Антитіла проти склеростину

1. Антитіло, яке специфічно зв'язує людський склеростин і містить шість гіперваріабельних ділянок з амінокислотними послідовностями, вибраними з групи, яку складають: і) HCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 20, HCDR2 з послідовністю SEQIDNO:21, HCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 22, LCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 23, LCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 24 та LCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 25, та ii) HCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 26, HCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 27, HCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 28, LCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 29, LCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: ЗО та LCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 31. 2. Антитіло за п. 1, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, де і) варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14, і варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 17, або іі) варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 15, і варіа 2 (19) 1 3 96474 4 11. Застосування антитіла за будь-яким із пп. 1-4 для виготовлення лікарського засобу для лікування у людини захворювання або розладу, вибраного з групи, яку складають остеопороз, остеопенія, остеоартрит, біль, пов'язаний з остеоартритом, ревматоїдний артрит, пародонтит та множинна мієлома. 12. Застосування антитіла за будь-яким із пп. 1-4 для виготовлення лікарського засобу для лікування остеопорозу. Цей винахід належить до галузі медицини, зокрема, до галузі антитіл, спрямованих проти склеростину. Конкретніше, цей винахід стосується антитіл з високою спорідненістю, які специфічно зв'язують людський білок - склеростин, та терапевтичного застосування згаданих антитіл для лікування різних розладів та станів у людей, сприятливим для яких є підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці або міцності кістки. Остеопороз являє собою захворювання, при якому мінеральна густина кісток (МГК) зменшується, мікроструктура кісток руйнується, й виникає високий ступінь ризику перелому кісток, уражених остеопорозом. Остеопороз залишається головною причиною тривалої непрацездатності та смертності, зокрема, серед осіб похилого віку. Незважаючи на існування ефективних методів лікування остеопорозу, таких як зміна способу життя та фармакотерапія, наявні на цей час способи лікарського впливу є обмеженими за кількістю та ефективністю і часто пов'язуються з небажаною побічною дією та не є універсально прийнятними для пацієнтів. Ряд протирезорбційних засобів, у тому числі кальцитонін, біфосфонати, засоби замісної терапії естрогенами та вибіркові модулятори естрогенного рецептора (SERM) запобігають подальшому розрідженню кісткової тканини, але вони не відновлюють кісткову тканину після її розрідження. Анаболічний засіб, який підвищує масу кістки та мінеральну густину кістки й відновлює структуру кістки, є доступним у формі людського РТH(1-34) (паратиреоїдний гормон). Однак цей терапевтичний засіб потребує щоденного підшкірного введення, часто впродовж року або більше, в результаті чого пацієнти майже не дотримуються режиму та схеми лікування. Склеростин, продукт гена SOST, інтенсивно експресується остеоцитами кісткової тканини. Оскільки склеростин відіграє роль сильнодіючого негативного регулятора утворення кісткової тканини, він являє собою бажану мішень для терапевтичного втручання при розладах та станах, сприятливим для яких було б підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці та міцності кістки, наприклад, при остеопорозі. Таким чином, антитіла проти склеростину можуть виявитись корисними як варіант анаболічного підходу при лікуванні таких розладів або станів. Публікація WO 2006/119107 розкриває амінокислотні послідовності конкретних гуманізованих антитіл проти склеростину, у яких усі гіперваріабельні ділянки (CDR) є повністю мишачими, тобто не зміненими, порів няно з гіперваріабельними ділянками антитіла, яке було утворено у організмі миші. Існує потреба у альтернативному антитілі проти склеростину, яке зв'язує людський склеростин із сильною зв'язувальною спорідненістю і має низьке значення ІС50 при кількісному визначенні біологічної активності склеростину. Таке антитіло, як прогнозують, буде більш терапевтично ефективним, зокрема, при остеопорозі, і потребуватиме менш частого введення, ніж РТH(1-34) або антитіло проти склеростину з меншою зв'язувальною спорідненістю (тобто вищим значенням KD) або вищим значенням IС50. Існує також потреба у антитілі, специфічному до людського склеростину, зі зменшенням ризику виникнення імунної реакції на згадане антитіло у людини, якій було введено згадане антитіло, або зменшенням ризику нестабільності з одночасним збереженням властивостей антитіла, а саме високої зв'язувальної спорідненості до людського склеростину та низького значення ІС50 при кількісному визначенні біологічної активності. Антитіла проти склеростину за цим винаходом задовольняють цим потребам і надають пов'язані із цим переваги. Антитіла за цим винаходом є химерними або гуманізованими моноклональними антитілами, містять специфічну поліпептидну послідовність, розкриту у цьому описі, специфічно зв'язують людський склеростин із високою зв'язувальною спорідненістю і можуть застосовуватись для підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці та міцності кістки у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людини. За одним із варіантів здійснення щонайменше одна гіперваріабельна ділянка антитіла за цим винаходом відрізняється за амінокислотною послідовністю від гіперваріабельної ділянки у цьому положенні, наявної у вихідного антитіла, тобто утвореного у організмі гризуна (наприклад, миші) антитіла, з якого одержали варіантну форму антитіла, тобто гуманізоване або химерне антитіло за цим винаходом. За варіантом, якому віддається перевага, результатом такої(-их) амінокислотної(их) заміни(замін) у послідовності гіперваріабельної ділянки антитіла за цим винаходом є більша зв'язувальна спорідненість (тобто нижче значення ΚD) до людського склеростину, нижче значення ІС50 при кількісному визначенні біологічної активності склеростину або і те, і друге, порівняно з відповідними характеристиками вихідного антитіла. Результатом амінокислотної заміни у послідовності гіперваріабельної ділянки антитіла за цим винаходом, порівняно з амінокислотою, наявною у послідовності гіперваріабельної ділянки вихідного анти 5 тіла, може бути зменшена інтенсивність імунної реакції на згадане антитіло у людини, якій було введено згадане антитіло. Крім того, результатом амінокислотної заміни у послідовності гіперваріабельної ділянки антитіла за цим винаходом, порівняно з амінокислотою, наявною у послідовності гіперваріабельної ділянки вихідного антитіла, може бути зменшення ризику нестабільності антитіла, наприклад, результатом заміни залишку аспарагіну іншою амінокислотою може бути зменшення ризику деамідування. За одним із варіантів здійснення антитіло за цим винаходом специфічно зв'язує людський склеростин і має шість гіперваріабельних ділянок з амінокислотними послідовностями, вибраними з групи, яку складають (і) HCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 20, HCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 21, HCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 22, LCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 23, LCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 24 та LCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 25; (ii) HCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 26, HCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 27, HCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 28, LCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 29, LCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 30 та LCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 31; та (ііі) HCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 32, HCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 33, HCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 34, LCDR1 з послідовністю SEQ ID NO: 35, LCDR2 з послідовністю SEQ ID NO: 36 та LCDR3 з послідовністю SEQ ID NO: 37. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом специфічно зв'язує людський склеростин і містить поліпептид варіабельної ділянки важкого ланцюга ("HCVR") та поліпептид варіабельної ділянки легкого ланцюга ("LCVR"), де (і) HCVR має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14, і LCVR має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 17; (іі) HCVR має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 15, та LCVR має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 18; або (ііі) HCVR має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16, та LCVR має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом специфічно зв'язує людський склеростин і містить поліпептид важкого ланцюга та поліпептид легкого ланцюга, де (і) поліпептид важкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, та поліпептид легкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 5; (іі) поліпептид важкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3, та поліпептид легкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6; або (ііі) поліпептид важкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, та поліпептид легкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7. За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом, як визначено у цьому описі, за варіантом, якому віддається перевага, визначені номером послідовності SEQ ID NO, додатково характеризуються як такі, що мають зв'язувальну спорідненість (KD) до людського склеростину на рівні приблизно 10 пМ або менше при температурі 96474 6 25°С. Антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, мають значення KD до склеростину макак-крабоїдів на рівні приблизно 100 пМ або менше при температурі 25°С. Антитіла за цим винаходом, яким віддається більша перевага, мають зв'язувальну спорідненість до людського склеростину на рівні приблизно 10 пМ або менше при температурі 25°С і зв'язувальну спорідненість до склеростину макак-крабоїдів на рівні приблизно 100 пМ або менше при температурі 25°С. За іншим варіантом здійснення антитіла за цим винаходом, як визначено у цьому описі, за варіантом, якому віддається перевага, визначені за допомогою номера послідовності SEQ ID NO, характеризуються як такі, що мають ІС50 на рівні 50 нМ або менше при проведенні аналізу кісткової специфічної лужної фосфатази із застосуванням людського склеростину. За варіантом, якому віддається перевага, ці антитіла також мають значення KD до людського склеростину на рівні приблизно 10 пМ або менше при температурі 25°С. За варіантом, якому віддається більша перевага, ці антитіла мають KD до людського склеростину на рівні приблизно 10 пМ або менше при температурі 25°С і KD до склеростину макак-крабоїдів на рівні приблизно 100 пМ або менше при температурі 25°С. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить антитіло за цим винаходом та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. За варіантом, якому віддається перевага, фармацевтична композиція містить однорідну або по суті однорідну популяцію моноклонального антитіла за цим винаходом та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. Цей винахід пропонує застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу. Цей винахід додатково пропонує застосування антитіла за цим винаходом у способі підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці або міцності кістки у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, у ссавця, за варіантом, якому віддається більша перевага, у людини. Цей винахід також пропонує спосіб підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці або міцності кістки, який включає введення в організм людини, яка цього потребує, ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Один із варіантів здійснення цього винаходу пропонує спосіб лікування у людини захворювання, стану або розладу, в тому числі, наприклад, остеопорозу, остеопенії, остеоартриту, болю, пов'язаного з остеоартритом, пародонтиту та множинної мієломи, для яких сприятливим є підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці або міцності кістки. Цей винахід також пропонує спосіб виявлення білка - склеростину - у біологічному зразку, який включає інкубування антитіла за цим винаходом із біологічним зразком при умовах та впродовж пері 7 оду часу, достатнього для зв'язування згаданого антитіла з білком - склеростином, та виявлення згаданого зв'язування. Антитіло для застосування у такому способі виявлення має поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 40 та поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 41; поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 42 та поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 43; поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 2 та поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 5; поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 3 та поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 6; або поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 4 та поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 7. Цей винахід також пропонує молекули виділеної нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло за цим винаходом; вектор, який містить згадану нуклеїнову кислоту, за факультативним варіантом функціонально зв'язану з контрольними послідовностями, які розпізнаються клітиною-хазяїном, трансформованою згаданим вектором; клітинухазяїна, яка містить згаданий вектор; процес продукування антитіла за цим винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна з експресією згаданої нуклеїнової кислоти та факультативне виділення згаданого антитіла з культурального середовища клітини-хазяїна. Цей винахід пропонує антитіла, які специфічно зв'язують людський склеростин, нейтралізують або пригнічують щонайменше одну біологічну активність людського склеростину in vitro або in vivo і, крім того, демонструють сильну зв'язувальну спорідненість до людського склеростину. При вживанні у цьому описі термін "склеростин" означає непроцесований людський білок з амінокислотною послідовністю, яка представлена послідовністю SEQ ID NO: 1, або зрілу форму білка з видаленою сигнальною послідовністю. Термін "антитіло", стосовно антитіла проти склеростину за цим винаходом (або просто "антитіла за цим винаходом"), який вживають у цьому описі, означає моноклональне антитіло. Термін "моноклональне антитіло", який вживають у цьому описі, означає химерне антитіло або гуманізоване антитіло, якщо не вказано інше. Моноклональні антитіла за цим винаходом можна одержати за допомогою, наприклад, методів рекомбінантних ДНК, методів проявлення у фагах, синтетичних методів, наприклад, пересадження гіперваріабельної ділянки, або комбінації таких методів, або інших методів, широко відомих у цій галузі. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, яке одержують з однієї копії або клону, у тому числі, наприклад, з будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не метод, за .. допомогою якого одержують згадане антитіло. "Моноклональне антитіло" або "антитіло за цим винаходом" чи просто "антитіло" може бути інтактним антитілом (яке містить повний або непроцесований Fc-фрагмент) або частиною чи фрагментом антитіла, яке містить антигензв'язувальну ділянку, наприклад, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент або F(аb')2-фрагмент химерного 96474 8 або гуманізованого антитіла. Зокрема, антигензв'язувальні фрагменти антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, зберігають здатність до пригнічення або нейтралізування однієї або декількох характеристик біологічної активності склеростину ссавців in vivo або in vitro. Наприклад, за одним із варіантів здійснення антигензв'язувальна ділянка антитіла за цим винаходом може пригнічувати взаємодію зрілого людського склеростину з одним або декількома з його лігандів та/або може пригнічувати одну або декілька рецептор-опосередкованих функцій людського склеростину. Крім того, термін "моноклональне антитіло" або "антитіло за цим винаходом" чи просто "антитіло", який вживають у цьому описі, може означати одноланцюговий Fv-фрагмент, який можна одержати шляхом сполучення ДНК, яка кодує LCVR та HCVR, з лінкерною послідовністю (дивись, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994). Слід усвідомлювати, що, незважаючи на те, вказуються антиген-зв'язувальні фрагменти чи ділянки або ні, термін "антитіло", який вживають у цьому описі, охоплює такі фрагменти або ділянки, а також одноланцюгові форми, якщо не вказано інше. Доки білок зберігає здатність до специфічного зв'язування склеростину, він охоплюється терміном "антитіло". Словосполучення "специфічно зв'язує", який вживають у цьому описі, означає ситуацію, у якій один із членів специфічної зв'язувальної пари незначною мірою зв'язується лише з молекулами, які не є його специфічним(-и) зв'язувальним(-и) партнером(-ами), що визначається методами, доступними у цій галузі, наприклад, конкурентним ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), аналі® ® зом BIACORE або аналізом KINEXA . Згадане словосполучення вживається також у разі, наприклад, коли антиген-зв'язувальний домен антитіла за цим винаходом є специфічним для конкретної антигенної детермінанти, яку несе ряд антигенів. У цьому випадку антитіло, що несе згаданий антиген-зв'язувальний домен, буде здатним до специфічного зв'язування з різними антигенами, які несуть згадану антигенну детермінанту. Термін "антигенна детермінанта" означає ту частину молекули, яка може розпізнаватись антитілом і зв'язуватись згаданим антитілом на одній або декількох антиген-зв'язувальних ділянках останнього. Словосполучення "біологічна активність", стосовно антитіла за цим винаходом, означає (але цим не обмежується) зв'язувальну спорідненість до антигенної детермінанти або антигену, здатність нейтралізувати або пригнічувати біологічну активність склеростину in vivo або in vitro, IC50 У аналізі кісткової специфічної лужної фосфатази (наприклад, як описано у Прикладі 2 у цьому описі) або іншому in vitro кількісному аналізі активності, in vivo та/або in vitro стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла, наприклад, при введенні людині. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або визначатись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому 9 числі (але без обмеження) ELISA, конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, in vitro та in vivo аналізів нейтралізації без обмеження, зв'язування рецептора та імуногістохімічного аналізу тканинних зрізів із різних джерел, у тому числі від людей, приматів або з будь-якого іншого джерела, за потребою. Словосполучення "біологічна активність", стосовно склеростину, означає (але цим не обмежується) специфічне зв'язування склеростину з іншим білком (наприклад, рецептором або членом родини TGF-β (трансформуючий фактор росту)), одну або декілька рецептор-опосередкованих функцій людського склеростину, трансдукцію сигналу, імуногенні властивості, in vivo або in vitro стабільність, впливання на рівні або активність іншого білка in vivo або in vitro (дивись, наприклад, Приклад 2), рівні експресії склеростину та розподіл у тканинах. Термін "пригнічувати" або "нейтралізувати", який вживають у цьому описі, відносно біологічної активності антитіла за цим винаходом, означає здатність до суттєвої протидії, заборони, запобігання, стримування, уповільнення, порушення, ліквідування, припинення, зменшення або обернення на протилежну біологічної активності склеростину (наприклад, як визначається у Прикладі 2 у цьому описі). Словосполучення "схема нумерації, яка розроблена Кабатом", яке вживають у цьому описі, є визнаним у цій галузі і означає систему нумерації залишків амінокислот, які є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші залишки амінокислот на ділянках важких та легких ланцюгів антитіла (Kabat at al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382393 (1971); Kabat at al., Sequences of Proteins of th Immunological Interest, 5 ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242 (1991)). Позиціонування гіперваріабельних ділянок на варіабельній ділянці антитіла здійснюється за схемою нумерації, яка розроблена Кабатом, або просто "за Кабатом". Полінуклеотид є "функціонально зв'язаним", коли він знаходиться у функціональному взаємозв'язку з іншим полінуклеотидом. Наприклад, промотор або енхансер є функціонально зв'язаним із кодувальною послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності. Терміни "суб'єкт" та "пацієнт", які вживаються у цьому описі взаємозамінно, означають ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людину. За певним варіантом здійснення суб'єкт додатково характеризується захворюванням, або розладом чи станом, для якого сприятливим було б зниження рівня склеростину або зниження біологічної активності склеростину. Термін "вектор" означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона є функціонально зв'язаною, у тому числі (але без обмеження) плазміди та вектори на основі вірусного геному. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітиніхазяїні, у яку їх вводять, у той час як інші вектори можуть бути інтегрованими до геному клітинихазяїна при введенні до згаданої клітини-хазяїна, і 96474 10 завдяки цьому розмножуються спільно з геномом хазяїна. Крім того, певні вектори є здатними для спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв'язаними. Такі вектори у цьому описі називають "рекомбінантними експресійними векторами" (або просто "експресійними векторами"). Приклади векторів добре відомі у цій галузі. При вживанні у цьому описі терміни "клітина", "клітина-хазяїн" та "культура клітин" вживаються взаємозамінно і означають окрему клітину або культуру клітин, яка є реципієнтом будь-якого виділеного полінуклеотиду за цим винаходом або будь-якого(-их) рекомбінантного(-их) вектора(-ів), що містить(-ять) нуклеотидну послідовність, яка кодує HCVR, LCVR або антитіло за цим винаходом. Термін "клітина-хазяїн" означає клітини, трансформовані, трансдуковані або інфіковані одним або декількома рекомбінантними векторами або полінуклеотидом, який експресує моноклональне антитіло за цим винаходом або його легкий чи важкий ланцюг. Кожен важкий ланцюг непроцесованого антитіла містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга (у цьому описі "HCVR") та константну ділянку важкого ланцюга. Кожен легкий ланцюг непроцесованого антитіла містить N-кінцеву варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") та константну ділянку легкого ланцюга. HCVR та LCVR можуть додатково підрозділятись на ділянки гіперваріабельності, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність ("CDR"), які чергуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками ("FR"). На функціональну здатність антитіла до зв'язування конкретного антигену або антигенної детермінанти значний вплив чинять шість гіперваріабельних ділянок, наявних на варіабельній ділянці антитіла. Кожна HCVR та LCVR складається з трьох гіперваріабельних ділянок (HCDR1, HCDR2 та HCDR3 на HCVR та LCDR1, LCDR2 та LCDR3 на LCVR) і чотирьох каркасних ділянок, які розміщуються у напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця у такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Гіперваріабельні ділянки містять більшість залишків, які забезпечують специфічну взаємодію з антигеном. Позиціонування гіперваріабельних ділянок у межах варіабельної ділянки відповідає схемі нумерації, яка розроблена Кабатом. Легкі ланцюги класифікуються як каппа або ламбда і характеризуються конкретною константною ділянкою, як відомо у цій галузі. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон і визначають ізотоп антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, відповідно, і декілька з них можуть додатково підрозділятись на підкласи, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Важкий ланцюг кожного типу характеризується конкретною константною ділянкою з послідовністю, широко відомою у цій галузі. Константна ділянка легкого ланцюга типу каппа та константні ділянки важкого ланцюга IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 є константними ділянками антитіл за цим винаходом, яким віддається перевага. За варіантом, якому віддається більша перевага, константна ділянка важкого ланцюга містить 11 96474 поліпептид з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 38, яка кодується полінуклеотидом із послідовністю SEQ ID NO: 39. Химерні антитіла можуть мати константні ділянки нелюдського походження, за варіантом, якому віддається перевага, пацючого або мишачого. Словосполучення "антиген-зв'язувальна ділянка" або "антиген-зв'язувальний домен", яке вживають у цьому описі, означає ту частину молекули антитіла, у межах варіабельної ділянки, яка містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і надають антитілу його специфічність та спорідненість до антигену. Ця частина антитіла містить каркасні амінокислотні залишки, необхідні для підтримання відповідної конформації антигензв'язувальних залишків. Антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить шість гіперваріабельних ділянок з амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 та SEQ ID NO: 25. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить шість гіперваріабельних ділянок з амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 та SEQ ID NO: 37. Антитіло за цим винаходом, якому віддається більша перевага, містить шість гіперваріабельних ділянок з амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 та SEQ ID NO: 31. Гіперваріабельні ділянки цих антитіл, яким віддається перевага, знаходяться у положенні, яке вказується у наведеній нижче Таблиці 1. Гіперваріабельні ділянки розміщують у межах варіабельної ділянки у відповідності до схеми нумерації, яка розроблена Кабатом. Антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 19. Інші моноклональні антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, містять HCVR з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 або SEQ ID NO: 16. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом містить LCVR послідовності SEQ ID NO: 17 та HCVR послідовності SEQ ID NO: 14. Альтернативне антитіло за цим винаходом містить LCVR послідовності SEQ ID NO: 19 та HCVR послідовності SEQ ID NO: 16. Антитіло за цим винаходом, якому віддається більша перева 12 га, містить LCVR послідовності SEQ ID NO: 18 та HCVR послідовності SEQ ID NO: 15. Такі варіабельні ділянки легкого ланцюга за варіантом, якому віддається перевага, є зв'язаними з константною ділянкою легкого ланцюга, за варіантом, якому віддається перевага, людського походження, за варіантом, якому віддається перевага, ланцюгом типу каппа. Такі варіабельні ділянки важкого ланцюга за варіантом, якому віддається перевага, є функціонально зв'язаними з константною ділянкою важкого ланцюга, за варіантом, якому віддається перевага, людського походження, за варіантом, якому віддається перевага, IgG1 або IgG4, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, з константною ділянкою важкого ланцюга, яка містить послідовність SEQ ID NO: 38. Одне з антитіл за цим винаходом, якому віддається перевага, містить поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 2 і поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 5. Поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 2 може кодуватись, наприклад, полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 8, поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 5 може кодуватись, наприклад, полінуклеотидом послідовності SEQ ID NO: 11. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 4 і поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 7. Поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 4 може кодуватись, наприклад, полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 10, поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 7 може кодуватись, наприклад, полінуклеотидом послідовності SEQ ID NO: 13. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 3 і поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 6. Поліпептид важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 3 може кодуватись полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 9, поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 6 може кодуватись полінуклеотидом послідовності SEQ ID NO: 12. Гуманізовані антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, згадуються у цьому описі як 86, 88 та 89. Номери їх послідовностей (SEQ ID NO) представлені у наведеній нижче Таблиці 1. Таблиця 1 Послідовності SEQ ID NO білків Антитіло Важкий ланцюг Легкий ланцюг 86 88 89 2 3 4 5 6 7 CDR1 CDR2 CDR3 HCVR важкого важкого важкого ланцюга ланцюга ланцюга 14 20 21 22 15 26 27 28 16 32 33 34 За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, де усі шість гіперваріабельних ділянок, HCVR, LCVR, HCVR та LCVR, LCVR 17 18 19 CDR1 CDR2 CDR3 легкого легкого легкого ланцюга ланцюга ланцюга 23 24 25 29 30 31 35 36 37 увесь важкий ланцюг, увесь легкий ланцюг або увесь важкий ланцюг і увесь легкий ланцюг обмежуються конкретною послідовністю, як показано 13 послідовністю SEQ ID NO у цьому описі (дивись, наприклад, Таблицю 1), додатково характеризується значенням KD до людського склеростину при температурі 25°С, меншим ніж приблизно 10 пМ, 8 пМ, 6 пМ або 4 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншим ніж приблизно 2,2 пМ. Крім того, за варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло додатково обмежується значенням KD до склеростину макак-крабоїдів при температурі 25°С, меншим ніж приблизно 100 пМ, 90 пМ або 80 пМ, або за варіантом, якому віддається більша перевага, меншим ніж приблизно 75 пМ. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, де усі шість гіперваріабельних ділянок, HCVR, LCVR, HCVR та LCVR, увесь важкий ланцюг, увесь легкий ланцюг або увесь важкий ланцюг і увесь легкий ланцюг обмежуються конкретною послідовністю, як показано послідовністю SEQ ID NO у цьому описі, додатково характеризується значенням ІС50 при проведенні аналізу кісткової специфічної лужної фосфатази із застосуванням людського склеростину (дивись, наприклад, Приклад 2 у цьому описі), яке дорівнює приблизно 50 нМ або менше, приблизно 40 нМ, 35 нМ або 30 нМ чи менше, за варіантом, якому віддається більша перевага, приблизно 25 нМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, приблизно 20 нМ (наприклад, 20,2 нМ) або менше. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом, де усі шість гіперваріабельних ділянок, HCVR, LCVR, HCVR та LCVR, увесь важкий ланцюг, увесь легкий ланцюг або увесь важкий ланцюг і увесь легкий ланцюг обмежуються конкретною послідовністю, як показано послідовністю SEQ ID NO у цьому описі, додатково характеризується значенням KD до людського склеростину при температурі 25°С, меншим ніж приблизно 10 пМ, 8 пМ, 6 пМ або 4 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншим ніж приблизно 2,2 пМ, а також характеризується значенням ІС50 при проведенні аналізу кісткової специфічної лужної фосфатази із застосуванням людського склеростину, яке дорівнює приблизно 50 нМ або менше, приблизно 40 нМ, 35 нМ або 30 нМ чи менше, за варіантом, якому віддається більша перевага, приблизно 25 нМ або менше, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, приблизно 20 нМ (наприклад, 20,2 нМ) або менше. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом, де усі шість гіперваріабельних ділянок, HCVR, LCVR, HCVR та LCVR, увесь важкий ланцюг, увесь легкий ланцюг або увесь важкий ланцюг і увесь легкий ланцюг обмежуються конкретною послідовністю, як показано послідовністю SEQ ID NO у цьому описі, додатково характеризується значенням Ко до людського склеростину при температурі 25°С, меншим ніж приблизно 10 пМ, 8 пМ, 6 пМ або 4 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншим ніж приблизно 2,2 пМ; також характеризується значенням ІС50 при проведенні аналізу кісткової специфічної лужної фосфатази із застосуванням людського склеростину, яке дорівнює приблизно 50 нМ або менше, приблизно 40 нМ, 35 нМ або 30 96474 14 нМ чи менше, за варіантом, якому віддається більша перевага, приблизно 25 нМ або менше, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, приблизно 20 нМ (наприклад, 20,2 нМ) або менше; і також характеризується значенням ІС50 при проведенні аналізу кістковоспецифічної лужної фосфатази із застосуванням склеростину макаккрабоїдів, яке дорівнює приблизно 75 нМ або менше. Експресія антитіла Цей винахід стосується також клітин-хазяїв, що експресують антитіло проти склеростину за цим винаходом. Одержання та виділення ліній клітин-хазяїв, що продукують антитіло за цим винаходом, може здійснюватись із застосуванням стандартних методів, відомих у цій галузі. Найрізноманітніші експресійні системи-хазяї, відомі у цій галузі, можуть застосовуватись для експресії антитіла за цим винаходом, у тому числі прокаріотні (бактеріальні) та еукаріотні експресійні системи (такі як клітини дріжджів, бакуловірусу, рослин, ссавців та інших тварин, клітини трансгенних тварин та гібридом), а також експресійні системи проявлення у фагах. Антитіло за цим винаходом можна одержати шляхом рекомбінантної експресії генів легкого і важкого ланцюга імуноглобуліну у клітині-хазяїні. Для експресії антитіла рекомбінантним шляхом клітину-хазяїна трансформують, трансдукують, інфікують тощо одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, що несуть фрагменти ДНК, які кодують імуноглобулінові легкі та/або важкі ланцюги антитіла, так що легкі та/або важкі ланцюги експресуються клітиною-хазяїном. Важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно від різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язаними у одному векторі, або за альтернативним варіантом важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно від різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язаними у двох векторах, один з яких експресує важкий ланцюг, і інший експресує легкий ланцюг. Факультативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись різними клітинами-хазяями. Крім того, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію легкого та/або важкого ланцюга антитіла проти склеростину клітиною-хазяїном. Ген легкого та/або важкого ланцюга антитіла проти склеростину може клонуватись у векторі, так що сигнальний пептид є функціонально зв'язаним у межах рамки зчитування з амінокінцем гена ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може бути сигнальним пептидом імуноглобуліну або гетерологічним сигнальним пептидом. За варіантом, якому віддається перевага, рекомбінантні антитіла секретують до середовища, у якому культивуються клітини-хазяї, з якого антитіла можуть бути виділені або очищені. Виділена ДНК, що кодує HCVR, може бути перетворена на непроцесований ген важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує HCVR, з молекулою іншої ДНК, що кодує константні ділянки важкого ланцюга. Послідовності генів константних ділянок важкого ланцюга люди 15 ни, а також інших ссавців, є відомими у цій галузі. Фрагменти ДНК, які охоплюють ці ділянки, можна одержати, наприклад, шляхом стандартної ПЛРампліфікації. Константна ділянка важкого ланцюга може бути константною ділянкою будь-якого типу (наприклад, IgG, IgA, IgE, IgM або IgD), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4) або підкласу та будь-яким її алотиповим варіантом, як описано у Kabat (дивись вище). Константна ділянка важкого ланцюга, якій віддають перевагу, містить поліпептид послідовності SEQ ID NO: 38. Виділена ДНК, що кодує LCVR, може бути перетворена на непроцесований ген легкого ланцюга (а також на ген Fab-фрагмента легкого ланцюга) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує HCVR, з молекулою іншої ДНК, що кодує константну ділянку легкого ланцюга. Послідовності генів константних ділянок легкого ланцюга людини, а також інших ссавців, є відомими у цій галузі. Фрагменти ДНК, які охоплюють ці ділянки, можна одержати шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка легкого ланцюга може бути константною ділянкою типу каппа або ламбда. Клітинами-хазяями ссавців для застосування за цим винаходом, яким віддається перевага, є клітини СНО (клітини яєчника китайського хом'ячка) (наприклад, АТСС (Американська колекція типових культур) CRL-9096), клітини NS0, клітини SP2/0 та клітини COS (клітини яєчника мавп) (наприклад, АТСС, CRL-1650, CRL-1651), клітини HeLa (АТСС CCL-2). Додатковими клітинамихазяями для застосування за цим винаходом є клітини інших ссавців, дріжджові клітини та прокаріотичні клітини. Після введення рекомбінантних експресійних векторів, що кодують гени антитіла, до клітин-хазяїв ссавця, антитіла продукують шляхом культивування клітин-хазяїв впродовж періоду часу, достатнього для забезпечення експресії антитіла у клітинах-хазяях, або за варіантом, якому віддається більша перевага, секреції антитіла до культурального середовища, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можуть бути виділені з клітини-хазяїна та/або культурального середовища за допомогою стандартних методів очищення. Після завершення експресії інтактні антитіла, окремі легкі та важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів за цим винаходом можуть бути очищені за стандартними методами у цій галузі, у тому числі шляхом осадження сульфатом амонію, засобами іонообмінної, афінної, зі зворотною фазою, гідрофобної хроматографії на колонках, шляхом гель-електрофорезу тощо. Для фармацевтичного застосування перевага віддається по суті чистим імуноглобулінам щонайменше приблизно 90%, 92%, 94% або 96% однорідності, та найбільша перевага віддається 98-99% або вищій однорідності. Після очищення, часткового або до бажаного рівня однорідності, стерильні антитіла можуть застосовуватись із терапевтичними цілями, як вказується у цьому описі. Гуманізоване антитіло За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, призначене для застосування з терапевтичними цілями, має послідовність каркасної та константної ділянки (у об'ємі існуван 96474 16 ня у антитілі), яка була одержана від ссавця, для якого воно буде застосовуватись як лікарський засіб, для зменшення ймовірності того, що у ссавця виникне імунна реакція проти терапевтичного антитіла. Гуманізовані антитіла становлять особливий інтерес, оскільки вони є цінними для терапевтичного застосування і зменшують ймовірність утворення людських антимишачих антитіл, що часто спостерігається з антитілами мишачого походження або антитілами, що містять фрагменти мишачого походження, при введенні людині. За варіантом, якому віддається перевага, введені гуманізовані антитіла можуть мати період напіввиведення, що більш нагадує відповідний показник природних людських антитіл, ніж, наприклад, мишачих антитіл, що уможливлює рідше введення суб'єкту менших доз. Термін "гуманізоване антитіло", який вживають у цьому описі, означає антитіло, щонайменше одна частина якого має людське походження. Наприклад, гуманізоване антитіло може містити частини, одержані з антитіла нелюдського походження, наприклад, мишачого, та частини, одержані з антитіла людського походження, об'єднані, наприклад, хімічним шляхом за допомогою традиційних методів (наприклад, синтетичного) або одержані у вигляді суцільного поліпептиду за допомогою методів генної інженерії. За варіантом, якому віддається перевага, "гуманізоване антитіло" має гіперваріабельні ділянки, які походять з вихідного антитіла або є похідними від нього, тобто нелюдського антитіла (за варіантом, якому віддається перевага, мишачого моноклонального антитіла), у той час як каркасна та константна ділянки, у об'ємі існування (або її суттєва чи значна частина, тобто щонайменше приблизно 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99%), кодуються інформацією, яку містить нуклеїновокислотна послідовність людської зародкової імуноглобулінової ділянки (дивись, наприклад, International ImMunoGeneTics Database) або її рекомбіновані чи мутовані форми, незалежно від того, продукуються чи ні згадані антитіла людською клітиною. За варіантом, якому віддається перевага, щонайменше дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок гуманізованого антитіла оптимізуються з гіперваріабельних ділянок нелюдського вихідного антитіла, похідним якого є гуманізоване антитіло, для одержання бажаної властивості, наприклад, поліпшеної специфічності, спорідненості або нейтралізації, яка може ідентифікуватись відбірковим аналізом, наприклад, ELISA. За варіантом, якому віддається перевага, оптимізована гіперваріабельна ділянка антитіла за цим винаходом містить щонайменше одну амінокислотну заміну, порівняно з присутньою наявною у вихідного антитіла. Певні амінокислотні заміни на гіперваріабельних ділянках гуманізованих антитіл 88 та 89 за цим винаходом, порівняно з амінокислотами вихідних антитіл 788 та 789 (дивись Приклад 5 та Приклад б у цьому описі), зменшують ймовірність нестабільності антитіла (наприклад, видалення залишків Asn гіперваріабельної ділянки) або зменшують ймовірність імуногенності антитіла при введенні людині (на 17 приклад, як прогнозується методом IMMUNOFILTER™). Гуманізовані антитіла за варіантом, якому віддається перевага, містять мінімальну послідовність, яку одержують від нелюдського антитіла. Гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не зустрічаються ні у антитіла-реципієнта, ні у послідовностях гіперваріабельної або каркасної ділянок, перенесених з вихідного антитіла. Гуманізовані антитіла можна піддавати in vitro мутагенезу із застосуванням стандартних методів, які застосовують у цій галузі, і таким чином, амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR гуманізованих рекомбінантних антитіл, хоча і одержані з послідовностей, споріднених із людськими зародковими послідовностями HCVR та LCVR, являють собою такі послідовності, які можуть не існувати при природних умовах у зародковому наборі людських антитіл in vivo. Припускається, що такі амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR гуманізованих рекомбінантних антитіл є на щонайменше 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% або за варіантом, якому віддається більша перевага, на щонайменше 99%, чи за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, на 100% ідентичними людській зародковій послідовності. За варіантами здійснення, яким віддається перевага, гуманізоване антитіло за цим винаходом містить людські зародкові послідовності каркасної ділянки легкого ланцюга (дивись, наприклад, РСТ WO 2005/005604) та людські зародкові послідовності каркасної ділянки важкого ланцюга (дивись, наприклад, РСТ WO 2005/005604). Людські зародкові каркасні ділянки легкого ланцюга, яким віддається перевага, походять із людського гена легкого ланцюга типу каппа, вибраного з групи, яку складають: A11, А17, А18, А19, А20, А27, А30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O2 та O8. Людські зародкові каркасні ділянки важкого ланцюга, яким віддається перевага, походять із людського важкого ланцюга, вибраного з групи, яку складають: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51 (дивись міжнародну публікацію WO2006/046935). У цій галузі доступними є численні методи одержання гуманізованих антитіл. Наприклад, гуманізовані антитіла можуть продукуватись шляхом одержання нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують HCVR та LCVR вихідного антитіла (наприклад, мишачого антитіла або антитіла, яке продукується гібридомою), яке специфічно зв'язує склеростин, за варіантом, якому віддається перевага, людський склеростин, розпізнавання гіперваріабельних ділянок у складі згаданих HCVR та LCVR (нелюдських) і пересадження таких нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують гіперваріабельні ділянки, на вибрані нуклеїновокислотні послідовності, що кодують людські каркасні ділянки. Факультативно гіперваріабельна ділянка може оптимізуватись шляхом мутагенезу на довільних або конкретних ділянках для заміни однієї або декількох амінокислот гіперваріабельної ділянки ін 96474 18 шою амінокислотою перед пересадженням геперваріабельної ділянки на каркасну ділянку. За альтернативним варіантом гіперваріабельна ділянка може оптимізуватись після введення до людської каркасної ділянки із застосуванням методів, доступних фахівцю у цій галузі. Після пересадження послідовностей, які кодують гіперваріабельні ділянки, на вибрані людські послідовності, які кодують каркасні ділянки, одержані послідовності ДНК, які кодують гуманізовані послідовності варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів, експресують з одержанням гуманізованого антитіла, яке зв'язує склеростин. Гуманізовані HCVR та LCVR можуть експресуватись, як частина цілої молекули антитіла проти склеростину, тобто як гібридний білок із людськими послідовностями константних ділянок. Однак послідовності HCVR та LCVR можуть експресуватись також при відсутності послідовностей константних ділянок з одержанням гуманізованого Fv-фрагмента проти склеростину. Нижче наведені літературні джерела, які додатково описують методи, які стосуються гуманізації мишачого антитіла, що можуть бути застосованими, наприклад, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991, та метод Вінтер (Winter) та співробітників [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)]. Варіанти діагностичного застосування Антитіло за цим винаходом може застосовуватись для діагностування розладу або захворювання, пов'язаного з експресією людського склеростину. Подібним чином, антитіло за цим винаходом може застосовуватись у аналізі для контролювання рівня склеростину у суб'єкта, якого піддають лікуванню з приводу стану, пов'язаного зі склеростином. Такі варіанти застосування включають методи, у яких застосовують антитіло за цим винаходом і мітку для виявлення склеростину у біологічному зразку, наприклад, у фізіологічній рідині організму людини або у клітинному чи тканинному екстракті (дивись, наприклад, Приклад 1, наведений у цьому описі). Антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись з модифікацією або без неї і можуть мітитись шляхом ковалентного або нековалентного приєднання виявлюваної складової. У цій галузі відомі численні традиційні методики визначення рівнів склеростину у біологічному зразку, в тому числі, наприклад, твердофазні імуноферментні аналізи, радіоімуноаналізи та клітинний сортер зі збудженням флуоресценції, що забезпечує основу для діагностування змінених або аномальних рівнів експресії склеростину. Нормальні або стандартні рівні склеростину, наявного у зразку, встановлюються за допомогою будь-якого відомого методу, наприклад, шляхом об'єднання зразка, що містить поліпептид склеростину, з, наприклад, антитілом за цим винаходом в умовах, придатних для утворення комплексу антиген:антитіло. Антитіло безпосередньо або опосередковано мітять за допомогою виявної речовини для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного антитіла. До числа придатних виявних ре 19 човин належать різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали. Кількісне визначення утвореного стандартного комплексу здійснюють за допомогою різних методів, наприклад, фотометричними засобами. Після цього кількості поліпептиду склеростину, наявні у зразку, порівнюють зі стандартними значеннями. Варіанти терапевтичного застосування Склеростин функціонує як негативний регулятор утворення кісткової тканини (дивись, наприклад, Cytokine & Growth Factor Reviews, 16:319327, 2005). У дорослих мРНК склеростину виявляють, головним чином, у остеоцитах, хоча нижчі концентрації були виявлені Заявниками у хрящі. Фармацевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти склеростину за цим винаходом, може бути застосована для підвищення щонайменше одного з таких показників: маси кістки, мінеральної густини кістки, вмісту мінералів у кістці або міцності як хребетної, так і нехребетної кістки або обох, при введенні ефективної кількості людині, яка цього потребує. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло проти склеростину за цим винаходом, може застосовуватись для зменшення кількості переломів хребетних та/або нехребетних кісток, при введенні ефективної кількості людині, яка цього потребує. Зменшення кількості переломів включає зменшення ймовірності або фактичної кількості переломів у людини, порівняно з необробленою контрольною групою. Крім того, антитіло за цим винаходом може бути придатним для лікування станів, захворювань або розладів, коли наявність склеростину спричинює або сприяє небажаним патологічним ефектам, або зниження рівнів склеростину чи біологічної активності склеростину чинить сприятливий терапевтичний вплив на людей. До таких станів, захворювань або розладів належать (але ними не обмежуються) остеопороз, остеопенія, остеоартрит, біль, пов'язаний з остеоартритом, пародонтит або множинна мієлома. Суб'єктами можуть бути чоловік або жінка. За варіантом, якому віддається перевага, людина, що знаходиться під загрозою перелому хребетної або нехребетної кістки, є під загрозою виникнення остеопорозу або страждає на нього. Людиною за варіантом, якому віддається перевага, є жінка, і за варіантом, якому віддається більша перевага, жінка, яка знаходиться під загрозою виникнення постклімактеричного остеопорозу або страждає на нього. Вважають, що спосіб за цим винаходом може принести користь суб'єкту на будь-якій стадії остеопорозу. Крім того, передбачається застосування антитіла за цим винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування щонайменше одного з вищезгаданих розладів. Термін "лікування" та "лікувати" означає усі процеси, результатом яких може бути уповільнення, переривання, затримка, контролювання або припинення розвитку розладів, опис яких наведено, але не обов'язково означає повну ліквідацію усіх симптомів розладу. Термін "лікування", який вживають у цьому описі, означає введення сполу 96474 20 ки за цим винаходом для лікування захворювання або стану у ссавця, зокрема, у людини, і включає: (а) пригнічення подальшого розвитку захворювання, тобто уповільнення його розвитку; та (b) полегшення тяжкості симптомів захворювання, тобто спричинення зворотного розвитку захворювання або розладу чи полегшення тяжкості його симптомів або ускладнень. Схема приймання лікарського засобу може коректуватись для забезпечення одержання оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної реакції). Наприклад, може вводитись одна доза у вигляді болюсу, декілька поділених доз можуть бути введені впродовж певного періоду часу, або доза може бути пропорційно зменшена або збільшена, як вказується потребами терапевтичної ситуації. Фармацевтична композиція Антитіло за цим винаходом може включатись до складу фармацевтичної композиції, придатної для введення людині. Антитіло за цим винаходом може вводитись людині самостійно або у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм та/або розріджувачем однією або численними дозами. Такі фармацевтичні композиції розробляються так, щоб вони були придатними для вибраного способу введення, і відповідним чином застосовуються фармацевтично прийнятні розріджувачі, носії та/або наповнювачі, такі як диспергатори, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, засоби регулювання ізотонічності, стабілізатори тощо. Такі композиції можуть розроблятись у відповідності до стандартних методів, розкритих, наприклад, у Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19^ ed., Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995, де надано стислий опис технології виготовлення лікарського засобу, які загалом є відомими лікарям-практикам. Прийнятними носіями для фармацевтичних композицій є будь-який матеріал, який при об'єднанні з моноклональним антитілом за цим винаходом зберігає активність молекули і не реагує з імунною системою суб'єкта. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло проти склеростину за цим винаходом, може вводитись суб'єкту, який знаходиться під загрозою виникнення або демонструє патології, опис яких наведений, наприклад, остеопорозу, остеоартриту або інших кісткових дегенеративних розладів, із використанням стандартних методів введення. Фармацевтична композиція за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, містить "ефективну кількість" антитіла за цим винаходом. Ефективна кількість означає кількість, необхідну (у дозах, впродовж періодів часу та для засобів введення) для досягнення бажаного терапевтичного результату. Ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать, маса індивіда, здатність антитіла або фрагмента антитіла викликати бажану реакцію у індивіда. Ефективною кількістю також є така кількість, при застосуванні якої терапевтично сприятлива дія антитіла переважає будьяку токсичну або шкідливу дію. 21 Ефективна кількість являє собою принаймні мінімальну дозу, але меншу за токсичну дозу, активного агента, яка є необхідною для виявлення терапевтично сприятливої дії на суб'єкта. Іншими словами, ефективною кількістю або терапевтично ефективною кількістю антитіла за цим винаходом є кількість, яка у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, у людей, (і) підвищує щонайменше один з таких показників: масу кістки, мінеральну густину кістки, вміст мінералів у кістці або міцність кістки, або (іі) лікує стан, розлад або захворювання, при яких наявність склеростину спричинює або сприяє небажаному патологічному ефекту чи (ііі) результатом зменшення рівнів склеростину або біологічної активності склеростину є терапевтично сприятлива дія на ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людини, у тому числі (але без обмеження) при остеопорозі, остеопенії, остеоартриті, ревматоїдному артриті, пародонтиті або множинній мієломі. Як добре відомо у галузі медицини, величина дози для будь-якого суб'єкта залежить від багатьох факторів, у тому числі розміру пацієнта, площі поверхні тіла, віку, конкретної сполуки, призначеної для введення, статі, часу та шляху ведення, загального стану здоров'я та інших лікарських засобів, які вводяться одночасно. Крім того, величина дози може змінюватись у залежності від типу та тяжкості захворювання. Типова доза може бути, наприклад, у межах від 0,001 мкг до 1000 мкг; за варіантом, якому віддається перевага, від 1 мкг до 100 мкг; однак передбачаються дози, які є меншими або більшими за цей приклад діапазону, особливо з прийняттям до уваги вищезгаданих факторів. Добова схема парентерального приймання лікарського засобу може включати від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 20 мкг/кг загальної маси тіла, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 0,3 мкг/кг до приблизно 10 мкг/кг. Розвиток може контролюватись шляхом періодичних визначень із відповідним коректуванням дози. Ці запропоновані кількості антитіла значною мірою залежать від терапевтичних міркувань лікаря. Ключовим фактором при виборі відповідної дози та схеми застосування лікарського засобу є результат, що досягається. Факторами, що приймаються до уваги у цьому контексті, є конкретний розлад, який піддають лікуванню, клінічний стан конкретного пацієнта, причина розладу, місце доставки антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, схема введення лікарського засобу та інші фактори, відомі лікарям-практикам. Шлях введення антитіла за цим винаходом може бути пероральним, парентеральним, інгаляційним або місцевим. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть вводитись до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального ведення. Термін "парентеральний", який вживають у цьому описі, означає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевага віддається парентеральній доставці шляхом внутрішньовенної, внутрішньоочеревинної або підшкірної ін'єкції. Найбільша перевага віддається підшкірній 96474 22 ін'єкції. Прийнятні засоби для таких ін'єкцій є добре відомими у цій галузі. Фармацевтична композиція, як правило, повинна бути стерильною та стабільною при умовах виготовлення та зберігання у наданому контейнері, у тому числі, наприклад, у герметизованому флаконі, шприці або іншому засобі для доставки, наприклад, у шприц-ін'єкторі. Таким чином, фармацевтичні композиції після виготовлення можуть фільтруватись при стерильних умовах, або їх мікробіологічна прийнятність повинна забезпечуватись іншим чином. Наведені нижче приклади представлені лише з ілюстративними цілями і не призначені для обмеження обсягу цього винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Твердофазний імуноферментний аналіз Цей аналіз застосовують для виявлення та кількісного визначення склеростину у зразках людської сироватки з нижньою межею виявлення 0,4 нг/мл. Антитіло 86 є іммобілізованим антитілом, у той час як антитіло 88 є ідентифікувальним антитілом (послідовності антитіл дивись у Таблиці 1). Внутрішні лунки 96-лункового планшета сенсибілізують 100 мкл розчину непроцесованого моноклонального антитіла 86 проти склеростину з концентрацією 0,5 мкг/мл у 0,5 Μ розчині карбонату натрію при рН 9,6 ("сенсибілізувальний буфер"). Планшет герметизують та інкубують впродовж ночі при температурі 4°С. Після цього планшет тричі промивають "промивним буфером" TBST (0,4 Μ трис-НСІ, 3 Μ NaCl, 0,1% твін 20). Після цього до кожної лунки вносять 200 мкл розчину казеїнового блокувального буфера у PBS (фосфатносольовий буферний розчин) (компанія Pierce, номер за каталогом 37528), і. планшет інкубують впродовж 1 год при кімнатній температурі. Після цього планшет двічі промивають промивним буфером для видалення блокувального розчину. Для одержання стандартної кривої одержують розчин людського склеростину з концентрацією 0,35 мг/мл у казеїновому блокувальному буфері з подальшим двократним серійним розведенням (від 1,25 нг/мл до 0 нг/мл) у 5% розчині збірної людської сироватки у казеїновому блокувальному буфері у PBS. Людську сироватку пропускають через колонку з магнітними гранулами, сенсибілізованими моноклональним антитілом 86 проти склеростину, для видалення склеростину, що може бути ендогенно наявним у сироватці. 100 мкл зразків (5% розчин сироватки у казеїновому блокувальному буфері) або стандартів додають до лунок із повторенням, і планшет додатково інкубують при кімнатній температурі впродовж 2 год. Після цього лунки 5 разів промивають промивним буфером. До кожної лунки додають 100 мкл ідентифікувального антитіла (непроцесоване моноклокональне антитіло 88 проти склеростину), біотинілованого за допомогою реактивів із біотинового набору Pierce EZ link NHS-LC. Планшет інкубують при кімнатній температурі впродовж 1 год, після чого чотири рази промивають промивним буфером. Стрептавідин-пероксидазу з хрону розбавляють 23 96474 1:2000 у казеїновому блокувальному буфері у PBS до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл, після чого додають по 100 мкл до кожної лунки, інкубують при кімнатній температурі впродовж 1 год, і потім промивають 7 разів промивним буфером. До кожної лунки додають по 100 мкл субстрату OPD (офенілендіаміндигідрохлорид) (Sigma P8806) з продовженням проходження реакції при кімнатній температурі впродовж 20 хв. Після цього реакцію припиняють шляхом додання 100 мкл на лунку 1н розчину НСl. Оптичну густину планшета зчитують при 490 нм. Приклад 2 Нейтралізація - аналіз кісткової специфічної лужної фосфатази Кісткова специфічна лужна фосфатаза є біохімічним показником активності остеобластів. Аналіз кісткової специфічної лужної фосфатази, опис якого наведений, ґрунтується на здатності склеростину до зменшення ВМР-4 та Wnt3астимульованих рівнів лужної фосфатази у лінії мишачих поліпотентних клітин, С2С12, тоді як результатом дії антитіла, яке нейтралізує активність склеростину, у цьому аналізі буде дозозалежне посилення активності лужної фосфатази. Wnt3a та ВМР-4 являють собою остеогенні фактори росту. Клітини лінії С2С12 (АТСС, CRL 1772) висівають (3000-5000 клітин/лунка) на 96-лунковий планшет для культури тканин у середовищі MEM (мінімальне підтримувальне середовище), доповненому 5% фетальної телячої сироватки, після чого інкубують при температурі 37°С у 5% СO2 впродовж ночі. Антитіло, яке піддають випробуванню, розбавляють у 0,5×Wnt3aкондиціонованому середовищі до різних кінцевих концентрацій. Після цього згадане середовище видаляють із клітин на планшеті для культури тканин, і до кожної лунки додають 150 мкл заздалегідь змішаного розчину антитіло-ВМР4-склеростин 24 (людський або макак-крабоїдів), де кінцева концентрація згаданого антитіла становить від 30 мкг/мл до 0,5 мкг/мл, кінцева концентрація ВМР4 становить 25 мкг/мл, кінцева концентрація білка - склеростину - становить 1 мкг/мл при 0,5× концентрації кондиціонованого середовища. Планшет після цього інкубують при температурі 37°С у 5% СО2 впродовж 72 год. Середовище з клітин на планшеті для культури тканин видаляють, клітини один раз промивають PBS, після чого планшет із клітинами тричі почергово заморожують та відтаюють у діапазоні температур -80°С та 37°С. Wnt3a-кондиціоноване середовище одержують шляхом вирощування L-Wnt-3А клітин та контролювання L-клітин (АТСС CRL-2647 та CRL2648, відповідно) впродовж чотирьох днів (з поділу 1:20 конфлюентних клітин) у DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла) з 10% FBS та 2 мМ L-глутаміну. Зібране середовище фільтрують через найлонові мембрани (0,2 мкм) та зберігають при температурі -20°С впродовж тривалого періоду часу або при температурі 4°С впродовж нетривалого періоду часу. Активність лужної фосфатази визначають шляхом додання до кожної лунки 150 мкл субстрату лужної фосфатази (одностадійний рнітрофенолфосфат, компанія Pierce, номер за каталогом 37621). Планшет із клітинами після цього інкубують впродовж 60 хв при кімнатній температурі із зчитуванням впродовж цього часу оптичної густини при 405 нм для визначення активності лужної фосфатази. Значення ІС50 нейтралізації антитіла, наведені нижче у Таблиці 2, являють собою середні значення 2 окремих експериментів. Значення ІС50 обчислюють за допомогою програми SigmaPlot Regression Wizard з 4-параметричним сигмоїдним емпіричним рівнянням. Таблиця 2 Антитіло 89 88 86 ІС50 (нМ) із застосуванням людського склеростину 25,1 20,2 25,5 Приклад 3 Афінне зв'язування Дослідження зрівноваженого зв'язування між антитілом проти склеростину та склеростином людей, макак-крабоїдів або пацюків здійснюють на приладі KіnЕхА 3000 (Sapidyne Instruments Inc.) при KD-контрольованих умовах. За цією методикою антитіло із фіксованою концентрацією нижче значення KD змішують із білком - склеростином різної концентрації і витримують до зрівноваження. Частину вільного, незв'язаного антитіла, що залишається у розчині, зондують шляхом нетривалого піддання цієї зрівноваженої суміші впливу сенсибілізованих склеростином гранул із подальшим детектуванням за допомогою "другого" антитіла із флуоресцентною міткою. Як правило, 2 пМ антитіла проти склеростину, яке піддають випробуванню, змішують із різними концентраціями склеростину людей, макак-крабоїдів або пацюків, ІС50 (нМ) із застосуванням склеростину макак-крабоїдів 34,4 23,7 31,6 розпочинаючи з 2-50 нМ із подальшими трикратними серійними розведеннями у зв'язувальному буфері (їх фосфатно-сольовий буферний розчин, рН 7,4, 0,02% азиду натрію та сироватковий альбумін великої рогатої худоби (1 мг/мл)), що містить 2 мМ антитіла, яке піддають випробуванню. Ці розчини витримують до досягнення стану зрівноваження впродовж двох днів при температурі 25°С. Кількість незв'язаного антитіла визначають за допомогою азлактонових гранул, сенсибілізованих людським склеростином (Sapidyne Instruments Inc.). Ці гранули одержують шляхом реагування 50 мг сухих гранул азлактону з 50 мкг/мл людського склеростину у 50 мМ розчині натрійкарбонатного буфера при рН 9,0-9,6 з перемішуванням впродовж ночі. Гранули після цього осаджують, супернатант замінюють блокувальним розчином (1 М розчин трис-буфера, рН 8,0, плюс 10 мг/мл сиро 25 96474 ваткового альбуміну великої рогатої худоби), та перемішують впродовж 1 год. Цей концентрований розчин гранул піддають двадцятикратному розведенню у зв'язувальному буфері і застосовують впродовж трьох днів. Для досліджень зв'язування застосовують прилад KinExA 3000, зрівноважений при кімнатній температурі (приблизно 25°С). Як правило, 6,25 мл зрівноваженого розчину антитіло/склеростин пропускають через колонку, заповнену азлактоновими гранулами, сенсибілізованими людським склеростином, при швидкості потоку 0,25 мл/хв, після чого прополіскують протоковим 26 буфером (1× фосфатно-сольовий буферний розчин, рН 7,4, з 0,02% азиду натрію). Кількісне визначення частини вільного антитіла проти склеростину, зв'язаної із цими гранулами, здійснюють за інтенсивністю флуоресценції, що є результатом введення міченого "другого" антитіла (Су5-мічене козяче антилюдське Fab'2 антитіло). Аналізують два повторні зразки для кожної умови, і значення KD визначають шляхом підгонки даних до моделі зв'язування 1:1 за допомогою комп'ютерної програми KinExA Pro. У наведеній нижче Таблиці 3 подані середні значення KD при температурі 25°С. Таблиця 3 Спорідненість Антитіло 89 88 86 Людський склеростин KD (пМ) 0,3 2,2 0,6 Пацючий склеростин KD (пМ) 0,4 2,2 0,1 Приклад 4 In vivo аналіз кальцеїну Аналіз кальцеїну пацюків уможливлює безпосереднє оцінювання утворення кісткової тканини впродовж короткого (10 днів) періоду часу та впливу антитіла за цим винаходом на утворення кісткової тканини. Кальцеїн являє собою флуорохромну мітку, яка включається до складу кісткової матриці під час утворення нової кісткової тканини. Кількісне визначення кальцеїну відображає ступінь утворення кісткової тканини, індукованого фармакологічними засобами. Застосовували пацюківсамиць лінії Sprague-Dawley (n=6 на групу для введення певної дози) віком шість місяців. Дозу пацюкам вводили кожні 3 дні шляхом підшкірної ін'єкції (дні 0, 3 та 6) - 1 мг/кг або 6 мг/кг розчину антитіла у носії PBS, або 10 мкг/кг РТН (парати Склеростин макак-крабоїдів KD (пМ) 1,4 75 1,0 реоїдний гормон) щоденно чи 6 мг/кг людського IgG як негативний контроль. Кальцеїн впорскують підшкірно на 7 день, і пацюків умертвляють на 10 день. Збирають великогомілкові кістки, які розрізають для оцінювання утворення трабекулярної кісткової тканини (дистальний метафіз) або утворення кортикальної кісткової тканини (тибіальний діафіз) та піддають демінералізації з кількісним флуорохромним оцінюванням загального кальцеїну. У наведеній нижче Таблиці 4 подані середні значення, де контрольний набір людського IgG приймають за 1,0. Дані демонструють, що введення антитіл за цим винаходом призводить до утворення як трабекулярної, так і кортикальної кісткової тканини. Таблиця 4 Антитіло Людський IgG РТН 89 88 86 Доза мг/кг 6 0,01 6 6 6 Відносний вміст трабекулярного кальцеїну 1,00 1,45 1,97 1,90 1,77 Приклад 5 Остеоартрит Експресія гена SOST обмежується, головним чином, кістковою тканиною. Однак заявники зазначають у цьому описі, що іншою тканиною із значною експресією SOST є хрящ, як визначається ПЛР у реальному масштабі часу. Експресія SOST хрящем спостерігається також при застосуванні набору РНК, виділеної із хряща звичайних пацієнтів або таких, що страждають на остеоартрит. Крім того, у згаданому наборі, експресія SOST зростає у залежності від тяжкості симптомів остеоартриту, так що експресія у хрящі при легкому остеоартриті є більшою за контроль, при тяжкому остеоартриті є більшою за легкий і при тяжкому хірургічному втручанні (у хрящі, видаленому для хірургічного Відносний вміст кортикального кальцеїну 1,00 1,89 1,88 2,18 2,78 протезування колінного суглоба) є більшою за усі інші випадки, що демонструє кореляцію остеоартриту та експресії SOST. Антитіло, специфічне до склеростину, може застосовуватись для лікування остеоартриту. Химерне антитіло проти склеростину з мишачою варіабельною ділянкою на пацючому Fcфрагменті, антитіло 789 з послідовністю SEQ ID NO: 42 для важкого ланцюга і послідовністю SEQ ID NO: 43 для легкого ланцюга випробують на здатність до блокування болю у суглобах за допомогою ΜΙΑ моделі остеоартриту. Варіабельна ділянка цього антитіла була вихідною послідовністю для одержання гуманізованого антитіла 89 (HCVR з послідовністю SEQ ID NO: 16 та LCVR з послідов 27 ністю SEQ ID NO: 19). Обидва антитіла, як гуманізоване антитіло 89, так і химерне антитіло 789, зв'язують одну й ту саму антигенну детермінанту. У цій моделі остеоартриту вдаються до ін'єкцій монойодацетату (ΜΙΑ) безпосередньо до колінного суглоба для індукування процесу, подібного до остеоартриту, що включає запалення, біль, опосередкований цитокінами, та процес руйнування хряща. У контралатеральне коліно пацюка впорскують лише фізіологічний розчин, і біль визначають як різницю у розподілі навантаження між 2 задніми лапками. У експерименті № 1 з монойодацетатом молодих пацюків-самців лінії Lewis (віком 7-8 тижнів) застосовують у "режимі запобігання", при якому антитіло проти склеростину вводять перед ін'єкціями ΜΙΑ. За добу до ін'єкцій ΜΙΑ пацюкам впорскують антитіло проти склеростину (10 мг/кг, внутрішньоочеревинно) або контрольний IgG (10 мг/кг) чи PBS (n=6 на групу). Наступного дня пацюкам дають наркоз, і у праві колінні суглоби вводять розчин 0,3 мг йодоацетату натрію у 50 мкл 0,9% стерильного фізіологічного розчину. У ліві колінні суглоби впорскують лише фізіологічний розчин. Ін'єкції здійснюють через зв'язку надколінної чашечки за допомогою інсулінового шприца з голкою 28G, закритою пластиковим трубчастим чохликом, який уможливлює лише 5 мм проникнення у колінний суглоб. Інтенсивність болю визначають через 2 дні та 7 днів після ін'єкції ΜΙΑ (через 3 дні та 8 днів після ін'єкції антитіла). Після визначення інтенсивності болю на 7 день вводять другу дозу антитіла або роблять контрольну ін'єкцію. Потім здійснюють додаткові визначення інтенсивності болю через 10 днів та 14 днів після ΜΙΑ (через 3 дні та 7 днів після другої ін'єкції антитіла). Інтенсивність болю визначають за різницею у розподілі навантаження між лапками, у які робили ін'єкції, за допомогою контрольно-вимірювального приладу для визначення розподілу максимального навантаження. Пацюків вміщують до ящика з органічного скла (Perspex) із задніми лапками на датчиках тиску. Коли пацюки є надійно знерухомлені, зчитують щосекундні показання з подальшими 2 додатковими зчитуваннями показань, і обчислюють середнє значення. Навантаження, яке припадає на лапку, у яку впорскували ΜΙΑ, віднімають від навантаження, яке припадає на лапку, у яку впорскували фізіологічний розчин, для одержання різниці у розподілі навантаження. Статистично значуще зниження інтенсивності болю спостерігається у разі застосування антитіла проти склеростину, порівняно з IgG (та PBS) контролем, на 7 день, 10 день та 14 день після введення ΜΙΑ (Таблиця 5 нижче). Значення являють собою різниці у розподілі навантаження між лапкою, у яку впорскували ΜΙΑ, та лапкою, у яку впорскували фізіологічний розчин, у грамах (середня квадратична помилка середнього). Другий експеримент із застосуванням ΜΙΑ проводять із пацюками старішого віку (вік 27 тижнів) і у "режимі лікування", при якому антитіло вводять після впорскування ΜΙΑ. Пацюкам здійснюють ін'єкції ΜΙΑ або контрольні ін'єкції фізіологічного 96474 28 розчину як і раніше, і через 6 днів після цього внутрішньоочеревинним шляхом впорскують антитіло проти склеростину (10 мг/кг), контрольний IgG або PBS (n=6 на групу). Як і раніше інтенсивність болю визначають через 8 днів та 15 днів після ін'єкції ΜΙΑ (через 2 дні та 9 днів після ін'єкції антитіла). На 16 день після ΜΙΑ вводять другу дозу антитіла проти склеростину, та роблять контрольні ін'єкції. На 21 день знову визначають інтенсивність болю (через 5 днів після другої дози антитіла). У більш ранні моменти часу після введення антитіла проти склеростину (8 день після ΜΙΑ) впливу антитіла на інтенсивність болю не спостерігається, але через 7 днів спостерігається тенденція до зниження інтенсивності болю за визначеннями різниці у розподілі навантаження між лапкою, у яку вводили ΜΙΑ, та лапкою, у яку вводили фізіологічний розчин, у грамах. Тенденція до зменшення інтенсивності болю з антитілом проти склеростину також спостерігається через 5 днів після введення другої дози антитіла. Химерне антитіло 789 відрізнялось від IgG контролю зі значенням ρ 0,06 та 0,08 на 15 день та 21 день, відповідно. Ці результати спільно демонструють, що суглобовий біль, спричинений хворобливим процесом, що розвинувся з причини введення ΜΙΑ, порушується завдяки введенню нейтралізуючого антитіла проти склеростину. Приклад 6 Дослідження на оваріектомізованих пацюках Оваріектомізований (OVX) пацюк є загальновизнаною моделлю постклімактеричного остеопорозу. При проведенні цього дослідження вплив антитіл проти склеростину за цим винаходом, які містять мишачу варіабельну ділянку та пацючий Fc-фрагмент, перевіряють на оваріектомізованих пацюках. Пацюків-самиць лінії Sprague-Dawley віком шість місяців оваріектомізують. Дозоване введення препарату розпочинають через 1 місяць, впродовж якого у пацюків проходить процес розрідження кісток. Одну групу пацюків (n=8) не піддають оваріектомізації, а лише симульовано оперують для порівняння кісткової тканини з кістковою тканиною оваріектомізованих пацюків. Усіх оваріектомізованих пацюків довільно розподіляють на експериментальні групи (n=7 у кожній) і обробляють РТН(1-38), IgG контролем (10 мг/кг) або химерним антитілом проти склеростину у дозі 10 мг/кг (антитіло 788, важкий ланцюг якого має послідовність SEQ ID NO: 40, і легкий ланцюг має послідовність SEQ ID NO: 41 [варіабельна ділянка цього антитіла була вихідною послідовністю для одержання гуманізованого антитіла 88]; антитіло 789, важкий ланцюг якого має послідовність SEQ ID NO: 42, і легкий ланцюг має послідовність SEQ ID NO: 43) впродовж загалом 58 днів. Усі антитіла вводять підшкірним шляхом один раз на 3 дні, у той час як РТН(1-38) вводять підшкірним шляхом щоденно у дозі 10 мг/кг. Після умертвіння тварин їхні стегнові кістки та хребці видаляють для кількісного аналізу за допомогою комп'ютерної томографії (СТ) із застосуванням компьютерного томографічного сканера для вимірювання дистальної частини стегнової кістки (трабекулярна кісткова 29 96474 тканина) та діафізу (кортикальний шар кістки), а також 5-го поперекового хребця. Кістки вміщують у формувальну глину для відтворюваних вимірів, і сканограми стегнової кістки роблять на відстані 2 мм від кінця епіфізу (дистальна частина стегнової кістки) або 10 мм від епіфізу (діафіз стегнової кістки). Вимірювання хребця здійснюють на рівні L-5 зі скануванням від орієнтирної структури "V" у хребці. Дані обчислюють за допомогою комп'ютерної програми SYS-C320-V 1.5 виробника. Біомеханічні властивості діафізу стегнової кістки, хребців L-5 та шийки стегнової кістки визначають після автопсії відповідно до: Turner С.Н., Burr D.B., Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial. Bone 14(4):595-608, 1993. Механічні властивості діафізу визначають на інтактній лівій стегновій кістці шляхом згинання у З точках із накладанням навантаження посередині між двома опорами, розміщеними на відстані 15 мм одна від другої. Стегнові кістки розміщують так, щоб точка навантаження знаходилась приблизно на відстані 7,5 мм у проксимальному напрямку від дистальної частини підколінної ямки, і згинання відбувається приблизно по медіально-латеральній осі. Зразки випробують у ванні із фізіологічним розчином при температурі 37°С. Криві зміщення навантаження реєструють при швидкості повзуна 10 мм/хв за допомогою установки для випробування механіч 30 них властивостей матеріалів (модель: 1/S, MTS Corp., Міннеаполіс, штат Міннесота), і аналізують за допомогою комп'ютерної програми TestWorks 4 (MTS Corp.) для обчислення максимального навантаження. Механічні властивості хребців L-5 аналізували після того як задні відростки були видалені, а кінцям тіла хребця була надана паралельна форма за допомогою алмазної пили установки для розпилювання кристалів на пластини (Buehler Isomet, Еванстон, штат Іллінойс). Зразки хребців піддають стискувальному навантаженню за допомогою установки для випробування механічних властивостей матеріалів, і аналізують за допомогою комп'ютерної програми TestWorks 4 (MTS Corp.). Для здійснення вимірів на шийці стегнової кістки стегнову кістку розміщують вертикально у патроні для кріплення з проксимальною частиною, спрямованою вгору, і навантаження спрямовують вниз на середню частину головки стегнової кістки. Аналіз здійснювали за допомогою комп'ютерної програми TestWorks 4 (MTS Corp.). Середні значення та середні квадратичні помилки середнього наведені нижче у Таблиці 5 та Таблиці 6. Дані демонструють, що химерні антитіла 788 та 789 підвищують мінеральну густину кістки ("BMD"), вміст мінералів у кістці ("ВМС") та міцність кістки (максимальне навантаження) у оваріектомізованих пацюків. Таблиця 5 Мінеральна густи- Вміст мінералів Мінеральна гус- Вміст мінера- Мінеральна Вміст мінена дистальної у дистальній тина діафізу лів у діафізі густина Обробка ралів у хребці частини стегнової частині стегно- стегнової кістки стегнової хребця (мг) 3 3 3 кістки (мг/см ) вої кістки (мг) (мг/см ) кістки (мг) (мг/см ) Симульована *602 74,1 898 61,2 *587 165 операція IgG 528 68,6 852 60,5 526 149 РТН *744 *95,3 *925 63,2 *642 *180 788 *675 *91,4 *946 *68,6 *703 *209 789 *710 *94,9 *951 *68,4 *721 *209 * Статистично значуще збільшення порівняно з IgG контролем, р