Спосіб вибіркової боротьби з бур’янистими рослинами

Реферат: Винахід належить до способу вибіркової боротьби з бур'янистими рослинами в місці виростання культурних рослин і бур'янів, який полягає у тому, що обробляють місце виростання пестицидною композицією в кількості, достатній для боротьби з бур'янистими рослинами, яка містить гербіцид, інгібуючий гомогентізатсоланезілтрансферазу (HST) і/або гербіцид, інгібуючий гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (HPPD), при цьому культурні рослини містять щонайменше один рекомбінантний полінуклеотид, який включає область, кодуючу HST. UA 107184 C2 (12) UA 107184 C2 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до способів вибіркової боротьби з бур'янистими рослинами в місці їх виростання. Винахід належить також до методу рекомбінантної ДНК і зокрема до одержання трансгенних рослин, які відрізняються вираженою стійкістю або вираженою толерантністю до гербіцидів у порівнянні з аналогічними нетрансгенними рослинами. Рослини мають виражену «толерантність» до гербіциду, якщо при його впливі на них одержують криву дозової залежності, зміщену праворуч у порівнянні з кривою, одержаною для підданих такому ж впливу аналогічних нетолерантних рослин. При побудові таких кривих дозової залежності «дозу» відкладають по осі абсцис, а «процент загибелі», «гербицідну дію» і т.д. відкладають по осі ординат. Як правило, толерантні рослини слід піддавати впливу щонайменше в два рази більшої кількості гербициду, ніж аналогічні нетолерантні рослини, для одержання конкретної гербіцидної дії. Рослини, які мають виражену «стійкість» до гербіциду, характеризуються наявністю невеликих, якщо вони взагалі наявні, некротичних, літичних, хлорозних або інших пошкоджень при впливі гербицидк в кінцінтраціях і нормах витрати, які, як правило, застосовують в сільському господарстві для знищення бур'янистих рослин в польових умовах. Більш конкретно даний винахід належить до одержання рослин, стійких до гербіцидів, які інгібують гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (HPPD), і/або гербицидів, які інгібують наступну стадію, пов'язану з гомогентізатсоланезілтрансферазою (HST), на шляху біосинтезу пластохінону. Гербіциди, дія яких полягає в інгібуванні HPPD, добре відомі в даній галузі. Інгібування HPPD блокує біосинтез пластохінону (PQ) з тирозину. PQ являє собою основний кофактор біосинтезу каротиноїдних ферментів, які мають вирішальне значення для фотопротекції фотосинтезуючих центрів. Інгибуючі HPPD гербіциди являють собою такі, що мають рухливість у флоеме субстанції, що викликає етіолірування, які приводять до того, що під впливом світла утворюються нові меристеми і листи білого кольору, у яких за відсутності каротиноїдів хлорифіл зазнає фоторозщеплення і сам стає агентом, що бере участь у фоторозщепленні за допомогою утворення під впливом світла синглетної форми кисню. Методи одержання трансгенних рослин, які відрізняються вираженою стійкістю або вираженою толерантністю до інгібуючих HPPD гербіцидів, описані, наприклад, в WO 02/46387. Фермент, каталізуючий наступну після HPPD-стадії стадію в біосинтезі пластохінону, являє собою HST. Фермент HST являє собою пренілтрансферазу, яка має здатність як декарбоксілірувати гомогентізат, так і переносити на нього соланезільну групу із соланезілдіфосфатату і в результаті приводити до утворення 2-метил-6-соланезіл-1,4бензохінолу (MSBQ), проміжного продукту на шляху біосинтезу пластохінону. HST належить до групи зв'язаних з мембраною ферментів, і гени, які їх кодують, включають послідовності, що забезпечують направлений перенос у пластиди. У теперішній час описані методи оцінки HST. Опубліковані дані про зверхекспрессію HST в трансгенних рослинах, і було встановлено, що ці рослини мають трохи підвищені кінцінтрації α-токоферолу. Однак до теперішнього часу немає даних про те, що HST є місцем-мішенню для певних класів гербіцидів, дія яких повністю або частково полягає в інгібуванні HST. Крім того, на даний час, встановлено поміж іншим, що сверхекспресія HST у трансгенній рослині надає йому толерантність до гербицидів, інгібуючим HST і/або інгібуючим HPPD. Таким чином, у даному винаході запропонований спосіб вибіркової боротьби з бур'янистими рослинами у місці виростання культурних рослин і бур'янів, який полягає у тому, що обробляють місце виростання пестицидною композицією в кількості, достатній для боротьби з бур'янистими рослинами, яка містить гербіцид, інгібуючий гомогентізатсоланезілтрансферазу (HST), і/або гербіцид, інгібуючий гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (HPPD), при цьому культурні рослини містять щонайменше один гетерологічний полінуклеотид, який містить область, кодуючу HST. У бажаному варіанті способу культурні рослини містять також додатковий гетерологічний полінуклеотид, який містить область, кодуючу гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (HPPD). Винахід належить також до способу вибіркової боротьби з бур'янистими рослинами в місці виростання культурних рослин і бур'янів, що полягає в тому, що обробляють місце виростання пестицидною композицією в кількості, достатній для боротьби з бур'янистими рослинами, яка містить гербіцид, інгібуючий гомогентізатсоланезілтрансферазу (HST), при цьому культурні рослини містять щонайменше один гетерологічний полінуклеотид, який містить область, кодуючу фермент HPPD. У бажаному варіанті здійснення винаходу пестицидна композиція, яку застосовують у вищезазначених способах, містить як інгібуючий HST гербіцид, так і інгібуючий HPPD гербіцид. Для цілей даного винаходу передбачається, що інгібуючий HST гербіцид являє собою гербіцид, який інгібує сам або в якості попередника утворює молекулу, яка інгібує HST Arabidopsis, що характеризується значенням IC50 менше 150 част./млн, бажано менше 60 1 UA 107184 C2 5 част/млн при використанні метода аналізу «всього екстракту», який викладений в даному описі. Як повинно бути очевидно, інгібуючі HST гербіциди можуть діяти також і в якості інгібіторів HPPD (для ідентифікації можна застосовувати, наприклад, аналізи фермента HPPD і/або різні відповіді зверхекспресуючих HPPD або HST трансгенних ліній рослин), і тому як буде описано нижче, має місце самосинергетична дія інгібування ними HST. Бажано інгібуючий HST гербіцид вибирають з групи, що включає сполуку формули (IIa) OH 3 2 R R (IIa) 1 R 10 N 4 R в якій R1, R2, R3 і R4 незалежно один від одного означають водень або галоген; при умові, що 1 2 3 4 щонайменше три з R , R , R і R означають галоген; або її солі; сполука формули (IIb) 5 R 1 R 4 R N (IIb) 2 R N O N 3 15 20 25 30 35 40 45 50 R в якій R1 і R2 незалежно один від одного означають водень, C1-C4алкіл, C1-C4галоалкіл, галоген, ціаногрупу, гідроксигрупу, C1-C4алкоксигрупу, C1-C4алкілтіогрупу, арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними; R3 означає водень, C1-C10алкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл, C3-C10циклоалкіл, C3C10циклоалкіл-C1-C6алкіл-, C1-C10алкокси-C1-C6алкіл-, C1-C10ціаналкіл-, C1-C10алкоксикарбонілC1-C6алкіл-, N-C1-C3алкіл-амінокарбоніл-C1-C6алкіл-, N,N-ди-(C1-C3алкіл)-амінокарбоніл-C1C6алкіл-, арил-C1-C6алкіл- або арил-C1-C6алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R7, які можуть бути однаковими або різними, або гетероцикліл-C1-C6алкіл- або гетероцикліл-C1-C6алкіл-, де гетероциклільний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R7, які можуть бути однаковими або різними; R4 означає арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R8, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарил або гетероарил заміщений 1-4 радикалами R8, які можуть бути однаковими або різними; R5 означає гідроксигрупу, R9-оксигрупу, R10-карбонілоксигрупу, три-R11-силілоксигрупу або 12 R -сульфонілоксигрупу, 6 7 8 R , R і R кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл, гідроксигрупу, C1-C10алкоксигрупу, C1C4галоалкоксигрупу, C1-C10алкокси-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл, C3-C7циклоалкоксигрупу, C3C7циклоалкіл-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл-C1-C4алкоксигрупу, C1-C6алкілкарбоніл-, форміл, C1C4алкоксикарбоніл-, C1-C4алкілкарбонілоксигрупу, C1-C10алкілтіогрупу, C1-C4галоалкілтіогрупу, C1-C10алкілсульфініл-, C1-C4галоалкілсульфініл-, C1-C10алкілсульфоніл-, C1C4галоалкілсульфоніл-, аміногрупу, C1-C10алкіламіногрупу, ди-C1-C10алкіламіногрупу, C1C10алкілкарбоніламіногрупу, арил або арил, заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути 13 однаковими або різними, гетероарил або гетероарил, заміщений 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, арил-C1-C4алкіл- або арил-C1-C4алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил-C1C4алкіл- або гетероарил-C1-C4алкіл-, де гетероарильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арилоксигрупу або арилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарилоксигрупу або гетероарилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арилтіогрупу або арилтіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарилтіогрупу або гетероарилтіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними; 9 R означає C1-C10алкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл або арил-C1-C4алкіл- або арил-C1C4алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-5 замісниками, незалежно один від одного вибраними з галогену, ціаногрупи, нітрогрупи, C1-C6алкілу, C1-C6галоалкілу або C1C6алкоксигрупи; 2 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 R10 означає C1-C10алкіл, C3-C10циклоалкіл, C3-C10циклоалкіл-C1-C10алкіл-, C1-C10галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл, C1-C4алкокси-C1-C10алкіл-, C1-C4алкілтіо-C1-C4алкіл-, C1C10алкоксигрупу, C2-C10алкенілоксигрупу, C2-C10алкінілоксигрупу, C1-C10алкілтіогрупу, N-C1C4алкіламіногрупу-, N,N-ди-(C1-C4алкіл)-аміногрупу-, арил або арил, заміщений 1-3 радикалами R14, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил або гетероарил, заміщений 1-3 14 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, арил-C1-C4алкіл- або арил-C114 C4алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, гетероарил-C1-C4алкіл- або гетероарил-C1-C4алкіл-, де гетероарильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R14, які можуть бути однаковими або різними, арилоксигрупу або арилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R14, які можуть бути однаковими або різними, 14 гетероарилоксигрупу або гетероарилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, арилотіогрупу або арилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R14, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарилотіогрупу або гетероарилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R14, які можуть бути однаковими або різними; R11 кожен незалежно один від одного означає C1-C10алкіл або феніл або феніл, заміщений 1-5 замісниками, незалежно один від одного вибраними з галогену, ціаногрупи, нітрогрупи, C1C6алкілу, C1-C6галоалкілу або C1-C6алкоксигрупи; 12 R означає C1-C10алкіл або феніл або феніл, заміщений 1-5 замісниками, незалежно один від одного вибраними з галогену, ціаногрупи, нітрогрупи, C1-C6алкілу, C1-C6галоалкілу або C1C6алкоксигрупи; 13 R кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1-C6алкіл, C1C6галоалкіл або C1-C6алкоксигрупу; і R14 кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1-C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C1-C10алкоксигрупу, C1-C4алкоксикарбоніл-, C1-C4галоалкоксигрупу, C1C10алкілтіогрупу, C1-C4галоалкілтіогрупу, C1-C10алкілсульфініл-, C1-C4галоалкілсульфініл-, C1C10алкілсульфоніл-, C1-C4галоалкілсульфоніл-, арил або арил, заміщений 1-5 замісниками, незалежно один від одного вибраними з галогену, ціаногрупи, нітрогрупи, C1-C6алкілу, C1C6галоалкілу або C1-C6алкоксигрупи, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-4 замісниками, незалежно один від одного вибраними з галогену, ціаногрупи, нітрогрупи, C1C6алкілу, C1-C6галоалкілу або C1-C6алкоксигрупи; або її солі або N-оксиди; сполука формули (IIc) 5 R 1 R 4 R N (IIc) 2 R N N O 3 35 40 45 50 R в якій R1 і R2 незалежно один від одного означають водень, C1-C4алкіл, C1-C4галоалкіл, галоген, ціаногрупу, гідроксигрупу, C1-C4алкоксигрупу, C1-C4алкілтіогрупу, арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними; R3 означає C1-C4галоалкіл, C2-C4галоалкеніл або C2-C4галоалкініл; 4 8 R означає арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R , які можуть бути однаковими або 8 різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-4 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними; R5 означає гідроксигрупу або групу, яку можна метаболізувати до гідроксигрупи; 6 8 R і R кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл, гідроксигрупу, C1-C10алкоксигрупу, C1C4галоалкокси, C1-C10алкокси-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл, C3-C7циклоалкоксигрупу, C3C7циклоалкіл-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл-C1-C4алкоксигрупу, C1-C6алкілкарбоніл-, форміл, C1C4алкоксикарбоніл-, C1-C4алкілкарбонілоксигрупу-, C1-C10алкілтіогрупу, C1-C4галоалкілтиогрупу, C1-C10алкілсульфініл-, C1-C4галоалкілсульфініл-, C1-C10алкілсульфоніл-, C1C4галоалкілсульфоніл-, аміногрупу, C1-C10алкіламіногрупу-, ди-C1-C10алкіламіногрупу, C113 C10алкілкарбоніламіногрупу, арил або арил, заміщений 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, гетероарил або гетероарил, заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арил-C1-C4алкіл- або арил-C1-C4алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил-C1C4алкіл- або гетероарил-C1-C4алкіл-, де гетероарильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами 3 UA 107184 C2 5 R13, які можуть бути однаковими або різними, арилоксигрупу або арилоксигрупу, заміщену1-3 13 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, гетероарилоксигрупу або 13 гетероарилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, арилотіогрупу або арилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарилотіогрупу або гетероарилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними; і 13 R кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1-C6алкіл, C1C6галоалкіл або C1-C6алкоксигрупу; або її сіль або N-оксид; сполука формули (IId) 5 R 1 R 15 20 25 30 35 40 45 R N 2 10 4 N R S O N O 3 R (IId) в якій R1 і R2 незалежно один від одного означають водень, C1-C4алкіл, C1-C4галоалкіл, галоген, ціаногрупу, гідроксигрупу, C1-C4алкоксигрупу, C1-C4алкілтіогрупу, арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними; R3 означає водень, C1-C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C4галоалкеніл, C2C10алкініл, C2-C4галоалкініл, C3-C10циклоалкіл, C3-C10циклоалкіл-C1-C6алкіл-, C1-C10алкокси-C1C6алкіл-, C1-C10ціаналкіл-, C1-C10алкоксикарбоніл-C1-C6алкіл-, N-C1-C3алкіл-амінокарбоніл-C1C6алкіл-, N,N-ди-(C1-C3алкіл)-амінокарбоніл-C1-C6алкіл-, арил-C1-C6алкіл- або арил-C1-C6алкіл-, где арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R7, які можуть бути однаковими або різними, або гетероцикліл-C1-C6алкіл- або гетероцикліл-C1-C6алкіл-, де гетероциклільний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R7, які можуть бути однаковими або різними; R4 означає арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R8, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-4 радикалами R8, які можуть бути однаковими або різними; R5 означає гідроксигрупу або групу, яку можна метаболізувати до гідроксигрупи; R6, R7 і R8 кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл, гідроксигрупу, C1-C10алкоксигрупу, C1C4галоалкоксигрупу, C1-C10алкокси-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл, C3-C7циклоалкоксигрупу, C3C7циклоалкіл-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл-C1-C4алкоксигрупу, C1-C6алкілкарбоніл-, форміл, C1C4алкоксикарбоніл-, C1-C4алкілкарбонілоксигрупу, C1-C10алкілтіогрупу, C1-C4галоалкілтіогрупу, C1-C10алкілсульфініл-, C1-C4галоалкілсульфініл-, C1-C10алкілсульфоніл-, C1C4галоалкілсульфоніл-, аміногрупу, C1-C10алкіламіногрупу, ди-C1-C10алкіламіногрупу, C1C10алкілкарбоніламіногрупу, арил або арил, заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил або гетероарил, заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арил-C1-C4алкіл- або арил-C1-C4алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил-C1C4алкіл- або гетероарил-C1-C4алкіл-, де гетероарильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами 13 R , які можуть бути однаковими або різними, арилоксигрупу або арилоксигрупу, заміщену 1-3 13 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, гетероарилоксигрупу або гетероарилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арилотіогрупу або арилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або 13 різними, або гетероарилотіогрупу - або гетероарилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними; і R13 кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу C1-C6алкіл, C1C6галоалкіл або C1-C6алкоксигрупу; або її сіль або N-оксид; IIe) сполука формули (IIe) 5 R A A 2 A 4 1 R (IIe) 3 A 4 N O 3 R 4 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 в якій 1 2 3 4 1 A , A , A і A незалежно один від одного означають C-R або N при умові, що щонайменше 1 2 3 4 1 4 2 3 один з A , A , A і A означає N і при умові, що, якщо A і A обоє означають N, то A і A обоє не 1 означають C-R ; R1 кожен незалежно один від одного означає водень, C1-C4алкіл, C1-C4галоалкіл, галоген, ціаногрупу, гідроксигрупу, C1-C4алкоксигрупу, C1-C4алкілтіогрупу, арил або арил, заміщений 1-5 6 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-5 радикалами R6, які можуть бути однаковими або різними; R3 означає водень, C1-C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C4галоалкеніл, C2-C10алкініл, C2-C4галоалкініл, C3-C10циклоалкіл, C3-C10циклоалкіл-C1-C6алкіл-, C1-C10алкоксиC1-C6алкіл-, C1-C10ціаналкіл-, C1-C10алкоксикарбоніл-C1-C6алкіл-, N-C1-C3алкіламінокарбоніл-C1C6алкіл-, N,N-ди-(C1-C3алкіл)амінокарбоніл-C1-C6алкіл-, арил-C1-C6алкіл- або арил-C1-C6алкіл-, 7 де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними, або гетероцикліл-C1-C6алкіл- або гетероцикліл-C1-C6алкіл-, де гетероциклільний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R7, які можуть бути однаковими або різними; R4 означає арил або арил, заміщений 1-5 радикалами R8, які можуть бути однаковими або 8 різними, або гетероарил або гетероарил, заміщений 1-4 радикалами R , які можуть бути однаковими або різними; R5 означає гідроксигрупу або групу, яку можно метаболізувати до гідроксигрупи; 6 7 8 R , R і R кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1C10алкіл, C1-C4галоалкіл, C2-C10алкеніл, C2-C10алкініл, гідроксигрупу, C1-C10алкоксигрупу, C1C4галоалкоксигрупу, C1-C10алкокси-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл, C3-C7циклоалкоксигрупу, C3C7циклоалкіл-C1-C4алкіл-, C3-C7циклоалкіл-C1-C4алкоксигрупу, C1-C6алкілкарбоніл-, форміл, C1C4алкоксикарбоніл-, C1-C4алкілкарбонілоксигрупу, C1-C10алкілтіогрупу, C1-C4галоалкілтіогрупу, C1-C10алкілсульфініл-, C1-C4галоалкілсульфініл-, C1-C10алкілсульфоніл-, C1C4галоалкілсульфоніл-, аміногрупу, C1-C10алкіламіногрупу, ди-C1-C10алкіламіногрупу, C1C10алкілкарбоніламіногрупу, арил або арил, заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил або гетероарил, заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними , арил-C1-C4алкіл- або арил-C1-C4алкіл-, де арильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарил-C1C4алкіл- або гетероарил-C1-C4алкіл-, де гетероарильний фрагмент заміщений 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арилоксигрупу або арилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, гетероарилоксигрупу або гетероарилоксигрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, арилотіогрупу або арилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними, або гетероарилотіогрупу або гетероарилотіогрупу, заміщену 1-3 радикалами R13, які можуть бути однаковими або різними; і R13 кожен незалежно один від одного означає галоген, ціаногрупу, нітрогрупу, C1-C6алкіл, C1C6галоалкіл або C1-C6алкоксигрупу; або її сіль або N-оксид; і сполука формули (IIf) 5 O 6 4 2 (Z )n 1 R 3 N 2 N O 2 R 45 50 (IIf) 1 Z G в якій 1 R означає C1-C6алкіл або C1-C6алкілокси-C1-C6алкіл; 2 R означає водень або C1-C6алкіл; G означає водень, -(C=L)R3, -(SO2)R4 або -(P=L)R5R6, де L означає кисень або сірку; R3 означає C1-C6алкіл, C3-C8циклоалкіл, C2-C6алкеніл, C2-C6алкініл, C6-C10арил, C6-C10арилC1-C6алкіл-, C1-C6алкілоксигрупу, C3-C8циклоалкілоксигрупу, C2-C6алкенілоксигрупу, C2C6алкінілоксигрупу, C6-C10арилоксигрупу, C6-C10арил-C1-C6алкілоксигрупу, аміногрупу, C1C6алкіламіногрупу, C2-C6алкеніламіногрупу, C6-C10ариламіногрупу, ди-(C1-C6алкіл)аміногрупу, ди-(C2-C6алкеніл)аміногрупу, (C1-C6алкіл)(C6-C10арил)аміногрупу або 3-8-членне азотовміщуюче гетероциклічне кільце, R4 означає C1-C6алкіл, C6-C10арил, C1-C6алкіламіногрупу або ди-(C1-C6алкіл)аміногрупу; і 5 UA 107184 C2 5 10 15 20 R5 і R6 можуть бути однаковими або різними і незалежно один від одного означають C1C6алкіл, C3-С8циклоалкіл, C2-C6алкеніл, C6-C10арил, C1-C6алкілоксигрупу, C3C8циклоалкілоксигрупу, C6-C10арилоксигрупу, C6-C10арил-C1-C6алкілоксигрупу, C1C6алкілтіогрупу, C1-C6алкіламіногрупу або ди(C1-C6алкіл)аміногрупу, де будь-яка група R3, R4, R5 і R6 може бути заміщена галогеном, C3-C8циклоалкілом, C6C10арилом, C6-C10арил-C1-C6алкілом, C3-C8циклоалкілоксигрупою, C6-C10арилоксигрупою, C6C10арил-C1-C6алкілоксигрупою, C6-C10ариламіногрупою, (C1-C6алкіл)(C6-C10арил)аміногрупою, а 3-8-членне азотовміщуюче гетероциклічне кільце може бути заміщене щонайменше одним C1C6алкілом; Z1 означає C1-C6алкіл; 2 Z означає C1-C6алкіл; n означає 0, 1, 2, 3 або 4; і 2 Z кожен може бути однаковим або різним, коли n означає ціле число, що дорівнює 2 або більше, і сумарна кількість атомів вуглецю в групі, представленій Z 1, і сумарна кількість атомів вуглецю в групі, представленій Z2, дорівнює 2 або більше. Інгібітори HST формули (IIa) є відомими, наприклад, можуть представляти собою галоксидин і піріклор. Інгібітори HST формули (IIb) описані, наприклад, у WO 2008/009908. Інгібітори HST формули (IIc) описані, наприклад, у WO 2008/071918.Інгібітори HST формули (IId) описані, наприклад, у WO 2009/063180. Інгібітори HST формули (IIe) описані, наприклад, у WO 2009/090401 і WO2009/090402.Інгібітори HST формули (IIf) описані, наприклад, у WO 2007/119434. Бажаними є сполуки формули (IIa) OH 3 2 R R (IIa) 1 R 25 30 35 4 N R в якій R1, R2, R3 і R4 незалежно один від одного означають водень, бром, хлор або фтор; при умові, що щонайменше три з R1, R2, R3 і R4 означають або бром, або хром, або фтор, найбільш бажаним є сполука формули (IIa), в якій R1 і R4 означають фтор і R2 і R3 означають хлор (галоксидин), або в якій R1, R2 і R3 означають хлор і R4 означає водень (піріклор). Поняття «інгібуючий HPPD гербіцид» належить до гербіциду, який безпосередньо або в якості попередника інгібує HPPD і який у своїй активній формі інгібує HPPD Arabidopsis, що характеризується значенням Ki менше 5нМ, бажано менше 1нМ, за даними аналізу швидкості реакції асоціації (on) і дисоціації (off), метод якого описаний у WO 02/46387. У контексті даного винаходу поняття гідроксифенілпіруват- (або пірувінова кислота)-діоксигеназа (HPPD), 4гідроксифенілпіруват(або пірувінова кислота)-діоксигеназа (4-HPPD) і парагідроксифенілпіруват- (або пірувінова кислота)-діоксигеназа (пара-HPPD) є синонімами. Переважно інгібуючий HPPD гербіцид вибирають з групи, яка включає сполуку формули (Ia) 3 4 R O R 1 R X (Ia) 6 O R 2 R 40 45 в якій 1 2 R і R означають водень або разом утворюють етиленовий місток; 3 R означають гідроксигрупу або фенілтіогрупу; R4 означає галоген, нітрогрупу, C1-C4алкіл, C1-C4алкокси-C1-C4алкіл, C1-C4алкокси-C1C4алкокси-C1-C4алкіл-; X означає метин, азот або C-R5, де R5 означає водень, C1-C4галоалкокси-C1-C4алкіл- або групу 6 UA 107184 C2 O O ; та 6 R означає C1-C4алкілсульфоніл- або C1-C4галоалкіл; сполуку формули (Ib) K 1 O O R O O (Ib) S O 2 5 O O R в якій R1 і R2 незалежно один від одного означають C1-C4алкіл; і його форми у вигляді вільної кислоти; сполуку формули (Ic) 1 4 R O R 5 R 2 R (Ic) N N 6 R 3 R 10 15 20 в якій R1 означає гідроксигрупу, фенілкарбоніл-C1-C4алкоксигрупу або фенілкарбоніл-C1C4алкоксигрупу, в якій фенільний фрагмент заміщений в пара-положенні галогеном або C1C4алкілом, або фенілсульфонілоксигрупу або фенілсульфонілоксигрупу, в якій фенільний фрагмент заміщений в пара-положенні галогеном або C1-C4алкілом; R2 означає C1-C4алкіл; R3 означає водень або C1-C4алкіл; 4 6 R і R незалежно один від одного означають галоген, C1-C4алкіл, C1-C4галоалкіл або C1C4алкілсульфоніл-; і R5 означає водень, C1-C4алкіл, C1-C4алкокси-C1-C4алкоксигрупу або групу N O ; сполуку формули (Id) 1 R O 4 5 R R 2 R (Id) N N S 3 R 25 6 R O O в якій R1 означає гідроксигрупу; 2 R означає C1-C4алкіл; 3 R означає водень; і R4, R5 і R6 незалежно один від одного означають C1-C4алкіл; сполуку формули (Ie) 1 2 R O R 3 R (Ie) O N 30 4 R в якій 7 UA 107184 C2 5 R1 означає циклопропіл; 2 4 R і R незалежно один від одного означають галоген, C1-C4галоалкіл або C1C4алкілсульфоніл-; і R3 означає водень; і сполуку формули (If) 2 O O R 3 R 1 R (If) CN 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4 R в якій R1 означає циклопропіл; R2 і R4 незалежно один від одного означають галоген, C1-C4галоалкіл або C1C4алкілсульфоніл-; і 3 R означає водень. Приклади інгібіторів HPPD описані також у WO 2009/016841. У бажаному варіанті здійснення винаходу інгібітор HPPD вибирають з групи, яка включає бензобіциклон, мезотріон, сулькотріон, тефурилтріон, темботріон, 4-гідрокси-3-[[2-(2-метоксиетокси)метил]-6-(трифторметил)-3піридиніл]карбоніл]біцикло[3.2.1]окт-3-ен-2-он (біциклопірон), кетоспірадокс або його форму у вигляді вільної кислоти, бензофенап, пірасульфотол, піразолінат, піразоксифен, топрамезон, [2хлор-3-(2-метоксиетокси)-4-(метилсульфоніл)феніл](1-етил-5-гідрокси-1H-піразол-4-ил)метанон, (2,3-дигідро-3,3,4-триметил-1,1-діоксидобензо[b]тіен-5-ил)(5-гідрокси-1-метил-1H-піразол-4ил)метанон, ізоксахлортол, ізоксафлутол, α-(циклопропілкарбоніл)-2-(метилсульфоніл)-β-оксо4-хлорбензолпропаненітрил і α-(циклопропілкарбоніл)-2-(метилсульфоніл)-β-оксо-4(трифторметил)бензолпропаненітрил. Ці інгібітори HPPD є відомими і мають наступні реєстраційні номери у Chemical Abstracts: бензобіциклон (CAS RN 156963-66-5), мезотріон (CAS RN 104206-82-8), сулькотрион (CAS RN 99105-77-8), тефурилтрион (CAS RN 473278-76-1), темботрион (CAS RN 335104-84-2), 4гідрокси-3-[[2-(2-метоксиетокси)метил]-6-(трифторметил)-3-піридиніл]карбоніл]біцикло[3.2.1]окт3-ен-2-он (CAS RN 352010-68-5), кетоспірадокс (CAS RN 192708-91-1) або його форма у вигляді вільної кислоти (CAS RN 187270-87-7), бензофенап (CAS RN 82692-44-2), пірасульфотол (CAS RN 365400-11-9), піразолінат (CAS RN 58011-68-0), піразоксифен (CAS RN 71561-11-0), топрамезон (CAS RN 210631-68-8), [2-хлор-3-(2-метоксиетокси)-4-(метилсульфоніл)феніл](1етил-5-гідрокси-1H-піразол-4-ил)метанон (CAS RN 128133-27-7), (2,3-дигідро-3,3,4-триметил1,1-діоксидобензо[b]тіен-5-ил)(5-гідрокси-1-метил-1H-піразол-4-ил)метанон (CAS RN 345363-975), ізоксахлортол (CAS RN 141112-06-3), ізоксафлутол (CAS RN 141112-29-0), α(циклопропілкарбоніл)-2-(метилсульфоніл)-β-оксо-4-хлорбензолпропаненітрил (CAS RN 14370166-0) і α-(циклопропілкарбоніл)-2-(метилсульфоніл)-β-оксо-4(трифторметил)бензолпропаненітрил (CAS RN 143701-75-1). Поняття, застосовувані для формули I і формули II, мають наступні значення. Алкільний радикал (або індивідуально або в якості фрагмента більш великої групи, такої як алкоксигрупа, алкоксикарбоніл, алкілкарбоніл, алкіламінокарбоніл, діалкіламінокарбоніл) означає прямий або розгалужений ланцюг і являє собою, наприклад, метил, етил, н-пропіл, нбутил, н-пентил, н-гексил, ізопропил, н-бутил, втор-бутил, ізобутил, трет-бутил або нео-пентил. Алкільні групи бажано означають C1-C6алкільні групи, більш бажано C1-C4алкільні групи, і найбільше бажано метильні групи. Алкенільні і алкінільні радикали (або індивідуально або в якості фрагмента більш великої групи, такої як алкенілоксигрупа або алкінілоксигрупа) можуть мати форму прямих або розгалужених ланцюгів і алкенільні радикали відповідно можуть перебувати або в (E)- або в (Z)-конфігурації. Прикладами євініл, аліл і пропаргіл. Алкенільні і алкінільні групи бажано являють собою C2-C6алкеніл або алкінильні групи, більш бажано C2-C4- і найбільш бажано C2C3алкенільні або -алкінільні групи. Алкоксиалкільні групи переважно мають ланцюг, що складається з 2- 8 атомів вуглецю або кисню. Прикладом алкоксиалкільної групи є 2-метоксиетил. Галоген, як правило, означає фтор, хлор, бром або йод, бажано фтор або хлор. Це ж визначення стосується і галогена в комбінації з іншими значеннями, такими як галоалкіл. Галоалкільні групи бажано мають ланцюг, що включає від 1 до 4 атомів вуглецю. Галоалкіл означає, наприклад, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлорметил, дихлорметил, трихлорметил, 2,2,2-трифторетил, 2-фторетил, 2-хлоретил, пентафторетил, 1,1-дифтор-2,2,2 8 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трихлоретил, 2,2,3,3-тетрафторетил або 2,2,2-трихлоретил; бажано трихлорметил, дифторхлорметил, дифторметил, трифторметил або дихлорфторметил. Галоалкоксиалкільні групи бажано мають ланцюг, що включає від 2 до 8 атомів вуглецю або кисню. Прикладом алкоксиалкільної групи є 2,2,2-трифторетоксиметил-. Алкоксиалкоксигрупи бажано мають ланцюг, що включає від 2 до 8 атомів вуглецю або кисню. Прикладами алкоксиалкоксигрупи є: метоксиметоксигрупа, 2-метоксиетоксигрупа, метоксипропоксигрупа, етоксиметоксигрупа, етоксиетоксигрупа, пропоксиметоксигрупа і бутоксибутоксигрупа. Алкоксиалкільні групи мають ланцюг, що включає бажано від 1 до 6 атомів вуглецю. Алкоксиалкіл означає, наприклад, метоксиметил, метоксиетил, етоксиметил, етоксиетил, н-пропоксиметил, н-пропоксиетил, ізопропоксиметил або ізоoпропоксиетил. Алкоксиалкоксиалкільні групи бажано мають ланцюг, що включає від 3 до 8 атомів вуглецю або кисню. Прикладами алкоксиалкоксиалкіла є: метоксиметоксиметил, метоксиетоксиметил, етоксиметоксиметил і метоксиетоксиетил. Ціаналкільні групи представляють собою алкільні групи, заміщені одною або декількома ціаногрупами, наприклад, ціанметил або 1,3-диціанпропіл. Циклоалкільні групи можуть перебувати в моно- або біциклічній формі і необов'язково можуть бути заміщені однією або декількома метильними групами. Циклоалкільні групи бажано містять 3-8 атомів вуглецю, більш бажано 3-6 атомів вуглецю. Прикладами моноциклічних циклоалкільних груп є циклопропіл, 1-метилциклопропіл, 2-метилциклопропіл, циклобутил, циклопентил і циклогексил. У контексті даного опису поняття «арил» стосується кільцевої системи, яка може бути моно-, бі- або трициклічною. Прикладами таких кільцевих систем є феніл, нафталініл, антраценіл, інденіл або фенантреніл. Бажаною арильною групою є феніл. Поняття «гетероарил» належить до ароматичної кільцевої системи, що містить щонайменше один гетероатом, і складається або з одного кільця, або із двох або більшої кількості злитих кілець. Бажано моноциклічні системи містять аж до трьох, а біциклічні системи аж до чотирьох гетероатомів, які бажано вибирають із азоту, кисню і сірки. Прикладами таких є піридил, піридазиніл, піримідиніл, піразиніл, триазиніл, фураніл, тіофеніл, оксазоліл, ізоксазоліл, оксадіазоліл, тіазоліл, ізотіазоліл, тіадіазоліл, піроліл, піразоліл, імідазоліл, тріазоліл і тетразоліл. Бажаною гетероарильною групою є піридин. Прикладами біциклічних груп є бензотіофеніл, бензимідазоліл, бензотіадіазоліл, хінолініл, цінолініл, кіноксалініл і піразолo[1,5a]піримідиніл. Мається на увазі, що поняття «гетероцикліл» включає гетероарил і також його ненасичені або частково ненасичені аналоги, такі як 4,5,6,7-тетрагідробензотіофеніл, хромен-4-оніл, 9Hфлуореніл, 3,4-дигідро-2H-бензо-1,4-діоксипініл, 2,3-дигідробензофураніл, піперидиніл, 1,3діоксоланіл, 1,3-діоксаніл, 4,5-дигідроізоксазоліл, тетрагідрофураніл і морфолініл. Повинно бути очевидно, що у вищевказаних способах гербіцидну композицію можна вносити в місце виростання до появи сходів культурної рослини і/або після появи сходів культурної рослини. У бажаному варіанті здійснення винаходу гербіцидну композицію застосовують після появи сходів культурної рослини – так звана «спрямована поверхнева» обробка. Можна застосовувати одну або при необхідності кілька обробок для досягнення необхідного знищення бур'янистих рослин. Поняття «бур'янисті рослини, бур'яни» стосується будь-якої небажаної рослинності і включає, наприклад, занесені або «сторонні культури» або культурні « рослини-самосіви» на полі культурних рослин сої. Як правило, гетерологічний полінуклеотид може містити (I) функціонуючий у рослині промотор, функціонально пов'язаний з (II) областю, кодуючою фермент HST, і (III) термінатором транскрипції. Як правило, гетерологічний полінуклеотид може містити також область, яка кодує поліпептид, що має здатність забезпечувати направлений перенос фермента HST в субклітинні органели, такі як хлоропласт або мітохондрії, бажано в хлоропласт. Гетерологічний полінуклеотид може містити також, наприклад, енхансери транскрипції. Крім того, область, кодуюча фермент HST, може являти собою область з «оптимізованими кодонами» в залежності від рослини-хазяїна, у якому потрібна експресія фермента HST. Фахівцю в даній галузі добре відомі функціонуючі у рослині промотори, термінатори транскрипції, хлоропластні транзитні пептиди, енхансери і т.д., які можна застосовувати згідно даному винаходу. HST може являти собою фермент «дикого типу» або може являти собою фермент, модифікований з метою одержання бажаних кінетичних характеристик для створення толерантних до гербіцидів рослин. В бажаному варіанті здійснення винаходу HST відрізняється тим, що містить один або декілька з наступних поліпептидних мотивів: w-(r/k)-f-l-r-p-h-t-i-r-g-t; і/або 9 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 n-g-(y/f)-i-v-g-i-n-q-i-(y/f)-d; і/або i-a-i-t-k-d-l-p; і/або y-(r/q)-(f/w)-(i/v)-w-n-l-f-y. Придатні HST виводять з Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa або Chlamydomonas reinhardtii. У ще більш бажаному варіанті здійснення винаходу HST вибирають з групи HST, що мають послідовності, представлені у SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10. Слід відзначити, що амінокислотні послідовності, представленні у SEQ ID NO: 1-10, є прикладами амінокислотних послідовностей HST, які включають область, яка відповідає хлоропластному транзитному пептиду. SEQ ID NO: 11-20 відповідають послідовностям ДНК, кодуючим HST, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 1-10, а SEQ ID NO: 21-24 є прикладами послідовностей ДНК, які кодують вкорочені зрілі послідовності HST без області транзитного пептиду. Амінокислотні послідовності, представленні у SEQ ID NO: 25-28 є прикладами амінокислотних послідовностей HPPD, а SEQ ID NO: 29-32 є прикладами послідовностей ДНК, які їх кодують. HPPD, які можна застосовувати для забезпечення толерантності до інгібуючих HPPD гербіцидів, добре відомі фахівцю в даній галузі – наприклад, описані у WO 02/46387. В SEQ ID NО: 33 представлена послідовність ДНК енхансера трансляції TMV, а у послідовності SEQ ID NО: 34 представлена послідовність ДНК енхансера трансляції TMV, злита на 5’-кінці з послідовністю ДНК, яка кодує HST Arabidopsis. Також повинно бути очевидно, що культурна рослина, застосовувана у вказаному способі, може додатково включати гетерологічний полінуклеотид, який кодує додатковий фермент, зумовлюючий толерантність до гербіцидів. Прикладами додаткових ферментів, зумовлюючих толерантність до гербіцидів, є, наприклад, зумовлюючі толерантність до гербіцидів ферменти, вибрані з групи, що включає 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), гліфосатацетилтрансферазу (GAT), цитохром P450, фосфінотріцінацетилтрансферазу (PAT), ацетолактатсинтазу (ALS), протопорфіриногеноксидазу (PPGO), фітоендесатуразу (PD), ферменти, що розщеплюють дикамбу (див., наприклад, WO 02/068607), і ферменти, що розщеплюють гербіциди, які містять арилоксигрупу описані у WO 2007/053482 і WO 2005/107437. Пестицидна композиція, що застосовується у вищевказаних способах, може містити також один або кілька додаткових пестицидів, зокрема, гербіцидів, до яких культурна рослина має природню толерантність, або до яких вона має стійкість у результаті експресії одного або декількох додаткових трансгенів, згаданих у даному описі. У бажаному варіанті здійснення винаходу один або кілька додаткових гербіцидів вибирають із групи, що включає гліфосат (включаючи його прийнятні для застосування в сільському господарстві солі); глуфосинат (включаючи його прийнятні для застосування в сільському господарстві солі); хлорацетаніліди, такі як алахлор, ацетохлор, метолахлор, S-метолахлор; інгібітори фотосистеми II, наприклад, триазини, такі як аметрин, атразин, ціаназин і тербутилазин, триазінони, такі як гексазінон і метрибузин, сечовини, такі як хлоротолурон, діурон, ізопротурон, лінурон і тербутіурон; інгібітори ALS, наприклад, сульфонілсечовини, такі як амідосульфурон, хлорсульфурон, флупірсульфурон, галосульфурон, нікосульфурон, примісульфурон, просульфурон, римсульфурон, триасульфурон, триафлоксисульфурон і тритосульфурон; прості дифенілові ефіри, наприклад, ацифлурофен і фомесафен. Даний винахід належить також до рекомбінантного полінуклеотиду, який містить кодуючу фермент HST область, функціонально зв'язану з функціонуючим в рослині промотором, при цьому область, кодуюча фермент HST не містить полінуклеотидну послідовність, яка представлена у SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 або SEQ ID NO: 15. В бажаному варіанті здійснення винаходу фермент HST вибирають з групи, що включає SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10. Даний винахід належить також до рекомбінантного полінуклеотиду, який містить (I) область, кодуючу фермент HST, функціонально зв'язану з функціонуючим в рослині промотором, і (II) щонайменше один додатковий гетерологічний полінуклеотид, який містить область, кодуючу додатковий зумовлюючий толерантність до гербицидів фермент, функціонально зв'язаний з функціонуючим в рослині промотором. Додатковий зумовлюючий толерантність до гербіцидів фермент являє собою, наприклад, фермент, вибраний з групи, що включає гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (HPPD) 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), гліфосатацетилтрансферазу (GAT), цитохром P450, фосфінотріцінацетилтрансферазу (PAT), ацетолактатсинтазу (ALS), протопорфіриногеноксидазу (PPGO), фітоендесатуразу (PD) і ферменти, що розщеплюють дикамбу, які описані у WO 02/068607. 10 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Бажано рекомбінантний полінуклеотид містить (I) область, яка кодує HST, функціонально зв'язану з функціонуючим у рослині промотором, і (II) область, яка кодує HPPD, функціонально зв'язану з функціонуючим у рослині промотором. Рекомбінантний полінуклеотид може містити щонайменше дві, три або більшу кількість додаткових областей, кожна з яких кодує зумовлюючий толерантність до гербіцидів фермент, наприклад, вказаний вище. Таким чином, іншим бажаним варіантом здійснення винаходу є рекомбінантний полінуклеотид, що містить (I) область, яка кодує фермент HST, (II) область, яка кодує фермент HPPD, (III) область, яка кодує фермент, зумовлюючий толерантність до гліфосату. Даний винахід належить також до вектора, який містить рекомбінантний полінуклеотид, запропонований в даному винаході. Даний винахід належить також до трансформованих рослин, у яких відбувається зверхекспресія фермента HST, що має виражену стійкість або виражену толерантність до інгібуючих HST гербіцидів і/або інгібуючим HPPD гербіцидів порівняно з нетрансгенними аналогічними рослинами. Повинно бути очевидно, що трансформовані рослини, запропоновані в даному винаході, як правило, мають підвищену толерантність до стресу, включаючи тепловий стрес і стрес, викликаний засухою. Таким чином, даний винахід належить також до рослинної клітини, що має виражену стійкість або виражену толерантність до інгібуючих HST гербіцидів і/або інгібуючих HPPD гербіцидів порівняно з клітиною нетрансгеної аналогічної рослини, де вказана рослинна клітина містить рекомбінантний полінуклеотид, запропонований в даному винаході, який представлений в даному описі. Повинно бути очевидно, що область, кодуючу HST, і будь-яку область, кодуючу один або декілька додаткових зумовлюючих толерантність до гербіцидів ферментів, можна створювати на одній («зчепленій») або на фактично розділених призначених для трансформації рекомбінантних молекулах полінуклеотиду. Рослинна клітина може нести додаткові трансгенні ознаки, наприклад, гетерологічні полінуклеотиди, зумовлюючі стійкість до комах, грибів і/або нематод. Даний винахід належить також до морфологічно нормальних фертильних толерантних до інгібітору HST рослин, рослинних клітин, тканин і насіння, які містять рослинну клітину, запропоновану в даному винаході. Трансформовані рослини або рослинні клітини включають (але, не обмежуючись тільки ними) польові культури, плодові і овочеві культури, такі як канола, соняшник, тютюн, цукровий буряк, бавовник, кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, томати, манго, персик, яблуня, груша, суниця, банан, диня, буряк кормовий, картопля, морква, салат, капуста, лук і т.д. Найбільш бажаними генетично модифікованими рослинами є різні сорти сої, цукровий очерет, горох, кормові боби, тополі, виноград, цитрусові, люцерна, жито, овси, газонні й кормові трави, льон і олійний рапс, і горіхоплодові дерева, якщо вони ще не зазначені вище. У найбільш бажаному варіанті способу зазначена рослина являє собою двочасткову рослину, переважно обрану із групи, що включає канолу, соняшник, тютюн, цукровий буряк, сою, бавовник, сорго, томати, манго, персик, яблуню, грушу, суницю, банан, диню, картоплю, моркву, салат, капусту, лук, і найбільш бажано сою. В інших бажаних варіантах здійснення винаходу зазначена рослина являє собою кукурудзу або рис. Бажана рослина, запропонована у винаході, являє собою сою, рис або кукурудзу. Винахід належить також до потомства рослини, зазначеної вище, і до насінь або іншому матеріалу для розмноження рослини зазначених рослин і їх потомства. Найбільш бажаний об'єкт винаходу належить до застосування рекомбінантного полінуклеотида, запропонованого в даному винаході, для захисту рослин культурно сої від пошкодження, викликуваного гербіцидами-інгібіторами HPPD з хімічних класу інгібіторів HPPD, вибраних з групи, що включає сполуки формули Ia або Ig. В іншому варіанті здійснення винаходу гербіцид-інгібітор HPPD вибирають з групи, що включає сулькотрион, мезотріон, темботрион і сполуки формули Ia, в якій X означає азот і R4 означає CF3, CF2H або CFH2 і/або в якій R1 і R2 разом утворюють етиленовий місток. Даний винахід належить також до способу одержання трансгенної рослини, толерантної до інгібуючих HST і/або інгібуючих HPPD гербіцидів, що полягає у тому, що трансформують рослинний матеріал рекомбінантним(ими) полінуклеотидом(ами), який(і) містить(ять) область, кодуючу фермент HST, відбирають трансформований рослинний матеріал з використанням інгібуючого HST гербіциду і/або інгібуючого HPPD гербіциду, і регенерують матеріал з одержанням морфологічно нормальної фертильної рослини. В бажаному варіанті здійснення винаходу трансформований рослинний матеріал відбирають з використанням інгібуючого HST гербіциду індивідуально або в комбінації з інгібуючим HPPD гербіцидом. Даний винахід належить також до застосування полінуклеотида, який містить область, що кодує фермент HST, в якості селектованого маркера при трансформації рослини і до 11 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування полінуклеотида, який містить область, кодуючу фермент HST, для одержання рослин, які мають толерантність до гербіцидів, дія яких повністю або частково полягає в інгібуванні HST. Даний винахід належить також до застосування інгібіторів HST в якості агентів для селекції при трансформації рослини і до застосування рекомбінантного фермента HST для скрінінгу in vitro потенційних гербіцидів. Даний винахід належить також до гербіцидної композиції, бажано синергетическої гербіцидної композиції, яка містить інгібуючий HPPD гербіцид (вказаний в даному описі) і інгібуючий HST гербіцид (вказаний в даному описі). Співвідношення інгібуючого HPPD гербіциду і інгібуючого HST гербіциду в композиції являє собою будь-яке прийнятне співвідношення, як правило, від 100:1 до 1:100, бажано від 1:10 до 1:100, ще більш бажано від 1:1 до 1:20. Фахівцю в даній галузі повинно бути очевидно, що оптимальне співвідношення залежить від відносної ефективності і спектра дії двох гербіцидів, і його можна визначати за допомогою загальноприйнятої процедури оптимізації в експериментальних умовах. Гербіцидна композиція може містити також один або декілька додатковий(их) інгредієнт(ів), що має(ють) пестицидну активність. Додаткові пестициди можуть являти собою, наприклад, гербіциди, фунгіциди або інсектициди (наприклад, тіометоксам), однак гербіциди є бажаними. Таким чином, додатковий гербіцид бажано вибирають з групи, що включає гліфосат (включаючи його прийнятні для застосування в сільському господарстві солі); глуфосинат (включаючи його прийнятні для застосування в сільському господарстві солі); хлорацетаніліди, такі як алахлор, ацетохлор, метолахлор, S-метолахлор; інгібітори фотосистеми II (PS-II), наприклад, триазини, такі як аметрин, атразин, цяаназин я тербутилазин, триазянони, такі как гексазінон і метрибузин, сечовини, такі як хлоротолурон, діурон, ізопротурон, лінурон і тербутіурон; інгібітори ALS, наприклад, сульфонілсечовини, такі як амідосульфурон, хлорсульфурон, флупірсульфурон, галосульфурон, нікосульфурон, примисульфурон, просульфурон, римсульфурон, триасульфурон, триафлоксисульфурон і тритосульфурон; прості дифенілові ефіри, наприклад, ацифлурофен і фомесафен. Гербіциди-інгібітори PS-II є найбільш бажаними для застосування у вказаних сумішах, які мають при цьому найбільш високу ефективність. Таким чином, даний винахід належить також до способу вибіркової боротьби з бур'янистими рослинами в місці виростання культурних рослин і бур'янів, що полягає у тому, що обробляють місце виростання взятої в нищівній бур'яни кількості синергетичної гербіцидної композиції, вказаної вище. Згідно іншому варіанту здійснення даного винаходу обприскування інгібуючими HPPD і HST гербіцидами зазвичай здійснюють послідовно, а не у вигляді суміші в один і той же час. Tак, наприклад, в програмі боротьби з бур'янистими рослинами, запропонованої в даному винаході, інгібуючий HST гербіцид доцільно вносити в місце виростання культури, яке раніше вже було оброблене інгібуючим HPPD гербіцидом. Як правило, це слід здійснювати в один і той же сезон, але, як це має місце перш за все у випадку інгібуючих HPPD гербіцидів, що мають більш високу персистентність інгібуючих HPPD гербіцидів, може виявитися доцільним застосовувати інгібуючий HST гербіцид в наступний сезон. Крім інгібуючих HST гербіцидів доцільно в якості частини програми боротьби з бур'янистими рослинами використовувати внесення інгібуючого HPPD гербіциду в більш ранній період сезону або навіть в попередній сезон. Інгібуючий HPPD гербіцид можна застосовувати для обробки місця виростання в будь-якій прийнятній нормі витрати, наприклад, від 1 до 1000 г/га, більш бажано від 2 до 200 г/га. Аналогічно цьому, інгібуючий HST гербіцид можна застосовувати в будь-якій прийнятній нормі витрати, наприклад, від 10 до 2000 г/га, більш бажано від 50 до 400 г/га. В іншому варіанті здійснення винаходу інгібуючий HPPD гербіцид застосовують для обробки місця виростання в нормі витрати, яка була б сублетальною для бур'янів у випадку, якщо інгібуючий HPPD гербіцид застосовувався б за відсутності інших гербіцидів. Фактична сублетальна норма витрати повинна залежати від видів присутніх бур'янистих рослин і застосовуваного інгібітора HPPD, але, як правило, становить менше 50 г/га, більш бажано менше 10 г/га. Таким чином, даний винахід належить також до застосування обробки сублетальної норми витрати інгібуючого HPPD гербіциду з метою підвищення ефективності у відношенні боротьби з бур'янистими рослинами інгібуючого HST гербіциду. Винахід повинний стати більш очевидним після ознайомлення з прикладеними не обмежуючими обсяг винаходу прикладами і переліком послідовностей. Перелік послідовностей SEQ ID NO: 1 Амінокислотна послідовність HST Arabidopsis melsisqsprvrfsslaprflaashhhrpsvhlagkfislprdvrftslstsrmrskfvstnyrkisiracsqvgaaesddpvldriarfqnacwrf lrphtirgtalgstalvtralienthlikwslvlkalsgllalicgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawllviffaiagllvvgfnfgpfitsly 12 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 slglflgtiysvpplrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyhatraalglpfqwsapvafitsfvtlfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniaflgsglll vnyvsaislafympqvfrgslmipahvilasglifqtwvlekanytkeaisgyyrfiwnlfyaeyllfpfl SEQ ID NO: 2 Амінокислотна послідовність HST рису maslaspplpcraaatasrsgrpaprllgpppppaspllssasarfprapcnaarwsrrdavrvcsqagaagpaplsktlsdlkdscwrflr phtirgtalgsmslvaralienpqlinwwlvfkafyglvalicgngyivginqiydiridkvnkpylpiaagdlsvqtawllvvlfaaagfsivvtnfgpfit slyclglflgtiysvppfrlkrypvaafliiatvrgfllnfgvyyatraalgltfqwsspvafitcfvtlfalviaitkdlpdvegdrkyqistlatklgvrniaflgsg llianyvaaiavaflmpqafrrtvmvpvhaalavgiifqtwvleqakytkdaisqyyrfiwnlfyaeyiffpli SEQ ID NO: 3 Варіант амінокислотної послідовності HST рису maslaspplpcraaatasrsgrpaprllgpppppaspllssasarfprapcnaarwsrrdavrvcsqagaagpaplsktlsdlkdscwrflr phtirgtalgsialvaralienpqlinwwlvfkafyglvalicgngyivginqiydiridkvnkpylpiaagdlsvqtawllvvlfaaagfsivvtnfgpfits lyclglflgtiysvppfrlkrypvaafliiatvrgfllnfgvyyatraalgltfqwsspvafitcfvtlfalviaitkdlpdvegdrkyqistlatklgvrniaflgsgll ianyvaaiavaflmpqafrrtvmvpvhaalavgiifqtwvleqakytkdaisqyyrfiwnlfyaeyiffpli SEQ ID NO: 4 Амінокислотна послідовність HST сої melslsptshrvpstiptlnsaklsstkatksqqplflgfskhfnsiglhhhsyrccsnavperpqrpssiractgvgasgsdrplaerlldlkda cwrflrphtirgtalgsfalvaralientnlikwslffkafcglfalicgngyivginqiydisidkvnkpylpiaagdlsvqsawflviffaaaglsiaglnfg pfifslytlglflgtiysvpplrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyyatraslglafewsspvvfittfvtffalviaitkdlpdvegdrkyqistfatklgvrniafl gsgillvnyivsvlaaiympqafrrwllipahtifaisliyqarileqanytkdaisgfyrfiwnlfyaeyaifpfi SEQ ID NO: 5 Амінокислотна послідовність HST Chlamidomonas mdlcsstgrgaclspastsrpcpapvhlrgrrlafspaqpagrrhlpvlssaavpaplpnggndesfaqklanfpnafwkflrphtirgtilgtt avtakvlmenpgcidwallpkallglvallcgngyivginqiydvdidvvnkpflpvasgelspalawglclslaaagagivaanfgnlitslytfglfl gtvysvpplrlkqyavpafmiiatvrgfllnfgvysatraalglpfewspavsfitvfvtlfatviaitkdlpdvegdqannistfatrmgvrnvallaigll manylgaialaltystafnvplmagahailaatlalrtlklhaasysreavasfyrwiwnlfyaeyallpfl SEQ ID NO: 6 Амінокислотна послідовність HST Nicotinia melacsscsslrfssvlthqdtaasryrklpptspsckaanfvlkssknlsssaglhigytnfsktvsyrkyrhisiracsqvgtagsepvldkl sqfkdafwrflrphtirgtalgslslvtralienpnlirwslamkafsglialicgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawflvllfamagll ivginfgpfitslyclglflgtiysvppfrmkrfavvafliiatvrgfllnygvyyattaalglsfqwsspvafittfvtlfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatkl gvrniaflgsglllanyigavvaaiympqafrsslmipvhailalclvfqawllekanytkeaisayyqfiwnffyaeylifpfi SEQ ID NO: 7 Амвнокислотна послідовність HST Aquilegia lcfsspsisipphcsttthyrkipinstfkstnflskasnnlttfgfsrnkkysrsilsrksrhfsiwassqvgaagsddpllkkipdfkdavwrflrp htirgtalgsialvsralienthlikwsllfkaicgvfalmcgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawslvtffavagvcivafnfgpfitsl yclglflgtiysvpplrmkrypvaafliiatvrgfllnfgvyhatraalgltfewsypvafittfvtmfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniallgtgl llanyigaivaaiylpqafrrnlmipahtilalglvfqawaleqakyskeaildfyrfvwnlfyseyflfpfi SEQ ID NO: 8 Амінокислотна послідовність HST Brassica napus melsishspclrfssssprflaasshhyrpsvhlagkllsrskdadltslssscmrskfvstnyrkisirassqvgaagsdpvldrlarfqnac wrflrphtirgtalgstalvtralienthlikwslvlkalsgllalicgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawllviffaiagltvvgfnfgpfit clyslglflgtiysvppfrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyhatraalglsfqwsapvafitsfvtlfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniaflgs glllvnyisaislafympqvfrgslmipahmilasclvfqtwvlekanytkeaiagyyrfiwnlfyaeyllfpff SEQ ID NO: 9 Амінокислотна послідовність HST Vitis vinifera mkvdavqastqvgaagsdpplnkfsvfkdacwrflrphtirgtalgstalvaralienpnlikwsllfkafsgllalicgngyivginqiydisidk vnkpylpiaagdlsvqsawflvlffavagvlivgsnfgsfitslyclglvlgtiysvppfrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyyatraalglpfmwsapv vfittfvtlfalviaitkdlpdvegdrkyqistlatklgvrniaflgsglllvnyigsilaaiympqafrlslmipahailaaglifqarvleqanytkeaisdfyrf iwnlfyveyiifpfi SEQ ID NO: 10 Амінокислотна послідовність HST Physcomitrella patens mgltaivvdvaqassssvalsqgrgatrrlpgglalgdafkglrkreyaqglqcrvrreggcasearvwkvrcssdsagslggdlpasqpq qsevsgirdpaaasaasfaplpqrialfydafwrflrphtirgtflgtsalvtrallenptlinwallpkalrgllallcgngfivginqifdsgidkvnkpflpi aagdlsvpaawalvgglaalgvglvatnfgplittlytfglflgtiysvpplrlkqypvpafmiiatvrgfllnfgvyyatraalglsyewspsvmfitifvtlf atviaitkdlpdiegdkkfnistfatnlgvrkisflgaglllvnyigaivaafylpqafktkimvtghavlglsliyqtwlldtakyskeaisnfyrfiwnlfyse yalfpfi SEQ ID NO: 11 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Arabidopsis atggagctctcgatctcacaatcaccgcgtgttcggttctcgtctctggcgcctcgtttcttagcagcttctcatcatcatcgtccttctgtgcattt agctgggaagtttataagcctccctcgagatgttcgcttcacgagcttatcaacttcaagaatgcggtccaaatttgtttcaaccaattatagaaaa atctcaatccgggcatgttctcaggttggtgctgctgagtctgatgatccagtgctggatagaattgcccggttccaaaatgcttgctggagatttctt agaccccatacaatccgcggaacagctttaggatccactgccttggtgacaagagctttgatagagaacactcatttgatcaaatggagtcttgt actaaaggcactttcaggtcttcttgctcttatttgtgggaatggttatatagtcggcatcaatcagatctacgacattggaatcgacaaagtgaaca aaccatacttgccaatagcagcaggagatctatcagtgcagtctgcttggttgttagtgatattttttgcgatagcagggcttttagttgtcggatttaa ctttggtccattcattacaagcctatactctcttggcctttttctgggaaccatctattctgttccacccctcagaatgaaaagattcccagttgcagcat ttcttattattgccacggtacgaggtttccttcttaactttggtgtgtaccatgctacaagagctgctcttggacttccatttcagtggagtgcacctgtgg cgttcatcacatcttttgtgacactgtttgcactggtcattgctattacaaaggaccttcctgatgttgaaggagatcgaaagttccaaatatcaaccc tggcaacaaaacttggagtgagaaacattgcattcctcggttctggacttctgctagtaaattatgtttcagccatatcactagctttctacatgcctc 13 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 aggtttttagaggtagcttgatgattcctgcacatgtgatcttggcttcaggcttaattttccagacatgggtactagaaaaagcaaactacaccaa ggaagctatctcaggatattatcggtttatatggaatctcttctacgcagagtatctgttattccccttcctctag SEQ ID NO: 12 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST рису atggcttccctcgcctcccctcctctcccctgccgcgccgccgccaccgccagccgcagcgggcgtcctgctccgcgcctcctcggccct ccgccgccgcccgcttcccctctcctctcctccgcttcggcgcgcttcccgcgtgccccctgcaacgccgcacgctggagccggcgcgacgcc gtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgctggagatttttacggcca catacaattcgaggaactgccttgggatccatgtcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaattggtggttggtattcaaag cgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgataaggtaaacaagccata tttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaattgttgtgacaaactttggac ctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgttgctgcttttcttatcattgca acggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctcgcctgttgctttcattacatg cttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatatcaactttggcgacaaagc tcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgcctcaggctttcaggcgcac tgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatactaaggatgctatttcacagt actaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgata SEQ ID NO: 13 Варіант амінокислотної послідовності (ДНК) HST рису atggcttccctcgcctcccctcctctcccctgccgcgccgccgccaccgccagccgcagcgggcgtcctgctccgcgcctcctcggccct ccgccgccgcccgcttcccctctcctctcctccgcttcggcgcgcttcccgcgtgccccctgcaacgccgcacgctggagccggcgcgacgcc gtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgctggagatttttacggcca catacaattcgaggaactgccttgggatccatagcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaattggtggttggtattcaaa gcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgataaggtaaacaagccat atttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaattgttgtgacaaactttgga cctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgttgctgcttttcttatcattgc aacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctcgcctgttgctttcattacat gcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatatcaactttggcgacaaag ctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgcctcaggctttcaggcgca ctgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatactaaggatgctatttcacag tactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgatatag SEQ ID NO: 14 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST сої tctgctaaattatcttctactaaagctactaaatctcaacaacctttatttttaggattttctaaacattttaattctattggattacatcatcattcttat agatgttgttctaatgctgtacctgaaagacctcaaagaccttcttctattagagcttgtactggagtaggagcttctggatctgatagacctttagct gaaagattattagatttaaaagatgcttgttggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatcttttgctttagtagctagagcttt aattgaaaatactaatttaattaaatggtctttattttttaaagctttttgtggattatttgctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatt tatgatatttctattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtttttagtaattttttttgctgctgctgg attatctattgctggattaaattttggaccttttattttttctttatatactttaggattatttttaggaactatttattctgtacctcctttaagaatgaaaagattt cctgtagctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatattatgctactagagcttctttaggattagcttttgaatggtcttc tcctgtagtatttattactacttttgtaactttttttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatatcaaatttctac ttttgctactaaattaggagtaagaaatattgcttttttaggatctggaattttattagtaaattatattgtatctgtattagctgctatttatatgcctcaagc ttttagaagatggttattaattcctgctcatactatttttgctatttctttaatttatcaagctagaattttagaacaagctaattatactaaagatgctatttct ggattttatagatttatttggaatttattttatgctgaatatgctatttttccttttatt SEQ ID NO: 15 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Clamidomonas atggacctttgcagctcaactggaagaggagcatgcctttcgccggcatccacgtcgcggccgtgcccagcaccagtgcatttgcgcgg ccgacgcctggctttctctccggctcagcctgctggacggcgccacttgccggtgctctcatctgcagcggtccccgctcccctcccaaatggtg gaaacgacgagagcttcgcacaaaaactggctaactttccaaacgccttctggaagttcctgcggccacacaccatccgggggactatcctg ggcaccacagctgtgaccgccaaggtccttatggagaaccccggctgcatagactgggcactgctgccgaaggcgctgctcggcctggtgg cgctgctgtgcggcaacggctacattgtgggcatcaaccaaatctacgacgtcgacattgacgtggtcaacaagccattcctccccgtggcgtc gggcgagctgtcgccggcgctggcgtggggcctgtgtctgtcgctggcggctgcgggcgcgggcatcgtagccgccaacttcggcaacctca tcaccagcctctacacctttggcctcttcctgggcaccgtgtacagtgtgcctcccctgcgcctgaagcagtacgcggtgccggccttcatgatca tcgccacggtgcgcggcttcctgctcaacttcggcgtgtacagcgccacgcgggcggcactgggactgcccttcgagtggagcccggccgtc agcttcatcacggtgtttgtgacgctgtttgccactgtgatcgccatcaccaaggacctgccggacgtggagggcgaccaggccaacaacatct ccaccttcgccacgcgcatgggcgtgcgcaacgtggcactgctggccatcggccttctcatggccaactacctgggtgccatcgcgctggcac tcacctactccaccgccttcaacgtgccgctcatggcgggcgcgcacgccatcctggccgccacgctggcgctgcgcacgctcaagctgcac gccgccagctacagccgggaggcggtggcgtccttctaccgctggatctggaacctgttctacgccgagtacgcgctgctgccgttcctgtag SEQ ID NO: 16 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Nicotinia atggaattagcttgttcttcttgttcttctttaagattttcttctgtattaactcatcaagatactgctgcttctagatatagaaaattacctcctacttct ccttcttgtaaagctgctaattttgtattaaaatcttctaaaaatttatcttcttctgctggattacatattggatatactaatttttctaaaactgtatcttata gaaaatatagacatatttctattagagcttgttctcaagtaggaactgctggatctgaacctgtattagataaattatctcaatttaaagatgctttttgg agatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctttatctttagtaactagagctttaattgaaaatcctaatttaattagatggtctttag ctatgaaagctttttctggattaattgctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatattggaattgataaagtaaataaa ccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtttttagtattattatttgctatggctggattattaattgtaggaattaattttggacc 14 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ttttattacttctttatattgtttaggattatttttaggaactatttattctgtacctccttttagaatgaaaagatttgctgtagtagcttttttaattattgctactgt aagaggatttttattaaattatggagtatattatgctactactgctgctttaggattatcttttcaatggtcttctcctgtagcttttattactacttttgtaacttt atttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatttcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaat attgcttttttaggatctggattattattagctaattatattggagctgtagtagctgctatttatatgcctcaagcttttagatcttctttaatgattcctgtac atgctattttagctttatgtttagtatttcaagcttggttattagaaaaagctaattatactaaagaagctatttctgcttattatcaatttatttggaatttttttt atgctgaatatttaatttttccttttatt SEQ ID NO: 17 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Aquilegia atgttatgtttttcttctccttctatttctattcctcctcattgttctactactactcattatagaaaaattcctattaattctacttttaaatctactaatttttt atctaaagcttctaataatttaactacttttggattttctagaaataaaaaatattctagatctattttatctagaaaatctagacatttttctatttgggcttc ttctcaagtaggagctgctggatctgatgatcctttattaaaaaaaattcctgattttaaagatgctgtatggagatttttaagacctcatactattaga ggaactgctttaggatctattgctttagtatctagagctttaattgaaaatactcatttaattaaatggtctttattatttaaagctatttgtggagtatttgct ttaatgtgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatattggaattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagattt atctgtacaatctgcttggtctttagtaactttttttgctgtagctggagtatgtattgtagcttttaattttggaccttttattacttctttatattgtttaggattatt tttaggaactatttattctgtacctcctttaagaatgaaaagatatcctgtagctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagt atatcatgctactagagctgctttaggattaacttttgaatggtcttatcctgtagcttttattactacttttgtaactatgtttgctttagtaattgctattacta aagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatttcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaatattgctttattaggaactggattat tattagctaattatattggagctattgtagctgctatttatttacctcaagcttttagaagaaatttaatgattcctgctcatactattttagctttaggattag tatttcaagcttgggctttagaacaagctaaatattctaaagaagctattttagatttttatagatttgtatggaatttattttattctgaatat tttttatttccttttatt SEQ ID NO: 1i8 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Brassica napus Ttagctgcttcttctcatcattatagaccttctgtacatttagctggaaaattattatctagatctaaagatgctgatttaacttctttatcttcttcttgt atgagatctaaatttgtatctactaattatagaaaaatttctattagagcttcttctcaagtaggagctgctggatctgatcctgtattagatagattagc tagatttcaaaatgcttgttggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctactgctttagtaactagagctttaattgaaaata ctcatttaattaaatggtctttagtattaaaagctttatctggattattagctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatattg gaattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggttattagtaattttttttgctattgctggattaactg tagtaggatttaattttggaccttttattacttgtttatattctttaggattatttttaggaactatttattctgtacctccttttagaatgaaaagatttcctgtag ctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatatcatgctactagagctgctttaggattatcttttcaatggtctgctcctgt agcttttattacttcttttgtaactttatttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatttcaaatttctactttagct actaaattaggagtaagaaatattgcttttttaggatctggattattattagtaaattatatttctgctatttctttagctttttatatgcctcaagtatttagag gatctttaatgattcctgctcatatgattttagcttcttgtttagtatttcaaacttgggtattagaaaaagctaattatactaaagaagctattgctggata ttatagatttatttggaatttattttatgctgaatatttattatttccttttttt SEQ ID NO: 19 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Vitis vinifera Atgaaagtagatgctgtacaagcttctactcaagtaggagctgctggatctgatcctcctttaaataaattttctgtatttaaagatgcttgttgg agatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctactgctttagtagctagagctttaattgaaaatcctaatttaattaaatggtcttta ttatttaaagctttttctggattattagctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatatttctattgataaagtaaataaacct tatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtttttagtattattttttgctgtagctggagtattaattgtaggatctaattttggatctttta ttacttctttatattgtttaggattagtattaggaactatttattctgtacctccttttagaatgaaaagatttcctgtagctgcttttttaattattgctactgtaa gaggatttttattaaattttggagtatattatgctactagagctgctttaggattaccttttatgtggtctgctcctgtagtatttattactacttttgtaactttat ttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatatcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaata ttgcttttttaggatctggattattattagtaaattatattggatctattttagctgctatttatatgcctcaagcttttagattatctttaatgattcctgctcatg ctattttagctgctggattaatttttcaagctagagtattagaacaagctaattatactaaagaagctatttctgatttttatagatttatttggaatttatttt atgtagaatatattatttttccttttatt SEQ ID NO: 20 Амінокислотна послідовність (ДНК) HST Physcomitrella patens atgggattaactgctattgtagtagatgtagctcaagcttcttcttcttctgtagctttatctcaaggaagaggagctactagaagattacctgg aggattagctttaggagatgcttttaaaggattaagaaaaagagaatatgctcaaggattacaatgtagagtaagaagagaaggaggatgtg cttctgaagctagagtatggaaagtaagatgttcttctgattctgctggatctttaggaggagatttacctgcttctcaacctcaacaatctgaagtat ctggaattagagatcctgctgctgcttctgctgcttcttttgctcctttacctcaaagaattgctttattttatgatgctttttggagatttttaagacctcatac tattagaggaacttttttaggaacttctgctttagtaactagagctttattagaaaatcctactttaattaattgggctttattacctaaagctttaagagg attattagctttattatgtggaaatggatttattgtaggaattaatcaaatttttgattctggaattgataaagtaaataaaccttttttacctattgctgctg gagatttatctgtacctgctgcttgggctttagtaggaggattagctgctttaggagtaggattagtagctactaattttggacctttaattactactttat atacttttggattatttttaggaactatttattctgtacctcctttaagattaaaacaatatcctgtacctgcttttatgattattgctactgtaagaggattttt attaaattttggagtatattatgctactagagctgctttaggattatcttatgaatggtctccttctgtaatgtttattactatttttgtaactttatttgctactgt aattgctattactaaagatttacctgatattgaaggagataaaaaatttaatatttctacttttgctactaatttaggagtaagaaaaatttcttttttagg agctggattattattagtaaattatattggagctattgtagctgctttttatttacctcaagcttttaaaactaaaattatggtaactggacatgctgtatta ggattatctttaatttatcaaacttggttattagatactgctaaatattctaaagaagctatttctaatttttatagatttatttggaatttattttattctgaatat gctttatttccttttatt SEQ ID NO: 21 ДНК, кодуюча зрілу послідовність HST Arabidopsis agaaaaatctcaatccgggcatgttctcaggttggtgctgctgagtctgatgatccagtgctggatagaattgcccggttccaaaatgcttgc tggagatttcttagaccccatacaatccgcggaacagctttaggatccactgccttggtgacaagagctttgatagagaacactcatttgatcaaa tggagtcttgtactaaaggcactttcaggtcttcttgctcttatttgtgggaatggttatatagtcggcatcaatcagatctacgacattggaatcgaca 15 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 aagtgaacaaaccatacttgccaatagcagcaggagatctatcagtgcagtctgcttggttgttagtgatattttttgcgatagcagggcttttagtt gtcggatttaactttggtccattcattacaagcctatactctcttggcctttttctgggaaccatctattctgttccacccctcagaatgaaaagattccc agttgcagcatttcttattattgccacggtacgaggtttccttcttaactttggtgtgtaccatgctacaagagctgctcttggacttccatttcagtggag tgcacctgtggcgttcatcacatcttttgtgacactgtttgcactggtcattgctattacaaaggaccttcctgatgttgaaggagatcgaaagttcca aatatcaaccctggcaacaaaacttggagtgagaaacattgcattcctcggttctggacttctgctagtaaattatgtttcagccatatcactagcttt ctacatgcctcaggtttttagaggtagcttgatgattcctgcacatgtgatcttggcttcaggcttaattttccagacatgggtactagaaaaagcaa actacaccaaggaagctatctcaggatattatcggtttatatggaatctcttctacgcagagtatctgttattccccttcctcta SEQ ID NO: 22 ДНК, кодуюча зрілу послідовність HST рису cggcgcgacgccgtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgct ggagatttttacggccacatacaattcgaggaactgccttgggatccatgtcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaatt ggtggttggtattcaaagcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgat aaggtaaacaagccatatttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaatt gttgtgacaaactttggacctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgt tgctgcttttcttatcattgcaacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctc gcctgttgctttcattacatgcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatat caactttggcgacaaagctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgc ctcaggctttcaggcgcactgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatact aaggatgctatttcacagtactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgatatag SEQ ID NO: 23 ДНК, кодуюча варіант зрілої послідовності HST рису cggcgcgacgccgtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgct ggagatttttacggccacatacaattcgaggaactgccttgggatccatagcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaatt ggtggttggtattcaaagcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgat aaggtaaacaagccatatttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaatt gttgtgacaaactttggacctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgt tgctgcttttcttatcattgcaacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctc gcctgttgctttcattacatgcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatat caactttggcgacaaagctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgc ctcaggctttcaggcgcactgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatact aaggatgctatttcacagtactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgatatag SEQ ID NO: 24 ДНК, кодуюча зрілу послідовність HST Arabidopsis з кодонами, оптимізованими для застосування в клітинах комах gggatccctcgtgcttgctcccaggtcggcgctgctgagtccgacgaccccgtgctggaccgtatcgctcgtttccagaacgcttgctggc gtttcctgcgtccccacaccatccgtggcaccgctctgggttccaccgccctggtgacccgtgctctgatcgagaacacccacctgatcaagtgg tccctggtgctgaaggctctgtccggtctgctggctctgatctgcggtaacggttacatcgtgggtatcaaccagatctacgacatcggtatcgac aaggtgaacaagccctacctgcccatcgctgctggtgacctgtccgtgcagtccgcttggctgctggtcatcttcttcgctatcgctggtctgctggt cgtgggtttcaacttcggtcccttcatcacttccctgtactccctgggcctgttcctgggcaccatctactccgtgccccccctgcgtatgaagcgtttc cccgtggctgctttcctgatcatcgctaccgtgcgtggtttcctgctgaacttcggtgtctaccacgctacccgtgctgctctgggtctgcccttccagt ggtccgctcccgtggctttcatcaccagcttcgtgaccctgttcgctctggtgatcgctatcaccaaggacctgcccgacgtggagggtgaccgta agttccagatctccaccctggctaccaagctgggtgtgcgtaacatcgctttcctcggttccggcctgctgctcgtgaactacgtgtccgctatctcc ctggctttctacatgccccaggtgttccgtggttccctgatgatccccgctcacgtgatcctggcttccggtctgatcttccagacctgggtgctcgag aaggctaactacaccaaggaagctatctccggttactaccgcttcatctggaacctgttctacgctgagtacctgctgttccccttcctgtaa SEQ ID NО: 25 Амінокислотна послідовність HPPD з штаму Pseudomonas fluorescens 87-79 madqyenpmglmgfefiefasptpgtlepifeimgftkvathrsknvhlyrqgeinlilnnqpdslasyfaaehgpsvcgmafrvkdsqq aynralelgaqpihietgpmelnlpaikgiggaplylidrfgegssiydidfvylegvdrnpvgaglkvidhlthnvyrgrmaywanfyeklfnfrea ryfdikgeytgltskamsapdgmiriplneesskgagqieeflmqfngegiqhvafltedlvktwdalkkigmrfmtappdtyyemlegrlpnhg epvdqlqargilldgssiegdkrlllqifsetlmgpvffefiqrkgddgfgegnfkalfesierdqvrrgvlttd SEQ ID NО: 26 Амінокислотна послідовність HPPD з Avena sativa mpptpatatgaaaaavtpehaarsfprvvrvnprsdrfpvlsfhhvelwcadaasaagrfsfalgaplaarsdlstgnsahaslllrsgalaf lftapyapppqeaataaatasipsfsadaartfaaahglavrsvgvrvadaaeafrvsvaggarpafapadlghgfglaevelygdvvlrfvsyp detdlpflpgfervsspgavdygltrfdhvvgnvpemapvidymkgflgfhefaeftaedvgttesglnsvvlannseavllplnepvhgtkrrsqi qtyleyhggpgvqhialasndvlrtlremrartpmggfefmappqakyyegvrriagdvlseeqikecqelgvlvdrddqgvllqiftkpvgdrptf flemiqrigcmekdevgqeyqkggcggfgkgnfselfksiedyekslevkqsvvaqks SEQ ID NО: 27 Амінокислотна послідовність HPPD з пшениці mpptpttpaatgaaavtpeharprrmvrfnprsdrfhtlafhhvefwcadaasaagrfafalgaplaarsdlstgnsvhasqllrsgnlaflft apyangcdaataslpsfsadaarqfsadhglavrsialrvadaaeafrasvdggarpafspvdlgrgfgfaevelygdvvlrfvshpdgrdvpfl pgfegvsnpdavdygltrfdhvvgnvpelapaaayvagftgfhefaefttedvgtaesglnsmvlannsegvllplnepvhgtkrrsqiqtflehh ggsgvqhiavassdvlrtlremrarsamggfdflppplpkyyegvrriagdvlseaqikecqelgvlvdrddqgvllqiftkpvgdrptlflemiqrig cmekdergeeyqkggcggfgkgnfselfksiedyeksleakqsaavqgs SEQ ID NО: 28 Амінокислотна послідовність HPPD з Shewanella collwelliana 16 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 maseqnplgllgieftefatpdldfmhkvfidfgfsklkkhkqkdivyykqndinfllnnekqgfsaqfakthgpaissmgwrvedanfafe gavargakpaadevkdlpypaiygigdsliyfidtfgddnniytsdfealdepiitqekgfievdhltnnvhkgtmeywsnfykdifgftevryfdik gsqtalisyalrspdgsfcipinegkgddrnqideylkeydgpgvqhlafrsrdivasldamegssiqtldiipeyydtifeklpqvtedrdrikhhqil vdgdedgyllqiftknlfgpifieiiqrknnlgfgegnfkalfesierdqvrrgvl SEQ ID NО: 29 Послідовність ДНК HPPD з штаму Pseudomonas fluorescens 87-79 atggccgaccaatacgaaaacccaatgggcctgatgggctttgaatttattgaattcgcatcgccgactccgggcaccctggagccgatc ttcgagatcatgggcttcaccaaagtcgcgacccaccgctccaagaatgtgcacctgtaccgccagggcgagatcaacctgatcctcaacaa ccagcccgacagcctggcctcgtacttcgccgccgaacacggcccttcggtgtgcggcatggcgttccgggtcaaagactcgcagcaggctt acaaccgcgcgttggaactgggcgcccagccgattcatatcgaaaccggcccgatggaactcaacctgccggccatcaagggcatcggcg gtgcgccgctgtacctgatcgaccgcttcggtgaaggcagctcgatatatgacatcgacttcgtgtacctcgaaggtgtcgaccgcaacccggt aggcgcgggcctcaaggtcatcgaccacctgacccacaacgtgtatcgcggccgcatggcctactgggccaacttctacgagaaactgttca acttccgtgaagcacgctacttcgatatcaagggcgaatacaccggccttacgtccaaggccatgagtgccccggacggcatgatccgcatc ccgctgaacgaggaatcgtccaagggcgccggccagatcgaagagttcctgatgcagttcaacggcgagggcatccagcacgtggcgttcc tcaccgaagacctggtcaagacctgggatgcgttgaagaagatcggcatgcgcttcatgaccgcgccgccggacacctactacgaaatgctc gaaggccgcctgccaaaccacggcgagccggtggaccaactgcaggcgcgcggtattttgctggacggctcctcgatcgagggcgacaag cgcctgctgctgcagatcttctcggaaaccctgatgggcccggtgttcttcgaattcatccagcgcaaaggcgacgatgggtttggcgagggca acttcaaggcgctgttcgagtcgatcgagcgcgaccaggtacgtcgcggtgtactgaccaccgac SEQ ID NО: 30 Послідовність ДНК HPPD з Avena sativa atgccgcccacccccgccaccgccaccggcgccgccgcggccgccgtgactccagagcacgcggcccggagctttccccgagtggt ccgcgtcaacccgcgcagcgaccgcttccccgtgctctccttccaccacgtcgagctctggtgcgccgacgccgcctcagcggccggacgctt ctccttcgcgctcggcgcgccgctcgccgcccggtccgacctctccacggggaactccgcgcacgcctccctcctgctccgctcgggcgccct cgccttcctcttcacggcgccctacgcgccgccgccgcaggaggccgccacggccgcagccaccgcctccatcccctccttctccgccgacg ccgcgcggacgttcgccgccgcccacggcctcgcggtgcgctccgtcggggtccgcgtcgctgacgccgccgaggccttccgcgtcagcgt agccggcggcgctcgcccggccttcgccccagccgacctcggccatggcttcggcctcgccgaggtcgagctctacggcgacgtcgtgctac gcttcgtcagctacccggacgagacagacctgccattcctgccagggttcgagcgcgtgagcagccccggcgccgtggactacggcctcac gcggttcgaccacgtcgtgggcaacgtcccggagatggccccggtcatagactacatgaaaggcttcttggggttccacgagttcgccgagttc accgccgaggacgtgggcacgaccgagagcgggctcaactcggtggtgctcgccaacaactccgaggccgtgctgctgccgctcaacga gcccgtgcacggcacaaagcgacggagccagatacagacgtacctggagtatcacggcgggcccggcgtgcagcacatcgcgctcgcc agcaacgacgtgctcaggacgctcagggagatgcgggcgcgcacgcccatgggcggcttcgagttcatggcgccaccgcaggcgaaata ctatgaaggcgtgcggcgcatcgcaggtgacgtgctctcggaagagcagatcaaggaatgccaggagctgggggtgctagtcgacaggga tgatcaaggggtgttgctccaaatcttcaccaagccagtaggggacaggccaacgtttttcctggagatgatccaaagaatcgggtgcatgga gaaggacgaggtcgggcaagagtaccagaagggtggctgcggcgggtttggcaagggcaatttctccgagctgttcaagtccattgaggact atgagaaatcccttgaggtcaagcaatctgttgtagctcagaaatcctag SEQ ID NО: 31 Послідовність кДНК HPPD з пшениці atgccgcccacccccaccacccccgcagccaccggcgccgccgcggtgacgccggagcacgcgcggccgcgccgaatggtccgct tcaacccgcgcagcgaccgcttccacacgctcgccttccaccacgtcgagttctggtgcgcggacgccgcctccgccgccggccgcttcgcct tcgcgctcggcgcgccgctcgccgccaggtccgacctctccacggggaactccgtgcacgcctcccagctgctccgctcgggcaacctcgcc ttcctcttcacggccccctacgccaacggctgcgacgccgccaccgcctccctgccctccttctccgccgacgccgcgcgccagttctccgcgg accacggcctcgcggtgcgctccatagcgctgcgcgtcgcggacgctgccgaggccttccgcgccagcgtcgacgggggcgcgcgcccgg ccttcagccctgtggacctcggccgcggcttcggcttcgcggaggtcgagctctacggcgacgtcgtgctccgcttcgtcagccacccggacg gcagggacgtgcccttcttgccggggttcgagggcgtgagcaacccagacgccgtggactacggcctgacgcggttcgaccacgtcgtcgg caacgtcccggagcttgcccccgccgcggcctacgtcgccgggttcacggggttccacgagttcgccgagttcacgacggaggacgtgggc acggccgagagcgggctcaactcgatggtgctcgccaacaactcggagggcgtgctgctgccgctcaacgagccggtgcacggcaccaa gcgccggagccagatacagacgttcctggaacaccacggcggctcgggcgtgcagcacatcgcggtggccagcagcgacgtgctcagga cgctcagggagatgcgtgcgcgctccgccatgggcggcttcgacttcctgccacccccgctgccgaagtactacgaaggcgtgcggcgcatc gccggggatgtgctctcggaggcgcagatcaaggaatgccaggagctgggggtgctcgtcgacagggacgaccaaggggtgttgctacaa atcttcaccaagccagtaggggacaggccgacgttgttcctggagatgatccagaggatcgggtgcatggagaaggacgagagaggggaa gagtaccagaagggtggctgcggcgggttcggcaaaggcaacttctccgagctgttcaagtccattgaagattacgagaagtcccttgaagcc aagcaatctgctgcagttcagggatcatag SEQ ID NО: 32 Послідовність ДНК HPPD Shewanella collwelliana gactttatgagtcgcacaggtatcgaagcgggctacatgaccttacatcaaaaaggcgtgccgcatggaccacaacctggtcgtactga agcctcagtgggcaaaactgaaacctatgagtatgcagtaatggtggacacctttgcaccactgcaactgacccagcatgtcaatgcgtgcat gagcaaagattacaaccgttcctggctagaagagtaaaagcgttcagccagtgctgaacatctaataaatataacaccagaggtgacaccg aagagtgcccttggttgcaataagttgaaagaggataattacatggcaagcgaacaaaacccactgggtctacttggtatcgaattcactgaatt tgctacaccagatctagattttatgcataaagtttttatcgactttggtttctcaaaacttaaaaaacacaagcagaaagatattgtttactataaaca aaatgatattaactttttactcaacaatgaaaaacagggcttttcagcccagtttgccaaaacgcatggcccagccattagttctatgggctggcgt gtagaagatgccaactttgcctttgaaggtgctgtagcccgtggggctaaacccgcagcagatgaggtgaaagatcttccctatcccgctatcta tggcattggtgacagccttatctactttatcgatacgtttggcgatgacaacaatatctacacttctgattttgaagcgttagatgagcctatcatcacc caagagaaaggcttcattgaggtcgaccatctcaccaataatgtccataagggcaccatggaatattggtcaaacttctacaaagacatttttgg ctttacagaagtgcgttacttcgacattaagggctcacaaacagctcttatctcttacgccctgcgctcgccagatggtagtttctgcattccaattaa 17 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 cgaaggcaaaggcgatgatcgtaaccaaattgatgagtacttaaaagagtacgatggcccaggtgtccaacacttagcgttccgtagccgcg acatagttgcctcactggatgccatggaaggaagctccattcaaaccttggacataattccagagtattacgacactatctttgaaaagctgcctc aagtcactgaagacagagatcgcatcaagcatcatcaaatcctggtagatggcgatgaagatggctacttactgcaaattttcaccaaaaatct atttggtccaatttttatcgaaatcatccagcgtaaaaacaatctcggttttggcgaaggtaattttaaagccctatttgaatcgattgagcgtgatca ggtgcgtcgcggcgtactctaacaatcacccagtgatccaacctcaaaaaaccagcatcgcgctggtttttttattgcagcacaacaataaacct ctacactagca SEQ ID NO: 33 Нуклеотидна послідовність енхансера транскрипції TMV tatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacac SEQ ID NO:34 Злита кодуюча послідовність HST TMV і Arabidopsis tatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacacatatggagctctcgatctcacaatc accgcgtgttcggttctcgtctctggcgcctcgtttcttagcagcttctcatcatcatcgtccttctgtgcatttagctgggaagtttataagcctcccac gagatgttcgcttcacgagcttatcaacttcaagaatgcggtccaaatttgtttcaaccaattatagaaaaatctcaatccgggcatgttctcaggtt ggtgctgctgagtctgatgatccagtgctggatagaattgcccggttccaaaatgcttgctggagatttcttagaccccatacaatccgcggaaca gctttaggatccactgccttggtgacaagagctttgatagagaacactcatttgatcaaatggagtcttgtactaaaggcactttcaggtcttcttgct cttatttgtgggaatggttatatagtcggcatcaatcagatctacgacattggaatcgacaaagtgaacaaaccatacttgccaatagcagcagg agatctatcagtgcagtctgcttggttgttagtgatattttttgcgatagcagggcttttagttgtcggatttaactttggtccattcattacaagcctatact ctcttggcctttttctgggaaccatctattctgttccacccctcagaatgaaaagattcccagttgcagcatttcttattattgccacggtacgaggtttc cttcttaactttggtgtgtaccatgctacaagagctgctcttggacttccatttcagtggagtgcacctgtggcgttcatcacatcttttgtgacactgttt gcactggtcattgctattacaaaggaccttcctgatgttgaaggagatcgaaagttccaaatatcaaccctggcaacaaaacttggagtgagaa acattgcattcctcggttctggacttctgctagtaaattatgtttcagccatatcactagctttctacatgcctcaggtttttagaggtagcttgatgattcc tgcacatgtgatcttggcttcaggcttaattttccagacatgggtactagaaaaagcaaactacaccaaggaagctatctcaggatattatcggttt atatggaatctcttctacgcagagtatctgttattccccttcctctag SEQ ID NO: 35 Поліпептидний мотив 1 HST w(r/k)flrphtirgt SEQ ID NO: 36 Поліпептидний мотив 2 HST ng(y/f)ivginqi(y/f)d SEQ ID NO: 37 Поліпептидний мотив 3 HST iaitkdlp SEQ ID NO: 38 Поліпептидний мотив 4 HST y(r/q)(f/w)(i/v)wnlfy Приклади Середні значення і розподіл значень рівнів толерантності або стійкості до гербіцидів, отримані в ряді випадків первинної трансформації рослин, оцінюють загальноприйнятим образом на основі пошкодження рослини, симптомів етіолірування меристеми і т.д. при використанні різних кінцінтрацій гербіцидів. Ці дані можна виражати в поняттях, наприклад, значень GR50, отриманих за допомогою кривих дозової залежності, у яких «дозу» відкладають по осі абсцис, а «знищення у відсотках» «гербіцидна дія», «кількість, зелених рослин, що зійшли» і т.д. відкладають по осі ординат, при цьому підвищені значення GR50 можуть, наприклад, відповідати підвищеним рівнями вродженої толерантності до інгібітору (наприклад, підвищене значення Ki × kcat./Km HPP) і/або рівням експресії експресируємих ферментів HPPD і/або HST. Описані нижче експерименти здійснювали з використанням різних інгібуючих HST гербіцидів, які описані у таблицях A-Е. OH 3 2 R R 1 R 45 N 4 R Таблиця А. Сполуки 1.1 – 1.4 Сполука 1.1 (14) 1.2 (M) 1.3 (N) 1.4 (O) R1 F Cl F F R2 Cl Cl F Br 18 R3 Cl Cl Br Br R4 F Cl F F UA 107184 C2 2 R 3 1 R 7 R R A 1 4 R 5 O N N R 6 R Таблиця Б. Сполуки 2.1 – 2.34 Сполука 2.1 (1) 2.2 (2) 2.3 (3) 2.4 (5) 2.5 (6) 2.6 (7) 2.7 (10) 2.8 (A) 2.9 (AA) 2.10 (AB) 2.11 (AC) 2.12 (AD) 2.13 (AE) 2.14 (Y) 2.15 (AF) 2.16 (AG) 2.17 (AH) 2.18 (AI) 2.19 (AJ) 2.20 (AK) 2.21 (AL) 2.22 2.23 2.24 2.25(AL*) 2.26 2.27 2.28(AX) 2.29 2.30(A*) 2.31(AK*) 2.32 2.33 2.34 1 A N N N N N N N N N N N N CH N CH N N N N N N CH N N N CH N N N N N N N N 1 R F -CH3 F F F H F F H -CH2CH3 -CH3 H F Cl F Cl F F H Cl F Cl F -CH3 F F F Cl F F Cl -CH2CH3 -CH3 H 2 R H H H H H H H H CF3 H H H H Cl H H H H Cl H H H H H H H H H H H H H H H 3 R H -CH3 H H H H H H H -CH2CH3 -CH3 H H H H H H H H H H H H -CH3 H H H H H H H -CH2CH3 -CH3 H 19 4 R Br H F F Br H F Br H H H H F H Br H F F H H Cl Br Br H Cl F Br H F Br H H H H 5 R Cl -CH3 Cl Cl Cl -OCF3 Cl Cl Cl -CH2CH3 -CH3 -OCF3 Cl Cl Cl -CF3 Cl Cl CF3 CF3 Cl Cl Cl -CH3 Cl Cl Cl -CF3 Cl Cl CF3 -CH2CH3 -CH3 -OCF3 6 R H -CH3 -CH2CF2H CH3 CH3 H H -CH2CF2H -CH2CF2H H -CH2CF2H H -CH2CF2H -CH2CF2H -CH2CF2H -CH3 -CH2CF3 -C CH -CH2CF2H -CH2CF2H -CH2CF2H -CH2CF2H H -CH3 -CH2CF2H CH3 CH3 -CH2CF2H H -CH2CF2H -CH2CF2H H -CH2CF2H H 7 R OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH -O(C=O)-Et -O(C=O)-iPr -O(C=O)-tBu -O(C=O)-tBu -O(C=O)-iPr -O(C=O)-iPr -O(C=O)-tBu -O(C=O)-iPr -O(C=O)-iPr O(C=O)-iPr -O(C=O)-Et -O(C=O)-iPr UA 107184 C2 2 R 3 1 R 7 R R A 1 4 N N O S R 5 R O 6 R Таблиця В. Сполуки 3.1 – 3.6 Сполука 3.1 (B) 3.2 (C) 3.3 (D) 3.4 (X) 3.5 (AN) 3.6 1 1 A 2 R CF3 H Cl Cl H CF3 N N N N N N 3 R H H H H H H 4 R 5 R H Cl H H Br H R H H H Cl H Cl Cl Cl CF3 Cl CF3 H 6 R -CH2CH3 -CH3 -CH2CF2H -CH2CF2H -CH2CF2H -CH2CF2H 7 R OH OH OH OH OH -O(C=O)-iPr 2 R 3 1 R R OH N 4 R 5 R N 6 R 5 Таблиця Г. Сполука 4.1 Сполука 4.1 (4) 1 2 R F 3 R 4 R H H F 2 1 R OH N 1 4 R 5 N O N 6 R 20 R 6 R Cl R A 5 R R CH3 UA 107184 C2 Таблиця Д. Сполука 5.1 Сполука 5.1 (Z) A1 R1 N R2 Cl R4 H 3 O H R5 Cl R6 -CH2CF2H R 4 R 1 R N 5 N O R 2 R Таблиця Е. Сполука 6.1 Сполука 6.1 (AO) 5 10 15 20 25 30 35 40 R1 -CH3 R2 -CH3 R3 -CH3 R4 -CH3 R5 -CH3 Приклад 1. Клонування і експресія рослинних ферментів HST у клітинах комах і E.coli Повнорозмірні кодуючі послідовності HST (мінус стартовий кодон ATG) ампліфікували з фланкуючими сайтами EcoRI з бібліотек кДНК Аrabidopsis (SEQ ID NO: 11) і рослин рису (SEQ ID NO: 12 або SEQ ID NO: 13) або створювали методом синтезу. Як вказані повнорозмірні, так і вкорочені кодуючі послідовності (які кодують зрілі послідовності, які починаються з ARG 64) Arabidopsis SEQ ID NO: 21, рису SEQ ID NO: 22 і рису SEQ ID NO: 23) клонували у сайті EcoRI вектора pAcG3X (фірма BD Biosciences, каталожний № 21415Р), трансформували їм клітини комах Sf9 (Spodoptera fugiperda), а потім експресували в них (згідно описаному нижче методу) у вигляді злитих на N-кінці з GST білків, що мають сайт розщеплення фактором Xa. Аналогічно цьому SEQ ID NO: 24, тобто послідовність ДНК з оптимізованим для клітин комах кодонами, яка кодує альтернативний вкорочений зрілий (ARG 69) HST Arabidopsis, клонували у сайті EcoR1 вектора pAcG3X і експресували у Sf9-клітинах у вигляді злитого на N-кінці з GST білка. Послідовність HST Arabidopsis зареєстрована в SWISSPROT (білок) під номером Q1ACB3, а послідовність HST Arabidopsis (ДНК) зареєстрована в EMBL під номером DQ231060. У іншому варіанті зрілі послідовності, кодуючі HST Arabidopsis і Chlamydomonas, клонували у вигляді злитих з GST на N-кінці ферментів і експресували в E.coli. Приклад 2. Вирощування клітин і одержання екстрактів ферменту HST E.coli. Клітини лінії BL21A1, експресуючі HST Arabidopsis або Chlamydomonas у вигляді злитих з GST на N-кінці білків вирощували, збирали, розщеплювали і одержували мембранні фракції, експресуючі HST. Наприклад, 1 нг рекомбінантної ДНК застосовували для трансформації BL21DE3-клітин з одержанням повністю індивідуальних колоній. Одну з таких колоній відбирали і застосовували для інокуляції отриманої протягом ночі культури у 100 мл бульйону Лурія (LB), доповненого канаміцином у кінцевій кінцінтрації 50 мкг/мл, вирощували при 37 °C , струшуючи при 220 об/хв. На наступний ранок 10 мл отриманої протягом ночі культури застосовували для інокуляції 1 л свіжого стерильного LB, доповненого канаміцином у кінцевій кінцінтрації 50 мкг/мл, вирощували при 37 °C, струшуючи при 220 об/хв до досягнення значення ОП (при 600 нм), що дорівнює 0,6, індукували шляхом додавання 0,1мМ ИПТГ і витримували для індукції при 15 °C протягом ночі. Клітини збирали центрифугуванням при 4600 об/хв протягом 10 хв при 4 °C і дебрис зберігали при -80 °C. Встановлено, наприклад, що з 1 л клітин можна одержувати приблизно 5 г клітинного дебрису у вологому стані. Потім клітинний дебрис E.coli ресуспендували у 25 мл 50мМ Трис, pH 7,5 доповненому не вміщуючою ЕДТК таблеткою інгібітора протеаз фірми Roche (одна таблетка в 200 мл буферу). 10 мл клітин лізували обробкою ультразвуком на кризі. Отримані лізовані клітини центрифугували при 3000×g протягом 10 хв для пелетирування клітинних ядер/дебрису і т.д. 10 мл супернатанту відсмоктували і центрифугували при 150000×g протягом 60 хв при 21 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4 °C. Вміщуючий мембрани дебрис ресуспендували в 2 мл вказаного вище буфера. Ці зразки зберігали у вигляді аліквот об'ємом 100 мкл при -80 °C, після чого розводили, додаючи гліцерин до 50 об.%. Експресуючими HST трансформуючими векторами на основі pAcG3X (які описані вище) незалежно один від одного котрансформували суспензію клітин Sf9 за допомогою батьківського бакуловірусного вектора FlashBac (фірма Oxford Expression Technologies). Ампліфікацію бакуловірусу і експресію білка HST здійснювали згідно інструкціям виробника. Суспензійні клітинні культури Sf9 субкультивували при щільності 1,0×106 клітин/мл в 140 мл середовища Sf900II (фірма Invitrogen, каталожний № 10902) в 500-милілітрових колбах Ерленмейера. Після культивування протягом 24 г при 27ºC при струшуванні при 120 об/хв 6 оцінювали клітинну щільність і повторно доводили до щільності 2,0×10 клітин/мл в 140 мл. В колби з отриманою суспензією додавали певні об'єми ампліфікованого маткового розчину вірусу з відомим титром, одержуючи множинність зараження 10. Колби закривали і інкубували при 27ºC при струшуванні при 125 об/хв протягом 72 ч, даючи пройти відповідній експресії білка без клітинного лізису. Клітини збирали, розділяючи вміст колби порівну між трьома 50милілітровими пробірками Фалькон, і центрифугували при 900 об/хв протягом 4 хв. Середовище відкидали, залишаючи 3 мл клітинного дебриса, який швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80ºC Дебрис, отриманий з 25 мл Sf9-клітин (після індукції експресії протягом 4 днів), ресуспендували в 10 мл 50мМ Трис, pH 7,5, доповненого не вміщуючій ЕДТК таблеткою інгібітора протеаз фірми Roche (одна таблетка в 200 мл буфера) і вручну за допомогою гомогенізатора. Отримані лізовані клітини центрифугували при 3000×g протягом 10 хв для пелетирування клітинних ядер/дебриса і т.д. 10 мл супернатанта відсмоктували і центрифугували при 150000×g протягом 60 хв при 4 °C. Вміщуючий мембрани дебрис ресуспендували в 2 мл вказаного вище буфера. Ці зразки зберігали у вигляді аліквот об’ємом 100 мкл при -80 °C, після чого розводили, додаючи гліцерин до 50 об.%. Аналіз методом вестерн-блоттінга для моніторингу експресії здійснювали за допомогою інкубації з антитілом (Ат) до GST, конʼюгованим з HRP (фірма GE Healthcare, робоче розведення 1:5000) з наступною оцінкою електрохемілюмінісценції (ECL) (фірма GE Healthcare). Препарати для аналізу ферменту HST приготовляли також безпосередньо зі свіжого рослинного матеріалу. Наприклад, одержували препарати ферменту HST зі шпинату. На першій стадії інтактні хлоропласти шпинату приготовляли із двох партій по 500 г свіжих листків бебішпинату (наприклад, які купували в секції салатів у місцевому супермаркеті). Попередньо упакований шпинат, як правило, є вже промитим, але при покупці неупакованих листків їх слід промивати водою перед обробкою. Стебла, великі листи і центральні жилки видаляли. Кожну партію по 500 г листків додавали в 1,5 л «середовища для здрібнювання» в 2-літровій пластиковій склянці. Середовище для здрібнювання являло собою охолоджений (4ºC) вміщуючий 50мМ тріцін/ NaOH буфер, pH 7,1, вміщуючий 330мМ глюкозу, 2мМ ізоаскорбат натрію, 5мМ MgCl2 і 0,1% бичачого сироваткового альбуміну. Склянка, витриману при 4ºС, поміщали в змішувач типу Polytron 6000, оснащенний ріжучою 1,5-дюймовою головкою, і суміш перемішували короткими імпульсами по 5-8 з аж до 8-10K об/хв до мацерації всіх листків. Гомогенат фільтрували в 5-літрову склянку (занурений у посудину з кригою) через 4 шари мусліну і 2 шари найлонового полотна з розміром отворів 50 мкм. Фільтрат переносили в 250милілітрові посудини центріфуги Beckman GS-6 і обертали при 200×g (3020 об/хв) протягом 2 хв при 4ºC. Супернатант зливали і відкидали, залишаючи осад хлоропластів. Хлоропласти ресуспендували з декількох мл холодного ресуспендуючого середовища шляхом обережного обертання і обережно застосовували для цієї мети змочену щітку з пташиного пера в ресуспендуючому середовищі. Ресуспендуюче середовище являла собою 50мМ Hepes/ KOH, pH 7,8, вміщуючий 330мМ сорбіт, 2мМ ЕДТК, 5мМ KH2PO4, 2мМ MgCl2 і 0,1% бичачого сироваткового альбуміну, і його застосовували при 4ºC. Хлоропласти ресуспендували в 5-10 мл ресуспендуючого буфера, повторно центрифугували і знову ресуспендували для відмивання. Потім хлоропласти один раз знову центрифугували і розщеплювали шляхом ресуспендування приблизно в 5 мл буфера 50мМ тріцін-NaOH, pH 7,8, до одержання кінцінтрації білка приблизно 40 мг/мл. Аліквоти розчину зберігали в замороженому вигляді при -80 °C. Цей ресуспендований продукт відтавали і застосовували безпосередньо для аналізу активності HST. В іншому варіанті хлоропласти одержували ресуспендуванням в буфере, що містить 50мМ Трис/HCl, pH 7,8, що включає 330мМ сорбіт (альтернативний ресуспендуючий буфер) і нашаровували на верхню частину градієнта перкола (той же буфер, вміщуючий 45% перкола), обертали, відбирали фракцію інтактних хлоропластів і відмивали 2 або 3 рази в альтернативному 22 UA 107184 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ресуспендуючому буфері і потім знову обертали, ресуспендували в буфері для розщеплення (без сорбіту), швидко заморожували і зберігали у вигляді аліквот при –80ºC. Приклад 3. Аналіз ферментів HST Активність пренілтрансферази (HST) оцінювали, визначаючи швидкість пренілірування [U14 C]гомогентізату з використанням фарнезілдифосфату (FDP) в якості донора пренілу. 14C14 гомогентізат одержували з C-тірозину за допомогою оксидази L-амінокислот і HPPD. Для оцінки інгібування сполуки розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО). Додавання ДМСО аж до 2 об.% не виявляло впливу на результати аналізу. В контрольні аналізи включали ДМСО в такій же кінцінтрації, що і в аналізи, включаючі інгібітор. У аналізовані зразки, що містять екстракти хлоропластів шпинату (кінцевий об'єм 100 мкл), входило аж до 2 мг хлоропластного білка, 50мМ тріцін-NaOH, pH 8,5, 50мМ MgCl 2, 200мкМ фарнезілдифосфат (FDP) і 26мкМ 14C-гомогентізат (167 dpm (число розпадів за хв)/пмоль). Аналізи здійснювали приблизно протягом 1 г при 28ºC. В дослідах по оцінці інгібуючої дії було встановлено, що галоксидин в кінцевій кінцінтрації 500 част./млн повністю інгібував реакцію. В альтернативному варіанті шляхом припинення реакції і екстракції розчинником в нульовий момент часу також одержували еталонне 100%-не вихідне інгібування. Ліпофільні продукти реакції екстрагували і аналізували в цілому згідно описаним в літературі методам. Рекомбінантний HST Chlamydomonas, експресований в мембранах E.coli, аналізували в стандартних реакційних сумішах з 200мкМ FDP і 100мкМ 14C-гомогентізатом (40 dpm/пмоль) в 50мM тріцін-NaOH, pH 8,5, 20мМ MgCl2. Реакції ініціювали, додаючи фермент, і здійснювали протягом ~ 20 хв при 28ºC. Рекомбінантні HST Arabidopsis і рису експресували в клітинах комах. Анализи здійснювали аналогично аналізам з використанням HST Chlamydomonas, за виключенням того, що температура аналізу становила 27ºC. Реакції припиняли, додаючи 300 мкл суміші розчинників (1:2, хлороформ:меанол) і 100 мкл 0,5% NaCl, обертали/змішували і центрифугували при 13000 об/хв за допомогою настільної центрифуги Епендорфа протягом 5 хв. 80 мкл нижньої фази екстракту вносили на пластину для ТШХ (силікагель 60, 20 см × 20 см) FLA3000-системи і розганяли протягом 35 хв в дихлорметані. Радіоактивність кількісно оцінювали за допомогою пристрою типу Fuji Phosphoimager і відповідну смузі інтенсивність використовували в якості кількісної міри рівня продукту. Смуги, відповідні окисненому і відновленому 2-метил-6-фарнезіл1,4-бензохінолу (MFBQ), ідентифікували і розраховували сумарну інтенсивність двох смуг (відповідних окисненому і відновленому продукту) для оцінки загальної кількості утвореного продукта MFBQ. Наприклад, встановлено, що питома активність, що складається з 8 пмоль MFBQ хв-1 мг-1 білка (23 пмоля) і 7 пмоль MFBQ хв-1 мг-1 білка (14 пмоль), характерна для злитого з GST вкороченого гена HST Arabidopsis (SEQ ID NO: 3), експресовуваного в мембранах клітин комах протягом 4 днів і 5 днів після трансфекції відповідно. Аналогічні результати відомі з літератури для експресовуваного в E. coli HST Arabidopsis. Активність експресовуваного в клітинах комах злитого з GST вкороченого HST рису (SEQ ID NO: 4) виявилася подібною. При експресії невкорочених кодуючих послідовностей HST у вигляді GST-злиттів також виявлена HST-активність. При експресії оптимізованого для клітин комах злитого з GST вкороченого HST Arabidopsis (SEQ ID NO: 23) виявлена приблизно в 3-10-раз більше висока питома активність порівняно з неоптимізованими генами. Нижче представлені дані, отримані в описаних вище аналізах, відносно відсотка інгібування кількості MFBQ, що утворився, при використанні різних доз інгібіторів щодо кількості в контролі без інгібітору (таблиця 1). Більш ефективні інгібітори забезпечували більш високий відсоток інгібування при застосуванні в більш низьких дозах. Встановлено, що у всіх проаналізованих препаратах ферменту HST в описаних умовах реакції утворення MFBQ не є єдиною реакцією, каталізованою HST в присутності 14Cгомогентізата (HGA). Фактично основна частина (~90%) радіоактивномічених продуктів, 14 отриманих з C-HGA, не представляли собою MFBQ. Ці невідомі інші продукти також екстрагувалися хлороформом/метанолом, але при використанні дихлорметану для ТШХ встановлено, що вони залишаються на старті або знаходяться на хроматограмі поблизу вихідної лінії. Чотири видимі 14C – мічених смуги (ймовірно, відповідних двом парам хінон/хінол) частково розділялися при здійсненні ТШХ у другому направленні в суміші 12:3:5:0,5 дихлорметан:гексан:ацетонітрил:мурашина кислота. Ніякі вказані смуги не виявлені за відсутності FDP (або коли FDP заміняли на пірофосфат) і, ймовірно, смуги відповідали продуктам, що утворилися через те, що фарнезілірування і декарбоксілірування не є тісно зв'язаними; тобто фарнезілірування за відсутності декарбоксілірування приводить до одержання карбоксіліруваного MFBQ, а декарбоксілірування за відсутності фарнезілірування приводить до одержання метилхінолу/хінону). 23 UA 107184 C2 5 10 15 Незважаючи на їхню ідентичність, очевидно, що ці продукти є більш полярними, ніж MFBQ, вони всі є істинними продуктами каталізовуваної ферментом реакції, оскільки за відсутності FDP або при використанні аналогічних, але не трансгенних (не експресуючих HST) мембран вони не утворюються. Крім того, виявлено, що інгібітори, такі как галоксидин, інгібують утворення цих інших продуктів залежним від дози способом, що очевидно нагадує інгібування утворення MFBQ. Так, галоксидин в кінцінтрації 500 част./млн практично повністю інгібував каталізовувану ферментом HST реакцію і при цьому не відбувалося утворення ні MFBQ, ні будь-якого іншого продукту. Так, в покращеній, більш чутливій і зручній версії вищевказаного аналізу стадію ТШХ без обробки галоксидином в кінцінтрації 500 част./млн (або іншим інгібітором в прийнятній кінцінтрації) застосовували в якості «контролю» 100%-ного інгібування і частину хлороформ/метанольного екстракту вносили безпосередньо у флакон для сцинтиляційного лічильника і кількісно оцінювали. Ці аналізи здійснювали стандартним методом з використанням 100мкМ 14C-HGA, при 25ºC протягом