Набір гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до нуклеокапсидного антигену р24 вірусу імунодефіциту людини, придатних для використання у імуноферментних тест-системах

Набір гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до нуклеокапсидного антигену р24 вірусу імунодефіциту людини, придатних для Приклад 1. Одержання гібридом (процедура гібридизації) [3, 4] Тварину-донора імунокомпетентних лімфоцитів вибирали за результатами титрування сироваток мишей. Селезінку після забою миші стерильно видаляли та м'яко гомогенізували в середовищі з 10% ембріональної телячої сироватки (ETC). Для лізису еритроцитів селезінки клітини після центрифугування ресуспендували в 0,83% розчині хлориду амонію. Спленоцити витримували 3хв. при 4°С і осаджували при 1500об/хв. 5хв. Потім ще раз відмивали середовищем без сироватки, ресуспендували в 15мл DMEM та підраховували кількість життєздатних клітин у камері Горяєва. 28629 (11) IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 Титр МКА культуральній 1:2000 1:1000 1:2000 1:1000 1:800 UA 284С6 282Н10 284G7 286D3 284Н3 Константа афінності МКАТ, ´1010М 5,0 10,0 11,0 5,0 10,0 (19) Назва гібридоми Ізотип МКАТ (13) Характеристика моноклональних антитіл до ан які продукують одержані гібридом 3 Таким чином одержували (3-5)´108 лімфоцитів із високою життєздатністю за результатами виключення тріпанового синього. Їх змішували з мієломними клітинами у співвідношенні 2:1 і центрифугували при 1000об/хв протягом 12хв у пробірці ємністю 50мл. Середовище майже повністю видаляли, а клітинний осад старанно розбивали, постукуючи пробіркою по столу ламінарного боксу. Потім у суспензію клітин вносили 1мл 40% розчину ПЕГ з 5% ДМСО. Суміш клітин витримували в середовищі з ПЕГ 5хв при кімнатній температурі і центрифугували при 1000об/хв 2хв. Потім суспензію повільно розводили середовищем DMEM без сироватки до об'єму 50мл. До суспензії додавали 3мл ETC. Клітини після зливання осаджували при 1000об/хв 15хв. Надосад відсмоктували, а осад обережно ресуспендували у повному ростовому середовищі DMEM з 15% ETC і 50мкг/мл гентаміцину. Концентрацію клітин доводили до (1-2)х10/мл і вносили в 96-лункові планшети по 100мкл на лунку. Приклад 2. Зберігання гібридом у рідкому азоті Для зберігання гібридом-продуцентів використовували кріосередовище, що містить 5% ДМСО, 50% ETC та 45% DMEM. В одну ампулу вносили від 105 до 2´106 клітин, які суспендували в 1мл кріосередовища, шляхом змивання моношару з 1-2 лунок 24-лункового планшету. Потім ампули поміщали в контейнер із теплоізоляційного матеріалу і повільно охолоджували до мінус 70°С. На другу добу ампули переносили в резервуар з рідким азотом. Таким чином, кріоконсервацію проводили по двоетапній схемі. Приклад 3. Клонування гібридом Гібридоми клонували методом лімітувальних розведень [5]. Суть його полягає у поступовому розведенні клітинної суспензії, поки концентрація не досягне однієї або менше клітин на лунку. Клонування проводили на 96-лункових плашках, на які попередньо вносили фідер із перитонеальних макрофагів по 100мкл на лунку. Із суспензії гібридом відбирали об'єм від 1 до 10мкл, у залежності від вихідної концентрації клітин, і розводили до 33мл повним ростовим середовищем. Розносили по 100мкл на 1/4 частину плашки. Потім ще тричі повторювали розведення до заповнення всієї плашки. Таким чином, сумарний об'єм середовища в лунках становив 200мкл. У результаті отримували чотири різні концентрації клітин. У якомусь із розведень обов'язково росли ізольовані клони, які після тестування, пересаджували або знову клонували. Приклад 4. Одержання асцитичної рідини Для накопичення значної кількості МКАТ гібридоми культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревно по 0,5мл пристану. Мінеральне масло слугувало сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 2x106 до 107 гібридом в 1мл середовища. Через 58 днів у мишей починала накопичуватися рідина в черевній порожнині. її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З 28629 4 однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв. протягом 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Літературні посилання: 1. Ehrhard В., Misselwitz R., Welfle К. et al. Chemical Modification of Recombinant HIV-1 Capsid Protein p24 Leads to the Release of a Hidden Epitope Prior to Changes of the Overall Folding of the Protein //Biochemistry. - 1996. - Vol. 35. - P.9097-9105. 2. Stevens P.W., HansenFrancis C, Jolley M.E. et al. Monoclonal antibodies to HIV-1 p24 core protein include pairs which exhibit synergistic binding //Molecular Immunology. - 1993. - Vol. 30, 3. - P.243254. 3. Ніколаєнко І.В. Отримання та порівняльний аналіз гібридом - продуцентів моноклональних антитіл, що диференціюють вакцинні та вірулентні поліовіруси І, II та III типів: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Київ, 1999. - 18с. 4. Широбоков В.П., Ніколаєнко І.В., Копаниця Л.В. та ін. Панель моноклональних антитіл для внутрішньотипової диференціації поліовірусів II типу // Мікробіол. журн. - 1997. - №6. – С.27-35. 5. Goding J. Monoclonal antibodies. Principles and practice. - San Diego: Acedemic press, 1996. 492p.