Штам гібридних клітин mus musculus 156с10 – продуцент моноклональних антитіл до імуноглобуліну людини класу g

Штам гібридних клітин 156С10 - продуцент моноклональних антитіл до імуноглобулінів людини класу G, які належать до G2b імуноглобулінів, Корисна модель стосується імунології та гібридомної технології і може бути використаний для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до IgG людини та імуноферментних кон'югатів на їх основі. Відомі штами гібридом, які синтезують МКАТ до IgG людини [1]. Однак данні штами придатні для визначення підкласів IgG людини та непридатні для використання у якості основи для імуноферментних кон'югатів. Найбільш близьким до запропонованого є штам, що синтезує МКАТ, які взаємодіють із всіма підкласами IgG людини [2]. В основу корисної моделі покладено завдання одержати штам гібридних клітин, що синтезують більш специфічні антитіла з високою константою афінності, які б були придатні для використання в якості основи для імуноферментних кон'югатів у діагностичних тест-системах. Суть корисної моделі полягає в створенні нового штаму гібридних клітин-продуцента моноклональних антитіл до IgG людини, що забезпечує високий рівень синтезу моноклональних антитіл шляхом гібридизації мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Гібридизацію здійснюють за допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ). Селекцію гібридних клітин проводять на середовищі із вмістом гіпоксантину, аміноптерину та тимідину. Штам клонують тричі. Після третього клонування практично 100% клонів є позитивними. Штам зберігається у колекції АТЗТ НВК "Діап роф-Мед", м. Київ. Штам характеризується наступними ознаками. Морфологічні властивості. Клітини штаму мають круглу форму, ядро займає більшу частину клітини. Культуральні властивості. При суспензійному культивуванні у середовищі H-Y з 15% ембріональної телячої сироватки (ETC) клітини погано закріплені на субстраті. Продуктивність штаму. При культивуванні in vitro штаму 156С10 концентрація імуноглобулінів складає 10 мкг/мл при густині клітин 1 млн/мл, у асцитичній рідині - 5 мг/мл. Стабільність продукції антитіл зберігається упродовж 20 пасажів у культурі. Характеристика одержаного продукту Моноклональні антитіла, що продукуються штамом 156С10, специфічні до IgG людини та належать до G2b імуноглобулінів, мають константу (13) 14890 (11) UA (19) афінності K a 9 1011M та титр у непрямому імуноферментному аналізі (ІФА) Т=1000. Приклад 1. Одержання штаму гібридних клітин 156С10. Імунізація тварин. Для індукції імунної відповіді використовували найбільш ефективне підшкірне введення антигену з повним ад'ювантом Фрейнда. Використовували наступну схему імунізації. Ін'єкції проводили в подушечки задніх лапок, перші дві з ад'ювантом, третю без нього. З кожною послідуючою імунізацією доза антигену збільшувалася: U мають константу афінності K a 9 1011 М, титр у непрямому імуноферментному аналізі (ІФА) Τ=1000, і придатні для використання як основи для імуноферментних кон'югатів у діагностичних тестсистемах. 3 10мкг, 15мкг і 25мкг. Після трьох введень, зроблених з інтервалами 2 дні, мишу забивали, стерильно видаляли лімфатичні вузли. Їх відмивали і м'яко гомогенізували в середовищі з 10 % ETC. Лімфоцити ресуспендували в 15мл DMEM та підраховували кількість життєздатних клітин у камері Горяєва. Таким чином одержували 3 5 108 лімфоцитів із високою життєздатністю за результатами виключення тріпанового синього. Підготовка мієломи Sp-2/0. Мієлому за 1-1,5 місяці до запланованого зливання вводили мишам лінії Balb/c підшкірне, в кількості 106-107 клітин. Коли клітини утворювали під шкірою солідну пухлину, її, після забою тварини, стерильно видаляли і м'яко гомогенізували в з 10% ETC. Одноразово відмивали при 2000об/хв на протязі 2хв і засівали в концентрації 200-300 тис. клітин/мл у повному ростовому середовищі. Культивували 4-7 днів до накопичення достатньої для зливання кількості. Клітини в логарифмічній фазі росту збирали з 2-3 матрасів, осаджували при 1500об/хв на протязі 5хв і двічі відмивали середовищем DMEM без сироватки. Після цього їх ресуспендували в 1520мл безсироваткового середовища, підраховували і зберігали на протязі кількох годин, до використання, при кімнатній температурі. Лімфоцити змішували з мієломними клітинами у співвідношенні 2:1-5:1 і центрифугували при 1200об/хв на протязі 8хв у пробірці ємкістю 45мл. Середовище майже повністю видаляли. Потім у суспензію клітин вносили 1 мл 40% розчину ПЕГ з 5% диметилсульфоксиду (ДМСО) (рН 7,6-7,8). ПЕГ готували завчасно, змішуючи розігрітий ПЕГ із середовищем DMEM та ДМСО. Після доведення рН розчином бікарбонату натрію, ПЕГ зберігали до зливання при 3-7°С. Суміш клітин витримували в середовищі з ПЕГ 6-7хв при кімнатній температурі і центрифугували при 1000об/хв 2 хв Потім суспензію повільно розводили середовищем DMEM без сироватки з таким розрахунком, щоб загальний об'єм за кожну хвилину зростав удвічі. До суспензії додавали 3мл ETC. Клітини після зливання осаджували при 1000об/хв 7хв. Надосад відсмоктували, а осад обережно ресуспендували у повному ростовому середовищі H-Y з 15% ETC і 50мкг/мл гентаміцину. Концентрацію клітин доводили до 106 2 106 / мл і вносили в 96-лункові планшети по 100мкл на лунку. Таким чином, після зливання отримували 7-9 96-лункових планшетів. Клітини культивували при 37 °С в атмосфері, що містить 7% СО2. Через одну добу в кожну лунку вносили по 100мкл двократного концентрату середовища ПАТ у повному ростовому середовищі. На 4-5 добу спостерігали за появою клонів гібридних клітин. На 7-8 добу клони гібридом підгодовували свіжим середовищем HAT, замінюючи по 50мкл у кожній з Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 14890 4 лунок. На 10-14 добу клони наростали в кількостях, достатніх для аналізу. За 1 - 2 доби до тестування в лунках замінювали більшу частину середовища для зменшення рівня фонових антитіл, які синтезуюють плазмоцити. Клони гібридом тестували в ІФА. Позитивні клони пересаджували на 24-лункові планшети з фідером із перитонеальних макрофагів. Після підростання гібридоми заморожували, а культуральні рідини зберігали для подальшого визначення наявності та специфічності МКАТ. Приклад 2. Процедура ІФА для визначення моноклональних антитіл 156С10. При тестуванні гібридом використовували антиген та кон'югат із відомим титром. Культуральні рідини розводили в 2 рази, користуючись фосфатно-сольовим буфером із 5% Tween-20, для зменшення неспецифічного зв'язування. Попередньо вносили в лунки по 50мкл буферу, а потім по 50мкл культуральних рідин. При даному аналізі блокування було необов'язковим, адже середовище містить достатню кількість альбуміну, який має високу здатність до сорбції, блокуючи вільні місця лунок. Позитивними вважали клони, що дали втричі більшу оптичну щільність за загальний фон реакції. Приклад 3. Одержання та очистка моноклональних антитіл із асцитичної рідини. Для нагромадження значної кількості МКАТ гібридоми культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревне по 0,5мл пристану. Мінералне масло служило сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 106 до 107 гібридом в 1мл середовища. Через 5-8 днів у мишей починала накопичуватися рідина в черевній порожнині. Її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв на протязі 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Антитіла, що знаходяться в асциті, осаджували сульфатом натрію (18% та 16%), розчиняли у дистильованій воді, переосаджували сульфатом амонію (50%) та розчиняли у мінімальній кількості води. Література. 1. Климович В.Б., Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю. и др. Моноклональные антитела к подклассам IgG человека: получение и исследование специфичности // Иммунология. - 1998. - №3. - С. 2731. 2. Reimer C.B., Phillips D.J., Aloisio C.H. et al. Evaluation of thirty-one mouse monoclonal antibodies to human IgG epitopes // Hibridoma. - 1984. -Vol. 3,3.-P. 263-275. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601