Пестицидний ген axmi-205 та його використання для захисту рослин від комах-шкідників

Реферат: Винахід належить до молекул нуклеїнових кислот, що кодують білки з пестицидною активністю та амінокислотних послідовностей, що відповідають цим полінуклеотидам, ДНК-конструктів, трансформованих рослин та насіння, а також до способів надання пестицидної активності рослинам і насінню. UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою США, порядковий № 61/222,778, що була подана 2 липня 2009 року, зміст якої включений в цей документ шляхом посилання у повному обсязі. ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ Цей винахід відноситься до галузі молекулярної біології. Він стосується нових генів, що кодують пестицидні білки. Ці білки та послідовності нуклеїнових кислот, котрі їх кодують, є придатними для отримання пестицидних сполук та створення трансгенних рослин, стійких до шкідників. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Впровадження ДДТ (дихлордифенілтрихлоретану) та подальша тенденція до невибіркового використання синтетичних хімічних інсектицидів призвели до забруднення джерел води та продуктів харчування, отруєння корисних комах, які не є мішенями, та появи шкідливих комах, стійких до хімічних інсектицидів. Зростаюча громадська занепокоєність несприятливим впливом невибіркового використання хімічних інсектицидів на навколишнє середовище стала причиною пошуку альтернативних способів боротьби з комахами-шкідниками. Однією з перспективних альтернатив стало використання засобів біологічної боротьби. Існують документально підтверджені дані про безпечне використання Bt (B. thuringiensis, грампозитивної ґрунтової бактерії) як ефективних біопестицидів, та є цілий ряд звітів про експресію гену (генів) дельта- ендотоксинів у сільськогосподарських культурах. Для трансгенних Bt-рослин вимагається лише декілька обприскувань інсектицидами, що не тільки зберігає витрати і час, але й зменшує ризики для здоров'я. В деяких випадках у комах може розвинутися стійкість до різних інсектицидних сполук, що викликає необхідність визначення альтернативних засобів біологічної боротьби зі шкідниками. СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Винахід стосується композицій та способів надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам та насінню. Композиції включають молекули нуклеїнових кислот, що кодують послідовності пестицидних та інсектицидних поліпептидів, вектори, які містять такі молекули нуклеїнових кислот, та клітини-хазяї, що включають такі вектори. Композиції також включають послідовності пестицидного поліпептиду та антитіла до цих поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть використовуватися у ДНК-конструктах чи експресійних касетах для трансформації та експресії в організмах, включаючи мікроорганізми та рослини. Нуклеотидна чи амінокислотна послідовності можуть бути синтетичними послідовностями, сконструйованими для експресії в організмі, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроорганізм чи рослину. Крім того, композиції включають трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння. Зокрема, винахід стосується виділених чи рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, які кодують пестицидний білок. Крім того, винахід пропонує амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку. Зокрема, цей винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8, чи нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, 9, 10, 11 або 12, а також їхні варіанти та фрагменти. Також винахід забезпечує нуклеотидні послідовності, комплементарні до нуклеотидної послідовності за винаходом, або які гібридизуються з послідовністю за винаходом. Наведені способи продукування поліпептидів за винаходом та застосування таких поліпептидів для боротьби з лускокрилими, твердокрилими, нематодами чи двокрилими шкідниками або знищення їх. Способи та набори для визначення нуклеїнових кислот і поліпептидів за винаходом у зразку також є предметом винаходу. Композиції та способи за винаходом є придатними для продукування організмів з посиленою стійкістю чи толерантністю до шкідників. Ці організми та композиції, які містять організми, є бажаними для сільськогосподарських цілей. Композиції за винаходом також прийнятні для утворення змінених або покращених білків, які мають пестицидну активність, або для визначення наявності пестицидних білків чи нуклеїнових кислот в продуктах чи організмах. СТИСЛИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ Малюнок 1 показує порівняльний аналіз AXMI-205 (SEQ ID NO:2, 3 або 4) з білками MACPF (білками комплексу, який атакує мембрани, і перфорин) із Photorhabdus luminescens (SEQ ID NO:14) та Clavibacter michiganensis (SE Q ID NO:15). ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС Цей винахід стосується композицій та способів регулювання стійкості чи толерантності до шкідників у організмів, зокрема, рослин чи рослинних клітин. Під "стійкістю" мається на увазі, що шкідник (наприклад, комаха) знищується після поглинання чи іншого контакту з поліпептидами 1 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 за винаходом. Під "толерантністю" мається на увазі зменшення чи порушення рухомої активності, харчування, відтворення або інших функцій шкідника. Способи включають трансформацію організмів нуклеотидною послідовністю, що кодує пестицидний білок за винаходом. Зокрема, нуклеотидні послідовності за винаходом є придатними для отримання рослин та мікроорганізмів, що мають пестицидну активність. Отже, винахід стосується трансформованих бактерій, рослин, рослинних клітин, тканин рослин та насіння. Композиціями є пестицидні нуклеїнові кислоти та білки бактеріальних видів. Послідовності використовуються у конструюванні векторів експресії для подальшої трансформації в організми, що представляють інтерес як зонди для виділення інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для утворення змінених пестицидних білків за допомогою способів, відомих у цій галузі, таких як обмін доменів чи перестановки у ДНК. Білки знаходять використання у боротьбі з популяціями лускокрилих, твердокрилих, двокрилих та нематодних шкідників чи в їхньому знищенні та в отриманні композицій з пестицидною активністю. Під "пестицидним токсином" або "пестицидним білком" мається на увазі токсин, котрий має токсичну активність щодо одного чи кількох шкідників, включаючи, але не обмежуючись ними, членів рядів Lepidoptera, Diptera та Coleoptera, або типу Nematoda, чи білок, який має гомологічність до такого білка. Пестицидні білки виділені з організмів, включаючи, наприклад, Bacillus sp., Clostridium bifermentans та Paenibacillus popilliae. Пестицидні білки включають амінокислотні послідовності, отримані з повнорозмірних нуклеотидних послідовностей, розкритих в цьому винаході, та амінокислотні послідовності, коротші, ніж повнорозмірні послідовності, внаслідок використання альтернативного сайту ініціації трансляції у напрямку 3' або в результаті процесингу, що продукує коротший білок, який має пестицидну активність. Процесинг може відбуватися в організмі, в якому експресується білок, або в шкіднику, після поглинання білка. Таким чином, винахід стосується нових виділених чи рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, які забезпечують пестицидну активність. Крім того, винахід стосується амінокислотних послідовностей пестицидних білків. Білок, одержаний в результаті трансляції цього гену, дозволяє клітинам контролювати чи знищувати шкідників, які його поглинають. Виділені молекули нуклеїнової кислоти та їхні варіанти і фрагменти Один з аспектів винаходу стосується виділених чи рекомбінантних молекул нуклеїнової кислоти, які містять нуклеотидні послідовності, що кодують пестицидні білки та поліпептиди чи їхні біологічно активні ділянки, а також до молекул нуклеїнової кислоти, достатніх для використання як гібридизаційні зонди для ідентифікації молекул нуклеїнової кислоти, що кодують білки з ділянками з гомологічними послідовностями. Вираз "молекула нуклеїнової кислоти" в даному контексті включає молекули ДНК (наприклад, рекомбінантної ДНК, кДНК чи геномної ДНК) та молекули РНК (наприклад, мРНК) і аналоги ДНК або РНК, утворені з використанням нуклеотидних аналогів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою чи дволанцюговою, але найкращою є дволанцюгова ДНК. "Виділена" послідовність нуклеїнової кислоти (або ДНК) в цьому контексті означає послідовність нуклеїнової кислоти (або ДНК), яка більше не знаходиться в своєму природному оточенні, наприклад, in vitro або у рекомбінантній бактеріальній чи рослинній клітині-хазяїні. В деяких варіантах здійснення винаходу "виділена" нуклеїнова кислота не містить послідовностей (найкраще, послідовностей, що кодують білок), які в природних умовах знаходяться на кінцевих ділянках нуклеїнової кислоти (тобто, послідовності, розташовані на 5′ та 3′ кінцях нуклеїнової кислоти) в геномній ДНК організму, з якого походить нуклеїнова кислота. Для цілей винаходу термін "виділений", коли він використовується по відношенню до молекул нуклеїнової кислоти, виключає виділені хромосоми. Наприклад, в різних варіантах здійснення винаходу виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує пестицидний білок, може містити менш ніж приблизно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. або 0,1 т.п.н. нуклеотидних послідовностей, котрі в природних умовах розташовуються у бокових гілках молекули нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої походить нуклеїнова кислота. Пестицидний білок, який по суті не містить клітинного матеріалу, включає препарати білка, які мають менш ніж приблизно 30 %, 20 %, 10 % чи 5 % (за сухою вагою) непестицидного білка (в цьому винаході також називається "забруднюючим білком"). Нуклеотидні послідовності, що кодують білки за цим винаходом, включають послідовність, наведену в SEQ ID NO:1, 9, 10, 11 або 12, та її варіанти, фрагменти і комплементи. Під "комплементом" мається на увазі нуклеотидна послідовність, яка достатньо комплементарна даній нуклеотидній послідовності, так, щоб вона могла гібридизуватися з даною нуклеотидною послідовністю і, таким чином, утворити стабільний дуплекс. Відповідна амінокислотна 2 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність для пестицидного білка, який кодується цією нуклеотидною послідовністю, наводиться в SEQ ID NO:2, 3 або 4. Молекули нуклеїнової кислоти, котрі є фрагментами цих нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидні білки, також включені у цей винахід. Під "фрагментом" мається на увазі частина нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок. Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка чи він може бути фрагментом, який може використовуватись як гібридизаційний зонд чи праймер для ПЛР, з використанням способів, розкритих нижче. Молекули нуклеїнової кислоти, котрі є фрагментами нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, містять принаймні приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600 суміжних нуклеотидів чи до такої кількості нуклеотидів, що є присутньою в повнорозмірній нуклеотидній послідовності, яка кодує пестицидний білок, розкритий в цьому винаході, в залежності від передбачуваного використання. Під "суміжними" нуклеотидами маються на увазі нуклеотидні залишки, що безпосередньо примикають один до одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей за цим винаходом кодують білкові фрагменти, котрі зберігають біологічну активність пестицидного білка і, таким чином, зберігають пестицидну активність. Вираз "зберігає активність" означає, що фрагмент має принаймні близько 30 %, принаймні близько 50 %, принаймні близько 70 %, 80 %, 90 %, 95 % чи більше від пестицидної активності пестицидного білка. В одному з варіантів здійснення винаходу пестицидною активністю є активність по відношенню до твердокрилих. В іншому варіанті здійснення винаходу пестицидною активністю є активність по відношенню до лускокрилих. В іншому варіанті здійснення винаходу пестицидною активністю є активність по відношенню до нематод. В іншому варіанті здійснення винаходу пестицидною активністю є активність по відношенню до двокрилих. Методи вимірювання пестицидної активності добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; та патент США № 5 743 477, всі з яких включені в цей документ шляхом посилання в повному обсязі. Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, котрий кодує біологічно активну частину білка за винаходом, кодує принаймні близько 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 чи 600 суміжних амінокислот, чи аж до всієї кількості амінокислот, присутніх у повнорозмірному пестицидному білку за винаходом. В деяких варіантах здійснення винаходу фрагмент є результатом усікання N-кінцевого чи C-кінцевого кінця на принаймні близько 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 чи більше амінокислот, що відносяться до SEQ ID NO:2, 3 або 4. В деяких варіантах здійснення винаходу фрагменти, що включені в цей винахід, є результатом видалення C-кінцевих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 чи більше амінокислот, наприклад, шляхом протеолізу чи введення стоп-кодону до послідовності, що кодує. Кращі пестицидні білки за цим винаходом кодуються нуклеотидною послідовністю, що є достатньо ідентичною нуклеотидній послідовності SEQ ID NO:1, 9, 10, 11 або 12. Вираз "достатньо ідентичний" стосується амінокислотної чи нуклеотидної послідовності, що принаймні приблизно на 60 % чи 65 % ідентична, приблизно на 70 % чи 75 % ідентична, приблизно на 80 % або 85 % ідентична, приблизно на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % чи більше ідентична стандартній послідовності, з використанням однієї з програм вирівнювання, описаних тут, і стандартних параметрів. Фахівцю у даній галузі зрозуміло, що ці значення можуть бути належним чином скориговані для визначення відповідної ідентичності білків, що кодуються двома нуклеотидними послідовностями, беручи до уваги виродження кодонів, подібність амінокислот, місцезнаходження рамки зчитування і таке інше. Для визначення процентної ідентичності двох амінокислотних послідовностей чи двох нуклеїнових кислот послідовності вирівнюють для цілей оптимального порівняння. Процентна ідентичність між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень, які є спільними для цих послідовностей (тобто, процентна ідентичність = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень (наприклад, положення, що перекриваються) x 100). В одному з варіантів здійснення винаходу дві послідовності мають однакову довжину. В іншому варіанті здійснення винаходу порівняння робиться через усю стандартну послідовність (наприклад, через усю послідовність, розкриту як будь-яка з SEQ ID NO:1, 9, 10, 11 чи 12, чи будь-яка з SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 чи 8). Процентна ідентичність між двома послідовностями може визначатися з використанням методик, подібних описаним нижче, з розривами (гепами) чи без них. При розрахунку процентної ідентичності, як правило, підраховують точні відповідності. Визначення процентної ідентичності між двома послідовностями може бути виконане за допомогою математичного алгоритму. Іншим не обмежуючим прикладом математичного 3 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алгоритму, що використовується для порівняння двох послідовностей, є алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифікований, як описано Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такий алгоритм включений до програм BLASTN і BLASTX з Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Пошук нуклеотидів у пакеті програм BLAST може виконуватися з використанням програми BLASTN, міра подібності = 100, довжина вирівнювання = 12, для отримання нуклеотидних послідовностей, гомологічних пестицидоподібним молекулам нуклеїнової кислоти за винаходом. Пошук білків у пакеті програм BLAST може виконуватися з використанням програми BLASTX, міра подібності = 50, довжина вирівнювання = 3, для отримання амінокислотних послідовностей, гомологічних пестицидним білковим молекулам за винаходом. Щоб отримати вирівнювання, які містять гепи, для цілей порівняння може бути використана база даних Gapped BLAST (у BLAST 2.0), як описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Як альтернатива, може використовуватись база даних PSI-Blast для проведення ітераційного пошуку, що виявляє віддалені взаємовідношення між молекулами. Див. Altschul et al. (1997), що згадана вище. При застосуванні програм BLAST, Gapped BLAST та PSI-Blast можуть використовуватись параметри за умовчанням відповідних програм (наприклад, BLASTX і BLASTN). Вирівнювання також можуть виконуватися вручну, шляхом перегляду. Іншим не обмежуючим прикладом математичного алгоритму, який використовується для порівняння послідовностей, є алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:46734680). ClustalW порівнює послідовності та вирівнює амінокислотні чи ДНК- послідовності по всій довжині, і таким чином може надати дані про збереження послідовності для усієї амінокислотної послідовності. Алгоритм ClustalW використовується в кількох комерційно доступних пакетах програм ДНК/амінокислотного аналізу, таких як модуль ALIGNX пакету програм Vector NTI (компанії Invitrogen Corporation, Карлсбад, Каліфорнія, США). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою ClustalW можна оцінити амінокислотну ідентичність у процентах. Не обмежуючим прикладом комп'ютерної програми, придатної для аналізу вирівнювань за алгоритмом ClustalW, є GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) дозволяє оцінити амінокислотну (чи ДНК) подібність та ідентичність між багатьма різними білками. Ще один не обмежуючий приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, – це алгоритм Майєрса та Міллера (Myers and Miller (1988)) CABIOS 4:11-17. Такий алгоритм вбудований у програму ALIGN (версія 2.0), що є частиною пакету програм GCG Wisconsin Genetics, версія 10 (її можна придбати у компанії Accelrys, Inc., 9685 Скрантон Роуд, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). При використанні програми ALIGN для порівняння амінокислотних послідовностей може застосовуватися таблиця вагових залишків PAM120, штраф за подовження 12 і штраф за геп 4. Якщо не зазначено інше, GAP версії 10, що використовує алгоритм Нудельмана-Вунша (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, застосовують для визначення ідентичності або подібності послідовності на основі таких параметрів: % ідентичності та % подібності для нуклеотидної послідовності звикористанням GAP Weight 50 та Length Weight 3, і матриці підрахунку nwsgapdna.cmp; % ідентичності або % подібності для амінокислотної послідовності з використанням значень GAP weight 8 та length weight 2, та програми підрахунку BLOSUM62. Також можуть використовуватися еквівалентні програми. Під "еквівалентною програмою" мається на увазі будь-яка програма порівняння послідовностей, котра для будьяких двох досліджуваних послідовностей забезпечує вирівнювання, яке має ідентичні відповідності нуклеотидних залишків та ідентичний процент подібності послідовностей при порівнянні з відповідним вирівнюванням, проведеним за допомогою GAP версії 10. Винахід також охоплює варіанти молекул нуклеїнової кислоти. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидний білок, включають ті послідовності, які кодують пестицидні білки, розкриті в цьому винаході, але які консервативно відрізняються внаслідок виродження генетичного коду, а також ті, що є достатньо ідентичними, як обговорювалося вище. Алельні варіанти природного походження можуть бути ідентифіковані за допомогою добре відомих методик молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і методи гібридизації, які стисло охарактеризовані нижче. Варіантні нуклеотидні послідовності також включають синтетично отримані нуклеотидні послідовності, котрі були утворені, наприклад, шляхом використання сайт-спрямованого мутагенезу, але які ще й кодують пестицидні білки, розкриті в цьому винаході, як описано нижче. Варіантні білки, включені у цей винахід, є біологічно активними, тобто, вони не втрачають бажану біологічну активність нативного білка, а саме, зберігають пестицидну активність. Вираз "зберігає активність" означає, що варіант має принаймні близько 30 %, принаймні близько 50 %, принаймні близько 70 %, чи принаймні близько 80 % від пестицидної активності нативного білка. Методи вимірювання 4 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пестицидної активності добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; та патент США № 5 743 477, всі з яких включені в цей документ шляхом посилання у повному обсязі. Фахівцю в даній галузі також зрозуміло, що зміни можуть бути внесені шляхом мутації нуклеотидних послідовностей за винаходом, ведучи, таким чином, до змін в амінокислотній послідовності кодованих пестицидних білків без зміни біологічної активності білків. Отже, виділені варіантні молекули нуклеїнової кислоти можуть шляхом введення одного чи більше нуклеотидних замін, додавань чи делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, розкриту в цьому винаході, таким чином, що одна чи більше амінокислотних замін, додавань чи делецій вводяться у білок, що кодується. Мутації можуть вводитися за допомогою стандартних методик, таких як сайт-спрямований мутагенез і ПЛР-опосередкований мутагенез. Такі варіантні нуклеотидні послідовності також включені у цей винахід. Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можуть бути зроблені на одному чи кількох прогнозованих несуттєвих амінокислотних залишках. "Несуттєвим" амінокислотним залишком є залишок, який може бути змінений у послідовності дикого типу пестицидного білка без зміни біологічної активності, в той час як "суттєво важливий" амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" є такою, при якій амінокислотний залишок замінюється амінокислотним залишком, що має подібний боковий ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бокові ланцюги, визначені в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глютамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глютамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Амінокислотні заміни можуть бути зроблені у неконсервативних ділянках, що забезпечує зберігання функції. Як правило, такі заміни не слід робити для консервативних амінокислотних залишків або для амінокислотних залишків, що розташовуються в межах консервативного мотиву, де такі залишки є суттєво важливими для білкової активності. Приклади залишків, що є консервативними та можуть бути суттєво важливими для білкової активності, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними для усіх білків, включених у вирівнювання подібних чи споріднених токсинів до послідовностей за винаходом (наприклад, залишки, котрі є ідентичними у вирівнюванні гомологічних білків). Приклади залишків, що є консервативними, але можуть допускати консервативні амінокислотні заміни і все ще зберігати активність, включають, наприклад, залишки, що мають тільки консервативні заміни для усіх білків, включених у вирівнювання подібних чи споріднених токсинів до послідовностей за винаходом (наприклад, залишки, котрі мають тільки консервативні заміни для усіх білків, включених у вирівнювання гомологічних білків). Однак фахівцю у даній галузі зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні чи неконсервативні зміни у консервативних залишках. Альтернативно, варіантні нуклеотидні послідовності можуть бути отримані шляхом введення мутацій в довільному порядку вздовж усієї послідовності, що кодує, або її частини, наприклад, шляхом насичувального мутагенезу, а одержані мутанти можуть піддаватися скринінгу на здатність надання пестицидної активності для ідентифікації мутантів, які зберігають активність. Після мутагенезу білок, що кодується, може бути експресований рекомбінантно, а активність білка можна визначити, використовуючи стандартні аналітичні методики. Використовуючи такі методи, як ПЛР, гібридизацію та подібні їм, можна ідентифікувати відповідні пестицидні послідовності, при цьому такі послідовності мають істотну ідентичність послідовностям за винаходом. Див., наприклад, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). В гібридизаційному аналізі уся пестицидна нуклеотидна послідовність або її частина може використовуватися для скринінгу кДНК чи геномних бібліотек. Способи конструювання таких кДНК чи геномних бібліотек, як правило, відомі в даній галузі та розкриті Sambrook and Russell, 2001, див. вище. Так звані гібридизаційні зонди можуть бути фрагментами геномної ДНК, фрагментами кДНК, фрагментами РНК чи іншими олігонуклеотидами та можуть бути помічені групою, що може бути визначена, такою як 32P, чи будь-яким іншим маркером, що піддається визначенню (наприклад, інші радіоізотопи, флуоресцентна сполука, фермент або ферментний кофактор). Зонди для гібридизації можуть бути отримані за допомогою введення міток у 5 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синтетичні олігонуклеотиди на основі відомої нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, розкритої в цьому винаході. Можна додатково використовувати вироджені праймери, сконструйовані на основі консервативних нуклеотидів чи амінокислотних залишків у нуклеотидній послідовності або кодованій амінокислотній послідовності. Зонд зазвичай містить ділянку нуклеотидної послідовності, що гібридизується в жорстких умовах з принаймні близько 12, принаймні близько 25, принаймні близько 50, 75, 100, 125, 150, 175 чи 200 послідовними нуклеотидами нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок за винаходом або його фрагмент чи варіант. Способи підготовки зондів для гібридизації, як правило, добре відомі в даній галузі та розкриті Sambrook and Russell, 2001, див. вище, котра включена у цей документ шляхом посилання. Наприклад, повна послідовність пестицидного білка, розкрита у цьому винаході, або одна чи кілька її частин, може бути використана як зонд, здатний специфічно гібридизуватися з відповідними послідовностями пестицидних білковоподібних речовин та матричними РНК. Для досягнення специфічної гібридизації при різних умовах такі зонди включають послідовності, котрі є унікальними та найкраще, якщо вони мають довжину принаймні близько 10 нуклеотидів або принаймні близько 20 нуклеотидів. Такі зонди можуть застосовуватися для ампліфікації відповідних пестицидних послідовностей із вибраного організму за допомогою ПЛР. Ця методика може бути використана для виділення додаткових послідовностей, що кодують, із бажаного організму, або як діагностичний засіб для визначення наявності послідовностей, що кодують, в організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних на чашки бібліотек ДНК (бляшок або колоній; див., наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Гібридизація таких послідовностей може бути проведена при жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або "жорсткими умовами гібридизації" маються на увазі умови, при яких зонд гібридизується зі своєю цільовою послідовністю до більшого ступеню, як може бути виявлено, ніж з іншими послідовностями (наприклад, що принаймні в 2 рази перевищує фон). Жорсткі умови залежать від послідовності та відрізняються залежно від обставин. Шляхом контролю жорсткості умов гібридизації та/або умов відмивання можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які на 100 % комплементарні зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, жорсткість умов може регулюватись для того, щоб дозволити деякі невідповідності у послідовностях, для виявлення більш низьких ступенів подібності (гетерологічне зондування). Як правило, зонд є менш ніж приблизно 1000 нуклеотидів довжиною, найкраще, менш ніж 500 нуклеотидів довжиною. Зазвичай жорсткими умовами будуть ті, при яких концентрація солей становить менш ніж приблизно 1,5 моль/л в перерахунку на іони Na, зазвичай приблизно 0,01-1,0 моль/л іонів Na (або інших солей) при pH 7,0-8,3, а температура становить принаймні близько 30 °C для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) та принаймні близько 60 °C для довгих зондів (наприклад, більш ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови також можна досягти додаванням дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Приклади умов низької жорсткості включають гібридизацію буферним розчином 30-35 % формаміду, 1 моль/л NaCl, 1 % SDS (додецилсульфат натрію) при 37 °C і промивання у 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 моль/л NaCl/0,3 моль/л тринатрію цитрату) при 50-55 °C. Приклади умов середньої жорсткості включають гібридизацію у 40-45 % формаміді, 1,0 моль/л NaCl, 1 % SDS при 37 °C та промивання у 0,5X-1X SSC при 55-60 °C. Приклади умов високої жорсткості включають гібридизацію у 50 % формаміді, 1 моль/л NaCl, 1 % SDS при 37 °C та промивання у 0,1X SSC при 60-65 °C. Необов'язково, промивні буфери можуть містити від приблизно 0,1 % до приблизно 1 % SDS. Тривалість гібридизації, як правило, становить менш ніж приблизно 24 години, зазвичай приблизно від 4 до 12 годин. Специфічність, як правило, залежить від умов промивань після гібридизації, при цьому критичними факторами є іонна сила та температура розчину завершального промивання. Для гібридів ДНК-ДНК Tm може бути підраховано згідно з рівнянням, наведеним Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5 °C+16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; де M – молярність одновалентних катіонів, %GC – процентний вміст гуанозинових та цитозинових нуклеотидів у ДНК, % form – процентний вміст формаміду у гібридизаційному розчині, а L – довжина гібриду в парах основ. Tm є температурою (при визначеній іонній силі та значенні pH), при якій 50 % комплементарної цільової послідовності гібридизується з повністю співпадаючим зондом. Tm зменшують приблизно на 1 °C для кожного 1 % розбіжностей; отже, Tm умов гібридизації та/або промивання можуть бути відрегульовані для гібридизації послідовностей бажаної ідентичності. Наприклад, якщо шукають послідовності з ідентичністю 6 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 >90 %, Tm можна зменшити на 10 °C. В цілому, жорсткі умови вибирають так, щоб вони були приблизно на 5 °C нижчими, ніж точки плавлення (Tm) для конкретної послідовності та її комплементу при визначеній іонній силі та значенні pH. Однак як умови високої жорсткості можна використовувати гібридизацію та/або промивання при температурі на 1, 2, 3 або 4 °C нижче, ніж точка плавлення (Tm); як умови середньої жорсткості можна використовувати гібридизацію та/або промивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижче, ніж точка плавлення (Tm); як умови низької жорсткості можна використовувати гібридизацію та/або промивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижче, ніж точка плавлення (Tm). Використовуючи наведене рівняння, умови гібридизації та промивання, а також бажану Tm, фахівцям зрозуміло, що зміни у жорсткості гібридизації та/або розчинах для промивання недвозначно описані. Якщо бажаний ступінь розбіжностей приводить до того, що Tm стає меншою, ніж 45 °C (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), найкращим є збільшення концентрації SSC таким чином, щоб можна було використовувати більш високу температуру. Вичерпну інформацію щодо гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); та Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Див. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Виділені білки та їхні варіанти і фрагменти Пестицидні білки також включені в цей винахід. Під "пестицидним білком" мається на увазі білок, який має амінокислотну послідовність, наведену вSEQ ID NO:2, 3 або 4. Винахід також стосується фрагментів, біологічно активних частин та їхніх варіантів (наприклад, SEQ ID NO:5, 6, 7 та 8), котрі можуть використовуватись для здійснення способів за цим винаходом. Термін "виділений білок" використовується відносно білка, який більше не знаходиться у своєму природному оточенні, наприклад, in vitro чи в рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. «Фрагменти" чи "біологічно активні частини" включають фрагменти поліпептиду, які містять амінокислотні послідовності, достатньо ідентичні амінокислотній послідовності, яка наведена у SEQ ID NO:2, 3 або 4, що проявляють пестицидну активність. Біологічно активна частина пестицидного білка може бути поліпептидом, який має довжину, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 чи більше амінокислот. Такі біологічно активні частини можуть бути отримані за допомогою рекомбінантних методик, та може бути проведена оцінка їх пестицидної активності. Методи вимірювання пестицидної активності добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; і патент США № 5 743 477, всі вони включені в цей документ шляхом посилання у повному обсязі. В межах цього винаходу фрагмент містить принаймні 8 суміжних амінокислот у послідовності SEQ ID NO:2, 3 або 4. Однак винахід охоплює інші фрагменти, такі як будь-який фрагмент білка більший, ніж приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 чи більше амінокислот. В деяких варіантах здійснення винаходу фрагментом є фрагмент, що є результатом усікання з N-термінального чи C-термінального кінця на принаймні близько 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 чи більше амінокислот, що відносяться до SEQ ID NO:2, 3 або 4 (наприклад, SEQ ID NO:7 або 8). В деяких варіантах здійснення винаходу фрагменти, включені у винахід, є результатом видалення C-термінальних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 чи більше амінокислот, наприклад, шляхом протеолізу чи введення стоп-кодону до послідовності, що кодує. Під "варіантами" маються на увазі білки чи поліпептиди, які мають амінокислотну послідовність, котра принаймні приблизно на 60 %, 65 %, приблизно на 70 %, 75 %, приблизно на 80 %, 85 %, приблизно на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % чи 99 % ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8. Варіанти також включають поліпептиди, що кодуються молекулою нуклеїнової кислоти, котра гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти послідовності SEQ ID NO:1, 9, 10, 11 або 12 чи її комплементом в жорстких умовах. Варіанти включають поліпептиди, які мають різну амінокислотну послідовність внаслідок мутагенезу. Варіантні білки, включені в цей винахід, є біологічно активними, тобто, вони продовжують мати бажану біологічну активність нативного білка і зберігають пестицидну активність. В деяких варіантах здійснення винаходу варіанти мають підвищену активність. Методи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) 7 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; і патент США № 5 743 477, усі з яких включені у цей документ шляхом посилання у повному обсязі. В деяких варіантах здійснення винаходу варіантний білок чи поліпептид містить одну чи кілька замін в положеннях амінокислот, вибраних з групи, яка складається з положень 307, 315, 317, 349, 351, 353, 355, 395, 399, 407, 419, 435, 443, 465, 467, 483, 487, 495, 497, 499, 509 та 513, по відношенню до SEQ ID NO:2. В деяких варіантах здійснення винаходу заміною є аланін для нативної амінокислоти у зазначеному положенні (положеннях). Крім того, у цей винахід включені нуклеотидні послідовності (послідовність), що кодують варіантний білок чи поліпептид. Бактеріальні гени, такі як axmi-гени за цим винаходом, достатньо часто мають множинні метіонінові ініціюючі кодони в безпосередній близькості до початку відкритої рамки зчитування. Ініціація трансляції в одному чи кількох з цих стартових кодонів часто веде до утворення функціонального білка. Ці стартові кодони можуть включати ATG-кодони. Наприклад, SEQ ID NO:3 і 4 представляють білки альтернативного сайту ініціації, що кодуються SEQ ID NO:1. Однак такі бактерії, як Bacillus sp., також розпізнають кодон GTG як стартовий кодон, а білки, що ініціюють трансляцію у GTG-кодонах, містять метіонін як першу амінокислоту. В рідких випадках трансляція у бактеріальних системах може ініціюватися у TTG-кодонах, хоча в цьому випадку TTG кодує метіонін. Крім того, не дуже часто визначається a priori, які з цих кодонів використовуються в бактерії у природі. Отже, мається на увазі, що використання одного з альтернативних метіонінових кодонів також може привести до утворення пестицидних білків. Ці пестицидні білки включені у цей винахід і можуть використовуватися у способах за винаходом. Слід розуміти, що при експресії у рослинах необхідно змінити альтернативний стартовий кодон на ATG для належної трансляції. Також пропонуються антитіла до поліпептидів за цим винаходом, чи до їхніх варіантів або фрагментів. Способи отримання антитіл добре відомі у цій галузі (див., наприклад, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; U.S. Patent No. 4,196,265). Змінені або покращені варіанти Визнано той факт, що ДНК-послідовності пестицидного білка можуть бути змінені різними способами і що ці зміни можуть привести до послідовностей ДНК, що кодують білки з амінокислотними послідовностями, які відрізняються від кодованих пестицидним білком за цим винаходом. Цей білок може бути змінений різними способами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, усікання та вставлення однієї чи кількох амінокислот за SEQ ID NO:2, 3 або 4, включаючи до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 чи більше амінокислотних замін, делецій чи вставок. Методи таких маніпуляцій загальновідомі у даній галузі. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності пестицидного білка можуть бути одержані мутаціями в ДНК. Це також можна здійснити однією чи кількома формами мутагенезу та/або спрямованою еволюцією. В деяких аспектах зміни, що кодовані в амінокислотній послідовності, не будуть значно впливати на функцію білка. Такі варіанти будуть зберігати бажану пестицидну активність. Однак слід розуміти, що здатність пестицидного білка надавати пестицидну активність може бути покращена шляхом використання даних методик до композицій за цим винаходом. Наприклад, фахівець може експресувати пестицидний білок в клітинах-хазяях, які виявляють високі ступені помилок включення основ під час реплікації ДНК, наприклад, штаму XL-1 Red (Stratagene, Ла Джола, Каліфорнія, США). Після розмноження таких штамів фахівець може виділити ДНК (наприклад, шляхом створення плазмідної ДНК чи ампліфікації за допомогою ПЛР та клонування отриманого фрагменту ПЛР у вектор), культивувати продуценти мутантних форм пестицидного білка у немутагенний штам та ідентифікувати мутовані гени з пестицидною активністю, наприклад, шляхом проведення аналізу для перевірки пестицидної активності. Як правило, білок змішують та використовують у біологічних випробуваннях впливу при згодовуванні. Див., наприклад, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такі біологічні випробування можуть включати контакт рослин з одним чи кількома шкідниками та визначення здатності рослини до виживання та/або причини смерті шкідників. Приклади мутацій, що приводять до підвищеної токсичності, можна знайти у Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806. Альтернативно, зміни можуть бути зроблені у білковій послідовності багатьох білків на аміно- чи карбокси-кінці без значної зміни активності. Сюди входять вставки, делеції або заміни, 8 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внесені сучасними методами молекулярної біології, такими як ПЛР, включаючи ПЛРампліфікації, що змінюють чи подовжують послідовність кодування білка шляхом включення послідовностей, що кодують амінокислоти, в олігонуклеотидах, що використовуються в ПЛРампліфікації. Альтернативно, додані білкові послідовності можуть включати повні послідовності, що кодують білок, подібні тим, що традиційно використовуються у даній галузі для утворення злитих білків. Такі злиті білки часто використовуються для (1) підвищення експресії білка, що представляє інтерес, (2) введення зв'язувального домену, ферментної складової чи епітопу для полегшення очищення білка, його виявлення або для інших експериментальних цілей, відомих в даній галузі, (3) цільового виділення чи трансляції білка до внутрішньоклітинної органели, такої як периплазматичний простір грам-негативних бактерій або ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, останнє з яких часто приводить до глікозилювання білка. Варіантні нуклеотидні та амінокислотні послідовності за цим винаходом також включають послідовності, одержані з використанням методик надання мутагенної та рекомбіногенної активності, таких як перестановка у ДНК. За допомогою такої методики для утворення нового пестицидного білка, що має бажані можливості, можуть використовуватись одна чи кілька різних ділянок, які кодують пестицидний білок. Таким чином, створюються бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів із популяції нуклеотидів споріднених послідовностей, які містять ділянки послідовності, що мають значну ідентичність послідовності та можуть бути гомологічно рекомбіновані in vitro або in vivo. Наприклад, за допомогою такого підходу мотиви послідовностей, що кодують домен, який представляє інтерес, можуть переставлятися між пестицидним геном за винаходом та іншими відомими пестицидними генами для отримання нового гену, котрий кодує з поліпшеною цільовою властивістю, наприклад, покращеною інсектицидною активністю. Стратегії такої перестановки у ДНК відомі у даній галузі. Див., наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; і патенти США № № 5 605 793 та 5 837 458. Обмін чи перестановка доменів – ще один механізм створення змінених пестицидних білків. Домени можуть бути обміняні між пестицидними білками, що веде до утворення гібридних чи химерних токсинів з підвищеною пестицидною активністю чи спектром мішеней. Способи створення рекомбінантних білків і тестування їх на пестицидну активність добре відомі в цій галузі (див., наприклад, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925). Вектори Пестицидна послідовність за винаходом може міститися в експресійній касеті для експресії у рослині, що представляє інтерес. Під "експресійною касетою рослини" мається на увазі ДНКконструкт, який здатний приводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування у рослинній клітині. Як правило, вони містять промотор і послідовність, що кодує. Часто такі конструкти також містять нетрансльовану ділянку 3′. Такі конструкти можуть включати "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення котрансляційного чи посттрансляційного переносу пептиду до окремих внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (чи інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або апарат Гольджі. Під "сигнальною послідовністю" мається на увазі послідовність, котра, як відомо чи як передбачається, приводить до котрансляційного чи пост-трансляційного переносу пептиду через клітинну мембрану. У еукаріотів це зазвичай включає секрецію у апарат Гольджі, з деяким глікозилюванням, що відбувається у результаті. Інсектицидні токсини бактерій часто синтезуються як протоксини, які протолітично активуються у травному тракті шкідника-мішені (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). В деяких варіантах здійснення цього винаходу сигнальна послідовність розташована у нативній послідовності чи може бути отримана з послідовності за винаходом. Під "лідерною послідовністю" мається на увазі будь-яка послідовність, котра при трансляції приводить до амінокислотної послідовності, достатньої для запуску котрансляційного транспорту пептидного ланцюгу до субклітинної органели. Таким чином, вона включає лідерні послідовності, які націлюють транспорт та/або глікозилювання шляхом переносу в ендоплазматичний ретикулум, переносу у вакуолі, пластиди, включаючи хлоропласти, мітохондрії і таке інше. Під "вектором для трансформації рослини" мається на увазі молекула ДНК, котра є необхідною для ефективної трансформації рослинної клітини. Така молекула може складатися з однієї чи кількох експресійних касет рослин і може бути організована у більш ніж одну 9 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, бінарними векторами є вектори для трансформації рослин, які використовують два несуміжних вектори ДНК для кодування усіх необхідних функціональних груп, що знаходяться у цис- і транс-положенні, для трансформації рослинних клітин (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Вектор" означає конструкт нуклеїнової кислоти, призначений для переносу між різними клітинами-хазяями. "Вектор експресії" означає вектор, який має здатність вбудовувати, інтегрувати і експресувати гетерологічні послідовності ДНК чи фрагменти у чужорідній клітині. Касета включає регуляторні послідовності на 5′- і 3′-кінцях, функціонально зв'язані з послідовністю за винаходом. Під терміном "функціонально зв'язаний" мається на увазі функціональний зв'язок між промотором та другою послідовністю, причому послідовність промотора ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Взагалі, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовності нуклеїнової кислоти, будучи з'єднаними, є суміжними та, якщо необхідно з'єднати дві ділянки, що кодують білки, - суміжними і в тій самій рамці зчитування. Касета може додатково містити принаймні один додатковий ген, який треба спільно трансформувати у організм. Альтернативно, на кількох експресійних касетах можуть міститися додатковий ген чи гени. "Промотор" стосується послідовності нуклеїнової кислоти, що забезпечує спрямування процесу транскрипції послідовності, що кодує, по ходу транскрипції. Промотор, разом із іншими послідовностями нуклеїнових кислот, що регулюють транскрипцію і трансляцію (також відомі під назвою "контрольні послідовності"), є необхідними для експресії послідовності ДНК, що представляє інтерес. Така експресійна касета має багато сайтів рестрикції для вставлення пестицидної послідовності, транскрипція якої знаходиться під управлінням регуляторних ділянок. Експресійна касета включає у напрямку 5′-3′-кінців транскрипції ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто, промотор), послідовність ДНК за винаходом та ділянку термінації трансляції та транскрипції (тобто, термінаційну ділянку), що є функціональною у рослин. Промотор може бути нативним чи аналогічним, або чужорідним чи гетерологічним рослині-хазяїну та/або послідовності ДНК за винаходом. До того ж, промотор може бути природною послідовністю або, як альтернатива, синтетичною послідовністю. У випадках, коли промотор є "нативним" чи "гомологічним" рослині-хазяїну, мається на увазі, що промотор виявлений у нативній рослині, в яку введений промотор. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" послідовності ДНК за винаходом, мається на увазі, що промотор не є нативним чи таким, який зустрічається у природі, для функціонально зв'язаної послідовності ДНК за винаходом. Ділянка термінації може бути нативною з ділянкою ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною послідовністю ДНК, що представляє інтерес, може бути нативною з рослиною-хазяїном чи може бути отримана з іншого джерела (тобто, чужорідна або гетерологічна промотору, послідовності ДНК, що представляє інтерес, рослині-хазяїну чи будьякій їхній комбінації). Прийнятні ділянки термінації можна одержати з Ti-плазміди бактерії A. tumefaciens, такі як ділянки термінації октопінсинтази і нопалінсинтази. Див. також Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; та Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. У разі необхідності ген(и) може бути оптимізований для підвищеної експресії у трансформованій клітині-хазяїні. Тобто, гени можна синтезувати з використанням оптимальних для клітин-хазяїв кодонів для покращеної експресії чи можуть бути синтезовані за допомогою кодонів з кращою для хазяїна періодичністю використання кодонів. Як правило, GC-вміст гену буде підвищеним. Див., наприклад, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11, стосовно обговорення використання кодонів, кращих для клітин-хазяїв. Способи синтезу генів, найкращих для рослини, описані у даній галузі. Див., наприклад, патенти США №№ 5 380 831 і 5 436 391, а також Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, які включені у цей документ шляхом посилання. В одному з варіантів здійснення винаходу пестицидний білок націлений на хлоропласт для експресії. Таким чином, у випадках, коли пестицидний білок безпосередньо не вбудований у хлоропласт, експресійна касета додатково містить нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид для доставки пестицидного білка до хлоропластів. Такі транзитні пептиди відомі в даній галузі. Див., наприклад, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; та Shah et al. (1986) Science 233:478-481. 10 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пестицидний ген, який повинен бути спрямований на хлоропласт, може бути оптимізований для експресії у хлоропласт з урахуванням відмінностей у використанні кодонів між ядром клітин рослини та цією органелою. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, можуть бути синтезовані з використанням кодонів, кращих для хлоропластів. Див., наприклад, патент США 5 380 831, включений у цей документ шляхом посилання. Трансформація рослини Способи за винаходом включають введення нуклеотидного конструкту в рослину. Під "введенням" мають на увазі представлення рослині нуклеотидного конструкту таким чином, що конструкт одержує доступ до внутрішнього простору клітини рослини. Способи за винаходом не вимагають, щоб використовувався якийсь конкретний спосіб введення нуклеотидного конструкту у рослину; треба тільки, щоб нуклеотидний конструкт одержав доступ до внутрішнього простору принаймні однієї клітини рослини. Способи введення нуклеотидних конструктів у рослини відомі у цій галузі, включаючи, але не обмежуючись ними, способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи, опосередковані вірусом. Під "рослиною" розуміють цілі рослини, органи рослин (наприклад, листя, стебла, корені та ін.), насіння, рослинні клітини, пагони, зародки та їхнє потомство. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, клітини суспензійної культури, протопласти, клітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, пилок). «Трансгенні рослини" чи "трансформовані рослини" або "стабільно трансформовані" рослини чи клітини або тканини мають відношення до рослин, які мають вбудовані чи інтегровані у рослинну клітину екзогенні послідовності нуклеїнової кислоти чи фрагменти ДНК. Ці послідовності нуклеїнової кислоти включають ті, які є екзогенними або не присутні у нетрансформованій рослинній клітині, а також ті, що можуть бути ендогенними, або присутні у нетрансформованій рослинній клітині. Поняття "гетерологічний" взагалі вживається щодо послідовностей нуклеїнової кислоти, котрі не є ендогенними по відношенню до клітини або частини нативного геному, в якому вони присутні, та були додані до клітини шляхом інфекції, трансфекції, мікроін'єкції, електропорації, мікропроекції чи подібним способом. Трансгенні рослини за винаходом експресують одну чи кілька пестицидних послідовностей, розкритих в цьому документі. В різних варіантах здійснення винаходу трансгенна рослина, крім того, містить один чи кілька додаткових генів для забезпечення стійкості до дії комах, наприклад, один чи кілька додаткових генів для боротьби з твердокрилими, лускокрилими, напівтвердокрилими чи нематодними шкідниками. Фахівцю у даній галузі зрозуміло, що трансгенна рослина може містити будь-який ген, що є джерелом агрономічної ознаки, що представляє інтерес. Трансформація клітин рослини може виконуватися за допомогою кількох методик, відомих у даній галузі. Пестицидний ген за винаходом може бути модифікований для досягнення чи посилення експресії у рослинних клітинах. Як правило, конструкт, що експресує такий білок, містить промотор для управління транскрипцією гена, а також нетрансльовану ділянку 3′, щоб забезпечити термінацію транскрипції та поліаденілювання. Організація таких конструктів добре відома у даній галузі. В деяких випадках може бути корисним конструювання гена таким чином, щоб отриманий пептид виділявся чи інакше націлювався всередині рослинної клітини. Наприклад, ген може бути сконструйований так, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переносу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також може бути найкращим конструювання експресійної касети рослини, яка містить інтрон, процесинг мРНК якого є необхідним для експресії. Зазвичай ця "експресійна касета рослини" вводиться у "вектор для трансформації рослини". Цей вектор для трансформації рослини може містити один чи кілька ДНК-векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, звичайною практикою в даній галузі є використання векторів трансформації рослини, що включають більш ніж один суміжний сегмент ДНК. Ці вектори часто називають у даній галузі "бінарними векторами". Бінарні вектори, а також вектори з плазмідами-хелперами, найчастіше застосовуються для трансформації, опосередкованої Agrobacterium, де розмір та складність сегментів ДНК, необхідних для ефективної трансформації, достатньо великі, та найкращим є розділення функцій між окремими молекулами ДНК. Бінарні вектори зазвичай включають плізмідний вектор, котрий містить діючі в цис-положенні послідовності, які потрібні для переносу T-ДНК (такі як ліва межа та права межа), маркер селекції, який сконструйовано так, щоб надати можливість експресії у рослинній клітині, та "цільовий ген" (ген, сконструйований з метою надання можливості експресії у рослинній клітині, для якого бажано утворення трансгенного різновиду). У цьому плазмідномувекторі також присутні послідовності, необхідні для бактеріальної реплікації. Діючі у цис-положенні 11 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності розташовані таким чином, щоб забезпечити ефективний перенос у рослинні клітини та експресію у них. Наприклад, ген-маркер селекції та пестицидний ген знаходяться між лівою та правою межами. Дуже часто другий плазмідний вектор містить діючі у транс-положенні фактори, котрі опосередковують перенос T-ДНК з Agrobacterium у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить ділянки, відповідальні за вірулентність (Vir-гени), що дозволяють інфікувати рослинні клітини за допомогою Agrobacterium, і переносить ДНК шляхом розриву граничних послідовностей та опосередкованого вірусом переносу ДНК, як це описано в даній галузі (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Для трансформації рослин можуть використовуватись декілька типів штамів Agrobacterium (наприклад, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 та ін.). Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослин іншими способами, такими як мікропроекція, мікроін'єкція, електропорація, трансформація в присутності поліетиленгліколю та інші. Як правило, способи трансформації рослин включають перенос гетерологічної ДНК у рослинні клітини-мішені (наприклад, незрілі чи зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти та ін.), з наступним застосуванням максимально припустимого рівня відповідної селекції (в залежності від гена-маркера селекції) для виділення трансформованих рослинних клітин з групи трансформованої клітинної маси. Експлантати, як правило, переносяться у свіжу порцію того самого середовища і культивуються звичайним способом. Потім трансформовані клітини диференціюються у пагони після їхнього розміщення у середовищі для регенерації, в яку введений максимально припустимий рівень селектуючого агента. Потім пагони переносять на селективне середовище коренеутворення для відновлення укорінених пагонів чи проростків. Трансгенний проросток потім виростає у зрілу рослину та продукує схоже насіння (наприклад, див. Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Експлантати, як правило, переносяться у свіжу порцію того самого середовища і культивуються звичайним способом. Загальний опис технологій та способів отримання трансгенних рослин можна знайти в роботі Ayres і Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 і Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, в будь-якій частині калюсу-мішені чи тканини або групи клітин, що піддавалися дії, присутні і трансформовані, і нетрансформовані клітини. Здатність знищувати нетрансформовані клітини та дозволяти трансформованим клітинам проліферувати дає в результаті трансформовані рослинні культури. Дуже часто здатність видаляти нетрансформовані клітини є обмеженням для швидкого виділення трансформованих рослинних клітин і успішного створення трансгенних рослин. Протоколи трансформації, а також протоколи введення нуклеотидних послідовностей у рослини, можуть змінюватися в залежності від типу рослини чи рослинної клітини, тобто, однодольна чи дводольна, які є об'єктами трансформації. Створення трансгенних рослин може бути виконано одним з декількох способів, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроін'єкцію, електропорацію, прямий перенос гена, введення гетерологічної ДНК за допомогою Agrobacterium у рослинні клітини (трансформація, опосередкована Agrobacterium), бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, закріпленою на частинках, балістичне прискорення частинок, аерозольну пучкову трансформацію (опублікована заявка на патент США № 20010026941; патент США № 4 945 050; міжнародна заявка № WO 91/00915; опублікована заявка на патент США № 2002015066), використання сім'ядоль (Lec1) для трансформації та різні інші способи для переносу ДНК без прямого опосередкування частинками. Способи трансформації хлоропластів відомі у даній галузі. Див., наприклад, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. В основі спобу лежить доставка генетичною гарматою частинок, покритих ДНК, яка містить маркер селекції, і націлювання ДНК на пластидний геном за допомогою гомологічної рекомбінації. Крім того, трансформація пластид може бути здійснена трансактивацією "мовчазного" транс-гена пластидного походження за допомогою бажаної для тканини експресії РНК- полімерази, що кодується ядерною ДНК і регулюється пластидами. Така система описана у роботі McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини використовують максимально припустимий рівень належної селекції у середовищі для знищення нетрансформованих клітин і відділення та проліферації потенційно трансформованих клітин, котрі виживають у результаті цієї селекційної обробки шляхом регулярного переносу у свіже середовище. За допомогою безперервного пасажу та контрольного зараження з відповідною селекцією, ідентифікують та проліферують клітини, котрі трансформовані плазмідним вектором. 12 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Після цього можуть бути використані методи молекулярної біології та біохімії для підтвердження наявності інтегрованого гетерологічного гена, який представляє інтерес, у геномі трансгенної рослини. Клітини, які були трансформовані, можуть бути вирощені у рослинах відповідно до загальноприйнятих способів. Див., наприклад, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини потім можна виростити, а також або опилити тим самим трансформованим штамом, або відмінними штамами, причому одержаний гібрид має конститутивну експресію бажаної ідентифікованої фенотипічної ознаки. Можуть бути вирощені два чи більше поколінь, щоб впевнитися у тому, що експресія бажаної фенотипічної ознаки стабільно підтримується та успадковується, а потім збирається насіння для пересвідчення у досягненні експресії бажаної фенотипічної ознаки. Таким чином, цей винахід пропонує трансформоване насіння (також має назву: "трансгенне насіння"), яке містить нуклеотидний конструкт за винаходом, наприклад, експресійну касету за винаходом, що стабільно вбудована в їхній геном. Оцінка трансформації рослин Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена у рослинний геном підтверджують різними методами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, пов'язаних із інтегрованим геном. Аналіз ПЛР є швидким методом дослідження трансформованих клітин, тканини чи пагонів на наявність вбудованого гена на ранній стадії до пересадження у ґрунт (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ПЛР проводиться з використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічних до гена, який представляє інтерес, чи вектора Agrobacterium як фону, та ін. Трансформація рослини може бути підтверджена аналізом геномної ДНК методом саузернблотингу (Sambrook and Russell, 2001, див. вище). Як правило, усю ДНК виділяють із трансформанта, розщеплюють відповідними ферментами рестрикції, розділяють в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну чи нейлонову мембрану. Після цього мембрана чи "блот" зондується, наприклад, цільовим фрагментом ДНК, міченим радіоактивним 32P, для підтвердження інтеграції введеного гена у геном рослини у відповідності до стандартних методик (Sambrook and Russell, 2001, див. вище). В нозерн-блотинг аналізі РНК виділяють з конкретних тканин трансформанта, розділяють в агарозному гелі з формальдегідом і блотують на нейлоновому фільтрі, відповідно до стандартних методик, котрі зазвичай використовуються у даній галузі (Sambrook and Russell, 2001, див. вище). Експресія РНК, що кодується пестицидним геном, потім тестується гібридизацією вмісту фільтра з радіоактивним зондом, отриманим із пестицидного гена, за допомогою методів, відомих у даній галузі (Sambrook and Russell, 2001, див. вище). Для підтвердження наявності білка, який кодується пестицидним геном, на трансгенних рослинах може бути проведений вестерн-блотинг, біохімічні аналізи і т. ін., за допомогою стандартних методик (Sambrook and Russell, 2001, див. вище), з використанням антитіл, що зв'язують один чи декілька епітопів, присутніх на пестицидному білку. Пестицидна активність у рослин В іншому аспекті цього винаходу можна створювати трансгенні рослини, які експресують пестицидний білок, котрий має пестицидну активність. Способи, наведені вище для прикладу, можуть використовуватись для створення трансгенних рослин, але спосіб, у який створюються трансгенні рослинні клітини, не є критичним для цього винаходу. Способи, вже відомі чи описані у даній галузі, такі як трансформація, опосередкована Agrobacterium, біолістична трансформація та способи переносу ДНК, не опосередковані частинками, можуть бути використані, на розсуд експериментатора. Рослини, що експресують пестицидний білок, можуть бути виділені звичайними способами, які описані у цій галузі, наприклад, трансформацією калюсу, селекцією трансформованого калюсу та регенерацією плодоносних рослин з такого трансгенного калюсу. В такому процесі можна використовувати будь-який ген як маркер селекції, доки його експресія у рослинних клітинах дає можливість ідентифікувати чи відбирати трансформовані клітини. Був розроблений цілий ряд маркерів для використання з рослинними клітинами, такі як стійкість до хлорамфеніколу, аміноглікозиду G418, гігроміцину і т. ін. Інші гени, що кодують продукт, який бере участь у метаболізмі хлоропластів, також можна використовувати як маркери селекції. Наприклад, гени, які забезпечують стійкість до рослинних гербіцидів, таких як гліфосат, бромоксиніл або імідазолінон, можуть знайти особливе застосування. Такі гени вже були описані (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (ген нітрилази, що забезпечує стійкість до бромоксинілу); та Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (ген синтетази ацетогідроксикислот (AHAS), що забезпечує стійкість до імідазолінону). Крім того, гені, розкриті 13 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у цьому винаході, є придатними для використання як маркери для оцінки трансформації бактеріальних чи рослинних клітин. Методи визначення наявності трансгена у рослині чи органі рослини (наприклад, у листі, стеблах, коренях та ін.), насінні, рослинній клітині, пагоні, зародку чи в їхньому потомстві добре відомі у даній галузі. В одному з варіантів здійснення винаходу наявність трансгена визначається шляхом тестування на пестицидну активність. Плодоносні рослини, що експресують пестицидний білок, можуть бути перевірені на пестицидну активність, і рослини, що показали оптимальну активність, вибирають для подальшого культивування. В даній галузі відомі способи аналізу активності по відношенню до шкідників. Як правило, білок змішують та використовують в аналізах згодовування. Див., наприклад, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Цей винахід може використовуватися для трансформації будь-яких видів рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, однодольні та дводольні. Приклади рослин, що представляють інтерес, включають (але не обмежуються ними) кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті, перці, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь та масляний рапс, Brassica sp., люцерну, жито, просо, сафлор, арахіс, солодку картоплю, маніоку, кавове дерево, кокос, ананас, цитрусові дерева, какао, чай, банан, авокадо, інжир, гуаяву, манго, оливу, папайю, кешью, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні і хвойні рослини. Овочі включають (але не обмежуються ними) томати, салат-латук, зелену квасолю, квасолю Ліма, горох та членів роду Curcumis, таких як огірок, канталупа та мускусна диня. Декоративні рослини включають, але не обмежуються ними, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, нарциси жовті, петунії, гвоздику, пуансетію та хризантему. Переважно, рослинами за цим винаходом є сільськогосподарські культури (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, томат, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, масляний рапс та ін.). Використання у контролі боротьбі зі шкідниками Загальні способи застосування штамів, які містять нуклеотидну послідовність за цим винаходом або її варіант, у контролі боротьбі зі шкідниками чи в конструюванні інших організмів, як пестицидних агентів, вже відомі в цій галузі. Див, наприклад, патент США № 5 039 523 і європейський патент 0480762A2. Штами Bacillus, котрі включають нуклеотидну послідовність за цим винаходом або її варіант, чи мікроорганізми, що були генетично змінені для того, щоб містити пестицидний ген та білок, можуть використовуватись для захисту сільськогосподарських рослин і продуктів від шкідників. В одному аспекті винаходу цілі, тобто, нелізовані, клітини організму, що продукує токсин (пестицид), обробляють реагентами, які подовжують дію токсину, виробленого у клітині, в тому випадку, коли клітину вносять в оточуюче середовище шкідника(ів)- мішені(ей). Альтернативно, пестицид одержують шляхом введення пестицидного гена до клітинихазяїна. Експресія пестицидного гена приводить, безпосередньо чи опосередковано, до внутрішньоклітинного продукування та збереження пестициду. В одному з аспектів винаходу ці клітини потім обробляються в умовах, які подовжують дію токсину, виробленого у клітині, коли клітину вносять в оточуюче середовище шкідника(ів)- мішені(ей). Одержаний в результаті продукт зберігає токсичність токсину. Ці природно інкапсульовані пестициди можуть бути потім переведені у готову до використання форму, згідно із загальноприйнятими методиками, для внесення в оточуюче середовище шкідника-мішені, наприклад, ґрунт, воду і листя рослин. Див., наприклад, EPA 0192319 і посилання, наведені в ньому. Альтернативно, можна перевести клітини, що експресують ген відповідно до цього винаходу, в готову форму так, щоб забезпечити застосування одержаного матеріалу як пестициду. Пестицидні композиції Активні інгредієнти за цим винаходом зазвичай використовуються у формі композицій та можуть наноситися на посівну площу чи рослину, що потребує обробки, одночасно чи послідовно з іншими сполуками. Цими сполуками можуть бути добрива, гербіциди, кріопротектори, поверхнево-активні речовини, детергенти, пестицидні мила, масла, що застосовуються у стані вегетативного покою, полімери та/або суміші носіїв, що вивільняються з часом або розкладаються мікроорганізмами, котрі дозволяють довгочасне дозування в цільовій області після одноразового нанесення суміші. Це також можуть бути селективні гербіциди, хімічні інсектициди, віруцидні засоби, мікробіциди, амебіциди, пестициди, фунгіциди, бактеріциди, нематоциди, молюскоциди або суміші кількох таких препаратів, за бажанням, разом із додатковими прийнятними у сільському господарстві носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними засобами, які сприяють нанесенню (ад'ювантами), що зазвичай використовуються при приготуванні сумішей. Прийнятні ад'юванти можуть бути твердими чи 14 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рідкими та можуть належати до речовин, які взагалі використовуються в технології сумішей, наприклад, природні чи отримані в результати переробки мінеральні речовини, розчинники, дисперганти, засоби змочування, посилювачі клейкості, зв'язуювальні речовини або добрива. Також можуть бути приготовлені суміші у виді їстівних "принад" чи "пасток" для шкідників, щоб дати змогу шкідникам-мішеням з'їсти чи поглинути пестицидну суміш. Способи нанесення активного інгредієнту за винаходом або агрохімічної композиції за цим винаходом, що містить принаймні один з пестицидних білків, котрі продукуються бактеріальними штамами за цим винаходом, включають нанесення на листя, покриття насіння та нанесення на ґрунт. Кількість нанесень та норма внесення залежать від інтенсивності зараженості відповідним шкідником. Композиція може бути виготовлена як порошок, дуст, таблетка, гранула, аерозоль, емульсія, колоїд, розчин і т. ін., і її можна приготувати такими традиційними засобами, як висушування, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, седиментація або концентрування культури клітин, які містять поліпептид. В усіх таких композиціях, які містять принаймні один таких пестицидний поліпептид, поліпептид може бути присутній у концентрації від приблизно 1 % до приблизно 99 % за вагою. Лускокрилі, двокрилі, напівтвердокрилі, твердокрилі шкідники чи нематоди можуть бути знищені або зменшені у кількостях на даній площі з використанням засобів за винаходом, або композиції можуть профілактично наноситися на природну територію для попередження зараження шкідником, який є чутливим до них. Переважно, шкідник поглинає чи входить у контакт із пестицидно- ефективною кількістю поліпептиду. "Пестицидно-ефективна кількість" означає кількість пестициду, здатну викликати загибель принаймні одного шкідника чи помітне зменшення росту кількості шкідників, порушення харчування або нормального фізіологічного розвитку. Ця кількість може мінятися в залежності від таких факторів, як, наприклад, конкретний вид шкідників-мішеней, з якими треба боротися, конкретне оточуюче середовище, місцевість, рослина, культура чи сільськогосподарська ділянка, що обробляється, екологічні умови та спосіб, норма, концентрація, стійкість та кількість нанесень пестицидно- ефективної композиції поліпептиду. Суміші також можуть мінятися, відповідно до кліматичних умов, питань охорони навколишнього середовища та/або частоти нанесення та/або ступеню зараженості шкідниками. Описані пестицидні композиції можуть бути одержані шляхом приготування готової форми з бактеріальної клітини, суспензії кристалів та/або спор чи виділеного білкового компоненту з потрібним прийнятним для сільського господарства носієм. Композиції можуть бути виготовлені перед нанесенням у відповідній формі, такій як ліофілізований, висушений замороженням, зневоднений чи водний носій, середовище чи прийнятний розчинник, наприклад, фізіологічний розчин або інший буфер. Виготовлені композиції можуть бути у формі дусту чи гранульованого матеріалу, або суспензії у маслі (рослинному чи мінеральному), водних чи масляно-водних емульсій, або у виді змочуваного порошку, або в комбінації з будь-яким іншим матеріаломносієм, прийнятним для сільськогосподарського застосування. Прийнятні сільськогосподарські носії можуть біти твердими чи рідкими, та вони є добре відомими у даній галузі. Термін "прийнятний сільськогосподарський носій" охоплює усі ад'юванти, інертні компоненти, диспергатори, поверхнево-активні речовини, посилювачі клейкості, зв'язувальні речовини та ін., що зазвичай використовуються у технології пестицидних сумішей; вони добре відомі фахівцям, які працюють з пестицидними сумішами. Суміші можна приготувати змішуванням з одним чи кількома твердими чи рідкими ад'ювантами та готуватися різними способами, наприклад, шляхом гомогенізації, змішування та/або подрібнення пестицидної композиції з належними ад'ювантами згідно із загальноприйнятими методиками приготування сумішей. Відповідні суміші та способи нанесення описані у патенті США № 6 468 523, який включений в даний документ шляхом посилання. Рослини можна також обробляти одним чи кількома хімічними композиціями, включаючи один чи кілька гербіцидів, інсектицидів або фунгіцидів. Приклади хімічних композицій включають: гербіциди для фруктів/овочів: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метрибузін, симазин, трифлуралін, флуазифоп, глуфосинат, галосульфурон компанії Gowan, паракват, пропізамід, сетоксидім, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для фруктів та овочів: альдикарб, Bacillus thuriengiensis, карбарил, карбофуран, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, діазинон, малатіон, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, есфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацехіноцил, біфеназат, метоксіфенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, дінотефуран, флуакрипірим, толфенпірад, клотіанідин, спіродиклофен, гама-цигалотрин, спіромезифен, спіносад, ринаксипір, ціазипір, спінотерам, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодикарб, метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, ціанопірафен, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, 15 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спіноторам, тіодикарб, флонікамід, метіокарб, емамектин-бензоат, індоксакарб, фостіазат, фенаміфос, кадусафос, пірипроксифен, фенбутатин оксид, гекситіазокс, метоміл, 4-[[(6хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил) аміно]фуран-2(5H)-он; фунгіциди для фруктів та овочів: карбендазим, хлороталоніл, етиленбісдитіокарбамати (EBDC), сірка, тіофанат-метил, азоксистробін, цимоксаніл, флуазинам, фосетил, іпродіон, кресоксим-метил, металаксил/мефеноксам, трифлоксистробін, етабоксам, іпровалікарб, трифлоксистробін, фенгексамід, окспоконазол фумарат, ціазофамід, фенамідон, зоксамід, пікоксистробін, піраклостробін, цифлуфенамід, боскалід; гербіциди для зернових: ізопротурон, бромоксиніл, іоксиніл, феноксильні, хлорсульфурон, клодинафоп, диклофоп, дифлуфенікан, феноксапроп, флорасулам, флуроксипір, метсульфурон, триасульфурон, флукарбазон, йодсульфурон, пропоксикарбазон, піколінафен, мезосульфурон, бефлубутамід, піноксаден, амідосульфурон, тифенсульфурон, трибенурон, флупірсульфурон, сульфосульфурон, пірасульфотол, піроксулам, флуфенацет, тралкоксидім, піроксасульфон; фунгіциди для зернових: карбендазим, хлороталоніл, азоксистробін, ципроконазол, ципродиніл, фенпропіморф, епоксиконазол, крезоксим-метил, хіноксифен, тебуконазол, трифлоксистробін, сімеконазол, пікоксистробін, піраклостробін, димоксистробін, протіоконазол, флуоксастробін; інсектициди для зернових: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, бета-цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, хлорпірифос, метамідофос, оксидеметон-метил, піримікарб, метіокарб; гербіциди для кукурудзи: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, S-диметенамід, глуфосинат, гліфосат, ізоксафлутол, S-метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, примісульфурон, римсульфурон, сулькотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флуфенацет, піроксасульфон; інсектициди для кукурудзи: карбофуран, хлорпірифос, біфетрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромезифен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, дельтаметрин, тіодикарб, бета-цифлутрин, циперметрин, біфентрин, луфенурон, трифлуморон, тефлутрин, тебупіримфос, етипрол, ціазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, авермектин, метіокарб, спіродиклофен, спіротетрамат; фунгіциди для кукурудзи: фенітропан, тирам, протіоконазол, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даймурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутікарб, хінклорак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, оксазикломефон, бензобіциклон, пірифталід, пеноксулам, біспірибак, оксадіаргіл, етоксисульфурон, претилахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримісульфан; інсектициди для рису: діазинон, фенітротіон, фенобукарб, монокротофос, бенфуракарб, бупрофезин, дінотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, тіаклоприд, клотіанидин, етипрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спіноторам, емамектин-бензоат, циперметрин, хлорпірифос, картап, метамідофос, етофенпрокс, триазофос, 4-[[(6- хлорпіридин-3-іл)метил](2,2- дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, карбофуран, бенфуракарб; фунгіциди для рису: тіофанат-метил, азоксистробін, карпропамід, едифенфос, феримзон, іпробенфос, ізопротіолан, пенцикурон, пробеназол, пірохілон, трициклазол, трифлоксистробін, диклоцимет, феноксаніл, сімеконазол, тіадиніл; гербіциди для бавовника: діурон, флуометурон, MSMA (мононатрійметиларсонат), оксифторфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, гліфосат, норфлуразон, пендиметалін, піритіобак-натрій, трифлоксисульфурон, тепралоксидім, глуфосинат, флуміоксазин, тідіазурон; інсектициди для бавовника: ацефат, алдикарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, малатіон, монокротофос, абамектин, ацетаміприд, емамектин бензоат, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, спіносад, тіодикарб, гама-цигалотрин, спіромезифен, піридаліл, флонікамід, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, бетацифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, динетофуран, флубендіамід, ціазипір, спіносад, спіноторам, гама-цигалотрин, 4-[[(6- хлорпіридин-3-іл)метил](2,2дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, тіодикарб, авермектин, флонікамід, піридаліл, спіромезифен, сульфоксафлор, профенофос, триазофос, ендосульфан; фунгіциди для бавовника: етридіазол, металаксил, хінтозен; гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлоримурон-етил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазахін, імазетапір, S-метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, глуфосинат; інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, паратіон, тіокарб, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксан, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, спіносад, спіноторам, емамектин-бензоат, фіпроніл, етипрол, дельтаметрин, бета-цифлутрин, гама- і лямбда-цигалотрин, 4-[[(6- хлорпіридин-3 16 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іл)метил](2,2- дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодикарб, бета-цифлутрин; фунгіциди для сої: азоксистробін, ципроконазол, епоксиконазол, флутріафол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін, протіоконазол, тетраконазол; гербіциди для цукрового буряку: хлоридазон, десмедіфам, етофумезат, фенмедіфам, тріалат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамітрон, хінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, хізалофоп; інсектициди для цукрового буряку: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, дельтаметрин, бетацифлутрин, гама / лямбда цигалотрин, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, тефлутрин, ринаксипір, ціазипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для каноли: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глуфосинат, глифосат, метазахлор, трифлуралін етаметсульфурон, хінмерак, хізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для каноли: азоксистробін, карбендазим, флудиоксоніл, іпродіон, прохлораз, вінклозолин; інсектициди для каноли: карбофуран, органофосфати, піретроїди, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, динетофуран, бета-цифлутрин, гама і лямбда цигалотрин, тау-флувалеріат, етипрол, спіносад, спіноторам, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он. Термін "шкідник" включає, але не обмежується ними, комах, гриби, бактерії, нематоди, кліщів, іксодових кліщів і т. ін. Комахи-шкідники включають комах, вибраних з рядів Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera та інших, зокрема, Coleoptera, Lepidoptera та Diptera. Ряд Coleoptera включає підряди Adephaga та Polyphaga. Підряд Adephaga включає надродини Caraboidea і Gyrinoidea, в той час як підряд Polyphaga включає надродини Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea та Curculionoidea. Надродина Caraboidea включає родини Cicindelidae, Carabidae та Dytiscidae. Надродина Gyrinoidea включає родину Gyrinidae. Надродина Hydrophiloidea включає родину Hydrophilidae. Надродина Staphylinoidea включає родини Silphidae та Staphylinidae. Надродина Cantharoidea включає родини Cantharidae та Lampyridae. Надродина Cleroidea включає родини Cleridae та Dermestidae. Надродина Elateroidea включає родини Elateridae та Buprestidae. Superfamily Cucujoidea включає родину Coccinellidae. Надродина Meloidea включає родину Meloidae. Надродина Tenebrionoidea включає родину Tenebrionidae. Надродина Scarabaeoidea включає родини Passalidae та Scarabaeidae. Надродина Cerambycoidea включає родину Cerambycidae. Надродина Chrysomeloidea включає родину Chrysomelidae. Надродина Curculionoidea включає родини Curculionidae та Scolytidae. Ряд Diptera включає підряди Nematocera, Brachycera та Cyclorrhapha. Підряд Nematocera включає родини Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae та Cecidomyiidae. Підряд Brachycera включає родини Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae та Dolichopodidae. Підряд Cyclorrhapha включає розділи Aschiza та Schizophora. Розділ Aschiza включає родини Phoridae, Syrphidae та Conopidae. Розділ Schizophora включає підрозділи Acalyptratae та Calyptratae. Підрозділ Acalyptratae включає родини Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae та Drosophilidae. Підрозділ Calyptratae включає родини Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae та Sarcophagidae. Ряд Lepidoptera включає родини Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae та Tineidae. Комахи-шкідники за винаходом для більшості основних сільськогосподарських культур включають: Кукурудза: Ostrinia nubilalis, європейський кукурудзяний метелик; Agrotis ipsilon, совка іпсілон; Helicoverpa zea, совка бавовняна; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Diatraea grandiosella, вогнівка кукурудзяна південно-західна; Elasmopalpus lignosellus, малий метелик кукурудзяний; Diatraea saccharalis, вогнівка цукрового очерету; Diabrotica virgifera, західний кукурудзяний жук; Diabrotica longicornis barberi, північний кукурудзяний жук; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точкова Говарда; Melanotus spp., дротяники; Cyclocephala borealis, північний масковий хрущ (личинка хруща); Cyclocephala immaculata, південний масковий хрущ (личинка хруща); Popillia japonica, хрущик японський; Chaetocnema pulicaria, земляна кукурудзяна блошка; Sphenophorus maidis, довгоносик кукурудзяний; Rhopalosiphum maidis, попелиця кукурудзяна листкова; Anuraphis maidiradicis, попелиця кукурудзяна коренева; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Melanoplus 17 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 femurrubrum, червоно-стегнова кобилка; Melanoplus sanguinipes, мігруючий коник; Hylemya platura, личинка мухи росткової; Agromyza parvicornis, кукурудзяна мінуюча мушка; Anaphothrips obscrurus, трипс злаковий; Solenopsis milesta, мураха-крадій; Tetranychus urticae, кліщ павутинний; Сорго: Chilo partellus, соргова вогнівка; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Helicoverpa zea, совка бавовняна; Elasmopalpus lignosellus, малий метелик кукурудзяний; Feltia subterranea, совка зерниста; Phyllophaga crinita, личинка хруща; Eleodes, Conoderus та Aeolus spp., дротяники; Oulema melanopus, п'явиця червоногруда; Chaetocnema pulicaria, земляна кукурудзяна блошка; Sphenophorus maidis, довгоносик кукурудзяний; Rhopalosiphum maidis; попелиця кукурудзяна листкова; Sipha flava, жовта попелиця цукрового очерету; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Contarinia sorghicola, галиця соргова; Tetranychus cinnabarinus, червоний павутинний кліщ; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Пшениця: Pseudaletia unipunctata, похідний черв'як; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Elasmopalpus lignosellus, малий метелик кукурудзяний; Agrotis orthogonia, совка прямокутна; Elasmopalpus lignosellus, малий метелик кукурудзяний; Oulema melanopus, п'явиця червоногруда; Hypera punctata, довгоносик точковий; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точкова Говарда; російська пшенична попелиця; Schizaphis graminum, попелиця злакова звичайна; Macrosiphum avenae, попелиця злакова велика; Melanoplus femurrubrum, червоно-стегнова кобилка; Melanoplus differentialis, кобилка відмітна; Melanoplus sanguinipes, мігруючий коник; Mayetiola destructor, гессенська мушка; Sitodiplosis mosellana, комарик пшеничний; Meromyza americana, личинка американської меромизи; Hylemya coarctata, муха озима; Frankliniella fusca, тютюновий трипс; Cephus cinctus, стебловий пильщик хлібний; Aceria tulipae, цибулевий кліщ тюльпанів; Соняшник: Suleima helianthana, листовійка соняшникова; Homoeosoma electellum, вогнівка соняшникова; zygogramma exclamationis, совка соняшникова оклична; Bothyrus gibbosus, жук морквяний; Neolasioptera murtfeldtiana, мошка насіння соняшника; Бавовник: Heliothis virescens, листовійка тютюнова; Helicoverpa zea, совка бавовняна; Spodoptera exigua, совка мала; Pectinophora gossypiella, рожевий коробочний черв'як; Anthonomus grandis, довгоносик бавовняний; Aphis gossypii, попелиця бавовняна; Pseudatomoscelis seriatus, бавовняний сліпняк; Trialeurodes abutilonea, облямована білокрилка; Lygus lineolaris, клоп трав'яний; Melanoplus femurrubrum, червоностегнова кобилка; Melanoplus differentialis, кобилка відмітна; Thrips tabaci, цибулевий трипс; Franklinkiella fusca, тютюновий трипс; Tetranychus cinnabarinus, червоний павутинний кліщ; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Рис: Diatraea saccharalis, вогнівка цукрового очерету; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Helicoverpa zea, совка бавовняна; Colaspis brunnea, коласпіс виноградний; Lissorhoptrus oryzophilus, довгоносик рисовий водяний; Sitophilus oryzae, довгоносик рисовий; Nephotettix nigropictus, рисова цикадка; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Acrosternum hilare, клопщитник; Соя: Pseudoplusia includens, соєва п'ядениця; Anticarsia gemmatalis, гусениця оксамитової квасолі; Plathypena scabra, гусениця клеверної совки; Ostrinia nubilalis, європейський кукурудзяний метелик; Agrotis ipsilon, совка іпсілон; Spodoptera exigua, совка мала; Heliothis virescens, листовійка тютюнова; Helicoverpa zea, совка бавовняна; Epilachna varivestis, сонечко бобове мексиканське; Myzus persicae, попелиця персикова зелена; Empoasca fabae, цикадка картопляна; Acrosternum hilare, клоп-щитник; Melanoplus femurrubrum, червононога кобилка; Melanoplus differentialis, кобилка відмітна; Hylemya platura, личинка мухи росткової; Sericothrips variabilis, соєвий трипс; Thrips tabaci, цибулевий трипс; Tetranychus turkestani, кліщ павутинний полуничний; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Ячмінь: Ostrinia nubilalis, європейський кукурудзяний метелик; Agrotis ipsilon, совка іпсілон; Schizaphis graminum, попелиця злакова звичайна; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Acrosternum hilare, клоп-щитник; Euschistus servus, бурий клоп-щитник; Delia platura, личинка мухи росткової; Mayetiola destructor, гессенська мушка; Petrobia latens, кліщ бурий пшеничний; масляний рапс: Brevicoryne brassicae, попелиця капустяна; Phyllotreta cruciferae, земляна блошка; Mamestra configurata, совка латукова; Plutella xylostella, моль капустяна; Delia ssp., весняна капустяна муха. Нематоди включають паразитичних нематод, таких як яванська галова нематода, цистові нематоди і кореневі нематоди, включаючи Heterodera spp., Meloidogyne spp. і Globodera spp.; зокрема, членів цистових нематод, включаючи, але не обмежуючись ними, Heterodera glycines (соєва цистова нематода); Heterodera schachtii (бурякова цистова нематода); Heterodera avenae (цистова нематода зернових); і Globodera rostochiensis та Globodera pailida (картопляні цистові нематоди). Кореневі нематоди включають Pratylenchus spp. Способи збільшення врожайності рослин 18 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід пропонує способи збільшення врожайності рослин. Способи включають надання рослини чи рослинної клітини, що експресує полінуклеотид, який кодує пестицидну поліпептидну послідовність, розкриту в цьому винаходу, і вирощування рослини чи її насіння на полі, зараженому шкідником, проти якого зазначений поліпептид виявляє пестицидну активність. В деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид виявляє пестицидну активність проти лускокрилих, двокрилих, твердокрилих, напівтвердокрилих чи нематодних шкідників, та зазначене поле уражене лускокрилим, двокрилим, твердокрилим, напівтвердокрилим чи нематодним шкідником. Як визначено в цьому винаході, "врожайність" рослини стосується якості та/або кількості біомаси, яку виробляє рослина. Під "біомасою" мається на увазі будь-який рослинний продукт, урожайність якого визначають. Збільшенням виробництва біомаси є будь-яке покращення у врожайності такого рослинного продукту. Збільшення врожайності рослин має декілька комерційних застосувань. Наприклад, збільшення біомаси листя може підвищити врожайність листкових овочів для споживання людьми і тваринами. Крім того, збільшення біомаси листя може використовуватися для росту виробництва фармацевтичних або промислових продуктів, одержаних з рослин. Підвищення врожайності може включати будь-яке статистично значуще збільшення, включаючи, але не обмежуючись ними, принаймні 1 % збільшення, принаймні 3 % збільшення, принаймні 5 % збільшення, принаймні 10 % збільшення, принаймні 20 % збільшення, принаймні 30 %, принаймні 50 %, принаймні 70 %, принаймні 100 % чи більше підвищення врожайності у порівнянні з рослиною, яка не експресує пестицидну послідовність. В конкретних методах врожайність рослини підвищується в результаті покращеної стійкості до шкідників рослини, що експресує пестицидний білок, розкритий в цьому винаході. Експресія пестицидного білка приводить до меншої здатності шкідника заражувати рослину або поїдати її, таким чином збільшуючи врожайність рослини. Наведені нижче приклади пропонуються з ілюстративною метою і не передбачають якихось обмежень. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРИКЛАДИ Приклад 1. Ідентифікація білка, активного проти західного кукурудзяного жука зі штаму ATX 2024. Білок AXMI-205, активний до західного кукурудзяного жука, був ідентифікований шляхом поєднання біохімічного та геномного аналізу зі штаму ATX 2024. ATX2024 був ідентифікований як активний штам в біологічному аналізі Diabrotica virgifera (західний кукурудзяний жук чи WCRW), що проявляє теплочутливу активність. Фракціонування та очищення білка були виконані на матеріалах культури ATX2024, як описано нижче: Клітини ATX2024 вирощували у відповідному середовищі (такому як середовище C2; вибір середовища не є критично важливим для винаходу) протягом 3 днів при температурі 37C. Був зібраний клітинний конгломерат, а потім клітини були зруйновані у буфері A (20мМ ацетату натрію/50мМ хлориду натрію, pH 5) з використанням високого тиску (прес "French Press"). Лізати були освітлені шляхом центрифугування та діалізовані проти 20мМ ацетату натрію, 50мМ хлориду натрію, значення рH 5.0. Після цього діалізований зразок був завантажений в катіонообмінну колонку SP Sepharose™ 20 мл (GE Healthcare). Білки були елюйовані за допомогою лінійного сольового градієнту у буфері A з 50 ммоль/л до 1 моль/л хлориду натрію більш ніж двадцятьма об'ємами колонки. Активні фракції були об'єднані та діалізовані проти буферу B (20 ммоль/л TrisHCl/50 ммоль/л NaCl, pH 7). Діалізовані активні фракції бути потім завантажені в аніонообмінну колонку з Q-сефарозою (5 мл). Білки були елюйовані за допомогою лінійного сольового градієнту у буфері A з 50 ммоль/л до 1 моль/л NaCl. Зібрані фракції перевіряли на активність щодо WCRW; було проведене спостереження фракцій з активністю щодо WCRW. Була ідентифікована білкова смуга приблизно в 52 кДа, як така, що має кореляцію з активністю фракцій. Цей білок має назву в цьому винаході "білкова смуга № 10". Активні фракції потім об'єднанували та концентрували, а потім піддавали SDS-PAGE (електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію). Була виділена частка отриманого гелю, що відповідає білковій смузі № 10, і проаналізована методами N-кінцевого секвенування та часопрольотної тандемної мас-спектрометрії з матрично-активованою лазерною десорбцією / іонізацією (MALDI-TOF-TOF), відомими в цій галузі. Порівняння даних MALDI-TOF-TOF щодо білкової смуги № 10 не показало ніяких відповідностей з базою даних відомих білків. 19 UA 105046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Амінокислотне секвенування N-кінця білкової смуги № 10 дало в результаті N-кінцеву пептидну послідовність, яка не продемонструвала ніяких відповідностей з відомими білковими послідовностями при порівнянні з базою даних відомих білкових послідовностей. Приклад 2. Геномне секвенування ATX2024 З вибраного штаму булі ідентифікована повна послідовність ДНК, як описано нижче: Загальна ДНК містить суміш деяких або усіх наступних компонентів: геномна ДНК, плазміди різного розміру; фагові хромосоми; інші не ідентифіковані позахромосомні молекули. Механічне або ферментативне фрагментування позахромосомної ДНК для отримання розподілених за розміром фрагментів. Секвенування фрагментованої ДНК за допомогою методів, відомих у цій галузі. Приклад 3. Порівняння даних N-кінцевого секвенування та MALDI-TOF-TOF з даними геномного секвенування: Набір даних щодо передбачуваних відкритих рамок зчитування (ORF), кодованих послідовностями ATX2024, був отриманий шляхом виділення усіх можливих ORF зі зчитувань послідовності, генерованих від ATX2024. Дані N-кінцевого секвенування білкової смуги № 10 (див. вище) були порівняні з набором ORF для ATX2024, з використанням алгоритму BLAST. Дві рамки зчитування, як виявилося, кодують передбачувані білкові фрагменти з високою гомологією до даних N- кінцевого секвенування. Подібним чином дані MALDI-TOF-TOF щодо білкової смуги №10 були порівняні з набором ORF для ATX2024 з використанням програми Mascot (www.matrixscience.com; Perkins et al. (1999) Electrophoresis 20(18):3551-67). Як виявилося, сім рамок зчитувань кодують передбачувані білкові фрагменти, що мають значну подібність з піками, які визначені в наборі даних MALDI-TOF-TOF. Зчитування послідовності нуклеотидів у ДНК, ідентифіковані після аналізу даних Nкінцевого секвенування та MALDI-TOF-TOF, були зібрані для визначення попередньої послідовності гена. Були використані стратегії TAIL-PCR (ПЛР) для одержання даних щодо фланкуючої послідовності, що примикає до попередньої послідовності гена. Послідовності одержаних ПЛРпродуктів були поєднані з первісними геномними даними від ATX2024, для того щоб визначити остаточну послідовність гена для відкритої рамки зчитування, що кодує білкову смугу № 10. Ця відкрита рамка зчитування позначена як Axmi205 (SEQ ID NO:1), а білок, який кодується відкритою рамкою зчитування, - як AXMI-205 (SEQ ID NO:2, 3 або 4). Геномна ділянка, що кодує AXMI-205, потім була ампліфікована з ATX2024-геному, клонована, і була одержана ДНК-послідовність цього клону. ДНК-послідовність цього клону у ділянці, що охоплює Axmi205, наведена як SEQ ID NO:16. Порівняння AXMI-205 з базами даних відомих білкових послідовностей показує, що AXMI205 є унікальним білком, що має дуже низьку гомологію (20 % чи менше) з відомими білками. Цікавим є той факт, що AXMI-205 має низьку, але можливо важливу, гомологію з широким класом слабо споріднених білків, які часто називаються білками MACPF (Rosado et al, Cellular Microbiology (2008) 10(9), 1765–1774). Вважають, що ці білки відіграють певну роль у таких процесах, як імунний відклик та захист від бактеріальної атаки. AXMI-205 на 20 % ідентичний білку з Clavibacter michiganensis (SEQ ID NO:14; № зразка у GENBANK YP_001223127, Gartemann et al, J. Bacteriol. 190 (6), 2138-2149 (2008)), і на 13 % ідентичний білку Photorhabdus luminescens (SEQ ID NO:15; № зразка у GENBANK 2QP2_A; Rosado, C.J., et al, Science 317 (5844), 1548-1551 (2007)). Хоча ці проценти ідентичності невеликі, можна ідентифікувати консервативні блоки амінокислот між цими білками, див. Малюнок 1. Приклад 3. Гетерологічна експресія AXMI-205 Плазміду, що містить відкриту рамку зчитування гена Axmi205, клонували у вектор для експресії в E. coli на основі (1) злитого вектору, що зв'язує мальтозу, для створення pAX6911 та (2) вектору експресії на основі pRSF1b для створення pAX7011. Для експресії у E. coli, BL21*DE3 трансформували за допомогою pAX6911, pAX7011, чи контрольними плазмідами. Одну колонію, трансформовану вектором, висівали у LB- бульйон з доданням канаміцину та вирощували протягом ночі при 37 °C. Наступного дня висівали у свіже середовище, у дві порції, 1 % вирощеної за ніч культури та вирощували при 37 °C до фази логарифмічного росту. Потім культури індукували 1мM IPTG протягом 3 годин при 37 °C чи протягом ночі при 20 °C. Кожний клітинний конгломерат суспендували у буфері на основі 50 ммоль/л карбонату натрію з pH 10,5 з доданням 1ммоль/л DTT (дитіотреїтол) і піддавали дії ультразвуку. Методом SDS-PAGE була виявлена експресія білка, що відповідає прогнозованому розміру AXMI-205. У випадку злитого білка pAX6911 на основі вектору pMal, білок, що відповідає прогнозованому розміру для гібриду pMAL-AXMI-205, спостерігався за допомогою PAGE. 20 UA 105046 C2 5 10 Приклад 4. Пестицидна активність AXMI-205 Гібридний білок був очищений від лізатів клітин клонів E. coli, як рекомендовано постачальником (New England Biolabs), та розщеплений за допомогою фактора Xa або трипсину. Розщеплення очищеного гібридного білка підтверджене аналізом SDS-PAGE. Очищений білок із pAX6911, який містить AXMI-205 та або pAX6911, розщеплений за допомогою фактора Xa чи трипсину, або нерозщеплений білок, перевірялися під час аналізу комах з належними контролями у буферному розчині, що складався з 20 ммоль/л Tris, 1 моль/л DTT, 50 моль/л NaCl. Розчинні екстракти pAX7011, що експресують AXMI-205, були також перевірені таким методом. Через два дні ті зразки, що вміщували AXMI-205, продемонстрували сильний ефект стимуляції низькорослості і призводили до підвищеної смертності західного кукурудзяного жука. Таблиця 1 дає опис способу присвоєння балів, що використаний у цьому документі. В Таблиці 2 стисло описана активність, що спостерігалася для зразків AXMI-205. Таблиця 1. Опис системи присвоєння балів Бал Опис 0 не спостерігалося ніякого ефекту 1 слабка неоднорідна низькорослість 2 помірна неоднорідна низькорослість від помірної до сильної однорідної 3 низькорослості смертність (