Спосіб оцінки захисного потенціалу клітин кісткового мозку при мієлотрансплантації

Изобретение относится к медицине, в частности, иммуногематологии и может быть использовано при исследовании функциональной полноценности миелотрансплантата. Наиболее близким к заявляемому является способ оценки защитного потенциала - костного мозга путем определения его колониеобразующей активности [1]. Недостатком способа является низкая точность оценки, связанная с тем, что количество формируемых в селезенке реципиентов колоний не всегда коррелирует с истинным содержанием кроветворных клеток в костном мозге и, в конечном итоге, с его защитным потенциалом, обусловленным присутствием этих клеток в суспензии миелокариоцитов. В основу изобретения поставлена задача создания такого способа оценки защитного потенциала костного мозга при миелотрансплантации, в котором использование, нового показателя выживаемости позволило бы определить истинное содержание кроветворных клеток в костном мозге, и тем самым повысить точность оценки. Эта задача решается тем, что в способе оценки защитного потенциала клеток костного мозга при миелотрансплантации путем определения колониеобразующей активности, определяют количество Thy-1,2+ клеток в костном мозге и пропорционально ему оценивают защитный потенциал. Способ осуществляется следующим образом. После предварительной фиксации моноклональных антител (MAT) к антигену Th y-1,2+ в лунках пластмассового планшета на них наслаивают суспензию костного мозга. Сорбированные на антителах клетки вводят облученным реципиентам и определяют их колониеобразующую активность. Процентное содержание A ×B Thy-1,2 КОЕс в костном мозге определяют по формуле: X = , C где х - количество (%) Th y-1,2 + КОЕс, А - количество (%) Thy-1 ,2+ клеток в костном мозге, В - количество колоний после введения Thy-1,2+ фракции костного мозга. С - количество колоний, образованных после введения исходной суспензии костного мозга. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Суспензию костного мозга получали на гемодезе, содержащем 7,5% криопротектора полиэтиленоксида м.м. 400, ресуспендировали, доводили концентрацию до 2-106 ядерных клеток в 1 мл. Суспензию делили на две части, одну из которых крио-консервировали при – 1960С, другую оставляли в качестве контроля (нативный костный мозг). Моноклональные антитела к антигену Thy-1,2+ разводили фосфатным буфером до концентрации 1:300, в объеме 300 мкл вносили в ячейки пластикового планшета и экспонировали при температуре 40С в течение 12 часов. После связывания антител с пластиком надосадок с несвязавшимися антителами удаляли пастеровской пипеткой. Приготовленные суспензии нативного консервированного костного мозга вносили в лунки с моноклональными антителами в объеме 0,5 мл и экспонировали в течение 70 мин при 40С. Несвязавшиеся с антителами клетки удаляли "мягким" смыванием средой 199. Сорбированные на антителах Th y-10+ клетки удаляли таким же образом, жестким смыванием. Снятые Thy-1,2+ клетки доводили до необходимой концентрации: исходные 5•105/мл, сорбированные 5•104/мл, вводили внутривенно по 0,2 мл летально облученным мышам - реципиентам, в селезенках которых на 10-е сутки определяли количество гемопоэтических колоний. Как видно изданных, после криоконсервирования костного мозга его колониеобразующая активность снижается в сравнении с нативным. При этом в криоконсервированном костном мозге значительно снижается содержание Thy-1,2+ клеток вообще, в том числе и Thy-1,2+ КОЕс. Об этом свидетельствует тот факт, что из криоконсервированной суспензии элиминируется только 1% Thy-1,2+ КОЕс от исходного количества всех КОЕс в криоконсервированном костном мозге. В сравнении с нативным контролем это составляло не более 6-7% (р > 0,05). Пример 2. Суспензию сорбированных нативных и криоконсервированных Thy-1,2+ клеток вводили внутривенно в различных дозах облученным реципиентам и определяли их 20 дневную выживаемость. Рx - степень достоверности различий в сравниваемых группах. Показано, что защитный потенциал костного мозга находится в строгой зависимости от наличия в нем Thy-1,2+ кроветворных клеток: с увеличением дозы вводимых клеток выживаемость облученных мышей повышается. Низкая выживаемость реципиентов, которым вводили криоконсервированные Thy-1,2+ клетки, подтверждает более низкое содержание в этой фракции Thy1,2+ кроветворных клеток, обеспечивающих защитный потенциал костного мозга. Очевидно, что более низкая концентрация Thy-1,2 КОЕс во всей фракции криоконсервированных Thy-1,2+ клеток связана с потерей кроветворными клетками мембранного антигена Thy-1,2+ и способности связываться с антителами к этому антигену. Следовательно, основная масса кроветворных клеток после криоконсервирования становится Thy-1,2+. Это приводит к изменению защитного потенциала криоконсервированного костного мозга в целом. Так, выживаемость в течение 20 дней облученных реципиентов с трансплантатом 1-105 ядерных клеток нативного костного мозга выше, чем криоконсервированного (табл.1). Таким образом, заявляемый способ повышает точность оценки защитного потенциала костного мозга. Оценка количественного содержания Thy-1,2+ кроветворных клеток в суспензии миелокариоцитов дает основание считать, что костный мозг, содержащий около 15-17% Thy-1,2+ КОЕс во всей популяции кроветворных клеток (КОЕс) обладает достаточным защитным потенциалом при восстановлении гемопоэза полученных реципиентов. При снижении концентрации клеток данного типа, в частности, после криоконсервирования, снижается и защитный потенциал костного мозга. Повышение точности оценки защитного потенциала костного мозга подтверждается также тем, что при сравнительной оценке колониеобразующей активности нативного и криоконсервированного костного мозга, содержания Thy-1,2+ кроветворных клеток в обоих миелотрансплантатах и выживаемости облученных реципиентов коэффициент корреляции между содержанием в костном мозге Thy-1,2+ КОЕс и выживаемость животных для нативного костного мозга в 4, а для криоконсервированного в 2,5 раза выше, чем между содержанием колоний в селезнке и выживаемостью (р > 0,05).