Пухлино-асоційований пептид, що неспецифічно зв’язується з молекулами ii класу лейкоцитарного антигену людини (hla)

Реферат: Винахід належить до пухлино-асоційованого пептиду, який складається з амінокислотної послідовності відповідно до SEQ ID NО: 33, який має здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу II, зокрема з HLA-DRB1*0101, для застосування в медицині. UA 98295 C2 (12) UA 98295 C2 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід відноситься до методів імунотерапії, а також до молекул і клітин, що застосовуються в імунотерапевтичних методах. Зокрема, цей винахід відноситься до імунотерапії раку, в особливості, раку нирки та раку товстої кишки. Крім того, цей винахід відноситься до пухлино-асоційованих пептидних епітопів Т-хелперів, окремо або в поєднанні з іншими пухлино-асоційованими пептидами, які виступають активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції. Зокрема, цей винахід відноситься до 49 нових пептидних послідовностей, одержаних з молекул HLA II класу ліній пухлинних клітин людини, що можуть використовуватися у вакцинних композиціях для викликання протипухлинних імунних реакцій. В цілях даного винаходу, усі довідкові матеріали, що згадані тут, включені шляхом посилань в усій повноті. Стимулювання імунної реакції залежить від наявності антигенів, що визнані імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування антигенів, асоційованих з пухлинами, надало можливість використовувати імунну систему хазяїна для впливу на ріст пухлини. Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних компонентів імунної системи для імунотерапії раку. Окремі елементи клітинної імунної реакції мають здатність безпосередньо розпізнавати та руйнувати клітини пухлин. Ізоляція цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) з популяцій пухлинних клітин або з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини відіграють значну роль в природних імунних захистах проти раку (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112). + + Зокрема, Т-клітини CD8 (TCD8 ), котрі розпізнають молекули головного комплексу гістосумісності (МНС) Класу І, що презентують пептиди зазвичай в 8-10 залишків, одержані з білків, які розташовані у ядрі чи цитозолі, відіграють важливу роль в цій реакції. МНС-молекули людини також мають назву лейкоцитарних антигенів людини (HLA). Є два класи МНС-молекул: молекули МНС-І, які можна знайти на більшості клітин, котрі мають ядро, що презентують пептиди, утворені в результаті протеолітичного розпаду ендогенних протеїнів та більш крупних пептидів. МНС-молекули класу II можна знайти тільки на професійних антиген-презентуючих клітинах (АПК), та вони презентують пептиди екзогенних протеїнів, поглинених клітинами АПК в ході ендоцитозу, і проходять подальшу обробку. Комплекси пептиду та МНС-І розпізнаються СБ8-позитивними цитотоксичними Т-лімфоцитами, а комплекси пептиду та МНС-ІІ розпізнаються CD4-позитивними Т-клітинами- хелперами. СD4-позитивні Т-клітини-хелпери грають важливу роль в регуляції ефекторних функцій протипухлинних реакцій Т-клітин, та з цієї причини iдентифікація СD4-позитивних епітопів Тклітин, одержаних з пухлино-асоційованих антигенів (ПАА) може мати велике значення для розробки фармацевтичних продуктів для викликання протипухлинних імунних реакцій (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J.J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoerabryonic antigen. Clin. Cancer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NYESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(15):8862-7). На моделях ссавців, наприклад, мишей, було продемонстровано, що навіть за відсутністі цитотоксичних Т-лімфоцитарних (ЦТЛ) ефекторних клітин (тобто, СD8-позитивних Тлімфоцитів), CD4-позитивні Т-клітини є достатніми для візуалізації інгібування пухлин шляхом інгібування ангіогенезу завдяки секреції гамма-інтерферону (IFN) (Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000. CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12:677-686). Крім того, було продемонстровано, що СD4-позитивні Т-клітини, які розпізнають пептиди з пухлиноасоційованих антигенів, представлених молекулами HLA класу II, можуть протидіяти розвитку пухлини шляхом індукування Антитіл (Аb) (Kennedy, R.C., М.Н. Shearer, A.M. Watts, and R.K. + Bright. 2003. CD4 T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 63:1040-1045). На відміну від пухлиноасоційованих пептидів, які зв'язуються з молекулами HLA класу І, лише невелика кількість лігандів класу II ПАА була описана до цього часу (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Оскільки визначальна експресія молекул HLA класу II зазвичай притаманна лише клітинам імунної системи (Mach, В., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), можливість виділення пептидів класу II безпосередньо з первинних пухлин не вважалася ймовірною. Отже, описувались різноманітні стратегії щодо включення відповідних антигенів у шлях перетворення 1 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 класу II антиген-презентуючими клітинами (АПК), наприклад, інкубування АПК з антигеном, що представляє інтерес, для забезпечення можливості його захвату, обробки та презентування (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med 189:767-778), або трансфекція клітин генами чи міні-генами, що кодують відповідний антиген та включені в інваріантний ланцюжок, який сприяє транслокації антигенів до лізосомного компартменту обробки та компонування МНС класу II (МIIС). Для того, щоб пептид індукував (викликав) клітинну імунну реакцію, він повинен бути зв'язаним з МНС-молекулою. Цей процес залежить від алелі МНС-молекули та специфічного поліморфізму амінокислотної послідовності пептиду. Зв'язані з МНС класу І пептиди зазвичай мають довжину 8-10 залишків, яка вміщує два консервативні залишки ("домени") в своїй послідовності, що взаємодіють з відповідною порожниною зв'язування МНС-молекули. За відсутності запалення, експресія МНС-молекул класу II, переважно, зводиться до клітин імунної системи, зокрема, професійних антиген-презентуючих клітин (АПК), наприклад, моноцитів, клітин, що походять з моноцитів, макрофагів, дендритних клітин. Антигени, які розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними Т-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з усіх класів білків, таких як, ферменти, рецептори, транскрипційні фактори та ін. Крім того, пухлино-асоційовані антигени, наприклад, також можуть бути присутні тільки в клітинах пухлин, таких як продукти генів, що мутували, або з альтернативних відкритих рамок зчитування (ORF), чи від сплайсінгу білків (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome. Science. 2004 Apr 23; 304 (5670):587-90). Іншим важливим класом пухлино-асоційованих антигенів є тканино-специфічні структури, такі як СТ-антигени (антигени раку сем'яників), які експресуються в різних видах пухлин та в здоровій тканині сем'яників. Були ідентифіковані різноманітні антигени, асоційовані з пухлинами. Крім того, проведена значна дослідницька робота по ідентифікації додаткових антигенів, асоційованих з пухлинами. Деякі групи асоційованих з пухлинами антигенів, також згадуваних в літературі як пухлиноспецифїчні антигени, є тканино-специфічними. Приклади включають тирозиназу для меланоми, PSA та PSMA для раку простати та хромосомні кросовери, такі як bcr/abl в лімфомі, але не обмежуються ними. Однак, ряд ідентифікованих пухлинних антигенів зустрічається в багатьох видах пухлин, а деякі з них, такі як онкогенні білки та/або гени-супресори пухлин (огляд генівсупресорів пухлин для раку нирок наведено, наприклад, в роботі Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170(6 Pt 1):2163-72), котрі фактично викликають трансформаційну дію, зустрічаються практично в усіх видах пухлин. Наприклад, звичайні білки клітин, контролюючі ріст та диференціацію клітин, такі як р53 (що є прикладом гена-супресора пухлин), ras, c-met, myc, pRB, VHL та HER-2/neu, можуть накопичувати мутації, що призводить до посилення експресії цих генних продуктів, таким чином роблячи їх онкогенними (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). Ці білки-мутанти можуть бути мішенню пухлино-специфічної імунної реакції при багатьох видах ракових захворювань. Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними Т-лімфоцитами (ЦТЛ) як пухлиноспецифічні антигени, та з метою використання в лікуванні, треба дотримуватися деяких попередніх умов. Антиген має бути синтезований, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи він має бути присутній в здорових клітинах в достатньо невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутній в одному виді пухлин, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій на клітину). Істотною є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), котрий одержується з асоційованого з пухлиною антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo. До цього часу, були описані різноманітні стратегії щодо включення антигенів до шляхів перетворення класу II. Можна інкубувати антиген-презентуючі клітини (АПК) з відповідним антигеном, що представляє інтерес, для його прийняття та обробки (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M, Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med 189, 767-778). Інші стратегії використовують гібридні білки, які вміщують цільові послідовності для лізосом. Такі гібридні білки, експресовані в АПК, направляють антигени до ділянки обробки класу II (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J, Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430). 2 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Т-хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, що запускають реакцію цих клітин типу ТН1, підтримують + ефекторнІ функції CD8 Т-клітин-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/МНС на своїх клітинних поверхнях. Таким способом, пептидні епітопи Т-хелперів, самостійно чи в комбінації з іншими пухлино-асоційованими, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Основна задача розробки протипухлинної вакцини полягає, таким чином, в ідентифікації та характеристиці нових асоційованих з пухлинами антигенів та епітопів імуногенних Т-хелперів, + які походять з них, що можуть розпізнаватися CD4 ЦТЛ. Отже, задача цього винаходу полягає в знаходженні нових амінокислотних послідовностей для таких пептидів, що мають здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу II. Відповідно до цього винаходу, така задача вирішується визначенням пухлино-асоційованого пептиду, що обирається з групи пептидів, яка вміщує, принаймні, послідовність відповідно до будь-якої послідовності від SEQ ID № 1 до SEQ ID № 49 доданого переліку, де пептид має здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу II, за умови, що пептид не є неушкодженим поліпептидом, асоційованим з пухлиною людини. В цьому винаході автори демонструють, що можливо виділяти та характеризувати пептиди, що зв'язуються з молекулами HLA класу II, безпосередньо з пухлин ссавців, переважно, пухлин людини, зокрема, солідних пухлин, наприклад, гіпернефроми та карциноми товстої кишки. Інфільтруючі моноцити експресували МНС-молекули класу II, як і пухлинні клітини, і, крім того, пухлинні клітини демонстрували підвищуючу регуляцію декількох генних продуктів, індукованих цитокінами чи хемокінами, наприклад, генних продуктів, індукованих гамма-інтерфероном. Цей винахід пропонує пептиди, що походять з антигенів, асоційованих з пухлиногенезом, та їхню можливість в достатній мірі зв'язуватись з молекулами HLA класу II для викликання імунної реакції лейкоцитів людини, зокрема, лімфоцитів, в особливості, Т-лімфоцитів, головним чином, СD4-позитивних Т-лімфоцитів, ще конкретніше - CD4-позитивних Т-лiмфоцитiв, які є посередниками імунних реакцій Т Н1-типу. Пептиди мають походження з пухлино-асоційованих антигенів, зокрема, пухлино-асоційованих антигенів з функціями, наприклад, в протеолізі, ангіогенезі, рості клітин, регуляції клітинного циклу, діленні клітин, регуляції транскрипції, регуляції трансляції, інвазії тканин, включаючи, наприклад, пухлино-асоційовані пептиди з матричної металопротеїнази 7 (ММР7; SEQ ID № 1) та зв'язаний з iнсуліноподібним фактором росту білок 3 (IGFBP3; SEQ ID № 25). В цьому винаході автори також надають незаперечний доказ того, що пухлино-асоційовані пептиди, які в достатній мірі неспецифічно зв'язуються з молекулами HLA класу II, зокрема ті алелі HLA класу II, що генетично кодуються локусами HLA DR геному людини, мають здатність викликати імунні реакції, в яких посередниками виступають CD4-позитивні Т-клiтини людини. СD4-позитивні Т-клітини були виділені з периферичної крові людини, демонструючи те, що заявлені пептиди є прийнятними для запуску Т-клітинних реакцій імунної системи людини проти обраних пептидів в пептидомі пухлинної клітини. Оскільки пептиди можуть синтезуватись хімічним способом та використовуватись як активні фармацевтичні інгредієнти фармацевтичних препаратів, пептиди, запропоновані авторами у винаході, можна використовувати для імунотерапії, переважно, імунотерапії раку. Щоб iдентифікувати ліганди HLA класу II з ПАА для розробки імунотерапії на основі пептидів, автори зробили спробу виділити HLA-DR-презентовані пептиди безпосередньо з препарованих солідних пухлин, зокрема, гіпернефроми (RCC), про які були одержані дані, що вони здатні експресувати молекули класу II (Gastl, G., Т. Ebert, C.L. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W. Aulitzky, and N.H. Bander. 1996. Major histocompatibility complex class I and class II expression in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma. J. Urol. 155:361-367). Навіть якщо більшість пухлинних клітин були клас ІІ-негативними, сучасні мас-спектрометри повинні забезпечити чутливість, потрібну для ідентифікації пептидів класу II з мінімальної кількості пухлинних клітин, або з інфільтруючих лейкоцитів, які можуть кросс-презентувати ПАА, або з клітин строми по периметру зростаючої пухлини. Причини того, що RCC була обрана для демонстрації технічних доказів концепції, викладені нижче: Близько 150 000 людям в усьому світі кожного року ставиться діагноз "гіпернефрома" (RCC), хвороба, що асоціюється з високим рівнем смертності та призводить приблизно до 78000 смертей на рік (Pavlovich, С.Р. and L.S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma. Nat. Rev. Cancer 4:381-393). Якщо діагностуються метастази, виживаність протягом одного року зменшується приблизно до 60 % (Jemal, A., R.C. Tiwari, Т. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, and M.J. Thun. 2004. Cancer statistics, 2004. CA Cancer 3 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 J. Clin. 54:8-29), що підкреслює високу незадоволену потребу в цій iндикації. Оскільки RCC вважається імуногенною пухлиною (Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy on progression. Моl Biother. 1988; 1:14-20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, et al. Interferon gamma-1b compared with placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl J Med. 1998;338:1265), про що свідчить існування пухлино-реагуючих та пухлино-інфільтруючих ЦТЛ (Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990. Characterization of the cytolytic activity of CD4-positive and CD8-positive tumorinfiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Cancer Res. 50:2363-2370), були розпочаті клінічні дослідження по розробці протипухлинних вакцинацій на пептидній основі (Wierecky J, Mueller M, Brossart P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1. Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). Однак, внаслідок відсутності епітопів Т-клітин-хелперів з ПАА, молекулярно визначені вакцини зазвичай вміщують пептиди, функціонуючі тільки як ліганди класу І. В науковій роботі, що призвела до цього винаходу, автори зуміли виділити ліганди класу II з десяти зразків RCC, трьох колоректальних карцином (ССА) та однієї перехідно-клітинної карциноми (ТСС, уротеліальна карцинома). Лише деякі ліганди з ПАА, iдентифіковані в цьому підході, мають спільну здатність 1. походити з антигенів з відомою асоційованістю з пухлиною; 2. зв'язуватися з найбільш типовим DR-алелем HLA класу II, HLA DRB 1*0101; та 3. мати характеристики, що виділяють їх з більшості лігандів HLA класу II, оскільки вони відповідають критеріям відносно їхньої первинної амінокислотної послідовності, що дає їм змогу неспецифічно зв'язуватись з молекулами HLA-DR, як мінімум, з двох різних алелів. Як показано нижче на пептиді з ММР7 (SEQ ID № 1), було виявлено, що ці пухлиноасоційовані пептиди, які неспецифічно зв'язуються з HLA-DR, розпізнаються CD4-позитивними Т-клітинами. Перший аспект винаходу пропонує пептид, який вміщує амінокислотну послідовність, згідно із будь-яким ідентифікаційним номером від SEQ ID № 1 до SEQ ID № 49, чи її варіант, за умови, що пептид не є неушкодженим поліпептидом людини, з якого одержується амінокислотна послідовність (тобто, одна з повних послідовностей, зазначених в ідентифікаційних даних ділянки локуса (номер за каталогом див. в доданій таблиці 1 нижче). Як описується нижче, усі пептиди, що утворюють базис цього винаходу, представлені клітинами, що несуть МНС класу II (RCC). хоча та міра, в якій ця реакція буде індукуватися, може варіюватися в залежності від конкретного пептиду. Таким чином, уcі ці конкретні пептиди, а також інші пептиди, які вміщують послідовність (тобто, похідні пептиди), будуть, найбільш ймовірно, викликати специфічну Т-клітинну реакцію, хоча та міра, в якій така реакція буде індукуватись, може варіюватися в залежності від конкретного пептиду. Різниця, наприклад, може бути викликана мутаціями в зазначених пептидах (див. нижче). Фахівцю, який має значний досвід в цій галузі, добре відомі методи, що можуть бути застосовані для визначення міри індукування реакції окремим пептидом, зокрема, із посиланням на наведені тут приклади та відповідні літературні джерела. По суті, пептид за цим винаходом переважно складається з амінокислотної послідовності, відповідно до ідентифікаційного номеру від SEQ ID № 1 до SEQ ID № 49, чи її варіанту. Вираз "складається, по суті, з" буде означати, що пептид, згідно із цим винаходом, на додаток до послідовності за номерами від SEQ ID № 1 до SEQ ID № 49, чи її варіанту, вміщує додаткові N- та/або С-термінальні ділянки амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як ключова послідовність пептиду, вміщуючи модель зв'язку, та як епітоп імуногенного Т-хелпера. Однак, ці ділянки можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду, відповідно до цього винаходу, в клітини. В одному з втілень цього винаходу, пептид цього винаходу вміщує 80 N-термінальних амінокислот HLA-DR- антиген-асоційованого інваріантного ланцюгу (рЗЗ, надалі "Іі"), одержаного з NCBI, інвентарний номер в генному банку (GenBank) X00497 (Strubin, M., Mach, В. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DRassociated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)). Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюжки, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (наприклад, шляхом заміни їх боковим ланцюжком іншого природно існуючого амінокислотного залишку чи якимось іншим боковим ланцюжком) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою HLA, по суті, в такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної 4 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотної послідовності. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде якнайменше утримувати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися з прийнятною молекулою МНС, такою як HLA-A, та якнайменше утримувати, чи навіть поліпшувати, здатність утворювати активований ЦТЛ, який може розпізнавати та знищувати клітини, котрі експресують поліпептид, що вмішує амінокислотну послідовність, як визначено в аспектах винаходу. Як можна дізнатися з бази даних, описаної далі, окремі позиції HLA-Aзв'язуючих пептидів є, як правило, доменними залишками, формуючими ключову послідовність, що відповідає за зв'язок у порожнини зв'язування HLA. Ті амінокислотні залишки, що не є суттєвими для взаємодії з Т-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має суттєвого впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНС. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид винаходу може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи варіант, що надається. Стосовно МНС-презентуючих пептидів (класу II) відомо, що ці пептиди складаються з "ключової послідовності", яка має певний HLA-специфічний амінокислотний фрагмент та додаткові N- та/або С-термінальні подовження, які не втручаються у функцію ключової послідовності (тобто, вважаються не релевантними до взаємодії пептиду i Т-клітини). N- та/або С-термінальні подовження можуть мати довжину від 1 до 10 амінокислот, відповідно. Тобто, переважний пептид цього винаходу демонструє загальну довжину від 9 до 100 амінокислот, переважно від 9 до 30 амінокислот. Цей пептид може використовуватись безпосередньо для завантаження МНС-молекул класу II, або послідовність може клонуватись у вектори, згідно із наведеним нижче описанням. Оскільки ці пептиди формують кінцевий продукт обробки більш крупних пептидів в межах клітини, також можуть використовуватися довші пептиди. Пептиди винаходу можуть мати будь-який розмір, але як правило вони можуть бути меншими ніж 100000 за молекулярною вагою, переважно меншими 50 000, ще більш переважно меншими 10000 та, зазвичай, приблизно 5000. Що стосується кількості амінокислотних залишків, пептиди винаходу можуть мати менше 1000 залишків, переважно менше, ніж 500 залишків, та ще більш переважно - менше 100 залишків. Якщо пептид, більший ніж приблизно 12 амінокислотних залишків, використовується безпосередньо для зв'язування з МНС-молекулою, бажано, щоб залишки, розташовані по краях основної ділянки зв'язування HLA, не завдавали значного впливу здатності пептиду специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування МНС-молекули чи представляти пептид в ЦТЛ. Однак, як вже зазначалося вище, перевага надається використанню більш крупних пептидів, особливо, коли вони кодуються полінуклеотидом, оскільки ці більш крупні пептиди можуть розділятися на частини відповідними антиген-презентуючими клітинами. Приклади пептидів МНС-лігандів, мотиви, варіанти, а також окремі приклади N- та/або Стермінальних подовжень можна, наприклад, одержати в базі даних SYFPEITHI (Rammensee Н, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9.) на сайті http://syfpeithi.bmiheidelberg.com/ тa у посиланнях, наведених на ньому. В якості необмежених прикладів, окремі пептиди для HLA-DR в базі даних - це KНКVYACEVTHQGLSS, одержаний з ланцюгу Ig kappa 188-203 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr; 27(4):1014-21); KVQWKVDNALQSGNS, одержаний з ланцюгу Ig kappa 145-159 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr; 27(4): 1014-21), LPRLIAFTSEHSHF, одержаний з GAD65 270-283 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10):2405-15) або FFRMVISNPAATHQDIDFLI, одержаний з GAD65 556-575 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10):2405-15). Крім того, пептиди також можуть походити з мутованих послідовностей антигенів, наприклад, у випадку ATGFKQSSKALQRРVAS, що одержується з гібридного білку bcr-abl 210 kD (ten Bosch et al. Blood. 1996 Nov 1; 88(9):3522-7), GYKVLVLNPSVAAT, одержаної з HCV-1 NS3 28-41 Diepolder et al. J Virol. 1997 Aug; 71(8):6011-9), або FRKQNPDIVIQYMDDLYVG, одержаної з HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg et al. J Immunol. 1999 Jan 1; 162(1): 152-60). Усі "доменні" амінокислоти (див. Friede et al., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7; 1316(2):85-101; Sette et al. J Immunol. 1993 Sep 15; 151(6):3163-70.; Hammer et al. Cell. 1993 Jul 16; 74(1):197-203., and Hammer et al. J Exp Med. 1995 May 1; 181(5):1847-55. As examples for HLA-DR4) позначаються жирним шрифтом, а передбачувані ключові послідовності підкреслюються. Усі описані вище пептиди підпадають під термін "варіанти" даної амінокислотної послідовності. Термін "пептид" трактується авторами винаходу як такий, що включає не тільки молекули, в яких амінокислотні залишки з'єднуються пептидними зв'язками (-CO-NH-), але також молекули, 5 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 де пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть вироблятися за методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі Meziere et al (1997) J. Immunol. 159,3230-3237, яка включена в даний документ шляхом посилання. Цей підхід включає формування псевдо-пептидів, які включають зміни із залученням основи, а не орієнтації бокових ланцюгів. Автори Meziere et al (1997) показали, що, якнайменш, для реакцій клітин МНС класу II і Т-хелперів такі псевдо-пептиди є корисними. Ретро-інверсивні пептиди, які вміщують зв'язки NH-CO замість пептидних зв'язків CO-NH, набагато більш стійкі до протеолізу. Як правило, пептид винаходу - це пептид, котрий при експресії антиген-презентуючою клітиною може бути оброблений так, що створюється фрагмент, який здатний зв'язатися з відповідною молекулою МНС та може бути представлений відповідною клітиною і викликати належну Т-клітинну реакцію. Буде братися до уваги той факт, що фрагмент, який створюється з пептиду, також може бути пептидом винаходу. Прийнятним є те, що пептид винаходу вміщує частину, котра включає дану амінокислотну послідовність або її частину чи варіант, та додаткову частину, яка надає якусь бажану властивість. Наприклад, додаткова частина може включати іншій епітоп Т-клітини (незалежно від того, чи походить він з того ж поліпептиду, що й перша частина епітопа Т-клітини), або вона може включати білок-носій чи пептид. Отже, в одному з втілень винаходу пептид являє собою укорочений білок людини чи гібридний білок або фрагмент білка та іншої поліпептидної частини, за умови, що частина, яка включає білок людини, вміщує одну чи декілька амінокислотних послідовностей винаходу. В особливо переважному втіленні винаходу, пептид включає амінокислотну послідовність винаходу та, якнайменш, один додатковий епітоп Т-клітини, причому додатковий епітоп Тклітини здатний полегшувати викликання Т-клітинної реакції, спрямованої на тип пухлини, що аберантно експресує пухлино-асоційований антиген. Таким чином, пептиди винаходу включають так звані "нанизані" поліпептиди, котрі також можуть використовуватися як вакцини. З наведених нижче даних зрозуміло, що в деяких випадках застосування пептиди винаходу можуть використовуватись безпосередньо (тобто, вони не утворюються шляхом експресії полінуклеотиду в клітині пацієнта чи в клітині, що вводиться пацієнту); в таких випадках бажано, щоб пептид мав менше, ніж 100 чи 50 залишків. Переважний пептид цього винаходу має загальну довжину від 9 до 30 амінокислот. Бажано, щоб пептиди винаходу мали здатність зв'язуватись з HLA-DR. Зокрема, переважним є те, щоб пептиди зв'язувалися селективно з HLA-DRB1*0101. В іншому аспекті цього винаходу, подібно до ситуації, роз'ясненої вище для МНС-молекул класу II, пептиди цього винаходу (хоча і відносяться головним чином до МНС класу І) можуть використовуватись для викликання специфічної реакції МНС класу II. (В іншому аспекті цього винаходу, подібно до ситуації, роз'ясненої вище для МНС-молекул класу II, пептиди винаходу можуть використовуватись для викликання реакції Т-клітин МНС класу І). Тобто, переважний пептид цього винаходу демонструє загальну довжину від 9 до 16 амінокислот, переважно, від 9 до 12 амінокислот. Мається на увазі, що такі пептиди можуть використовуватись (наприклад, у вакцині) як довші пептиди, подбні пептидам МНС класу II. Методи ідентифікації специфічних для МНС класу І "Ключових послідовностей", які мають визначений HLA-специфічний амінокислотний мотив для молекул HLA класу І, відомі спеціалістам та можуть бути спрогнозовані, наприклад, комп'ютерними програмами РАРrоС (http://www.unituebingen.de/uni/kxi/) та SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de). Пептиди винаходу, зокрема, є прийнятними для імунотерапевтичних методів з метою визначення та знищення клітин, котрі аберантно експресують поліпептиди, що формують основу для пептидів цього винаходу. Оскільки ці специфічні пептиди, які складаються з певних амінокислотних послідовностей, зв'язуються з HLA-DR, переважно, щоб пептиди винаходу були такими, що зв'язуються з HLA-DR, та зв'язаний таким чином HLA-DR-пептидний комплекс, коли він присутній на поверхні належної антиген-презентуючої клітини, здатний призводити до виробництва ЦТЛ, який розпізнає клітину, що аберантно експресує поліпептид, вміщуючий певну амінокислотну послідовність. В одному з втілень цього винаходу, пептид винаходу вміщує 80 N-термінальних амінокислот HLA-DR антиген-асоційованого інваріантного ланцюгу (р33, надалі "Іі"), отриманого в NCBI, інвентарний номер в генному банку (GenBank) X00497 (також див. нижче). Під терміном "аберантно експресовані" ми маємо на увазі, що поліпептид надмірно експресований, в порівнянні з нормальними рівнями експресії, або що ген є мовчазним у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Термін "надмірно експресований" трактується авторами винаходу таким чином: поліпептид присутній на рівні, що принаймні в 1.2 рази перевищує рівень, який спостерігається в нормальній тканині; та 6 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно, принаймні, в 2 рази та ще більш переважно, принаймні, в 5 або 10 разів більше рівня, присутнього в нормальній тканині. Пептиди (принаймні ті, що вміщують пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані за допомогою Fmoc-поліамідного способу синтезу пептидів твердої фази, як розкривається в роботі Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 та посиланнях на літературні джерела, наведених в ній. Тимчасовий захист N-аміно-групи забезпечується 9фторенілметилоксикарбонільною (Fmoc) групою. Повторне розщеплювання цієї високолабільної основної захисної групи виконується із використанням 20 % піперидину в N,Nдіметилформаміді. Функціональність бокових ланцюгів може захищатися у виді їхніх простих бутилових ефірів (у випадку серинового треоніну і тирозину), складних бутилових ефірів (у випадку глютамінової кислоти та аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільних похідних (у випадку лізину та гістидину), тритилового похідного (у випадку цистеїну) та 4-метокси-2,3,6тріметилбензолсульфонільного похідного (у випадку аргініну). Коли глютамін чи аспарагін є Стермінальними залишками, використовується 4,4'-дiметоксибензогідрильна група для захисту функціональних амідних груп бокових ланцюгів. В якості твердофазної підкладки використовують полідиметил-акриламідний полімер, що складається з трьох мономерів, диметилакриламіду (основний мономер), бісакрилоїлетилендіаміну (крос-лінкер) та метилового ефіру акрилоїлсаркозину (функціональна речовина). Використовувана речовина пептиднополімерного зв'язку, що розщеплюється, - це кислотно-лабільна похідна 4-гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Усі амінокислотні похідні додаються у виді їхніх сформованих симетричних ангідридних похідних, за винятком аспарагіну та глютаміну, що додаються за допомогою реверсованої процедури зв'язку, де посередником виступає N,N-діциклогексилкарбодиімід/1гідроксибензотриазол. Контроль усіх реакцій зв'язування та зняття захисту ведеться із використанням нінгідринового, тринітробензол-сульфоново-кислотного чи ізотинового тестів. Після завершення синтезу пептиди звільняються від полімерної підкладки з одночасним видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 % трифтороцтовою кислотою, яка вміщує 50 % суміші поглиначів. Поглиначі, які зазвичай використовуються, - це етандітіол, фенол, анізол та вода; точний вибір залежить від амінокислот-складникiв пептиду, який синтезується. Крім того, можливе поєднання твердофазного та рідиннофазного синтезу пептидів (див., наприклад, роботу Bruckdorfer T, Marder О, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb; 5(1):29-43 та посилання, наведені в ній). Трифтороцтова кислота (ТФК) видаляється шляхом випарювання у вакуумі, з подальшим розтиранням в порошок з діетиловим ефіром, з одержанням первинного пептиду. Будь-які присутні поглиначі видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дає первинний пептид, вільний від поглиначів. Реактиви для пептидного синтезу, взагалі, можна одержати в компанії Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. Очищення може виконуватися із використанням будь-кого одного чи кількох методів, таких як, гель-хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із використанням градієнтного розділення ацетонітрил/вода. Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, зворотнофазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після гідролізу кислот та мас-спектрометричного аналізу із бомбардуванням прискореними атомами (БПА), а також мас-спектрометричного аналізу MALDI та ESI-Q-TOF. Ще один аспект винаходу дає нуклеїнову кислоту (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид винаходу. Полінуклеотидом може бути ДНК, кДНК, ПНК, СНК, РНК чи їхні комбінації, та вони можуть вміщувати або не вміщувати інтрони, за умови, що полінуклеотид кодує пептид. Без сумніву, тільки ті пептиди, що вміщують природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природними пептидними зв'язками, кодуються полінуклеотидом. Інший аспект винаходу пропонує вектор експресії, здатний експресувати поліпептид, відповідно до винаходу. Були розроблені різноманітні методи для оперативного зв'язку полінуклеотидів, зокрема, ДНК, з векторами, наприклад, за допомогою комплементарних когезійних сайтів термінації. Наприклад, комплементарні гомополімерні ділянки можуть додаватися до ДНК-сегменту для введення у векторну ДНК. Вектор та ДНК-сегмент потім з'єднуються шляхом водневого зв'язку між комплементарними гомополімерними кінцями для формування рекомбінантних молекул ДНК. Синтетичні лінкери, які вміщують один чи кілька рестрикційних сайтів, забезпечують альтернативний метод з'єднання ДНК-сегменту з векторами. ДНК-сегмент, сформований 7 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рестрикційним гідролізом ендонуклеази, як описувалось раніше, обробляється ДНКполімеразою бактеріофага Т4 або ДНК-полімеразою І зі штаму Е.соlі, ферментів, що видаляють виступаючі, 3'- однониткові сайти за допомогою своїх 3'-5'-екзонуклеотичних функцій та заповнюють заглиблені 3'-кінці завдяки процесам полімеризації. Комбінація цих функцій, таким чином, генерує ДНК-сегменти з тупими кінцями. Сегменти з тупими кінцями потім інкубуються з великим молярним надлишком молекул лінкерів в присутності ферменту, що здатний каталізувати зшивання ДНК-молекул з тупими кінцями, таких як ДНК-лігаза бактеріофагу Т4. Таким чином, продуктами реакції є ДНК-сегменти з послідовностями полімерних лінкерів на кінцях. Ці ДНК-сегменти потім розщеплюються відповідним рестрикційним ферментом та зшиваються з вектором експресії, що був гідролізований ферментом, який утворює сайти термінації, сумісні з сайтами ДНК-сегмента. Синтетичні лінкери, які вміщують ряд рестрикційних сайтів ендонуклеази, доступні для придбання в ряді компаній, включаючи International Biotechnologies Іnс, Нью Хейвен, Цинцинаті, США. Бажаним способом модифікації ДНК, що кодує поліпептид винаходу, є використання ланцюгової полімеразної реакції, як розкривається в роботі Saiki et al (1988) Science 239,487491. Цей метод може застосовуватись для введення ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення належних рестрикційних сайтів, чи для модифікації ДНК іншими прийнятними шляхами, які відомі в цій галузі. В цьому методі до ферментативно примноженої ДНК з обох сторін примикають два праймери, котрі самі по собі включаються у примножену ДНК. Зазначені праймери можуть вміщувати сайти розпізнавання рестрикційних ендонуклеаз, що можна використовувати для клонування векторів експресії за методами, відомими в цій галузі. ДНК (або у випадку ретровірусних векторів, РНК) потім експресується в належному організмі хазяїна для утворення поліпептиду, що становить сполуку цього винаходу. Таким чином, ДНК, що кодує поліпептид, який є сполукою винаходу, може використовуватися за відомими методами, відповідним чином модифікованими згідно із доктринами, вміщеними тут, для створення вектору експресії, що згодом використовується для трансформації відповідної клітини хазяїна з метою експресії та формування поліпептиду винаходу. Такі методи розкриті в патентах США: № 4,440,859, виданий 3 квітня 1984 р. авторам Rutter et al, № 4,530,901, виданий 23 липня 1985 p. автору Weissman, № 4,582,800, виданий 15 квітня 1986 p. автору Crowl, № 4,677,063, виданий 30 червня 1987 р. авторам Mark et al, № 4,678,751, виданий 7 липня 1987 p. автору Goeddel, № 4,704,362, виданий 3 листопада 1987 р. авторам Itakura et al, № 4,710,463, виданий 1 грудня 1987 p. автору Murray, № 4,757,006, виданий 12 липня 1988 р. авторам Toole, Jr. et al, № 4,766,075, виданий 23 серпня 1988 p. авторам Goeddel et al та № 4,810,648, виданий 7 березня 1989 p. автору Stalker, всі з яких включені в цей документ шляхом посилань. ДНК (або у випадку ретровiрусних векторів, РНК), що кодує поліпептид, який є сполукою винаходу, може з'єднуватись з різними іншими ДНК-послідовностями для введення в належний організм хазяїна. Супутня ДНК буде залежати від характеру хазяїна, способу введення ДНК до хазяїна та від того факту, чи бажане епісомне утримання або інтеграція. В цілому, ДНК вводиться у вектор експресії, такий як плазміда, в належній орієнтації та з відповідною рамкою зчитування для експресії. При необхідності, ДНК може зв'язуватися з належними нуклеотидними послідовностями транскрипційного і трансляційного регуляторного контролю, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи взагалі є доступними у векторі експресії. Потім вектор вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. В цілому, не всі організми-хазяїни будуть трансформуватися вектором. Таким чином, виникає необхідність обрати трансформовані клітини хазяїна. Одна з методик вибору включає введення у вектор експресії ДНК-послідовності з будь-якими необхідними контрольними елементами, що кодує специфічну рису у трансформованій клітині, наприклад, резистентність до антибіотиків. Як альтернативний варіант, ген для такої специфічної риси може бути на іншому векторі, котрий використовується для ко-трансформації бажаної клітини хазяїна. Клітини хазяїна, трансформовані рекомбінантною ДНК винаходу, потім культивуються протягом достатнього часу в належних умовах, які відомі досвідченим фахівцям, з урахуванням розкритих в цьому документі доктрин, щоб дозволити експресію поліпептиду, котрий згодом може бути виділений. Існує багато систем експресії, включаючи бактерії (наприклад, Е. соlі та Bacillus subtilis), дріжджі (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), нитковидні грибки (наприклад, Aspergillus), клітини рослин, тварин і комах. Переважною системою можуть бути RCC або клітини Awells. 8 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Промотором є елемент контролю експресії, що сформований ДНК-послідовністю, яка забезпечує зв'язування РНК-полімерази і транскрипцію. Промоторні послідовності, порівнювані із зразковими бактеріальними хазяїнами, як правило, знаходяться у векторах плазмід, які вміщують зручні сайти рестрикції для введення ДНК-сегмента цього винаходу. Типовими векторними плазмідами прокаріотів є pUC18, pUC19, pBR322 та pBR329, які можна придбати в Biorad Laboratories, (Річмонд, Каліфорнія, США) та рТrс99А і рKK223-3, які продає компанія Pharmacia, Piscataway, Нью-Джерсі, США. Типовою векторною плазмідою клітин ссавців є pSVL, що є в наявності в компанії Pharmacia, Piscataway, Нью-Джерсі, США. Цей вектор використовує останній промотор SV40, для викликання експресії клонованих генів, і найвищий рівень експресії спостерігається в Т-антигенутворюючих клітинах, таких як клітини COS-1. Прикладом індукованого вектора експресії у ссавців є pMSG, який також можна придбати в Pharmacia. Цей вектор використовує індукований глюкокортикоїдом промотор вірусу пухлини грудей у мишей з довгим термінальним повтором для викликання експресії клонованого гена. Прийнятними плазмідними векторами дріжджів є pRS403-406 та pRS413-416, які доступні для придбання в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Каліфорнія 92037, США. Плазміди pRS403, pRS404, pRS405 та pRS406 - це дріжджові інтегровані плазміди (YIp), що включають специфічні маркери дріжджів HIS3, TRP1, LEU2 та URA3. Плазміди pRS413-416 - це дріжджові центромерні плазміди (Ycps). Існують також інші вектори та системи експресії, для використання з клітинами різних хазяїв. Цей винахід також відноситься до клітини хазяїна, що трансформується полінуклеотидним вектором даного винаходу. Клітина хазяїна може бути прокаріотом чи еукаріотом. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами хазяїна, в деяких обставинах це типові штами Е. соlі, такі як, наприклад, штами DH5 Е. соlі, які можна придбати в Bethesda Research Laboratories Inc., Бетесда, Мерiленд, США, та RR1, які доступні для придбання в American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, Меріленд, США (№ ATCC 31343). Переважні еукаріотичні клітини хазяїна включають клітини дріжджів, комах та ссавців, переважно клітини хребетних, такі як клітини мишей, пацюків, мавп чи фібробластичні та ниркові клітинні лінії людини. Дріжджові клітини хазяїна включають YPH499, YPH500 та YPH501, які доступні для придбання в Stratagene Cloning Systems, Ла Джолла, Каліфорнія 92037, США. Переважні клітини хазяїна у ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), що можна придбати в АТСС як CCL61; клітини ембріона NIH швейцарської миші (NIH/3T3), які можна придбати в АТСС як CRL 1658; клітини COS-1, виділені з нирок мавпи, що є в наявності для продажу в АТСС як CRL 1650, та клітини 293, які представляють клітини нирок ембріону людини. Переважними клітинами комах є клітини Sf9, в які можуть вводитись вектори експресії бакуловірусу. Трансформація клітин хазяїна ДНК-конструкцією цього винаходу виконується за допомогою добре відомих методів, що, як правило, залежать від типу використовуваного вектору. Трансформація прокаріотичних клітин хазяїна описана, наприклад, в роботах Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,2110 та Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Трансформація дріжджових клітин описана в роботі Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Метод Бегса - Beggs (1978) Nature 275,104-109 - також є прийнятним. Стосовно клітин хребетних, реактиви, які використовуються для трансфекції таких клітин, наприклад, фосфат кальцію та DEAE-декстран чи ліпосомні композиції, можна придбати в компаніях Stratagene Cloning Systems або Life Technologies Inc., Gaithersburg, Меріленд, 20877, США. Електропорація також прийнятна для трансформації та/або трансфекції клітин і є добре відомим методом трансформації дріжджових клітин, бактеріальних клітин, клітин комах та хребетних. Успішно трансформовані клітини, тобто, клітини, які вміщують ДНК-конструкцію цього винаходу, можна ідентифікувати за допомогою добре відомих методик. Наприклад, клітини, одержані в результаті введення конструкції експресії цього винаходу, можуть вирощуватись з утворенням поліпептиду винаходу. Клітини можуть збиратись та лізуватися із дослідженням вмісту ДНК на присутність ДНК за методом, описаним в роботі Southern (1975) J. Моl. Віоl. 98,503 чи Berent et al (1985) Biotech 3,208. Альтернативно, присутність білку в надосадовій рідині може визначатися із використанням антитіл, як описано нижче. На додаток до прямого визначення присутності рекомбінантної ДНК, успішна трансформація може підтверджуватися добре відомими імунологічними методами, коли рекомбінантна ДНК здатна спрямовувати експресію білка. Наприклад, клітини, успішно трансформовані вектором експресії, утворюють білки, які демонструють належну антигенність. Зразки клітин з вірогідною трансформацією збираються та досліджуються на білок за допомогою належних антитіл. Отже, 9 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на додаток до самих трансформованих клітин хазяїна, цей винахід також передбачає культуру таких клітин, переважно моноклональну (клонально гомогенну) культуру, чи культуру, яка виділяється з моноклональної культури у живильному середовищі. Далі роз'яснюється, що певні клітини хазяїна, згідно із винаходом, можуть застосовуватись у синтезі пептидів винаходу, наприклад, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини комах. Однак, в ряді терапевтичних методів можуть бути прийнятними інші клітини хазяїна. Наприклад, антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть з успіхом використовуватись для експресування пептидів винаходу, за умови, що ці пептиди можуть надходити у відповідні МНСмолекули. Інший аспект винаходу пропонує метод створення пептиду для внутрішньовенного (і.v.) введення, підшкірного (s.c.) введення, інтрадермального (i.d.) введення, внутрішньочеревного (і.р.) введення, внутрішньом'язового (і.m.) введення. Переважні способи введення пептиду - це s.c, i.d., і.р., і.m. та i.v. Переважними способами введення ДНК є i.d., i.m., s.c, і.р. та i.v. Можуть вводитись дози від 1 до 500 мг пептиду чи ДНК. Інший аспект винаходу відноситься до використання пухлино-асоційованого пептиду, відповідно до винаходу, нуклеїнової кислоти, відповідно до винаходу, чи вектору експресії, відповідно до винаходу, в медицині. Ще один аспект винаходу пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені аберантно експресують поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність винаходу, і цей метод передбачає введення пацієнту ефективної кількості пептиду, згідно із винаходом, чи ефективної кількості полінуклеотиду або вектору експресії, що кодує даний пептид, причому кількість цього пептиду або полінуклеотиду чи вектору експресії є ефективною для стимуляції імунної реакції проти клітини-мішені у зазначеного пацієнта. Клітина-мішень - це, як правило, клітина пухлини чи ракова клітина. Пептид або нуклеїнова кислота, що кодує пептид, являє собою протипухлинну чи протиракову вакцину. Вона може вводитись безпосередньо пацієнту в уражений орган, або системно, чи застосовуватись ex vivo до клітин, виділених з пацієнта чи клітинної лінії людини, котрі згодом вводяться пацієнту, чи використовуватись in vitro для обирання субпопуляції з імунних клітин, які виділяються з пацієнта і потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини in vitro, вона може бути корисна для трансфекції клітин, з метою ко-експресії імуно-стимулюючих цитокінів, таких, як інтерлейкін-2. Пептид може бути, по суті, чистим чи комбінованим з імуно-стимулюючим ад'ювантом, таким як Detox, або може використовуватись в комбінації з імуно-стимулюючими цитокінами чи вводитись з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептид також може з'єднуватись з належним носієм, таким як гемоцианін лімфи равлика (KLH) або маннан (див. WO 95/18145 та Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). Пептид також може бути міченим, або бути гібридним білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовність яких дається в цьому винаходу, + стимулюють CD8 ЦТЛ. Однак, стимуляція більш ефективна у присутності підтримки, яка + надається CD4 Т-клітинами. Отже, гібридний партнер або частини гібридної молекули + + належним чином утворюють епітопи, які стимулюють CD4 Т-клітини. СD4 -стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в анатоксині правця. Полінуклеотид може бути, по суті, чистим, або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Відповідні вектори та системи доставки включають вірусні системи, основані на аденовірусі, вірусі коров'ячої віспи, ретровірусах, вірусі герпесу, адено-асоційованому вірусі чи гібридах, які включають елементи більш, ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі як засоби доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою "генної пушки". Пептид чи пептид, кодований нуклеїновою кислотою, може бути гібридним білком, наприклад, епітопом, + що стимулює CD8 Т-клітини. Пептид для використання в протираковій вакцині може бути будь-яким прийнятним пептидом. Зокрема, це може бути прийнятний 9-мерний пептид чи 7-, 8-, 10-, 11- або 12-мерний пептид. Пептиди більшої довжини також можуть використовуватись, але 9-мерні або 10-мерні пептиди, описані в доданій таблиці 1, є переважними. Відповідно, будь-яка нуклеїнова кислота, яка вводиться пацієнту, є стерильною і такою, що не вміщує пірогену. Чиста ДНК може вводитися внутрішньом'язовим, інтрадермальним чи підшкірним шляхом. Пептиди можуть вводитись внутрішньом'язовим, інтрадермальним, внутрішньочеревним, внутрішньовенним або підшкірним шляхом (див. також опис методу утворення пептиду вище). Переважно, пептиди, як активні фармацевтичні компоненти вводяться в комбінації з ад'ювантом, наприклад, з IL-2, IL-12, GM-CSF, неповним ад'ювантом Фрейнда, повним ад'ювантом Фрейнда чи ліпосомними композиціями. Найбільш переважні 10 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ад'юванти можна знайти, наприклад, в роботі Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb; 4(2):181-98. Вакцинація призводить до ЦТЛ-реакцій, стимульованих професійними антигенпрезентуючими клітинами; коли ЦТЛ примовані, з'являється перевага в посиленні МНСекспресії в клітинах пухлин. Також може бути корисним спрямовування вакцини в конкретні клітинні популяції, наприклад, антиген-презентуючі клітини, по місцю введення, використання цільових векторів та систем доставки чи селективна очистка такої клітинної популяції у пацієнта та введення пептиду чи нуклеїнової кислоти ex vivo (наприклад, дендритні клітини можуть сортуватись, як описано авторами Zhou et al (1995) Blood 86,3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43,646651). Наприклад, цільові вектори можуть вміщувати тканино-чи пухлино-специфічний промотор, який спрямовує експресію антигену в належне місце. Інший аспект винаходу, таким чином, пропонує вакцину, ефективну проти раку чи ракових або пухлинних клітин, яка включає ефективну кількість пептиду, згідно із винаходом, або нуклеїнову кислоту, яка кодує такий пептид. Також бажано, щоб вакцина була вакциною з нуклеїновою кислотою. Відомо, що щеплення вакциною з нуклеїновою кислотою, такою як ДНК-вакцина, що кодує поліпептид, призводить до Т-клітинної реакції. Найбільш переважною є вакцина, яка вміщує (синтетичний) пептид чи пептиди (тобто, самостійно чи в комбінаціях 1, 2, 3, 4, 5 чи 6, 11 або навіть більше пептидів, див. нижче). Зручним є те, що вакцина з нуклеїновою кислотою може включати будь-який прийнятний засіб доставки нуклеїнової кислоти. Нуклеїнова кислота, переважно ДНК, може бути чистою (тобто, по суті, без інших компонентів для введення) або може доставлятись з ліпосомами чи як частина вірусної векторної системи доставки. Існує думка, що поглинання нуклеїнової кислоти та експресія кодованого поліпептиду дендритними клітинами може бути механізмом ініціації імунної реакції, однак, дендритні клітини не можуть бути трансфековані, але є все ж таки важливими, оскільки вони можуть забирати експресований пептид з трансфекованих клітин в тканині. Бажано, щоб вакцина, така як ДНК-вакцина, вводилася в м'язи. Також переважним варіантом є введення вакцини в шкіру. Вакцина з нуклеїновою кислотою може вводитись без ад'юванта. Вакцина з нуклеїновою кислотою може вводитись з ад'ювантом, таким як BCG чи галун. Інші прийнятні ад'юванти включають стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Ворчестер, Масачусетс, США), який виділяється з сапоніну, мікробактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також патентовані ад'юванти, наприклад Ribi's Detox. Інший ад'ювант, похідний з сапоніну, Quil А, також може використовуватись (Superfos, Данія). Бажано, щоб вакцина з нуклеїновою кислотою вводилася без ад'юванта. Крім того, можуть використовуватись інші ад'юванти, такі як ад'ювант Фрейнда. Також може бути зручним введення пептиду, зв'язаного з гемоцианіном лімфи равлика, переважно також з ад'ювантом. Імунізаційна терапія раку, в якій посередником виступає полінуклеотид, описана в роботах Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2,11221127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3,558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65,664-670; та Burchell et al (1996) pp 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext, всі з яких включені в цей документ шляхом посилань в усій повноті. Ще один аспект цього винаходу пропонує використання пептиду, згідно із винаходом, чи полінуклеотиду або вектору експресії, що кодує такий пептид, у виготовленні медикаменту для знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені аберантно експресують поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність винаходу. Ще один аспект цього винаходу пропонує використання пептиду, згідно із винаходом, чи полінуклеотиду або вектору експресії, що кодує такий пептид, у виготовленні медикаменту для індукування імунної реакції, зокрема, клітинної імунної реакції, ще конкретніше, імунної реакції з посередництвом Т-клітин, проти клітин солідних пухлин, коли ці клітини експресують МНСмолекулу людини класу II на своїй поверхні та представляють поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність винаходу. В контексті цього винаходу було несподівано виявлено, що пухлинні клітини солідних пухлин, на відміну від здорових клітин тієї ж тканини, експресують молекулу HLA людини класу II на своїй поверхні. Інший аспект винаходу пропонує метод утворення активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) in vivo або in vitro, причому метод включає контакт ЦТЛ in vitro з антиген-завантаженими МНС-молекулами класу II людини, експресованими на поверхні відповідної антигенпрезентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації даного ЦТЛ антигенспецифічним способом, коли антиген являє собою пептид згідно із винаходом. 11 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповідно, ЦТЛ є СD4-позитивними клітинами-хелперами, переважно ТНl-типу. МНСмолекули класу II можуть експресуватися на поверхні будь-якої прийнятної клітини, та переважно, якщо клітина є такою, що природно не експресує МНС-молекули класу II (в цьому випадку виконується трансфекція клітини для експресії такої молекули) або, якщо експресує, вона є дефектною в шляхах процесінгу чи презентації ангигену. Таким чином, для клітини, що експресує МНС-молекулу класу II, можливо примування, по суті, повністю, обраним пептидним антигеном до активації ЦТЛ. Антиген-презентуюча клітина (чи клітина-стимулятор), як правило, має на своїй поверхні МНС-молекулу класу II та переважно не здатна, сама по собі, завантажувати зазначену МНСмолекулу класу II обраним антигеном. Як описується більш детально нижче, МНС-молекула класу II може легко завантажуватись обраним антигеном in vitro. Переважно, клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР, чи має його знижений рівень або зменшену функцію. Відповідні клітини, в яких немає пептидного транспортера ТАР, включають Т2, RMA-S та клітини дрозофіли. ТАР - це Транспортер, асоційований з процесінгом антигенів. Клітинна лінія Т2, яка не здатна завантажувати пептиди людини, є доступною для придбання в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Мерiленд 20852, США, номер за каталогом CRL 1992; лінія клітин дрозофіли, лінія Schneider 2, доступна для придбання вАТСС, номер за каталогом CRL 19863; клітинна лінія миші RMA-S описана авторами Kаrrе та Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745. Простіше кажучи, клітина хазяїна перед трансфекцією практично не експресує МНС-молекул класу І. Також бажано, щоб клітина-стимулятор експресувала молекулу, важливу для костимуляції Т-клітини, наприклад, будь-яку з В7.1, В7.2, ІСАМ-1 та LFA 3. Послідовності нуклеїнових кислот різних МНС-молекул класу II та молекул костимуляторів широко доступні в базах даних GenBank та EMBL. Ще в одному втіленні винаходу також можуть використовуватись комбінації HLA-молекул, такі як, наприклад, МНС-молекули класу II, як описано в Таблицях А і В. Використання + рекомбінантних поліепiтопних вакцин для доставки ряду CD8 ЦТЛ-епітопів описано в роботах Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 та WO 96/03144, посилання на які включені в цей документ. Відносно цього винаходу, може бути бажано включити в єдину вакцину пептид (чи нуклеїнову кислоту, що кодує пептид), причому пептид включає в будь-якому порядку + амінокислотну послідовність цього винаходу та інший епітоп, який стимулює CD8 Т-клітину. Ця вакцина була б особливо корисна для лікування ракових захворювань. Такі "нанизані" вакцини є типово ДНК-вакцинами. Одночасний запуск імунної реакції, що залежить від МНС класу II, разом з iмунною реакцією, яка залежить від МНС класу І, має перевагу у тому, що це призводить до локальної ТН1-подібної Т-клітинної реакції СD4-позитивних Т-клітин, шляхом якої підтримуються CD8-позитивні Т-клітини, які залежать від МНС класу І. Для генерації ЦТЛ in vitro може використовуватись ряд інших методів. Наприклад, методи, описані в роботах Peoples et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436 та Kawakami et al (1992) J. Immunol. 148,638643 використовують аутологічні лімфоцити з популяцій пухлинних клітин в генерації ЦТЛ. В роботі Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787 описується використання аутологічних лімфоцитів периферичної крові (ЛПК) для отримання ЦТЛ. Робота Jochmus et al (1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695 стосується створення аутологічних ЦТЛ шляхом імпульсного введення пептиду чи поліпептиду до дендритних клітин або інфікування рекомбінантним вірусом. Автори роботи Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 та Jerome et al (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 використовують В-клітини у формуванні аутологічних ЦТЛ. Крім того, макрофаги, завантажені пептидом чи поліпептидом імпульсним методом або інфіковані рекомбінантним вірусом, можуть використовуватись для отримання аутологічних ЦТЛ. Автори S. Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15; 171(10):4974-8) описують праймінг Т-клітин in vitro шляхом використання штучних антиген-презентуючих клітин, що також представляє прийнятний спосіб для генерації Т-клітин проти обраного пептиду. Алогенні клітини також можуть використовуватись у підготовці ЦТЛ, і цей спосіб детально описаний в патенті WO 97/26328, який включено в цей документ шляхом посилання. Наприклад, на додаток до клітин дрозофіли та клітин Т2, можуть застосовуватись інші клітини для представлення антигенів, такі як клітини СНО, клітини комах, інфіковані бакуловірусом, клітини бактерій, дріжджів та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою. Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу Porta et al (1994) Virology 202, 449 12 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 955, в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентації чужорідних пептидів). Активовані ЦТЛ, коли вони спрямовуються проти пептидів винаходу, є корисними в терапії. Отже, ще один аспект винаходу пропонує активовані ЦТЛ, що одержуються за допомогою згаданих вище методів винаходу. Ще один аспект винаходу пропонує активовані ЦТЛ, котрі селективно розпізнають клітину, що аберантно експресує поліпептид, вміщуючий амінокислотну послідовність винаходу. Переважно, ЦТЛ розпізнає цю клітину шляхом взаємодії з комплексом HLА/пептид (наприклад, зв'язування). ЦТЛ є корисними у методі знищення клітин-мішеней у пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу, причому пацієнту вводиться ефективна кількість активованих ЦТЛ. Ті ЦТЛ, які вводяться пацієнту, можуть виділятися з пацієнта та активуватись, як описано вище (тобто, вони є аутологічними ЦТЛ). Альтернативно, ЦТЛ одержуються не від пацієнта, а від іншої людини. Безумовно, переважно, якщо людина є здоровою людиною. Під терміном "здорова людина" автори винаходу мають на увазі, що людина взагалі має добре здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, що може бути легко перевірено та виявлено. Активовані ЦТЛ експресують рецептор Т-клітини (РТК), що включається в розпізнавання клітин, які експресують аберантний поліпептид. Корисно, якщо кДНК, що кодує РТК, клонується з активованих ЦТЛ та передається в подальші ЦТЛ для експресії. + In vivo, клітини-мішені для CD8 ЦТЛ, відповідно до цього винаходу, можуть бути клітинами пухлини (що іноді експресують МНС класу II) та/або клітинами строми, що оточують пухлину (клітинами пухлини) (які іноді також експресують МНС класу II). РТК клонів ЦТЛ винаходу, специфічні для пептидів винаходу, є клонованими. Використання РТК в клонах ЦТЛ визначається із використанням (і) РТК-варійованих моноклональних антитіл, які є регіонально специфічними, та (іі) RT PCR з праймерами, специфічними для генних сімейств Va та Vp. Бібліотека кДНК формується з полі-А-мРНК, що екстрагується з клонів ЦТЛ. Використовуються праймери, специфічні для С-термінальної частини ланцюгів а та Р РТК та для N-термінальної частини ідентифікованих сегментів Va та Р. Повна кДНК для ланцюгу а та b РТК примножується ДНК-полІмеразою високої точності, та примножені продукти клонуються в належний вектор клонування. Клоновані гени ланцюгу а та П можуть бути зібрані в РТК з одним ланцюгом за методом, описаним в роботі Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1265412658. В цій одноланцюговій конструкції за сегментом VaJ йде сегмент V DJ, після чого слідує сегмент Ср, за яким йде трансмембранний і цитоплазматичний сегмент ланцюгу CD3. Цей одноланцюговий РТК потім вводиться у ретровірусний вектор експресії (може + використовуватись панель векторів, на основі їхньої здатності інфікувати зрілі CD8 T-лімфоцити людини та бути посередником в генній експресії: ретровірусна векторна система Kat є одною з переважних можливостей (див. Finer et al (1994) Blood 83,43). Амфотропний ретровірус високого + + титру використовується для інфікування очищених CD8 або CD4 Т-лімфоцитів, виділених з периферичної крові у пацієнтів з пухлинами (за протоколом, опублікованим в роботі Roberts et al (1994) Blood 84,2878-2889, яка включена в цей документ шляхом посилання). Антитіла проти + CD3 використовуються для ініціації проліферації очищених CD8 Т-клітин, що полегшує ретровірусну інтеграцію та стабільну експресію одноланцюгових РТК. Ефективність + ретровірусної трансдукції визначається шляхом викрашування інфікованих CD8 Т-клітин + антитілами, специфічними для РТК з одним ланцюгом. Аналіз трансдукованих CD8 Т-клітин in vitro підтверджує, що вони демонструють те ж саме пухлино-специфічне знищення, що спостерігається алло-рестрикційним ЦТЛ-клоном, з якого первісно були клоновані ланцюги РТК. + Популяції трансдукованих CD8 Т-клітин з очікуваною специфічністю можуть використовуватись 8 11 для адоптивної імунотерапії пацієнтів з пухлинами. Пацієнти можуть одержувати від 10 до 10 аутологічних трансдукованих ЦТЛ. Аналогічно СD8-позитивним, можуть бути генеровані трансдуковані СD4-позитивні Т-клiтини- хелпери, які вміщують відповідні конструкції. Інші прийнятні системи для введення генів у ЦТЛ описані в роботі Moritz et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322, яка включена в цей документ шляхом посилання. В роботах Eshhar et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 та Hwu et al (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 також описується трансфекція ЦТЛ. Отже, інший аспект винаходу пропонує РТК, який розпізнає клітину, що аберантно експресує поліпептид, вміщуючий амінокислотну послідовність винаходу, причому РТК одержується з активованого ЦТЛ. На додаток до РТК, у винахід включені молекули, функціонально еквівалентні РТК. Вони включають будь-яку молекулу, яка функціонально еквівалентна РТК, котра може виконувати ту ж функцію, що й РТК. Зокрема, такі молекули включають генетично розроблені тридоменні 13 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одноланцюгові РТК, які створюються за методом, описаним в роботі Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658, яка включена в цей документ шляхом посилання та згадана вище. Винахід також включає полінуклеотид, що кодує РТК чи функціонально еквівалентну молекулу, та вектор експресії, який кодує РТК чи його функціонально еквівалентну молекулу. Вектори експресії, які є прийнятними для експресування РТК винаходу, включають описані вище, стосовно експресування пептидів винаходу. Однак, бажано, щоб вектори експресії були векторами, які здатні експресувати РТК в ЦТЛ після трансфекції. Ще один аспект винаходу пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли ці клітини-мішені аберантно експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу, і цей метод включає етапи (1) одержання ЦТП від пацієнта; (2) введення в зазначені клітини полінуклеотиду, який кодує РТК, або функціонально еквівалентної молекули, як зазначено вище; та (3) введення клітин, утворених в етапі (2), пацієнту. Інший аспект винаходу пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли ці клітинимішені аберантно експресують поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність, як визначено у першому чи другому або третьому аспектах винаходу, і цей метод включає етапи (1) отримання антиген-презентуючих клітин, таких як дендритні клітини, від зазначеного пацієнта; (2) контакту антиген-презентуючих клітин з пептидом, як визначено в першому чи другому або третьому аспектах винаходу, або з полінуклеотидом, що кодує такий пептид, ex vivo; та (3) повторного введення таким чином оброблених антиген-презентуючих клітин пацієнту. Переважно, антиген-презентуючі клітини є дендритними клітинами. Відповідно, дендритні клітини є аутологічними дендритними клітинами, які імпульсним методом завантажуються антигенним пептидом. Антигенний пептид може бути належним антигенним пептидом, який викликає відповідну Т-клітинну реакцію. Т-клітинна терапія із використанням аутологічних дендритних клітин, в які імпульсним методом завантажуються пептиди з пухлино-асоційованого антигену, розкривається в роботі Murphy et al (1996) The Prostate 29,371-380 and Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278. В іншому втіленні винаходу антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, контактують з полінуклеотидом, котрий кодує пептид винаходу. Полінуклеотид може бути будьяким відповідним полінуклеотидом, та переважно, щоб він був здатний трансдукувати дендритні клітини, таким чином забезпечуючи презентування пептиду та стимуляцію імунітету. Зручним є те, що полінуклеотид може включати в себе вірусний полінуклеотид чи вірус. Наприклад, показано, що дендритні клітини, трансдуковані аденовірусом, стимулюють антигенспецифічний протипухлинний імунітет відносно MUC1 (див. Gong et al (1997) Gene Ther. 4,10231028) Подібним чином, можуть використовуватись системи на основі аденовірусів (див., наприклад, роботу Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); ретровірусні системи (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 та Szabolcs et al (1997). Крім того, можна використовувати перенос в дендритні клітини за допомогою кров'яних часток (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); та можна використовувати РНК (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182). Роз'яснюється, що відносно методів знищення клітин-мішеней у пацієнта особливо бажано, щоб клітинами-мішенями були ракові клітини, ще більш переважно клітини злоякісних новоутворень нирки чи товстої кишки. Особливо переважно, щоб пацієнти, які лікуються за методами винаходу, мали гаплотип HLA-DR. Отже, в переважному втіленні винаходу перед лікуванням визначається HLA-гаплотип пацієнта. Визначення HLA-гаплотипу може проводитись із використанням будь-якого прийнятного методу; такі методи добре відомі фахівцям. Винахід включає, зокрема, використання пептидів винаходу (чи полінуклеотидів, що кодують їх) для активної вакцинації in vivo; для обробки аутологічних дендритних клітин in vitro із подальшим введенням таким чином оброблених дендритних клітин in vivo для активації ЦТЛреакцій; для активації аутологічних ЦТЛ in vitro із подальшою адоптивною терапією (тобто, оброблені ЦТЛ вводяться пацієнту); та для активації ЦТЛ від здорових донорів (з відповідними чи невідповідними МНС) in vitro із подальшою адоптивною терапією. Вакцини цього винаходу, в його переважному втіленні, вводяться в організм-хазяїн окремо чи разом із іншими засобами протиракової терапії для сповільнення чи припинення формування пухлин. Пептидна вакцина може вводитися без ад'юванта. Вакцина з нуклеїновою кислотою може також вводитись з ад'ювантом, таким як BCG чи галун. Інші прийнятні ад'юванти включають стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Ворчестер, Масачусетс, США), який виділяється з 14 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сапоніну, мікробактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також патентовані ад'юванти, наприклад Ribi's Detox. Інший ад'ювант, похідний з сапоніну, Quil А, також може використовуватись (Superfos, Данія). Інші ад'юванти, такі як олігонукеотиди CpG, стабілізована РНК, Imiquimod (є в продажу під торговою маркою Aldara™ в компанії 3М Pharma, США.), неповний ад'ювант Фрейнда (комерційна назва Montanide ISA-51, можна придбати в Seppic S.A., Париж, Франція), ліпосомні композиції чи GM-CSF також можуть бути корисними. Також може бути зручним введення пептиду, зв'язаного з гемоцианіном лімфи равлика, переважно також з ад'ювантом. Пептиди, відповідно до винаходу, також можуть використовуватись як діагностичні реактиви. Використовуючи пептиди, можна проаналізувати, чи присутні в ЦТЛ-популяції ті ЦТЛ, які специфічно направлені проти пептиду або індукуються терапією. Крім того, збільшення прекурсорних Т-клітин може бути перевірено з тими пептидами, які мають реактивність проти визначеного пептиду. Пептид також може використовуватись як маркер для моніторингу розвитку пухлини, що експресує зазначений антиген, з якого виділяється пептид. В доданій Таблиці 1 перелічені пептиди в тому виді, як вони iдентифікуються. Крім того, в Таблиці визначені білки, з яких походить пептид, та відповідне положення пептиду в належному білку. Також даються відповідні інвентарні номери, котрі відносяться до генного банку (Genbank) "Національного Центру Інформації з Біотехнології" Національного Інституту Здоров'я (див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov). В іншому переважному втіленні пептиди використовуються для викрашування лейкоцитів, зокрема, Т-лімфоцитів. Це використання має особливу перевагу, якщо доказується, чи присутні в ЦТЛ-популяції специфічні ЦТЛ, які спрямовані проти пептиду. Крім того, пептид можна використовувати як маркер для визначення ходу лікування пухлинної хвороби чи розладу. В іншому переважному втіленні пептиди використовуються для виробництва антитіла. Поліклональні антитіла можна одержати стандартним шляхом, за допомогою імунізації тварин, вводячи їм пептид, та подальшої очистки імунного глобуліну. Моноклональні антитіла можуть бути одержані за стандартними протоколами, такими як описані, наприклад, в роботі Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Винахід в своєму іншому аспекті відноситься до фармацевтичної композиції, яка вміщує один чи кілька зазначених пептидів, згідно із винаходом. Ця композиція використовується для парентерального введення, наприклад, підшкірного, інтрадермального, внутрiшньом'язового чи перорального введення. Для цього пептиди розчиняються або суспендуються у фармацевтично прийнятному, переважно водному, носії. Крім того, композиція може вміщувати наповнювачі, такі як буферні елементи, зв'язувальні речовини, очисники, розчинники, ароматизатори, мастильні речовини та ін. Пептиди також можуть вводитись разом з імуно-стимулюючими речовинами, такими як цитокіни. Вичерпний перелік наповнювачів, які можуть використовуватись у такій композиції, наведений, наприклад, в книзі A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиція може використовуватись для попередження, профілактики та/або лікування пухлинних захворювань. Фармацевтичний препарат, який вміщує принаймні один з пептидів цього винаходу, що включає будь-яку з послідовностей від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 49, вводиться пацієнту, який страждає на пухлинне захворювання, асоційоване з відповідним пептидом чи антигеном. Таким чином, можна викликати ЦТЛ-специфічну імунну реакцію. В іншому аспекті цього винаходу, комбінація з двох чи декількох пептидів, згідно із винаходом, може використовуватись як вакцина, в прямому поєднанні чи в межах однієї схеми лікування. Крім того, можуть використовуватись комбінації з іншими пептидами, наприклад, МНС-ІІ-специфічними пептидами. Досвідчений фахівець зможе обрати бажані комбінації імуногенних пептидів шляхом тестування, наприклад, генерації Т-клітин in vitro, а також їхньої ефективності та загальної присутності, проліферації, спорідненості та розширення окремих Тклітин для певних пептидів, та функціональності Т-клітин, наприклад, аналізуючи утворення IFN- (див. також приклади нижче), IL-12 чи Перфоріну. Зазвичай, найбільш ефективні пептиди згодом комбінуються як вакцина в цілях, описаних вище. Належна вакцина буде вміщувати 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 різних пептидів, переважно 4, 5, 6 або 7 різних пептидів, і, найбільш переважно, 6 різних пептидів. Нарешті, вакцина може залежати від специфічного виду раку, яким хворіє пацієнт, що проходить лікування, а також стану захворювання, попередньої схеми лікування, імунного статусу пацієнта та, звичайно, від HLA-гаплотипу пацієнта. Було продемонстровано, що 80 N-термiнальних амінокислот з Іі є достатніми, щоб спрямувати білки до шляху обробки класу II (Sanderson, S., Frauwirth, К. & Shastri, N. (1995) 15 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Proc. Natl. Acad. Set U. S. A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C, Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354). Ідентифікація епітопів Т-хелперів пухлино-асоційованих антигенів залишається важливою задачею в протипухлинній імунотерапії. В цьому винаході автори описують загальноприйнятний метод та пептиди, які одержані шляхом диференційного аналізу пептидів за допомогою масспектрометрії (MS) для ідентифікації природно оброблених та існуючих МНС-лігандів класу II пухлино-асоційованих антигенів. Цей підхід вперше поєднує етап трансфекції АПК вектором, що кодує інтегрований білок між ланцюгом Іі та відповідним Ag, елюцію HLA-зв'язаних пептидів та MS-ідентифікацію Ag-похідних пептидів, представлених трансфектантом, шляхом порівняння з нетрансфекованими клітинами. Крім того, автори винаходу змогли обгрунтувати метод, демонструючи, що Т-клітини, індуковані проти ідентифікованого пептиду, специфічно розпізнають трансфектанти, надмірно експресуючі споріднений Ag. Хоча ідентифіковані пептиди все ж таки треба перевірити на їхню імуногенність in vivo, наш підхід веде до точної характеризації природно оброблених МНС-лігандів класу II. Таким чином, автори уникають тестування синтетичних частково співпадаючих пептидів пухлино-асоційованих антигенів, чи широкого діапазону пептидів, обраних шляхом прогнозування епітопів, яке є менш точним в порівнянні з прогнозуванням епітопів класу І. На відміну від трудомісткого Т-клітинного аналіза, що може призвести до ідентифікації неявних Т-клітинних епітопів, нездатних індукувати активацію Т-клітин in vivo (Anderton, S. M, Viner, N. J., Matharu, P., Lowrey, P. A. & Wraith, D. C. (2002) Nat. Immunol 3, 175-181), робота була зосереджена на невеликій кількості пептидів, котрі, як виявилось, презентувалися. Більше того, при використанні цього методу немає необхідності у виробництві рекомбінантного Ag чи в наявності Ag-експресуючих ліній пухлинних клітин, щоб доказати, що пептиди є природно обробленими. Автори використали N-кінець Іі для віднесення пухлино-асоційованих антигенів до процесінгового компартменту класу II EBV-трансформованих В-клітин. Щоб досягти цього, автори побудували універсальний вектор, з яким ми можемо експресувати будь-який антиген як гібридний білок з Іі, та який допомагає нам визначити рівень експресії білку в трансфекованих клітинах за допомогою Вестерн-блот аналізу. Вже було показано, що N-кінець Іі є достатнім для направлення білків до процесінгового компартменту класу II. Але до цього часу це було описано тільки в моделі, що використовує яєчний альбумін (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221), щоб ідентифікувати невідомий Ag із використанням бібліотек кДНК, кодуючих гібридний білок (Wang, R. F., Wang, X., Atwood, А. С, Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354), або підтвердити специфічність відомих Т-клітинних клонів (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M, Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Наскільки відомо авторам винаходу, цей метод ніколи не використовувався раніше для ідентифікації природно існуючих пептидів відомих пухлино-асоційованих антигенів, зв'язаних з МНС класу II. Диференційний аналіз лігандів класу II трансфекованих і нетрансфекованих клітин за допомогою MALDI-MS та подальша характеристика диференційно експресованих пептидів шляхом ESI-MS дає прямий метод для ідентифікації лігандів класу II антигенів, що представляють інтерес. Трансфекція клітин гібридним білком кератином 18 підтвердила, що метод авторів винаходу є загальноприйнятним для антигенів, що представляють інтерес, і знову, автори зуміли описати пептид, презентований HLA-DR, з моделі трансгену - кератину 18. Ідентифікація епітопів Т-хелперів пухлино-асоційованих антигенів залишається важливою задачею в протипухлинній імунотерапії. Отже, були описані різноманітні стратегії щодо спрямування антигенів до шляху обробки класу II антиген-презентуючих клітин (АПК), наприклад, інкубування АПК з антигеном, що представляє інтерес, для забезпечення можливості його захвату, обробки та презентування (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, К. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778), або трансфекція клітин генами чи міні-генами, що кодують відповідний антиген та включені в інваріантний ланцюжок, сприяючий транслокації антигенів до лізосомного компартменту обробки та компонування МНС класу II (МIIС). Усі ці методи є дуже трудомісткими та часто залишаються неясними, якщо ідентифіковані HLA-ліганди фактично представлені in vivo тканиною людини. Автори винаходу змогли вперше показати, що можливо виділити HLAліганди класу II прямо з препарованих солідних пухлин, таким чином ідентифікуючи пептиди, котрі представлені пухлинами, та оточуючу тканину in vivo, що, відповідно, можуть бути розпізнані Т-клітинами, які несуть належний Т-клітинний рецептор та одночасно експресують костимуляторний ліганд CD4 на своїй клітинній поверхні. Між білків, які функціонують як джерело для ендогенно оброблених HLA-лігандів класу II, було ідентифіковано декілька службових та 16 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 імуно-релевантних білків. Однак, пептиди з ПАА також можуть визначатись, що веде до прямого підходу до ідентифікації відповідних лігандів ПАА класу II in vivo. Автори винаходу ідентифікували три ліганди, що відповідають за одну ключову послідовність з IGFBP3 та один ліганд з ММР7. Автори винаходу виявили, що ці білки надмірно експресовані в гіпернефромі; до того ж, вони були описані як пухлино-асоційовані (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, Т., Т. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279). Ці пептиди неспецифічно зв'язувались з молекулами HLA класу II та були здатні активувати СD4-позитивні Т-клітини різних здорових донорів. Таким чином, підхід авторів винаходу буде корисним для ідентифікації нових перспективних варіантів пептидів класу II з ПАА для використання в клінічних протоколах вакцинацій. Винахід в своєму іншому аспекті відноситься до методу знищення клітин-мішеней у пацієнта, клітини-мішені якого експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, яка наведена в цьому документі, причому метод передбачає введення пацієнту ефективної кількості пептиду, згідно із цим винаходом, або нуклеїнової кислоти за цим винаходом, чи вектору експресії відповідно до цього винаходу, коли кількість зазначеного пептиду чи нуклеїнової кислоти, або кількість вектору експресії є ефективною для викликання імунної реакції проти клітин-мішеней у цього пацієнта. Винахід в своєму іншому аспекті відноситься до методу знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, надану згідно із цим винаходом, і цей метод передбачає введення пацієнту ефективної кількості цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ), як визначено згідно із цим винаходом. Винахід в своєму додатковому аспекті відноситься до методу знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність, надану згідно із цим винаходом, і цей метод включає етапи (1) отримання цитотоксичних Тлімфоцитів (ЦТЛ) у пацієнта; (2) введення в зазначені клітини нуклеїнової кислоти, що кодує рецептор Т-клітини (РТК), або функціонально еквівалентну молекулу, як визначено згідно із цим винаходом; та (3) введення клітин, утворених на етапі (2), пацієнту. Переважно, клітини-мішені є раковими клітинами. Більш переважно, зазначений рак має бути лейкемією чи лімфомою, що експресує поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність, що пропонується згідно із цим винаходом. В контексті цього винаходу було несподівано виявлено, що пухлинні клітини солідних пухлин, на відміну від здорових клітин тієї ж самої тканини, експресують молекулу HLA класу II людини на своїй поверхні. Цей факт був описаний тільки один раз в роботі Brasanac et al (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinical and histopathological data. Neoplasma. 1999; 46(3): 173-8.), де вивчалися заморожені в кріостаті шматочки 37 гіпернефром (RCC) -- 25 клітин мононуклеарного типу, 10 гранулярних та 2 хромофобних -- за непрямим імунопероксидазним методом, що використовує моноклональні антитіла (МоАb) до HLA-DR, -DP та -DQ-антигенів для аналізу антигенів HLA класу II, та aнтi-CD14, -CD3, -CD4 та -CD8 МоАb до пухлино-інфільтруючих мононуклеарів (ТІМ). Кількість позитивних клітин оцінювалась напівкількісно, а результати імуно-гістохімiчних досліджень були співвіднесені з клінічними (рік та стать пацієнта, розмір пухлини та TNM-стадія - за класифікацією TNM (розмір пухлини, стан лімфовузлів та наявність метастаз)) та гістопатологiчними (цитологія, гістологія, ступінь) характеристиками RCC. Усі RCC експресували HLA-DR, 92 % -DQ та 73 % -DP-антигени з рівнем експресії в ієрархії - DR>-DQ>-DP, але ніяке статистично важливе співвідношення не могло бути встановлене з якимись проаналізованими гістопатологічними чи клінічними параметрами. Моноцити були в більшій кількості, ніж Тлімфоцити, а Т-клітини CD4+ - в більшій кількості, ніж CD8+, в той час як пухлини з перевагою Тлімфоцитів та приблизно рівною кількістю CD4+ та CD8+ Т-клітин мали найбільший середній діаметр. Неадекватна активація Т-лімфоцитів пухлинними клітинами (незважаючи на здатність антиген-презентування) могла бути причиною зв'язку параметрів, що означає більш агресивну поведінку пухлини, з аберантною експресією HLA-антигену класу II в RCC. 17 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Слід взяти до уваги, що ознаки винаходу, які розкриваються та описуються в цьому документі, можна використовувати тільки у відповідній комбінації, як зазначається, та за єдиною формою, не відходячи від обсягу цього винаходу. Тепер винахід буде описуватися більш детально, із посиланням на наступні малюнки, перелік послідовності та приклади. Наступні приклади даються в ілюстративних цілях та не мають наміру обмежувати винахід. Послідовності SEQ ID No 1 по SEQ ID No 49 показують пептидні послідовності Т-клітинного епiтопа, що вміщує пептиди, які представлені МНС класу II, згідно із цим винаходом. Послідовності з SEQ ID No 50 по SEQ ID No 79 показують пептидні послідовності Таблиці 3. Фіг. 1 показує експресію молекул HLA класу II в RCC у трьох пацієнтів. В той час як в пухлині пацієнта RCC132 HLA-позитивні клітини були переважно локалізовані по краях (А, В), клітини, що експресували HLA класу II у зразках пухлин пацієнтів RCC190 та RCC211 виявили більш папілярну структуру та були більш рівномірно розповсюджені (C, E, G). Візуалізація С068позитивних макрофагів (B, D, F) в послідовних ділянках тканини демонструє близьку просторову спорідненість мононуклеарних імунних клітин, інфільтрованих у пухлини, та пухлинних клітин, що експресують HLA II. Інкубування IgG миші, замість специфічних антитіл, постійно виявляло негативні результати викрашування (Н). Заплавна буква Т означає "пухлина" (tumor). Фіг. 2 показує FACS-аналіз СD4-позитивних Т-клітин, специфічних для IGFBP3169-181, ММР7247-262 та CCND1198-212. Показані типові дот-блоти внутрішньоклітинного викрашування IFN проти CD4-FITC. Фіг. 3 - це схематична ілюстрація антиген-специфічного IFN, що виробляється CD4позитивними Т-клітинами, виявленого у кожного донора та для кожного пептиду. Показане процентне співвідношення продукції IFN СD4-позитивними Т-клітинами для кожного донора та пептиду, використаного для стимуляції. Клітини були інкубовані в планшетах з 96 лунками - 7 лунок на донора та на пептид. В рамках даються значення, що вважаються позитивними: процент продукції IFN СD4-позитивними Т-клітинами був більш, ніж в два рази вище, в порівнянні з негативним контролем без пептиду. Процентні співвідношення продукції IFN СD4позитивними Т-клітинами, визначені після стимуляції нерелевантним пептидом, корелювали із значеннями після стимуляції без пептиду, за винятком Донора 1 після третьої стимуляції IGFBP3169-181. Однак, цей ефект не був наявним після четвертої стимуляції. Фіг. 4 показує експресію HLA-молекул класу II в ССА165 (помірно диференційована аденокарцинома товстої кишки). У власній пластинці ділянок з нормальною слизовою оболонкою кишечника (панель с та ліва сторона панелі а, з поміткою "зірочка"), як правило, спостерігаються деякі позитивні макрофаги HLA класу II, але епітеліальні клітини були постійно негативними з точки зору експресії HLA класу II. В епітеліальних клітинах з різних ділянок пухлини, однак, була відзначена чітка експресія HLA II, що продемонстровано як на правій стороні панелі а, так і на панелі b і d. Фіг. 5а та 5b показують ідентифікацію пептидної послідовності пептидів, елюйованих з HLAмолекул класу II, виділених з тканини первинної пухлини людини, за допомогою масспектроскопії. Фіг. 5а: фрагменти, одержані з фрагментації природно обробленого та презентованого HLA-ліганду класу II з ММР7, відповідно до пептидної послідовності з SEQ ID No. 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS). Фрагменти з коментарями відображені в Таблиці 5. Фіг. 5b: фрагменти, одержані з фрагментації синтетичного пептиду, що має пептидну послідовність SEQ ID No. I. Фрагментації як синтетичних, так і природно оброблених пептидів, дають еквівалентні фрагментаційні моделі та дозволяють зробити висновок і підтвердити первинну амінокислотну послідовність раніше неохарактеризованої пептидної послідовності (SEQ ID No. 1) цього HLAліганду класу II з ММР7 людини. 18 UA 98295 C2 Таблиця 1 Пептидні послідовності, побудовані згідно з мотивом HLA-DRB1*0101. Пептиди з показниками більше 19 вважалися зв'язувальними елементами DRB 1*0101 5 10 15 Приклади Матеріал та методи Імуногістологія МНС класу II: пухлини були поміщені в 4 % фосфатно-буферний формальдегід, потім - у парафін, викрашені в гематоксилін-еозині та досліджені за допомогою оптичного мікроскопа. Діазнос RCC був поставлений відповідно до звичайних гістопатологічних та імуногістологічних досліджень (Fleming, S. and M. O'Donnell. 2000. Surgical pathology of renal epithelial neoplasms: recent advances and current status. Histopathology 36:195-202). Для імуногістологічного визначення МНС-молекул класу II чи С068-молекул, відповідно, ділянки тканини з парафіну розміром 5 мкм, були заздалегідь оброблені 10 mМ цитратним буфером, рН 6, після чого було проведене інкубування з анти-HLA-DR миші альфа-ланцюгами mAb (Клон TAL.1B5, 1:50) чи CD68 Аb (Клон PGM1, 1:50) (DAKO, Гамбург, Германія) або IgGl миші (2 мкг/мл, BD Biosciences Pharmingen, Сан-Дієго, США) та візуалізовані з використанням набору реактивів для детекції - Ventana iView DAB (Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch, Франція). Ділянки тканин були контрастно викрашені гематоксиліном та потім введені в Entellan. Елюентний та молекулярний аналіз HLA-DR-зв'язаних пептидів: заморожені зразки пухлин були оброблені, як описувалось раніше (Weinschenk, Т., С. Gouttefangeas, M. Schirle, F. 19 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827), та були виділені пептиди, відповідно до стандартних протоколів (Dengjel, J., H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2005. Glycan side chains on naturally presented MHC class II ligands. J. Mass Spectrom. 40:100-104) із використанням HLA-DR-специфічного mAb L243 (Lampson, L.A. and R. Levy. 1980. Two populations of la-like molecules on a human В cell line. J. Immunol. 125:293-299). Природні пептидні суміші були проаналізовані за допомогою системи Ultimate HPLC (зворотно-фазної високоефективної рідинної хроматографії) (Dionex, Амстердам, Нідерланди), в поєднанні з мас-спектрометром Q-TOF I (Waters, Ешборн, Німеччина), чи зворотно-фазної системи CapLC HPLC в поєднанні з Q-TOF Ultima API (Waters), як описувалось раніше (Lemmel, С, S. Weik, U. Eberle, J. Dengjel, T. Kratt, H.D. Becker, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Differential quantitative analysis of MHC Hgands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat.Biotechnol 22:450-454). Спектри фрагментів були проаналізовані ручним та автоматичним способом. Аналіз генної експресії за допомогою олігонуклеотидних мікро-чіпів високої щільності: виділення RNA з пухлини та аутологічних зразків нормальної нирки, а також аналіз генної експресії за допомогою олігонуклеотидних мікро-чіпів Affymetrix U133 Plus 2.0 Геному людини (Affymetrix, Санта Клара, Каліфорнія, США), були виконані, як описувалось раніше (Krüger, Т., О. Schoor, С. Lemmel, В. Kraemer, С. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother), Дані були проаналізовані із використанням комп'ютерної програми GCOS (Affymetrix). Парні порівняння між пухлиною та аутологічною нормальною ниркою були розраховані із використанням відповідної нормального чіпу, як базису. Для RCC149 та RCC211 не було в наявності чіпових даних щодо аутологічної нормальної нирки. Отже, сумарні РНК здорових нирок людини були одержані комерційним способом (Clontech, Гейдельберг, Німеччина) та використані як базис для цих пухлин. Визрівання DC (дендритних клітин): DC були підготовлені із використанням крові здорових донорів. Коротше кажучи, РВМС (мононуклеари периферичної крові) були виділені за допомогою стандартного градієнтного центрифугування (Lymphocyte Separation Medium, PAA 6 Laboratories GmbH, Pasching, Австрія) та поміщені в концентрації 710 клітин на мл в середовище X-Vivo 15. Через 2 години при 37 °C, неадгезовані клітини були видалені, в той час як адгезовані моноцити витримувались протягом 6 днів в середовищі X-Vivo з 100 нг/мл GMCSF та 40 нг/мл IL-4 (AL-ImmunoTools, Фрізойте, Germany). На 7-й день, незрілі DC були активовані 10 нг/мл TNF- (R&D Systems, Вісбаден, Німеччина) та 20 мкг/мл полі-(ІС) (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Німеччина) протягом 3 днів. 6 Генерація антиген-специфічних СD4-позитивних Т-клітин: 10 РВМС на лунку були 5 стимульовані 210 аутологічними дендритними клітинами, в які імпульсним методом був введений пептид (5 мкг/мл). Клітини були інкубовані в планшетах на 96 лунок (7 лунок на донора та на пептид) Т-клітинним середовищем: доповнений RPMI 1640 у присутності 10 нг/мл IL-12 (Promocell, Гейдельберг, Німеччина). Через 3-4 дні ко-інкубування при 37 °C, було додане свіже середовище з 80 U/мл IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Емеривіль, Каліфорнія, США) та 5 нг/мл IL-7 (Promocell). Рестимуляції виконувались аутологічними РВМС плюс пептид кожні 6-8 днів. Внутрішньоклітинне IFN-викрашування: Після 3 та 4 циклів стимуляції, РВМС були 7 розморожені, двічі промиті в середовищі X-Vivo 15, повторно зважені при 10 клітин на мл в Тклітинному середовищі та витримані протягом ночі. Наступного дня РВМС, в які імпульсним методом було введено 5 g/мл пептиду, були інкубовані ефекторними клітинами в співвідношенні 1:1 6 годин. Golgi-Stop (Becton Dickinson, Гейдельберг, Німеччина) був доданий на останні 4 години інкубування. Клітини були проаналізовані за допомогою набору реактивів Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) та CD4-FITC- (Immunotools), а також IFN-PE- та CD8-PerCP (клон SK1-антитіл (Becton Dickinson). Для негативного контролю, клітини семи лунок були об'єднані та інкубовані нерелевантним пептидом чи без пептиду, відповідно. Стимуляція РМА/Іономіцином була використана для позитивного контролю. Клітини були проаналізовані на трикольоровому цитофлуоріметрі FACSCalibur (Becton Dickinson). 20 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади Експресія HLA класу II гіпернефромою (RCC) В нормальних умовах, без запалення, молекули HLA класу II повинні експресуватись тільки клітинами гематопоетичної системи та епітелієм тимусу (Mach, В., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu.Rev.Immunol. 14:301-331). При запаленні ситуація змінюється. Експресія HLA класу II може бути індукована в більшості типів клітин і тканин за допомогою IFN (Leib und Gut-Landmann, S., J. M. Waldburger, M. Krawczyk, L. A. Otten, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea, and W. Reith. 2004. Mini-review: Specificity and expression of CIITA, the master regulator of MHC class II genes. Eur.J.Immunol. 34:1513-1525). Оскільки RCC часто супроводжується запальними явищами (Blay, J. Y., J. F. Rossi, J. Wijdenes, С Menetrier-Caux, S. Schemann, S. Negrier, T. Philip, and M. Favrot. 1997. Role of interleukin-6 in the paraneoplastic inflammatory syndrome associated with renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer 72:424-430; Elsässer-Beile, U., M. Rindsfuser, T. Grussenmeyer, W. Schultze-Seemann, and U. Wetterauer. 2000. Enhanced expression of IFN-gamma mRNA in CD4(+) or CD8(+)tumourinfiltrating lymphocytes compared to peripheral lymphocytes in patients with renal cell cancer. Br. J. Cancer 83:637-641), молекули класу II дійсно експресуються в близькості від пухлин чи самими пухлинами, про що свідчать дані наукових робіт. Імуно-гістохімічне викрашування HLA-молекул класу II Автори винаходу проаналізували експресію HLA класу II десятьма зразками RCC, які вміщують гістологічні світлі клітини та папілярну гіпернефрому, за допомогою імуногістохімічного викрашування та виявили, що усі досліджені зразки вміщують клас II-позитивні пухлинні клітини. Як показано на прикладі Фіг. 1А, чітко виражена експресія HLA класу II часто визначалася по краю пухлини. У цих ділянках автори винаходу спостерігали близьке просторове співвідношення HLA-позитивних пухлинних клітин з пухлино-інфільтруючими імунними клітинами, як показано візуалізацією CD68-позитивних макрофагів в послідовній ділянці тканини (Фіг. 1В). В RCC з більш папілярною структурою експресія HLA-молекул класу II була більш рівномірно поширена по всій пухлині (Фіг. 1 С, Е, G). Порівняння імуно-гістохімічних моделей викрашування HLA класу II та CD68 в послідовних ділянках тканини чітко демонструє, що на додаток до макрофагів, пухлинні клітини також експресують HLA класу II (Фіг. 1 C, D та E, F). Було показано, що IFN-генеруючі СD4-позитивні ТH1-клітини, а також клітини-Природні Кілери (NK), інфільтрують RCC (Cozar, J.M., J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Cabrera, F. Garrido, and O.F. Ruiz-Cabello. 2005. Analysis of NK cells and chemokine receptors in tumor infiltrating CD4 T lymphocytes in human renal carcinomas. Cancer Immunol. Immunother). Оскільки клас ІІ-позитивні пухлинні клітини були виявлені переважно в зовнішніх частинах препарованих пухлин, можна припустити, що лейкоцити, що привертаються пухлиною, виробляють IFN, який діє на сусідні ракові клітини. Аномальна експресія HLA-молекул класу II в тканині новоутворень не обмежується RCC, вона також може визначатись в ТСС та ССА. На Фіг. 4 показане імуногістохімічне викрашування зразку тканини з аденокарциноми товстої кишки людини. Аналіз експресіх IFN та генних транскриптів, індукованих IFN Крім того, автори винаходу провели дослідження експресії HLA класу II за допомогою порівняльного аналізу генної експресії, із використанням олігонуклеотидних мікро-чіпів. За допомогою цієї технології, автори винаходу змогли оцінити загальну експресію HLA класу II в препарованих пухлинах, незалежно від типів експресуючих клітин. Автори проаналізували диференційну експресію в чотирьох пухлинах, RCC149, RCC180, RCC190 та RCC211, в порівнянні з нормальною ниркою, що використовувалась як стандарт. Було виявлено, що в усіх чотирьох пухлинах гени, кодуючі HLA-молекули класу II, надмірно експресовані (Таблиця 2). Однією з можливих причин для цього могла бути індукована експресія гама-інтерфероном (IFN), і тому автори винаходу почали пошук інших генів, відомих як підвищено регульованих інтерферонами (Kolchanov, N.A., E.V. Ignatieva, E.A. Ananko, O.A. Podkolodnaya, I.L. Stepanenko, T.I. Merkulova, M.A. Pozdnyakov, N.L. Podkolodny, A.N. Naumochkin, and A.G. Romashchenko. 2002. Transcription Regulatory Regions Database (TRRD): its status in 2002. Nucleic Acids Res. 30:312-317). Цікавим є той факт, що значна кількість таких генів, як було виявлено, надмірно експресована в одному чи кількох зразках пухлин. Таблиця 2 показує інтерферон-індуцибельні гени, котрі продемонстрували відтворювану підвищену регуляцію в усіх чотирьох зразках, згідно із попередніми даними, одержаними авторами (Weinschenk, Т., С. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827). Між них є LMP2, LMP7 та MECL1-білки, котрі обмінюються на складові підгрупи крупного протеолітичного повного ферменту, що розміщується в цитозолі, протеасоми, для формування імуно-протеасоми. Обмін нормально 21 UA 98295 C2 5 експресованих протеолітичних субодиниць протеасоми на ІFN-індуцибельнi субодиниці - ци визначний процес в інтерферон-насиченому середовищі. До того ж, IFN був оцінений прямим способом за допомогою кількісного аналізу в реальному часі ланцюгової реакції полімерази (RT) PCR (TaqMan). Пухлини, відображені в Таблиці 2, показали надмірну експресію IFN мРНК, в 5-60 разів вищу в порівнянні із аутологічними нормальними зразками РНК від того ж донора (дані не показані). Отже, результати авторів винаходу вказують на те, що IFN може відігравати важливу роль в RCC та бути причиною для поширеної експресії класу II. Таблиця 2: Експресія мРНК інтерферон-індуцибельних генів. Експресія в зразках пухлин була порівняна з аутологічною нормальною ниркою (RCC180, RCC190) чи пулом здорової нирки (RCC149, RCC211). Усі гени показали "збільшення" в changecall - алгоритмі програми GCOS для усіх чотирьох пухлин та описані як інтерферон-індуцибельні Символ гену Ід. номер гену HLA-DPA1 3113 HLA-DPB1 3115 HLA-DQB1 3119 HLA-DRB1 3123 CXCL10 3627 FCGR1A 2209 IFI16 3428 IFI44 10561 ОAS1 4938 PSMB8 5696 PSMB9 5698 PSMB10 5699 SP100 6672 ТАР1 6890 VCAM1 7412 В скільки разів експресія пухлини перевищує експресію нормальної нирки RCC149 RCC180 RCC190 RCC211 Назва гену головний комплекс гістосумісності, клас II, DP-альфа І головний комплекс гістосумісності, клас II, DP-бета І головний комплекс гістосумісності, клас II, DQ-бета І головний комплекс гістосумісності, клас II, DR-бета І ліганд 10 хемокіну (С-ХС-мотив) Fc-фрагмент IgG, високо-афінний Іа, рецептор для (CD64) гамма-інтерфероніндуцибельний білок 16 інтерферон-індукований білок 44 2',5'-олігоаденілатсинтетаза 1, 40/46kDa протеасомна субодиниця, бета-тип, 8 (LMP7) протеасомна субодиниця, бета-тип, 9 (LMP2) протеасомна субодиниця, бета-тип, 10 (MECL1) нуклеарний антиген Sp 100 транспортер 1, АТРзв'язуюча касета, підсімейство В (MDR/TAP) молекула 1 адгезії судинних клітин 10 22 3.5 3.7 4.9 13.9 2.6 2.5 2.8 14.9 4.3 4.0 6.5 5.3 1.2 1.9 2.8 4.3 1.1 3.2 10.6 24.3 6.5 2.6 12.1 29.9 8.6 3.0 4.3 11.3 2.8 1.4 2.5 2.8 3.5 2.3 2.6 5.3 2.6 4.3 6.1 6.5 4.3 7.5 6.5 16.0 3.2 2.5 5.3 13.0 4.0 1.1 1.5 2.8 2.5 2.8 6.5 8.0 5.7 5.3 3.2 12.1 UA 98295 C2 5 10 15 20 HLA-DR-ліганди, виділені з ракових тканин Відповідно до опублікованих наукових даних, пептиди, зв'язані HLA-молекулами класу II, експресованими в тканині солідних пухлин, до цього часу не були виділені чи ідентифіковани іншими спеціалістами. Автори винаходу проаналізували десять різних зразків RCC, три ССА та один ТСС i змогли виділити HLA-DR-ліганди з усіх зразків, які дали в сукупності 453 пептиди (дані не показані). Пептидні послідовності були визначені шляхом поєднання хроматографічного розділення і тандемного мас-спектрометричного аналізу (LC-MS/MS), як описувалось раніше (Weinschenk, Т., С. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-582; Schirle M, Keilholz W, Weber B, Gouttefangeas C, Dumrese T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee HG. Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T-cell-independent approach. Eur J Immunol. 2000; 30(8):2216-25). Приклад de novo-послідовності пептидів, визначеної за допомогою LC-MS/MS, наданий на Фіг. 5а та 5b. Виведеш амінокислотні послідовності фрагментів зіткнень, анотовані на Фіг. 5а та 5b, включені у Таблицю 5. Зразки пухлин відрізнялися своїми HLA-генотипами, вагою та загальною кількістю ідентифікованих HLA-лігандів. В таблиці 3 наведений представницький перелік пептидів та відповідних вихідних білків, ідентифікованих з одного показного зразку пухлини, RCC190. Пептиди були виділені з HLA-молекул класу II клітин, як описувалось раніше (Dengjel, J., P. Decker, О. Schoor, F. Altenberend, Т. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur.J.Immunol. 34:3644-3651). Таблиця 3 Перелік прикладів лігандів HLA-DR, виділених з RCC190. Показані ключові послідовності HLA-DR-лігандів, виділених з RCC190 (HLA-DRB1*11, DRB1*15, DRB3, DRB5) Символ гену ACTG1 Ід. № гену 71 ALB 213 ALB 213 ALB 213 АРОА2 336 АРОВ 338 C1R 715 С4В 721 C4BPA 722 CALR 811 CALR 811 CFL1 1072 CPE 1363 FCGBP 8857 Пептидна послідовність (SEQ ID No.) WISKQEYDESGPSIVHRKCF (SEQ ID No. 50) LKKYLYEIARRHP (SEQ ID No. 51) TLVEVSRNLGKVG (SEQ ID No. 52) TPTLVEVSRNLGKVGS (SEQ ID No. 53) EKSKEQLTPLIKKAGTELVNF (SEQ ID No. 54) YPKSLHMYANRLLDHR (SEQ ID No. 55) EPYYKMQTRAGSRE (SEQ ID No. 56) APPSGGPGFLSIERPDSRPP (SEQ ID No. 57) FGPIYNYKDTIVFK SEQ ID No. 58) SPDPSIYAYDNF (SEQ ID No. 59) EPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPD (SEQ ID No. 60) GVIKVFNDMKVRK (SEQ ID No. 61) APGYLAITKKVAVPY (SEQ ID No. 62) ASVDLKNTGREEFLTA (SEQ ID No. 63) 23 Назва гену актин, гамма-1-про пептид прекурсор альбуміну прекурсор альбуміну прекурсор альбуміну прекурсор аполіпопротеїну А-II прекурсор аполіпопротеїну В компонент комплементу 1, r субкомпонент компонент комплементу 4В пропротеїн компонент комплементу 4зв'язуючий білок, альфа прекурсор калретікуліну прекурсор калретікуліну кофілін 1 (не м'язовий) прекурсор карбоксІпептідази Е Fc-фрагмент IgG-зв'язуючого білку UA 98295 C2 Продовження таблиці 3 FCN1 2219 GNHQFAKYKSFKVADE (SEQ ID No. 64) FTL 2512 VSHFFRELAEEKREG (SEQ ID No. 65) FTL 2512 TPDAMKAAMALEKK (SEQ ID No. 66) GAPD 2597 FVMGVNHEKYDN (SEQ ID No. 67) GAPD 2597 TGVFTTMEKAGAH (SEQ ID No. 68) GAPD 2597 ISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE (SEQ ID No. 69) HIST1H1 3006 GTGASGSFKLNKKAASGEAKPK С (SEQ ID No. 70) HLA3119 DVGVYRAVTPQGRPD DQB1 (SEQ ID No. 71) HLA3123 DVGEFRAVTELGRPD DRB1 (SEQ ID No. 72) IGFBP3 3486 HPLHSKIIIIKKGHAK (SEQ ID No. 73) KNG1 3827 DKDLFKAVDAALKK (SEQ ID No. 74) NPC2 10577 KDKTYSYLNKLPVK (SEQ ID No. 75) S100A8 6279 VIKMGVAAHKKSHEESHKE (SEQ ID No. 76) SERPINA 5265 MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK 1 (SEQ ID No. 77) S0D1 TF 5 10 15 20 25 6647 7018 GPHFNPLSRKHGGPK (SEQ ID No. 78) DPQTFYYAVAVVKKDS (SEQ ID No. 79) прекурсор фіколіну 1 ферітін, легкий поліпептид ферітін, легкий поліпептид гліцериновий альдегід-3-фосфатдегідрогеназа гліцериновий альдегід-3-фосфатдегідрогеназа гліцериновий альдегід-3-фосфатдегідрогеназа сімейство Н1-гістону, член 2 головний комплекс гістосумісності, клас II, DQ бета 1-прекурсор головний комплекс гістосумісності, клас II, DR бета 1-прекурсор зв'язаний з інсуліно-подібним фактором росту білок 3 кiніноген 1 хвороба Німана-Піка, тип С2 прекурсор S100-кальций-зв'язаний білок А8 інгібітор серин (чи цистеїн)протеїнази, клас А (альфа-1антипротеїназа, антитрипсин), член 1 супероксид-дісмутаза 1, розчинна трансферин Не спостерігалося співвідношення між вагою пухлини та кількістю ідентифікованих HLAлігандів. Вихідні білки пептидів можна розділити на дві групи. З однієї сторони, були виявлені ліганди, які повинні бути представлені лейкоцитами, такі як пептиди з компонентів комплементу, наприклад, С3, С4А, С4-зв'язуючий білок альфа, а також інші білки, зв'язані зі специфічними функціями клітин імунної системи, наприклад, CD 14 та Fc-фрагмент IgG-зв'язуючого білку. З іншої сторони, автори винаходу змогли розкрити природу та характеристики раніше невідомих пептидів, які презентуються пухлинними клітинами з надмірно експресованих ПАА, наприклад, з віментіну, матричної металопротеїнази 7, подовження евкариотичної трансляції - фактор 1 альфа 1, та нікотинамід-N-метилтрансферази. Таке спостерігання відповідає даним імуногістохімії (Фіг. 1 та 4) і демонструє, що HLA-клас ІІ-позитивні пухлинні клітини та інфільтруючі лейкоцити були присутні в аналізованих зразках, та елюйовані пептиди походять з антигенів, що, як виявилося, надмірно експресовані в цих окремих типах клітин. Щоб ідентифікувати пептиди з ПАА, автори винаходу порівняли вихідні білки для індивідуальних лігандів з надмірно експресованими генами, виявленими при мікро-чіповому аналізі пухлин (Weinschenk, Т., С. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wemet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827; Krüger, Т., О. Schoor, С. Lemmel, В. Kraemer, С. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother). Автори ідентифікували пептид зі зв'язаного з інсуліноподібним фактором росту білку 3, IGFBP3166-181, на RCC190. До того ж, два варіанти цього пептиду, IGFBP3169-181 та IGFBP3169-184, котрі вміщують той самий ключовий мотив послідовності, що є необхідним та достатнім для того, щоб забезпечити зв'язування з HLA 24 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 DRB1*0101 (посилання - див. у Таблиці 1), були виявлені на ТСС108. З тієї ж пухлини, можна було виділити пептид з матричної металопротеїнази 7, ММР7247-262 (Таблиця 1). На рівні мРНК, ММР7 була надмірно експресована в 13, a IGFBP3 - в 22 з 23 проаналізованих RCC (дані не показані). Разом, з 453 пептидних послідовностей, визначених спочатку (не показані), були ідентифіковані основні антигени для 49 пептидів (послідовності SEQ ID Nos. 1-49), як пухлиноасоційовані, шляхом проведення експериментів авторами винаходу (дані включені в цей документ), або іншими (Miyamoto, S., К. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, Т., Т. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279; Hao, X., B. Sun, L. Hu, H. Lahdesmaki, V. Dunmire, Y. Feng, S.W. Zhang, H. Wang, С. Wu, H. Wang, G.N. Fuller, W.F. Symmans, I. Shmulevich, and W. Zhang. 2004. Differential gene and protein expression in primary breast malignancies and their lymph node metastases as revealed by combined cDNA microarray and tissue microarray analysis. Cancer 100:1110-1122; Helmke, B.M., M. Polychronidis, A. Benner, M. Thome, J. Arribas, and M. Deichmann. 2004. Melanoma metastasis is associated with enhanced expression of the syntenin gene. Oncol. Rep. 12:221-228; Hofmann, H.S., G. Hansen, G. Richter, С. Taege, A. Simm, R.E. Silber, and S. Burdach. 2005. Matrix metalloproteinase-12 expression correlates with local recurrence and metastatic disease in non-small cell lung cancer patients. Clin. Cancer Res. 11:1086-1092; Kamai, Т., Т. Yamanishi, H. Shirataki, K. Takagi, H. Asami, Y. Ito, and K. Yoshida. 2004. Overexpression of RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer. Clin. Cancer Res. 10:4799-4805; Koninger, J., N.A. Giese, F.F. di Mola, P. Berberat, T. Giese, I. Esposito, M.G. Bachem, M.W. Buchler, and H. Friess. 2004. Overexpressed decorin in pancreatic cancer: potential tumor growth inhibition and attenuation of chemotherapeutic action. Clin. Cancer Res. 10:4776-4783; Mori, M., H. Shimada, Y. Gunji, H. Matsubara, H. Hayashi, Y.Nimura, M.Kato, M. Takiguchi, T. Ochiai, and N. Seki. 2004. S100A11 gene identified by in-house cDNA microarray as an accurate predictor of lymph node metastases of gastric cancer. Oncol. Rep. 11:1287-1293; Nagler, D.K., S. Kruger, A. Kellner, E. Ziomek, R. Menard, P. Buhtz, M. Krams, A. Roessner, and U. Kellner. 2004. Up-regulation of cathepsin X in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia. Prostate 60:109-119; Nanda, A., P. Buckhaults, S. Seaman, N. Agrawal, P. Boutin, S. Shankara, M. Nacht, B. Teicher, J. Stampfl, S. Singh, B. Vogelstein, K.W. Kinzler, and C.B. St. 2004. Identification of a binding partner for the endothelial cell surface proteins TEM7 and TEM7R. Cancer Res. 64:8507-8511; Patel, I.S., P. Madan, S. Getsios, M.A. Bertrand, and CD. MacCalman. 2003. Cadherin switching in ovarian cancer progression. Int. J. Cancer 106:172-177; Santelli, G., D. Califano, G. Chiappetta, M.T. Vento, P.C. Bartoli, F. Zullo, F. Trapasso, G. Viglietto, and A. Fusco. 1999. Thymosin beta-10 gene overexpression is a general event in human carcinogenesis. Am. J. Pathol. 155:799-804; Schneider, D., J. Kleeff, P.O. Berberat, Z. Zhu, M. Korc, H. Friess, and M.W. Buchler. 2002. Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells. Biochim. Biophys. Acta 1588:1-6; Welsh, J.B., L.M. Sapinoso, S.G. Kern, D.A.Brown, T. Liu, A.R. Bauskin, R.L. Ward, N.J. Hawkins, D.I. Quinn, P.J. Russell, R.L. Sutherland, S.N. Breit, C.A. Moskaluk, H.F. Frierson, Jr., and G.M. Hampton. 2003. Large-scale delineation of secreted protein biomarkers overexpressed in cancer tissue and serum. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A 100:3410-3415; Xie, D., J.S. Sham, W.F. Zeng, L.H. Che, M. Zhang, H.X. Wu, H.L. Lin, J.M. Wen, S.H. Lau, L.Hu, and X.Y. Guan. 2005. Oncogenic role of clusterin overexpression in multistage colorectal tumorigenesis and progression. World J. Gastroenterol. 11:3285-3289). Зразок аналізу імунно-стимуляторного потенціалу пептидів, що зв'язуються з типовими HLA-DR-алелями, виявляє існування антигенспецифічних СО4-позитивних Т-клітин проти IGFBP3169-181 Та ММР7247-262. Неспецифічне зв'язування типової SEQ ID No. 1 з кількома HLA-DR-алелями можно виявити кількома незалежними методами: ліганди окремих MHC/HLA-молекул несуть хімічно-віднесені амінокислоти в певних позиціях їхньої первинної послідовності, що дозволяє визначити пептидний мотив для кожного MHC/HLA-алеля (Falk K, Rotzschke О, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature. 1991; 351(6324):290-6). SYFPEITHI використовує матриці мотивів, які виведені з уточнених мотивів, що виключно базуються на аналізі природних лігандів за методом розщеплення по Едману чи тандемної мас-спектрометрії. Ці матриці дозволяють прогнозувати пептиди з даної білкової послідовності, презентовані на МНС-молекулах класу І чи класу II 25 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 (Rotzschke О, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, Rammensee HG. Exact prediction of a natural T-cell epitope. Eur J Immunol. 1991; 21(11):2891-4). Із застосуванням принципів прогнозувань, виконаних за допомогою алгоритму SYFPEITHI (Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):213-9) до зазначеної вище зразкової пептидної послідовності (SEQ ID No. 1), було класифіковане зв'язування SEQ ID No. 1 з кількома типовими HLA-DR-алелями (див. Таблицю 7). Алгоритм був успішно використаний для прогнозування епітопів класу І і класу II з різних антигенів, наприклад, з ПАА TRP2 людини (прогнозування ліганду HLA класу І) (34) та SSX2 (прогнозування ліганду HLA класу II) (Neumann F, Wagner С, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, Pfreundschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis antigen HOM-MEL40/SSX2. Int J Cancer. 2004; 112(4):661-8). Порогове значення для значного зв'язування було визначене на показнику 18 або вище, на основі показників зв'язування для раніше опублікованих HLA-DR-пептидних лігандів, що зв'язуються неспецифічно. Неспецифічне зв'язування визначається як зв'язування пептиду з належною зв'язувальною здатністю, як зазначається показником 18 в тесті SYFPEITHI або вище, з двома чи більше різними типовими HLA-DR-алелями. Найбільш типові HLA DR-алелі показані в Таблиці 7. Локуси HLA-A та HLA-DR знаходяться у стані неврівноваженості зв'язків, що дає комбінації HLA-A2 та специфічних HLADR, котрі мають перевагу в порівнянні з іншими. Генотипи HLA-DR пухлин, взятих як відправна точка, були проаналізовані та підтверджені як становлячі HLA-DRB1*11 та DRB1*15 в обох випадках. Переважні доменні амінокислотні залишки для найбільш типових алелів HLA класу II (DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB1*0401, DRB 1*0701, DRB1*1101 та DRB1*1501) відображені у Таблиці 4. Наприклад, алель HLA класу II DRB1*0301 переважно зв'язує пептиди в своїй зв'язувальній порожнині, що включає специфічні амінокислотні залишки в позиціях 1, 4, 6 та 9 з N- до С-термінального кінця ключової послідовності будь-якого даного пептиду. Зокрема, DRB1*0301 показує належне зв'язування, якщо ключова послідовність пептиду має Глутаматний залишок (D) в позиції 4, а також L, I, F, М чи V в позиції 1, і K, R, E, Q чи N в позиції 6, чи Y, L або F в позиції 9. Таблиця 4: Пептидні мотиви типових HLA-DR-алелів. Відображені доменні амінокислоти одним буквенним кодом на відповідних нішах зв'язування 26 UA 98295 C2 5 10 15 20 Результати аналізу in silico, на основі комп'ютерних алгоритмів для прогнозування взаємодії між молкулами HLA та пептидними послідовностями, за допомогою www.syfpeithi.de, показали, що пептид ММР7247-262 SEQ ID No. 1 неспецифічно зв'язується з кількома HLA-DR-алелями. Відповідно до результатів попереднього аналізу, пептид з SEQ ID No. 1 одержує високий показник зв'язування для взаємодії з DRB1*1101, DRB1*1501, DRB1*0401, DRB 1*0301 та DRB1*0101 (Таблиця 7). HLA-DR-алелі, проаналізовані в цьому тесті на взаємодію з пептидною амінокислотною послідовністю /міцність зв'язування, охоплюють принаймні 69.6 % HLA-A2позитивної білої раси (Mori М, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997; 64(7):1017-27). Оскільки на даний час немає даних по частоті для HLA-DR15, алель не був взятий до уваги при розрахунку результату обхвату HLA-A2-позитивної білої раси. Отже, є висока ймовірність, що з SEQ ID No. 1 обхват популяції навіть вище, ніж 69.6 %, що вказує на прекрасні перспективи для цього пептиду, який може служити кандидатом для розробки фармацевтичних препаратів для більшості хворих на рак. Однак, застосування алгоритмів прогнозування призводить до заключних результатів, якщо результати аналізу in silico об'єднуються з експериментальним підтвердженням неспецифічного зв'язування, як було показано іншими дослідниками раніше, але вони не змогли продемонструвати імунні реакції, запущені пептидними послідовностями, котрі за прогнозами є хорошим зв'язувальним агентом (Bohm CM, Hanski ML, Stefanovic S, Rammensee HG, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken EO, Hanski С Identification of HLA-A2-restricted epitopes of the 27 UA 98295 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tumor-associated antigen MUC2 recognized by human cytotoxic T-cells. Int J Cancer. 1998; 75(5):688-93). Прогнозування артефактів, як в наведеному вище випадку, в принципі, не може бути виключено, оскільки алгоритми, використані для прогнозування, не беруть до уваги, що пептидна послідовність не обов'язково генерується в ситуації in vivo (всередині живих клітин). Експериментальне підтвердження можна одержати шляхом збирання діних in vitro біологічних тестів, наприклад, демонструючи присутність чи відсутність імуногенності пептиду. Отже, для експериментального підтвердження неспецифічного зв'язування SEQ ID No. 1 були одержані такі дані in vitro. Для тестування iмуно-стимулюючої здатності пептидів за допомогою експериментів примування Т-клітин in vitro, були використані найкоротші варіанти ("ключові послідовності") пептидів IGFBP3, IGFBP3169-181, а також пептиду ММР7 та ММР7247-262. Для генерації антиген-специфічних СD4-позитивних Т-клітин та тестування неспецифічного зв'язування пептидів, РВМС 4 здорових донорів з різними HLA-DR-алелями (Фіг. 2), один з яких ніс DRB1*1101, були стимульовані з використанням аутологічних дендритних клітин, в які імпульсним шляхом був введений пептид. Крім того, пептид CCND1 198-212, відомий Т-клітинний епітоп (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004, Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:36443651), був використаний як позитивний контроль. Як система зчитування для генерації антигенспецифічних CD4-позитивних Т-клітин, рівні IFN були оцінені за допомогою проточної цитометрії. Т-клітини були проаналізовані після третьої та четвертої щотижневої стимуляції внутрішньоклітинним IFN-викрашуванням плюс CD4-FITC та CD8-PerCP-викрашування, для визначення проценту IFN-генеруючих клітин в специфічних Т-клітинних субпопуляціях. В усіх експериментах симуляції нерелевантним пептидом та без пептиду були виконані як негативні контролі. IFN-реакція вважалася позитивною, якщо процент IFN-генеруючих СD4-позитивних Т-клітин був більш ніж в два рази вище, в порівнянні з негативними контролями (Horton, H., N. Russell, E. Moore, I. Frank, R. Baydo, C. Havenar-Daughton, D. Lee, M. Deers, M. Hudgens, K. Weinhold, and M.J. Mс Elrath. 2004. Correlation between interferon-gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific memory T-cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696). У трьох з чотирьох донорів автори винаходу змогли генерувати специфічні СD4-позитивні Тклітини для обох пептидів (Фіг. 2). Т-клітинні реакції не могли спостерігатися у донора 4 після будь-якої стимуляції. У донора 1, 0.05 %-0.1 % IFN-генеруючі CD4-позитивні Т-клітини (Фіг. 3) були визначені в усіх семи спробах стимуляції після третьої стимуляції з пептидом IGFBP3 169-181. Ці Т-клітини можуть бути розширені в більшості випадків проведенням додаткового циклу стимуляції, від 0.09 % до 0.13 %. IFN-генеруючі СD4-позитивні Т-клітини, специфічні для пептиду IGFBP3169-181, також спостерігалися у донора 2 та донора 3, з максимальними + частотами 0.05 % та 0.07 % IFN-генеруючих CD4 Т-клітин. + Донори 1, 2 і 3 також показали CD4 Т-клітини, реагуючі на пептид ММР7247-262. Найвищі + частоти IFN-генеруючих CD4 Т-клітин, специфічних для пептиду ММР7, були виявлені у донорів 1 та 2, відповідно. Донори 1, 2 і 3 показали реакції IFN на пептид CCND1198-212, котрий вже був описаний як МНС клас II-обмежений Т-клітинний епітоп (Dengjel, J., P. Decker, О. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J, Immunol. 34:3644-3651). Таким чином, пептиди з IGFBP3, ММР7 та CCND1 є агентами неспецифічного зв'язування з HLA класу II, що здатні викликати CD4-позитивні Т-клітинні реакції у трьох з чотирьох здорових донорів, які несуть різні HLA DR-алелі. Якщо HLA-алелі двох пацієнтів з пухлинами, у яких були одержані пептиди IGFBP3 та ММР7, порівнюються з алелями здорових донорів, стає ясно, що пептиди презентуються HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*04 та HLA-DRB1*11. Усі три зазначені HLA DR-аллотипи мають гліциновий амінокислотний залишок на позиції 86, та аспарагіновий кислотний залишок на позиції 57 своїх -ланцюгів, відповідно (див. www.anthonynolan.com/HIG). Тобто, вони мають подібні характеристики зв'язування для своїх ніш Р1 та Р9 (Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany). Для пептиду CCND1198-212, Т-клітинний епітоп, відомий як презентований HLA-DRB1*0401 та HLA-DRB1*0408 (Dengjel, J., P. Decker, О. Schoor, F. Altenberend, Т. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), це також виявляється вірним. Донор 4 має HLADRB1*0318 та HLA-DRB1*1401, алелі з пептидними мотивами, що відрізняються первинною амінокислотною послідовністю своїх бета-ланцюгів від тих, що описані вище. Це може пояснити, 28