрібне антитіло, відбирають за допомогою стандартного імунологічного аналізу, такого як вестернблоттінг, ELISA (імуносорбентний аналіз), РІА (радіоімунологічний аналіз) або подібні. Антитіла відділяють від середовища за допомогою стандартних технологій очищення білка [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]. Існує багато посилань для створення керівництва щодо застосування вищенаведених технологій [Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]. Також моноклональні антитіла можна одержати шляхом застосування добре відомих бібліотек фагів [дивитись, наприклад, Huse, et al., Science 246:1275 (1989); Ward, et al., Nature, 341:544 (1989)]. Таким чином отримані антитіла, як поліклональні, так і моноклональні, застосовують, наприклад, в імобілізованій формі, яка приєднана до твердої основи за допомогою добре відомих способів, з метою очищення собачого TSLP шляхом імуноафінної хроматографії. Антитіла проти собачого TSLP, немічені або мічені стандартними способами, також можна застосовувати як основи для імунологічного аналізу з метою виявлення або підрахування кількості собачого TSLP. Застосування конкретної мітки залежить від виду імунологічного аналізу. Приклади застосовуваних міток включають, проте не обме32 125 3 жуються, радіомітками, такими як Р, І, Н та 14 С; флуоресцентними мітками, такими як флуоресцин та його похідні, родамін та його похідні, данзил та умбеліферон; хемілюмінесцентні агенти, такі як люциферин та 2,3-дигідрофталазиндіони; та ферменти, такі як пероксидаза хріну, лужна фосфатаза, лізоцим та глюкозо-6-фосфат дегідрогеназа. Антитіла мітять такими мітками за допомогою відомих способів. Наприклад, зв'язувальні агенти, такі як альдегіди, карбодііміди, дималеміди, імідати, сукциніміди, біс-діазотований бензидин тощо, використовують для мічення антитіл флуоресцентними, хемілюмінесцентними та ферментними мітками. Загальні способи, які застосовували, є добре відомими та описані у, наприклад, Immunoassay: A Practical Guide, 1987, Chan (Ed.), АсАДеmіс Press, Inc., Orlando, FL. Такий імунологічний аналіз можно проводити, наприклад, на фракціях, отриманих протягом очищення рецепторів. Антитіла даного винаходу також застосовують для ідентифікації певних кДНК клонів, які експресують собачий TSLP, у клонованих системах експресії. Нейтралізуючі антитіла, специфічні до сайту зв'язування ліганду рецептора, також застосовують як антагоністи (інгібітори) для блокування або даун-регулювання функції собачого TSLP. Такі нейтралізуючі антитіла легко ідентифікувати протягом звичайного дослідження. 95329 24 Антагонізм активності собачого TSLP досягають використовуючи повні антитіла або добре відомі фрагменти для зв'язування антигенів, такі як Fab, Fc, F(ab)2, та Fv фрагменти. Визначення таких фрагментів можна знайти у вищенаведених джерелах або, наприклад, у Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 4th Ed. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986). Застосування та вироблення фрагментів антитіл також описано, наприклад: Fab фрагменти у [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], Fv фрагменти у [Hochman et al., Biochemistry 12:1130 (1973); Sharon ef al., Biochemistry 15:1591 (1976); Ehrlich et al., U.S. Patent No. 4,355,023] та неповні антитіла у (Auditore-Hargreaves, U.S. Patent No. 4,470,925). Способи отримання рекомбінантних фрагментів Fv на основі послідовностей варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів описані, наприклад, Муром та ін. (Патент США № 4,642,334) та Plückthun [Bio/Technology 9:545 (1991)]. Альтернативно, їх можна синтезувати хімічно стандартними способами. Даний винахід також стосується антиідіотипових антитіл, як поліклональних, так і моноклональних, які отримують використовуючи вищеописані антитіла як антигени. Ці антитіла є корисними, з огляду на те, що вони імітують структуру лігандів. Антитіла вироблені ссавцями, що не є собаками, або несобачими гібридомними системами, можуть бути необов'язково сконструйовані для того, щоб вони були загалом неантигенними при введенні собакам, наприклад, їх можна зробити собачими. Спосіб модифікації моноклонального антитіла тварини для того, щоб зробити його менш імуногенним при терапевтичному введенні людині (гуманізація), активно розглядався та описаний у кількох публікаціях [наприклад, Antibody Engineering: A practical Guide. Carl A.K. Borrebaeck ed. W.H. Freeman and Company, 1992; Reichman, L. ef al., "Reshaping human antibodies for therapy", Nature 332: 323-327 (1988)]. Альтернативно, моноклональні антитіла ссавців, що не є собаками, наприклад, моноклональні антитіла мишей, гібридизують з собачими антитілами або їх послідовностями з метою отримання антитіл, які розпізнаються реципієнтом-хазяїном як менш імуногенні, ніж звичайні мишинні моноклональні антитіла. Дивитись, наприклад, патент США № 5,593,861, "Собача-мишинна гетерогібридома та фрагмент гену, який кодує константну ділянку собачих імуноглобулінів", який наведено у даному документі як посилання. Окрім цього, Вассерман та Капра [Віоспет. 16: 3160 (1977)] визначили амінокислотну послідовність варіабельних регіонів важких ланцюгів як собачого ІgМ, так і собачого ІgА. Ці винахідники також визначили амінокислотну послідовність карра легкого ланцюгу собачого IgA [Wasserman and Capra, Immunochem. 15: 303 (1978)]. Маккамбер та Капра [Моl. Immunol. J6: 565 (1979)] описали повні амінокислотні послідовності собачого ти ланцюгу. Танг та ін. [Vet. Immunology 25 Immunopathology 80: 259 (2001)], описали один ланцюг gamma к ДНК собачого IgG-A та чотири gamma ланцюги послідовності собачого IgG-A. Танг та ін., про яких йшла мова вище, також описали ПЛР-ампліфікацію кДНК-бібліотеки собачої селезінки з виродженим олігонуклеотидним праймером, який складається з консервативних ділянок IgG людини, мишей, свинів та биків. Більш того, Кра та ін.. [Публікація США №20040181039, опублікована 16 вересня, 2004, наведена у даному документі як посилання] детально описали спосіб перетворення не собачих антитіл на собачі. Виділення гену собачого TSLP А. Перші спроби Перші спроби ідентифікувати собачий TSLP були основані на послідовності вивірювань клонованих кДНК послідовностей TSLP людини та мишей з кДНК послідовностями TSLP пацюків, шимпанзе та резус, які зібрали з BLAT (загальної бази даних генів Каліфорнійського Університету, СантаКруз). На рівні амінокислот TSLP шимпанзе є на 100% ідентичним до людського TSLP, у той час як резус TSLP є на понад 90% гомологічним до людського TSLP (12/151 різних залишків) на рівні процесованого білку. Однак, TSLP та кДНК послідовності людини та нелюдських приматів сильно відрізняються від послідовностей TSLP мишей. кДНК послідовності людського та мишиного TSLP співпадають лише на 43%, що робить неможливим клонування шляхом міжвидової гібридизації в умовах пониженої жорсткості між цими видами. Більш 95329 26 того, послідовність TSLP пацюків відрізняється на рівні послідовності залишків амінокислот процесованого білка як 39/121 від мишиного TSLP, що вказує на те, що навіть у близькоспоріднених мишиних видів послідовності TSLP значно відрізняються. Несподівано, як описано у даному документі, послідовність собачого TSLP відрізняється від усіх мишиних послідовностей та подібних послідовностей приматів. Таким чином, одержання собачого TSLP шляхом міжвидової гібридизації в умовах пониженої жорсткості виявилось невдалим. Насправді, праймери, розроблені для спроби клонувати ортолог собачого TSLP за допомогою ПЛР стратегій, які застосовують до людських, мишиних послідовностей, послідовностей пацюків та мавп, не змогли ідентифікувати навіть простий зв'язок який відповідає собачому TSLP. В. Вдале виділення гену собачого TSLP Дослідження пізніше доступної бази даних собачих генів (отриманих за допомогою секвенування методом "постріла з рушниці" (шотган); опублікованої Каліфорнійським Університетом, СантаКруз) щодо послідовності людського TSLP призвело до часткової ідентифікації екзону 1 та 4 собачого TSLP. Коротко кажучи, завдяки цьому пошуку ідентифікували декілька попадань значної послідовності гомології (дивитись "попадання" 1-6, нижче). Їх послідовності збирали та використовували як вимоги для продовження та збору часткової електронної послідовності гену собачого TSLP. 27 Порівняння цих електронних послідовностей людини, мавпи, пацюка та миші показало ідентичність границь нітрон/екзон та суттєвої послідовності, що призвело до ідентифікації цієї послідовності як частини ортологу собачого TSLP. Пізніше на основі цієї теорії розробили ПЛР праймери та використали їх для ампліфікації відсутніх сегментів гену. За допомогою "подвійної вкладеної ПЛР" з кДНК-бібліотеки активованих мононуклеарних клітин периферійної крові собак (РВМС) отримали два клони, що частково перетиняються. Додаткові спроби розкрити повну кДНК собачого TSLP шля 95329 28 хом вкладеної ПЛР, або спроби продовжити послідовності у напрямку 5' або 3' кінців виявились невдалими. Однак, ітераційні цикли дослідження бази даних за допомогою подовженої інформації послідовності цих клонів щодо даних повної собачої геномної шотган-послідовності (наведено Каліфорнійським Університетом, СантаКруз) у комбінації з ручною зборкою неочищеної ДНК послідовності з цієї бібліотеки призвело до електронної зборки кДНК непроцессованого собачого TSLP. Реальний клон цієї кДНК послідовності потім синтезували використовуюси синтезатор ДНК in vitro. 29 Наприкінці, застосування технологій молекулярного клонування сучасного рівня техніки не дозволяє отримувати послідовність собачого TSLP безпосередньо з послідовностей людини, миші, пацюка або мавпи. Тільки модернізоване ітераційне дослідження бази даних при використанні зібраних генів TSLP людини, миші, пацюка та NHP разом із застосуванням інтрон/екзон граничного розподілення та ідентичність послідовності у базі 95329 30 даних генів, у комбінації з технологіями молекулярного ПЛР клонування, призведе до ідентифікації гену, який кодує собачий TSLP. Отриманий собачий TSLP має відмінність 58/132 у порівнянні з амінокислотною послідовністю процесованого TSLP людини (61% ідентичності) та відмінність 83/129 у порівнянні із амінокислотною послідовністю процесованого TSLP миші (33% ідентичності) (дивитись нижче). 31 Таким чином, шляхом подолання раніше зазначених труднощів даний винахід забезпечує отримання ДНК послідовностей, які кодують собачий TSLP, та собачого TSLP. Сбочий TSLP та його певні послідовності є придатними антигенами, наприклад, імуногенами, для викликання антитіл проти різноманітних епітопів білку, як проти лінійних, так і проти конформаційних епітопів. ДНК, яка кодує собачий TSLP, є придатною для отримання векторів та клітин-хазяїнів для виготовлення TSLP для імунізації та/або як реагент для дослідження, також і для одержання вакцини на основі ДНК, для викликання антитіл протиTSLP, або для застосування у формі "голої" ДНК або плазміди або вектору тваринного вірусу, придатної для експресії TSLP у клітинах вакцинованої тварини. Таким чином отримана послідовність гену собачого TSLP показана на Фіг. 8А (SEQ ID NO: 1), та прогнозована експресія TSLP показана на Фіг. 8В (SEQ ID NO: 2). Залишки 1-28 означають сигнальну послідовність, та залишки 29 - 155 означають процесований білок. Ідентифікація гомологічних білків TSLP Даний винахід також стосується білків TSLP, які містять амінокислотну послідовність, яка на 80% або більше є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 2, за виключенням 28 амінокислотного залишку сигнальної послідовності, які при введенні собаці у складі вакцини викликають вироблення антитіл, які зв'язують собачий TSLP, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. Також винахід стосується антигенних фрагментів таких TSLP. Насправді, одним з способів показати, що запропонований TSLP є білком TSLP даного винаходу, є проаналізувати чи такий білок викликає вироблення антитіл, які зв'язують собачий TSLP, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. Одним з таких способів є вакцинування (наприклад, ін'єкція) собак різними дозами в діапазоні від 5 до 500 мкг запропонованого антигену TSLPGST. Такі антигени можна застосовувати у формі ад'юванту на основі гідроксиду алюмінію, такого як Rehydrogel. Собак вакцинують внутрішньом'язово тричі: на 0, 21 та 42 дні. Зразки сироватки відби 95329 32 рають у вакцинованих та контрольних (не імунізованих) собак на 0, 21, 42 та 63 дні. Вироблення антитіл у собак, вакцинованих антигенами, вимірюють за допомогою аналізу ELISA наступним чином: собачий TSLP, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, розводять до 5 мкг/мл у буфері для нанесення (Бікарбонат натрію рН 9,0) та розподіляють по 100 мкл/лунку 96 лункового планшету (Pierce). Планшети інкубують при 4°С протягом ночі. Надалі планшети тричі промивають фосфатним сольовим буфером, який містить 0,05% Tween-20 (PBST). Після цього, 200 мкл блокуючого буферу (2% знежирене молоко у PBST) додають у кожну лунку та планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 60 хвилин. Після цього планшети тричи промивають PBST. Наступним кроком, антисироватку тестованих собак, розведену 1:100, додають по 100 мкл/лунку у відповідні лунки. Після цього зразки сироватки розводять в 10 разів до відповідного місця у планшеті. Після інкубації планшет при кімнатній температурі протягом 60 хвилин, планшети тричі промивали PBST. Наступним кроком, 100 мкл/лунку розведеного 1:20,000 козячого проти-собачого IgG (Bethyl Laboratories), кон'югованого пероксидазою хріна, додають до кожної лунки. Після цього планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 60 хвилин. Наступним кроком планшети тричі промивають PBST, та після цього у всі лунки додають субстрат ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) у кількості 100 мкл/лунку. Забарвлення утворюється протягои 1020 хвилин при кімнатній температурі, та реакцію зупиняють шляхом додавання 0,18 М сірчаної кислоти у кількості 50 мкл/лунку. Оптичну густину (О.Г.) всіх лунок вимірювали при довжині волни 450 нм використовуючи ELISA планшет-рідер (Thermo Max; Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Зразки сироватки, взяті з собак, вакцинованих запропонованими антигенами TSLP, розглядали як з виявленим забарвленням, та таким чином, антигени ідентифікували як білки TSLP даного винаходу, коли оптична густина зразків дорівнювала або була в тричі більшою, ніж почат 33 кова, виявлена у зразках, взятих з собак до імунізації. Подібно, відносні титри антитіл для антигенів TSLP визначали на основі найбільшого розведення сироватки, значення О.Г. якої дорівнює або у тричі більше ніж початкове, виявлене у зразках, взятих з собак до імунізації. Антитіла специфічні до антигенів TSLP Антитіла виробляються у відповідь на різні епітопи собачих TSLP, включаючи видові, поліморфні та алельні варіанти, та їх фрагменти, як у їх природній формі, так і у рекомбінантній формі. Антитіла вробляються проти собачого TSLP, як у його активній, так і у неактивній формі, включаючи нативну та денатуровану версії. Вважають, що також виробляються антиідіотипові антитіла. Антитіла, включаючи фрагменти зв'язування та одноланцюгові версії, проти попередньо визначених фрагментів антигенів викликають шляхом імунізації тварин собачим TSLP та/або його фрагментами, разом із прийнятими у галузі ад'ювантами та/або кон'югованими імуногенними білками. Таким чином імунізовані тварини є собаками, яких імунізували з метою даун-регуляції активності собачого TSLP. Прийнятним хазяїном є, наприклад, інбредний штам мишей, таких як Balb/c, імунізований вибраним білком, з використанням стандартного ад'юванту, та за стандартною методикою імунізації мишей (дивитись Harlow and Lane, ld вище). Ад'ювант вводять тварині до, у комбінації із або після введення вакцини. Альтернативно, синтетичний петид, отриманий з послідовностей, описаних у даному документі та кон'югований з білковою основою, застосовують як імуноген. Поліклональну сироватку збирали та титрували проти імуногенного білку протягом імунологічного аналізу, наприклад, твердо фазний імунологічний аналіз, імобілізований на твердій підложці. Вибирали поліклональну антисироватку 4 з титром 1 х 10 або більше, та досліджували на крос-реактивність проти інших членів родини IL-7, наприклад, IL-7 гризунів, використовуючи конкурентно-зв'язуючий імунологічний аналіз, такий як описаний у Harlow and Lane, ld вище, на сторінках 570-573. Бажано, коли у цьому вимірюванні використовують IL-7 щонайменше одного іншого члену родини, наприклад, IL-7 приматів. Члени родини IL-7 отримують як рекомбінантні білки та ізолюють, використовуючи стандартні технології молекулярної біології та білкової хімії, як описано у даному документі. Імунологічні аналізи у форматі конкурентного зв'язування використовують для визначення кросреактивності. Наприклад, білок SEQ ID NO: 2 можна імобілізувати на тверду підложку. Білки додані до проби звершують зв'язування антисироватки з імобілізованим антигеном. Здатність вищенаведених білків завершити зв'язування антисироватки з імобілізованим білком порівнюють із білком, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. Кросреактивність вищенаведених білків розраховують за допомогою стандартних способів. Ті проби сироватки, кросреактивність яких становила менше 10% з кожним з вищеперелічених білків, збирали та об'єднували. Після цього з об'єднаної 95329 34 антисироватки виділяли кросреактивні антитіла шляхом імунологічної абсорбції вищенаведеними білками. Імунологічно абсорбовану та об'єднану антисироватку після цього використовували у імунологічному аналізі конкурентного зв'язування, як описано вище, для порівняння другого білку з імунологічним білком (наприклад, 1L-7 подібний білок SEQ ID NO: 2). З метою здійснення такого порівняння кожен з двох білків досліджували у великому діапазоні концентрацій та визначали кількість кожного білка, потрібну для інгібування зв'язування антисироватки з імобілізованим білком на 50%. У випадку, коли потрібна кількість другого білку становить менше ніж дві кількості вибраного білку або потрібного білку, тоді вважали, що другий білок специфічно зв'язує антитіло, викликане у відповідь на імуноген. Антитіла даного винаходу є придатними для діагностики. Як антитіла, що захоплюють або не нейтралізують, їх можна сортувати на здатність зв'язувати антигени, при цьому вони не інгібують зв'язування з рецептором. Як нейтралізуючі антитіла, вони є придатними для використання у аналізі конкуретного зв'язування. Вони також є придатними для визначення або підрахування кількості собачого TSLP або його рецепторів, [дивитись, наприклад, Chan (ed. 1987) Immunology: A Practical Guide, АсАДеmіс Press, Orlando, Fla.; Price and Newman (eds. 1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; and Ngo (ed. 1988) Nonisotopic Immunoassay. Plenum Press, N.Y.] Крос-абсорбція, інактивація комплементу або інші засоби забезпечують одержання визначеної селективності, наприклад, унікальна або загальновидова специфічність. Вказані способи є основою для ідентифікації різних груп антигенів. Окрім цього, антитіла, включаючи фрагменти зв'язування антигену, даного винаходу можуть бути потенційними антагоністами, які зв'язують антиген та інгібують функціональне зв'язування, наприклад, з рецептором, що викликає біологічну відповідь. Додатково ці антитіла можна поєднати з лікарськими засобами або іншими терапевтичними агентами, як безпосередньо, так і опосередковано за допомогою лінкеру, що приведе до ефекту "терапії мішеней". Синтетичний пептид, який складається з послідовностей, описаних у даному документі, та приєднаний до білкового носію, використовують як імуноген. У будь-якому випадку фрагменти антигену можуть бути приєднаними до інших матеріалів, зокрема поліпептидів, з огляду на те, що злиті або ковалентнопоєднані поліпептиди використовують як імуногени. Антиген або його фрагменти можуть бути злитими або ковалентно зв'язаними з різними імуногенами, такими як гемоціанін лімфи слимака, альбумін бичачої сироватки, правцевий токсоїд тощо. Дивитись Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistrv, vol. 1, АсАДеmіс Press, New York; та Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, 35 NY, описання способів одержання поліклональної антисироватки. У деяких випадках, бажано одержувати моноклональні антитіла з різних видів ссавців хазяїнів, таких як миші, гризуни, примати тощо. Описання технологій одержання таких моноклональних антитіл наведено, наприклад, Stites, etal. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., та посилання вказані у тому документі; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.), АсАДеmіс Press, New York; та зокрема у Kohler and Milstein (1975) in Nature 256:495-497, де досліджують спосіб вироблення моноклональних антитіл. Інші придатні технології включають in vitro вплив лімфоцитів на антигенні поліпептиди, або, альтернативно, вибір фага або подібних векторів для утворення бібліотек антитіл. [Дивитись, Huse, et аl. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; та Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546.1 Поліпептиди та антитіла даного винаходу використовують як у немодифікованій формі, так і у модифікованій, включаючи гібридні, подібні до собачих та/або гуманізовані антитіла. Часто, поліпептиди та антитіла даного винаходу мітять шляхом приєднання субстрату, який забезпечує отримання сигналу. Таке приєднання може бути як ковалентним, так і не ковалентним. Існує велика кільксть міток та технологій приєднання, вони описані у науковій та патентній літературі. Придатні мітки ключають радіонуклеїди, ферменти, субстрати, кофактори, інгібітори, флуоресцентні залишки, гемілюмінесцентні залишки, магнітні частинки тощо. Патенти, в яких описано застосування таких міток, включають патенти США № 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 та 4,366,241. Також, отримують рекомбінантні або гібридні імуноглобуліни, дивитись Cabilly, патент США № 4,816,567; Moore, et al., U.S. Pat. No. 4,642,334; and Queen, et al. (1989) Proc. Nat'l АсАД. Sci. USA 86:10029-10033; або трансгенних мишей, дивитись Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156. Ці документи включені у даний опис як посилання. Антитіла даного винаходу також застосовують для афінної хроматографії для виділення білка. Готують колонки, де білок приєднаний до твердої основи (дивитись, наприклад, Wilchek et al. (1984) Meth. Enzymol. 104:3-55). Альтернативно, антигени, приєднані до твердої основи, використовують для очищення відповідних антитіл. Антитіла, вироблені проти кожного собачого TSLP, також застосовують для викликання антиідіотипічних антитіл. Це є зручним для виявлення або діагностики різних імунологічних станів, пов'язаних з експресією відповідних антигенів. Інгібування РНК Інтерференція РНК, яка кодує собачий TSLP, у клітинах, які експресують собачий TSLP, є додатковим засобом інгібування біологічної активності TSLP та, в результаті, лікування TSLP 95329 36 асоційованих розладів, таких як атопічний дерматит. Для цієї мети молекули дволанцюгової РНК, як хімічно синтезовані, так і клоновані всередині відповідних векторів доставки, таких як плазміди або вірусні вектори, включають у клітини, які активно продукують мРНК TSLP, з метою зменшення ендогенного рівня мРНК, яка кодує TSLP. Після введення цих молекул РНК (у випадку екзогенної доставки молекул або транскрипції РНК, після введення плазміди або вірусних векторів у потрібні клітини) їх розщеплюють за допомогою рибонуклеази III на короткі нуклеотидні фрагменти, які називають siPHK (коротка інтерферуюча РНК). Після цього ці siPHK фрагменти включають у мультибілковий комплекс, який містить нуклеазу, який називається RISC (РНК-залежний комплекс репресії), який активується в результаті розгортання дволанцюгових фрагментів siPHK, внаслідок впливу РНК хелікази. Таким чином отримані одноланцюгові siPHK спрямовують комплекс RISC до його мішені мРНК, яка після цього розщеплюється та деградує внаслідок ендонуклеарної активності RISC. Зокрема, плазміди, які містять ген TSLP або його фрагмент, клонують у будь-якій з наявних у продажу еукаріотичних плазмід, де транскрипція гену TSLP або його фрагменту здійснюється відповідним промотором, наприклад, промотором CMV або SV40. Очищену плазмідну ДНК (1-100 мкг) після цього вводять у пошкоджені ділянки шкіри або у ділянки навколо пошкоджень, якими характеризується атопічний дерматит. Введення плазмідної ДНК після цього повторюють з частотою, потрібною для викликання відповідного зменшення мРНК TSLP. Таке зменшення визначають шляхом біопсій шкіри з уражених ділянок та визначають рівень мРНК за допомогою методів, таких як кількісна ПЛР. Наступні приклади здійснення даного винаходу спрямовані на оцінку винаходу, проте ніяким чином не обмежують обсяг прав винаходу. Приклади Приклад 1 ДНК та білкові послідовності собачого TSLP Ген собаки, який експресує собачий TSLP ідентифікували ітераційним шляхом, використовуючи данні, взяті з електронної бази даних та за допомогою методів молекулярної біології, як детально описано вище. Результати Послідовність гену собачого TSLP показана на Фіг. 8А (SEQ ID NO: 1), та прогнозований білок, який експресує TSLP, показано на Фіг. 8В (SEQ ID NO: 2). Залишки 1-28 на Фіг. 8В (SEQ ID NO: 2), позначені зірочкою, означають сигнальну послідовність, та залишки 29-155 означають процесований білок. Приклад 2 Клонування та експресія собачого TSLP ДНК, яка кодує собачий TSLP, ідентифікували як описано у даному документі, та клонували в векторі pDONR221 (Invitrogen Gateway System) за стандартними способами. Дослідження генів та клонування в вектор здійснювали у програмі досліджень ДНК 2.0., та це призвело до конструюван 37 ня плазміди, яку називають pDONR221.G03276, яка містить ідентифікований ген собачого TSLP. ДНК, яка кодує процесований (тобто без сигнальної послідовності) собачий TSLP, ПЛРампліфікували з pDONR221.G03276, за допомогою двох праймерів, які містять сайти Nco І та EcoR V, відповідно: Праймери #1: 5' AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACGTGAC-3' (SEQ ID NO: 4); та #2: 5'AAAATAGATATCTGAAATGCGACTGAAACGACG-3' (SEQ ID NO: 5). Після розщеплення Nco І та EcoR V, ПЛР продукти вводили у сайти Nco І та Sma І вектору pIVEX 1.3 WG (Roche Applied Sciences, Cat# 3728803). В результаті отримали плазміду, яка містить ген, який кодує процесований собачий TSLP, зв'язаний з шістьмома залишками гістидину на С-термінальному кінці ("Ніs6-кінець"). Плазміду, яка містить правильні послідовності з вставок, назвали плазміда 1265-93.D. Плазміду 1265-93.D застосовували для експресії TSLP у RTS Proteomaster Instrument відповідно до методики одержання (Roche Applied Sciences, Cat# 3064859). Як показано на Фіг. 1, ділянку @16 кДа спостерігали на лініях 2 та 4 (стрілки). Дослідження вестерн-блотінг (Фіг. 2А та 2В) показали, що ця ділянка специфічно взаємодіє із анти-His кінцем антитіла (Фіг. 2А), та моноклональне антитіло пацюка є специфічним до людського TSLP (Фіг. 2В). Приклад 3 Одержання собачого TSLP з клітин-хазяїн і в З метою експресії рекомбінантного TSLP у Е. соlі, нуклеотидну послідовність, яка кодує cTSLP (тобто, TSLP, який не містить нуклеотиди, які кодують сигнальну послідовність) ампліфікували шляхом ПЛР, використовуючи плазміду 1265-66С як матрицю, разом із прямим праймером та зворотнім праймером, які містять сайти Ncol та Hind III, відповідно: Прямий праймер 5'AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACGTGAC-3' (SEQ ID NO: 6) Зворотній праймер 5'ACATAAAAGCTTTGAAATGCGACTGAAACGACG-3' (SEQ ID NO: 7) Після розщеплення Nco І та Hind III, продукти ПЛР вводили у сайти Ncol/Hindlll вектору експресії pET42b(+) (Novagen). В результаті отримали плазміду, яка кодує процесований cTSLP, зв'язаний з GST-лігандом на N-кінці та 6xHis лігандом на Скінці. Плазміду, яка містила правильні послідовності з введених назвали 1265-93В. Експресію гібридного білку GST-TSLP-His здійснювали у E. соlі BL21(DE3)/pLysS, яка містила ген РНК-полімерази Т7 під контролем ізопропіл--Dтіогалактопіранозид (ІРТС)-індуцибельного lacUV5 промотера. Клітини Е. соlі, які містили плазміду 1265-93В, вирощували при 30° С до оптичної густини 600 0,6 та після цього викликали експресію білка шляхом додавання 0,5 мМ IPTG та подаль 95329 38 шою інкубацією при 30°С протягом 2 годин. SDSPAGE описує галузь локалізації білка (стрілочка) правильного розміру (~ 61 кДа), наявного у розчинній фракції Е. соlі (Фіг. 3А). Вестерн-блотінг показує, що експресований білок взаємодіє із анти-GST антитілом (Фіг. 3D). Білок GST-TSLP-His очищають за допомогою смоли глутатіонсефароза 4В (Фіг. 3В). Після додаткової очистки смолою Ni-NTA, переважна частина білка GSTTSLP містилась у проточній колонці (Фіг. 3С). Приклад 4 Виявлення собачого TSLP за допомогою імунофлуоресценції Експресію собачого TSLP у шкірі собаки та тканині мигдалин вимірювали за допомогою імуногістохімії ("ІГХ"), використовуючи поліклональні антитіла кроля проти людського TSLP. Імуногістохімію здійснювали на частинах тканини, оброблених парафіном, взятих як зі шкіри нормальних собак, яким вводили сольовий розчин, так і зі шкіри собак, хворих різними хворобами, включаючи атопічний дерматит, шкіряну червону вовчанку, ексудативну багатоформну ерітему та вроджений бульозний епідермоз. Окрім цього, експресію TSLP вимірювали у замороженій тканині мігдалин, взятої з двох собак. Методика вимірювання експресії TSLP за допомогою ІГХ є наступною: І. Підготовка ділянок: 1. Зразки шкіри залиті воском, порізали на зрізи товщиною 5-7 мікрон та помістили на слайди, оброблені полі-L-Лизином, з метою стимулювання адгезії. 2. Зрізи тканин відділяли від парафину ксиленом та перегідратовували рядом розчинів етанолу. 3. Відновлення антигену здійснювали у цитратному буфері [10 мМ цитрат натрію, який містить Tween-20 у концентрації 0,5 мл/л протягом 25 хв., використовуючи лабораторний мікрохвильовий пристрій для досягнення температури приблизно 99-100 °С]. Цей процес спрямовано на відновлення антигенності ділянок шкіри, маскованих протягом їх занурення у парафін. 4. II. Імунозабарвлення: 1. Зрізи інкубували у 10% нормальній сироватці віслюка, розведеній у фосфатному буфері (PBS), протягом 1 години при кімнатній температурі з метою зменшення неспецифічного зв'язування антитіла. 2. Надлишки сироватки видаляли, та зріз, покривали кролячим антитілом (1:100), розведеним у PBS, та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години або протягом ночі при 4°С у камері вологості. 3. Після цього зрізи двічі промивали у PBS протягом 5 хвилин, обережно перемішуючи. 4. Надлишок PBS обережно видаляли та зрізи покривали біотинільованим віслючим антикролячим IgG, розведеним 1:5000 у PBS, протягом 30 хвилин при кімнатній температурі у камері вологості. 5. Після цього зрізи двічі промивали у PBS протягом 5 хвилин, обережно перемішуючи. 6. Надлишок PBS обережно видаляли, та зрізи інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі у кон'югаті стрептавідин-флуоресцин ізо 39 95329 40 тіоціанат (стрептавідин-FITC) у PBS при концентрації 5 мкг/мл. 7. Після цього зрізи двічі промивали у PBS протягом 5 хвилин, обережно перемішуючи. 8. Після цього зрізи контрастно забарвлювали гематоксиліном протягом 2-3 хв. 9. Після цього зрізи досліджували за допомогою флуоресцентного мікроскопу. 10. Придатні картинки фотографували. 11. Експериментальні контролі не містили первинних анти-TSLP антитіл, або замінювали первинне анти-TSLP антитіло нормальними кролячими антитілами. Таблиця 1, нижче, підсумовує результати ІГХ експериментів. Експресію TSLP виявляли на 80% тканин шкіри з собак, яким поставили діагноз АД, тільки у 20% нормальних тканин шкіри оброблених сольовим розчином. Також TSLP виявляли у 66% та 100% тканин собак з ексудивною багатоформною ерітемою та собак з генетичними хворобами шкіри, вродженим бульозним епідермозом; відповідно. Не виявили експресію TSLP у тканинах шкіри собак, хворих на шкіряний червоний вовчак. У занурених у парафін тканинах шкіри експресію TSLP виявляли у потових залозах. Експресію TSLP у заморожених собачих тканинах залоз виявляли у шаровому сквамозному епітелії та прилежних слинних залозах. Приклад позитивного ІГХ забарвлення у зразках шкіри собак показано на Фіг. 4, на якій зображені зразки шкіри, занурені у парафін, отримані з собак, яким поставили діагноз атопічний дерматит. Приклад 6 Виявлення собачого TSLP імунопероксидазою Експресію собачого TSLP у зразках шкіри, занурених у парафін, які отримали з шкіри собак, яким поставили діагноз атопічний дерматит, також вимірювали за допомогою імуногістохімічного аналізу з використанням забарвлення імунопероксидазою як способу виявлення. У цьому способі епітоп-специфічне пацюкове моноклональне антитіло, яке вироблялось проти людського TSLP, використовували як первинне антитіло. Процедуру визначення експресії TSLP шляхом забарвлення імунопероксидазою здійснювали наступним чином: Спеціальні реагенти Нормальна сироватка новонароджених телят: #N-4762 Sigma Парафін-занурені тканини шкіри Первинне антитіло: пацюковий анти-людський TSLP mAb пацюковий lgG2a Вторинне антитіло: кролячий анти-пацюковий IgG (біотинільований): ВА-4000 Vector Lab. Burlingame, CA. Реагент для виявлення: стрептавидин-HRP: #43-8323 Zymed Labs. San Francisco, CA AEC substrate Kit: Biogenex#HK129-5K San Ramon, CA 1. зразок 4-6 мкм. 2. висушування протягом 10 хв. при кімнатній температурі 3. фіксація протягом 10 хв. у ацетоні 4. промивання у PBS (0,01 фосфатний сольовий буфер) протягом 3 хв. 5. блокування шляхом інкубації у 0,3 % пероксиді водню з 0,1% азидом натрію протягом 7-10 хв. 6. промивання протягом 5 хв. PBS. 7. блокування зразку 1% нормальною сироваткою новонароджених телят протягом 20 хв. у камері для зволоження. 8. Висушування препарату та нанесення первинного антитіла, розведеного 1:100, протягом 2 годин при кімнатній температурі. 9. промивання протягом 5 хв. 10. нанесення вторинного антитіла (кролячий анти-пацюковий IgG @1:400) протягом 30 хв. у камері для зволоження при кімнатній температурі. 11. промивання протягом 5 хв. 12. Висушування та нанесення реагенту для виявлення (стрептавідин-HRP @1:400) протягом 30 хв. при кімнатній температурі. 13. промивання протягом 2X5 хв. 14. нанесення АЕС протягом 2,5 хв. Регулювання відповідно до бажаної інтенсивності забарвлення та фону. 15. контрастне забарвлення гематоксиліном та монтування препарату. Набір тканин шкіри собак, взятий з собак хворих на АД , тестували шляхом ІГХ аналізу, використовуючи специфічне до собачого TSLP антитіло. Результати, зазначені на Фіг. 5, показали, що таке антитіло взаємодіє з молекулою, яка розділяє антигенні епітопи з людським TSLP. Забарвлення шматочків собачої шкіри з АД виявилось насиченим у ділянках хронічного запалення, де епідерміс був потовщений. Цей малюнок співпадає з даними, щодо розташування експресії TSLP у зрізах шкіри людини з АД та додатково підтверджує, що 41 молекула, виявлена у зрізах такнин шкіри собак з АД, є собачим TSLP. He було виявлено забарвлення ані при PBS, ані при різних пацюкових моноклональних антитілах, специфічних до різних білків (лімфоцит-асоційованих білків). Приклад 7 Мапування епітопів собачого TSLP З метою ідентифікації епітопів собачого TSLP, придатних для включення у вакцину, здатну нейтралізувати активність TSLP, синтезували набір пептидів, що перетинаються, на основі послідовності собачого TSLP, та тестували їх на здатність взаємодіяти з нейтралізуючим анти-людським TSLP моноклональним антитілом. Для цієї мети набір пептидів, що перетинаються, довжиною 15 амінокислот кожен та виступ з двох амінокислот синтезували під номерами у MIMOTOPES 95329 42 (Minneapolis, MN). Послідовності цих пептидів перелічені на таблиці 2. Пептиди 1-57 синтезували з амідованим кінцем у конфігурації NН2-ПЕТИД-РІМ. Пептиди 58-94 (копії материнських пептидів 1-37) виробили з ацетильованим кінцем у конфігурації АЦЕТИЛ-ПЕПТИД-PIN. Номери пептидів перелічені на таблиці 2 тестували у дослідженні ELISA згідно з рекомендованими методиками (Mimotopes, Minneapolis, MN). Як показано на Фіг. 6, пептид # 25 (епітоп 25) з амінокислотною послідовністю NH2-ARIERLTLHRIRGCA (SEQ ID NO: 32) мав найвищу реактивність проти РАВ100 моноклонального антитіла. Порівняння цієї пептидної послідовності з відповідною уявною пептидною послідовністю людського TSLP показано на Фіг. 7. 43 Даний винахід не обмежується певними варіантами здійснення, описаними у даному документі. Насправді, різні модифікації винаходу, на додаток до тих, що описані у даному документі, будуть очевидними для фахівців з вищенаведеного опису. Такі модифікації не виходять за рамки заявленого у формулі винаходу об'єму прав. 95329 44 Також потрібно розуміти, що всі розміри основ або амінокислот, та значення молекулярної ваги або маси, наведені для нуклеїнових кислот або поліпептидів, є приблизними, та наведені для опису. У даному документі наведені багаточисельні публікації, суть яких включена у даний документ як посилання. 45 95329 46 47 95329 48 49 95329 50 51 95329 52 53 95329 54 55 95329 56 57 95329 58 59 95329 60