Білок, що зв’язує рецептор інтерферонів типу і (варіанти), днк, яка кодує цей білок (варіанти), та способи модулювання клітинної реакції на інтерферони

1. Молекула рекомбінантної ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує білок, що зв'язує рецептор інтерферонів типу І (IFNAR1), який здатний до індукування IFN- або IFN- і має амінокислотну послідовність № 2. 2. Молекула рекомбінантної ДНК за п. 1, причому згадана нуклеотидна послідовність є послідовністю № 1. 3. Молекула рекомбінантної ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує білок, що зв'язує IFNAR1, який здатний до індукування IFNабо IFN- і має амінокислотну послідовність № 8. 4. Молекула рекомбінантної ДНК за п. 3, причому згадана нуклеотидна послідовність є послідовністю № 7. 5. Молекула рекомбінантної ДНК за п. 1 або 3, яка додатково включає промотор, функціонально зв'язаний зі згаданою послідовністю, що кодує білок, який зв'язує IFNAR1, у смисловій орієнтації, завдяки чому згаданий промотор є здатним до експресії 2 (19) 1 3 75560 4 12. Молекула рекомбінантної ДНК за п. 11, де зга8, 9 і 11-14, до клітин тканини або органа, признадана нуклеотидна послідовність є сегментом 5'ченого для трансплантації пацієнтові, що потребує кінця послідовності № 7. цього; та 13. Молекула рекомбінантної ДНК, яка включає трансплантацію згаданої тканини або органа згамолекулу ДНК, що включає нуклеотидну послідовданому пацієнтові. ність № 1 з антисмисловою орієнтацією, або її 19. Спосіб підсилення реакції на терапію екзогенфрагмент, що здатний до гібридизування з мРНК, ним інтерфероном при лікуванні раку, який вклюяка кодує індукований інтерфероном білок, що чає такі етапи: зв'язує IFNAR1, і тим самим запобігає його експревведення фармацевтичної композиції, яка містить сії. експресійний вектор, що включає молекулу реком14. Молекула рекомбінантної ДНК, яка включає бінантної ДНК за п. 2 або 6, та фармацевтично молекулу ДНК, що включає нуклеотидну послідовприйнятний наповнювач, безпосередньо у пухлиність № 7 з антисмисловою орієнтацією, або її ну; та фрагмент, що здатний до гібридизування з мРНК, подальше проведення терапії екзогенним інтеряка кодує індукований інтерфероном білок, що фероном. зв'язує IFNAR1, і тим самим запобігає його експре20. Білок, що зв'язує IFNAR1, який має послідовсії. ність № 2. 15. Молекула рекомбінантної ДНК за будь-яким із 21. Білок, що зв'язує IFNAR1, який має послідовпп. 5, 8, 9, 11 і 12, причому згаданий промотор є ність № 8. промотором, що індукується інтерфероном. 22. Молекула, яка включає антигензв'язувальну 16. Молекула рекомбінантної ДНК за будь-яким із ділянку антитіла, специфічну для білка, що зв'язує пп. 1-14, яка є експресійним вектором. IFNAR1, за п. 20 або 21. 17. Клітина-хазяїн, здатна до експресії антисмис23. Молекула за п. 22, яка являє собою моноклолової РНК, комплементарної до смислової РНК, нальне антитіло. яка кодує індукований інтерфероном білок, що 24. Спосіб одержання білка, що зв'язує IFNAR1, зв'язує IFNAR1, причому ця клітина включає ексякий включає внесення ДНК за п. 1 до хазяїна, пресійний вектор за п. 16. який є придатним для експресії, так що при куль18. Спосіб продовження терміну життя тканинного тивуванні згаданого хазяїна забезпечується екстрансплантата, який включає такі етапи: пресія згаданого білка, та культивування згаданого введення експресійного вектора, який включає хазяїна таким чином, який забезпечує експресію молекулу рекомбінантної ДНК за будь-яким із пп. згаданого білка. Цей винахід, взагалі, має відношення до молекулярних механізмів дії інтерферону та, зокрема, до нових білків, які зв'язують рецептор 1 інтерферону, молекул рекомбінантної ДНК, яка кодує ці білки, та способів модулювання клітинної реакції на інтерферон. Інтерферони типу І (підтипи IFN- та - ) проявляють плейотропні ефекти відносно клітин, наприклад, інгібірування репліка дії вірусу (антивірусний ефект), інгібірування проліферації клітин (протипухлинні ефекти) та модулювання імунної активності клітин (імунорегуляторні ефекти). Ці численні ефекти інтерферонів (IFNs) корелюють з морфологічними та біохімічними модифікаціями клітин [Ревел (Revel), 1984, оглядова стаття]. Інтерферони здійснюють свою активність через видоспецифічні рецептори. У разі інтерферонів типу І. було ідентифіковано два трансмембранні рецепторні ланцюги: IFNAR1 [Юз (Uze) та інші, 1990] та IFNAR2-2 [або IFNAR2-C, Доманскі (Domanski) та інші, 1995]. Трансдукція сигналу, генерованого IFN- , , залучає білок тирозинкіназу з сімейства кіназ Janus (Jak) та транскрипційні фактори сімейства Stat [Дарнелл (Darnell) та інші, 1994]. Білки шляхів Jak-Stat активуються шляхом зв'язування з інтрацитоглазматичними (ІС) ділянками рецепторних ланцюгів IFNAR1 та IFNAR2. До білків, які зв'язуються з IFNAR1 1С ділянкою, належать tyk2 та Stat2 [Абрамович (Abramovich) та інші, 1994]. Після цього Stat2 рек рутує Stat1 до утворення IFN-індукованого транскрипційного комплексу ISGF3, який активує IFNіндуковані гени [Лунг (Leung) та інші, 1995]. Транскрипційні комплекси, до складу яких входить Stat3, також індукуються IFN- [Герроч (Harroch) та інші, 1994]; спостерігали IFN-залежне зв'язування Stat3 з IFNAR1-IC [Янг (Yang) та інші, 1996]. Протеїнтирозинфосфатаза РТР1С та D зворотне пов'язуються з IFNAR1 у разі - додання IFN [Девід (David) та інші, 1995а]. На додаток до цього, дві серин/треонінпротеїнкінази, ERK2 МАР кіназа (48кДа) [Девід (David) та інші, 1995b] та цАМФ, активували протеїнкіназу А [Девід (David) та інші, 1996], зв'язану з ізольованими близькими до мембрани 50 залишками IFNAR1-IC. Таким чином, ІС ділянки рецептору IFN типу І служать як сайти "причалювання" для численних білків, які служать для генерування та регулювання біологічних ефектів IFNs на клітини. Двогібридний скринінг у дріжджей є дієвим способом індентифікування нових білків, які зв'язуються з визначеними поліпептидними послідовностями [Фідцз (Fields) та Сонг (Song), 1989]. Стисло, двогібридний скринінг здійснюють шляхом трансфектування дріжджових клітин (а) плазмідною ДНК, визначений поліпептид якої ("затравка") злито з ДНК-зв'язувальною ділянкою транскрипційного фактору Gal4, та (b) кДНК бібліотекою, злитою з активаційною ділянкою Gal4 у рАСТ плазміді. Після цього дріжджові клітини, трансфекто 5 75560 6 вані кДНК, яка кодує білок, який зв'язується зі згаНа Фігурі 1 показано взаємодію IR1B1 зі згададаною поліпептидною "затравкою", відновлюють ною IFNAR1-ІС ділянкою за результатами вимірів активність згаданого Gal4. Присутність такого білза допомогою аналізів двогібридної генетичної ку, який зв'язує згадану поліпептидну "затравку", взаємодії у дріжджах. У обмеженій рамкою нижній виявляється експресією ферментної активності, частині згаданої фігури зазначено інсерційні сегменти кДНК у рАСТ у комбінації з різними "затравнаприклад, -галактозидази, з генно-інженерної ками". конструкції GAL1-lacZ, яку, за переважним варіанНа Фігурі 2 показано взаємодію IR1B4 зі згадатом, вводять до дріжджового геному. З дріжджових ною IFNAR1-ІС ділянкою за результатами вимірів клонів, які виявляються позитивними у цій пробі, за допомогою аналізів двогібридної генетичної можна виділити плазміду рАСТ, визначити нуклеовзаємодії у дріжджах. У обмеженій рамкою нижній тидну послідовність її інсерційного сегменту та частині згаданої фігури зазначено інсерційні сегідентифікувати білок, який її кодує. Цей спосіб доменти кДНК у рАСТ у комбінації з різними "затравзволив ідентифікувати нові білки, які взаємодіють з ками". ІС ділянкою цитокінних рецепторів [Болдін (Boldin) На Фігурі 3 показано згадану нуклеотидну (Пота інші, 1995]. слідовність №1) та амінокислотну (Послідовність Цитування будь-якого документу у цій заявці №2) послідовності IR1B1. не повинно розглядатись, як признання того, що На Фігурі 4 показано гомологію та порівняльтакий документ належить до відомого рівня або ний аналіз первинної структури згаданої амінокисмає відношення до патентоздатності будь-якого лотної послідовності IR1B1 (Послідовність №2) зі пункту формули винаходу цієї заявки. Будь-яке згаданими амінокислотними послідовностями двох твердження щодо вмісту або дати будь-якого докальційзв'язувальних білків, кальцінейрину В (скокументу базується на інформації, що є доступна рочене позначення САLB; Послідовність №3) та заявникам на час подачі заявки, і не містить будькальтрактину (скорочене позначення CATR; Посякого визнання правильності такого твердження. лідовність №4). Ідентичні амінокислоти у IR1B1 та Цей винахід має відношення до двох нових CALB або між CALB та CATR показано символом людських білків, які у цьому описі було позначено "|", який розміщено між ними. Ідентичність між IR1B1 та IR1B4 та ідентифіковано, як білки, які IR1B1 та CATR, але не з CALB, показано симвозв'язують рецептор 1 IFN (IFNAR1), та до ДНК, яка лом ":", який розміщено між ними. Ділянки, познакодує два згадані білки. Кожен зі згаданих білків чені напівжирним шрифтом, представляють собою IR1B1 та IR1B4 взаємодіє з інтрацитоплазматичВF-відгалуження (спіраль-петля-спіраль) кальційзною (ІС) ділянкою IFNAR1 та опосередковує клів'язувальних ділянок. тинні реакції на інтерферон. На Фігурі 5 показано назерн-блотинги мРНК Цей винахід спрямовано на молекулу рекомбіIR1B1 та 18S рРНК (нижній рядок) клітин U266S нантної ДНК, до складу якої входить нуклеотидна мієломи людини, гібридизованих з кДНК IR1B1 та послідовність, яка кодує білок IR1B1 або білок прискорене та швидкоминуче індукування IR1B1 IR1B4, або їх фрагменти, а також на білки, які копісля обробки згаданих клітин за допомогою IFNдуються згаданою послідовністю. У молекулах 8 aбo IFN- впродовж 2 годин або 18 годин. Перрекомбінантної ДНК згадана нуклеотидна послідовність, яка кодує згаданий білок IR1B1 або згадаший зображений рядок представляє собою контний білок IR1B4, або їх фрагменти, функціонально роль без IFN-обробки через 2 години. зв'язана з промотором у значеннєвій або антизнаФігури 6А та 6В представляють собою смуги ченнєвій орієнтації. SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному Завдяки введенню згаданої молекули рекомгелі у присутності додецилсульфату натрію), на бінантної ДНК, до складу якої входить промотор, яких показано взаємодію in vitro IR1B4 з виділеною функціонально зв'язаний зі згаданою нуклеотидIFNAR1-1С ділянкою (Фігура 6А) та з клітинними ною послідовністю, яка кодує новий IFNAR1екстрактами мембран клітин U266S та U266R люзв'язувальний білок у згаданій значеннєвій орієндини (Фігура 6В). На Фігурі 6А згадані [35S]метіонінтації безпосередньо до пухлин, підсилюється реамічені трансляційні продукти з/без сигнальних кція на терапію екзогенним інтерфероном при ліIR1B4 in vitro транскриптів або імунопреципітувакуванні раку. лись (10мкл) за допомогою антисигнальних М2 На додаток до цього, цей винахід має також кульок (смуги 1 та 4), або реагували (50мкл) з глувідношення до способу продовження виживаності татіоновими кульками, сполученими з GST (глутатканинного трансплантату шляхом введення згатіон S-трансфераза), злитою з IFNAR1-IC ділянкою даної рекомбінантної молекули, до складу якої довжиною 100 амінокислот (смуги 2 або 5), або входить промотор, функціонально зв'язаний зі згасполученими лише з GST (смуги 3 та 6). Після інданою нуклеотидною послідовністю, яка кодує кубування впродовж ночі при температурі 4°С (кінновий IFNAR1-зв'язувальний білок або його фрагцевий об'єм 100мкл) згадані кульки промивали і менти, у антизначеннєвій орієнтації, до тканинного SDS (додецилсульфат натрію)-елюйовані білки трансплантату перед трансплантуванням пацієнкип'ятили за відновлювальних умов перед здійстові. ненням SDS-PAGE. На Фігурі 6В, клітини U266S Таким чином, цей винахід має також відно(смуга 1) або клітини U266R (смуга 2) екстрагували шення до фармацевтичних композицій, до складу за допомогою Brij буферу та антипротеаз [Абраяких входять такі ДНК, РНК або білок, та терапевмович (Abramovich) та інші, 1994] та 0,35мл (107 тичних способів їх застосування. клітин) інкубували з 75мкл [35S]метіонін-мічених Цей винахід має також відношення до антитіл, трансляційних продуктів сигнальних IR1B4 транскспецифічних до нових білків за цим винаходом. риптів впродовж ночі при температурі 4°С. Aнті 7 75560 8 IFNAR1 mAb (моноклональні антитіла) R3, імобілітипу 1 (IFN- , або ) та позначаються у цьому зовані на кульках протеїну G (25мкл), додавали описі, як IFN рецепторзв'язувальний білок 1 впродовж 2,5 години, промивали за допомогою Brij (IR1B1) та IFN рецепторзв'язувальний білок 4 буферу та піддавали SDS-елююванню, кип'ятили і (IR1B4). Згадану взаємодію цих двох нових білків з відновлені білки аналізували за допомогою SDSIFNAR1 було продемонстровано за допомогою PAGE. Було здійснено контроль за допомогою двогібридного генетичного тесту на дріжджах, де антисигнальних М2 кульок, як було зазначено пенаслідком трансфекції згаданого дріжджового реред тим (смуга 3). Згадані висушені гелі піддавали портерного штаму SFY526 [Бартел (Bartel) та інші, візуалізації на апараті Phosphor-Imager. На перших 1993] за допомогою кДНК IR1B1 або IR1B4, злитої трьох смугах Фігури 6А до згаданої трансляційної зі згаданою ділянкою активації GaІ4, була активреакції in vitro не додавали мРНК IR1B4. На трьох ність -галактозидази лише у тому разі, коли інших смугах Фігури 6А, мРНК, яка кодує IR1B4 IFNAR1-ІС ділянку (злиту зі згаданою ДНКбілок, злитий зі згаданим сигнальним білком, транзв'язувальною ділянкою Gal4) було використано, слювали у in vitro системі. як "затравку". На Фігурі 7 показано згадану нуклеотидну (ПоЗгадана послідовність кДНК IR1B1 кодує поліслідовність №7) та виведену амінокислотну посліпетид довжиною у 191 амінокислоту. За результадовність (Послідовність №8) IR1B4. тами комп'ютерних пошуків баз даних послідовноНа Фігурі 8 показано порівняльний аналіз перстей виявилось, що IR1B1 представляє собою винної амінокислотної структури IR1B4 (Послідовновий білок, який демонструє явно виражену гоність №8) та PRMT1 (протеїнаргінінметилтрансмологію, наприклад, кальційзв'язувальні ділянки фераза) (Послідовність №9) та їх відмінності. (E-F відгалуження), до згаданих кальційзв'язуваНа Фігурі 9 показано порівняльний аналіз перльних білків, кальцінейрину та кальтрактину. винної амінокислотної структури IR1B4 та НСР-1 Кальцінейрин [Геріні (Guerini) та інші, 1989] (Послідовність №10) та їх відмінності. представляє собою субодиницю (19кДа) сеНа Фігурі 10 показано метилтрансферазний рин/треонінфосфатази, яка відіграє ключову роль аналіз. Екстракт клітин U266S реагував з кулькау активації транслокації транскрипційного фактору ми, які було покрито Протеїном А та анти-IFNARl NFAT до ядра Т-лімфоцитів і яка пригнічується антитілом (смуга 1) або лише Білком А (смуга 2). імуносупресорними лікарськими засобами, наприМетилтрансферазну активність вимірювали шляклад, циклоспорином. Кальтрактин [Лі (Lee) та 14 хом мічення гістонів С(метил)-SХанг (Huang), 1993], білок масою 21кДа, представаденозинметіоніном та аналізували радіоактивляє собою пов'язаний з цитоскелетом білок, який ність у згаданій гістоновій смузі за допомогою знаходиться у центросомах та є залученим до пеSDS-PAGE. реміщення хромосом під час мітозу та, у більш На Фігурі 11 показано аналіз протеїнаргінінмезагальному плані, знаходиться у центрах організатилтрансферазної активності у клітинах U266S. На ції мікроканальців. Таким чином, згаданий новий смузі 1 згадану протеїнаргінінметилтранеферазну білок IR1B1 представляє собою новий член згадаактивність людських клітин U266S вимірювали ного кальцінейринового та кальтрактинового сішляхом метилування пептиду R1, який має Послімейства кальційрегульованих білків. довність №11. На смузі 2 додавали антизначеннєПодив викликало відкриття того, що згаданий вий олігонуклеотид (Послідовність №12), комплеген IR1B1 швидко активується у людських клітинах ментарний до послідовності нуклеотидів 12-33 при обробці IFN. Таким чином, це є перший прикдовкола старт-кодону кДНК IR1B4. На смузі 3 долад кальційзв'язувального білку, який індукується давали відповідний значеннєвий олігонуклеотид. IFN. Оскільки іони кальцію регулюють морфологію, Видно, що згаданий антизначеннєвий олігонуклеоадгезію та поділ клітини, модулювання активності тид суттєво інгібірує згадану протеїнаргінінметилтIR1B1 у клітинах може впливати на реакцію норрансферазну активність, у той час, як згаданий мальних та злоякісних клітин на IFN. Згадана роль контрольний значеннєвий олігонуклеотид має неIR1B1 у опосередкуванні згаданої дії IFN у клітизначний ефект. нах підтримується взаємодією IR1B1 з ІС ділянкою Фігура 12 представляє собою графік, який порецепторного ланцюгу IFN. казує інгібірування росту людських клітин U266S у Одночасно з тим, що за результатами комп'ювідповідь на обробку IFN- у присутності або за терних пошуків баз даних послідовностей було відсутності згаданого антизначеннєвого олігонуквстановлено, що IR1B4, подібно IR1B1, є "новим леотиду, який було застосовано на Фігурі 11 (ASбілком, було виявлено також, що IR1B4 має гомо1), згаданого значеннєвого олігонуклеотиду (S-3) логію послідовностей з ферментами, які використа іншого антизначеннєвого олігонуклеотиду, товують S-аденозилметіонін для метилування арспрямованого до середини кДНК IR1B4 (AS-2). гінінових залишків у білках та позначаються, як Кількісне визначення густини клітин здійснювали протеїнаргінінметилтрансферази [PRMT1; Каган за допомогою колориметричного тесту з застосу(Kagan) та Кларк (Clarke), 1994; Лін (Lin) та інб і, ванням барвнику Alamar Blue (див. Приклад 7); 1996]. Було встановлено, що IR1B4 зв'язується відновлення густини клітин вираховували у вигляді безпосередньо зі згаданою ІС ділянкою IFNAR1 in відсотку необроблених контрольних лунок та наvitro і згадану конституційну асоціацію активності носили на криву у вигляді інгібірування росту. PRMT з IFNAR ланцюгом рецептору IFN- , , видіЦей винахід має відношення до відкриття двох леним з людських клітин, було продемонстровано нових людських білків, які взаємодіють зі згаданою шляхом метилування гістонів. У разі додання анінтрацитоплазматичною ділянкою (1С) згаданого тизначеннєвих олігодеоксинуклеотидів з кДНК IFNAR1 ланцюгу згаданого рецептору інтерферону IR1B4 до культур людських клітин, спостерігалось 9 75560 10 вичерпання активності PRMT у згаданих культурах мку ДНК та її транскрибованої значеннєвої РНК клітин. Клітини мієломи людини, які було піддано (мРНК). Експресія антизначеннєвої РНК, комплеобробці подібним чином, демонстрували значно ментарної до згаданої значеннєвої РНК, є могутнім знижену реакцію на IFN за результатами визнашляхом регулювання біологічної функції молекул чення інгібірування росту. Таким чином, РНК. Завдяки утворенню стабільного дуплексу між IR1B4/PRMT залучено до шляху, яким рецептор значеннєвою РНК та антизначеннєвою РНК, згаIFN викликає інгібірування росту пухлинних клітин, даний нормальний або значеннєвий транскрипт а також до інших функцій згаданого рецептору IFN. РНК перетворюється на такий, що позбавляється До відомих субстратів PRMT належить цілий ряд активності та не піддається трансляції. РНК та ДНК-зв'язувальних білків і, зокрема, гетеМолекули рекомбінантної ДНК, як втілення рологічні ядерні рибонуклеопротеїни (hnRNPs). цього винаходу, містять у собі кДНК IR1B1 або Згадані hnRNPs залучено до перенесення мРНК з IR1B4, або їх фрагментів, функціонально зв'язану ядра до цитоплазми, до альтернативного сплайз промотором зі значеннєвою або антизначеннєсингу перед-мРНК та посттранскрипційного контвою орієнтацією. Згаданий термін "промотор" ролю [Лю (Liu) та Дрейфус (Dreyfuss), 1995]. Відозначає дволанцюгову послідовність ДНК або повідно, кДНК нового людського IR1B4/PRMT та ΡНК, яка є здатною до зв'язування РНКбілок, які було відкрито внаслідок їх зв'язку зі згаполімерази та стимулювання транскрипції "функданим рецептором IFN, можуть бути використані ціонально зв'язаної" послідовності нуклеїнової для модифікування реакції людських або тваринкислоти. Таким чином, послідовність ДНК може них клітин на IFN. бути функціонально зв'язаною з промоторною поМолекула рекомбінантної ДНК, за цим винахослідовністю, якщо згаданий промотор є здатним до дом, включає нуклеотидну послідовність, яка коздійснення транскрипції згаданої послідовності дує білок IR1B1 або IR1B4, або їх фрагменти, і ДНК, незалежно від орієнтації згаданої послідовможе бути використана для підвищення клітинної ності ДНК. реакції на IFN шляхом підвищення експресії кДНК До типів промоторів, які використовуються для IR1B1 або IR1B4, або зниження згаданої клітинної контролювання транскрипції, можуть належати реакції на IFN шляхом зниження експресії білків будь-які з тих, які є функціональними у клітинахІЕ1В1 або IR1B4 молекулами антизначеннєвої хазяях/мішенях. До прикладів промоторів, функціРНК. ональних у клітинах ссавців, належать ранній проЗгадане підвищення експресії in vivo кДНК мотор SV40, аденовірусний головний пізній промоIR1B1 або IR1B4 було б придатним при лікуванні тор, тимідинкіназний промотор простого герпесу раку, де наслідком підвищення клітинної реакції на (HSV), промотор довгого кінцевого повтору (LTR) IFN було б зменшення росту злоякісних клітин та саркоми Рауса (RSV), безпосередній ранній пропідвищена реакція на терапію екзогенним IFN. Для мотор цитомегаловірусу (CMV) людини, промотор забезпечення підвищення експресії in vivo IR1B1 LЕR вірусу раку молочних залоз мишей (MMTV), та IR1B4 у цільовому місцезнаходженні з метою промотор інтерферону , промотор білку тепловопідвищення клітинної реакції на IFN, вектори ексго шоку 70 (hsp70), а також багато інших, добре пресії, до складу яких входить кДНК IR1B1 або відомих у цій галузі. IR1B4, функціонально пов'язана зі значеннєвою Промотором, функціонально зв'язаним з кДНК орієнтацією з сильним конституціональним промоIR1B1 або IR1B4 зі значеннєвою орієнтацією для тором, можуть впорскуватись безпосередньо до експресії білку IR1B1 або IR1B4, за переважним згаданого цільового місцезнаходження, наприваріантом, є сильний конституціональний промоклад, до пухлин головного мозку або метастатичтор. Це забезпечує можливість високого рівня них ракових вузликів (наприклад, меланома або IR1B1 або IR1B4 незалежно від присутності ендорак молочної залози). генних клітинних механізмів для регулювання ексІ, навпаки, зменшення експресії in vivo білків пресії IR1B1 або IR1B4. IR1B1 та IR1B4 було б придатним для продовженПодібним же чином, згаданим промотором, ня виживаності тканинних трансплантатів, оскільки функціонально зв'язаним з кДНК IR1B1 або IR1B4 відторгнення згаданих трансплантатів хазяїном з антизначеннєвою орієнтацією, є, за переважним опосередковується антигенами гістосумісності варіантом, сильний промотор, наприклад, промо(МНС класу І), синтезування яких залежить від тор, присутній на ділянці регулювання вірусу Епшзгаданого IFN стимулу. У разі, коли кДНК IR1B1 тейна-Барра (EBV), який забезпечує високі рівні або IR1B4, або їх фрагментів, яка переноситься експресії антизначеннєвої РНК [Дейсс (Deiss) та придатним вектором та є функціонально зв'язаною Кімчі (Kimchi), 1991]. з антизначеннєвою орієнтацією з промотором, Згадана антизначеннєва послідовність ексвводиться до клітин згаданої тканини, призначеної пресується, за переважним варіантом, лише у клідля трансплантування, експресія антизначеннєвої тинах-хазяях/мішенях, яка за переважним варіанРНК призводить до деградації мРНК IR1B1 або том, є людськими клітинами, і згадана IR1B4 (або значеннєвої РНК для IR1B1/IR1B4) та експресована антизначеннєва РНК повинна бути наступного зниження клітинних рівнів білку IR1B1 стійкою (тобто, не піддаватись прискореній деграабо IR1B4. дації). Згадана антизначеннєва РНК повинна лише Антизначеннєва РНК транскрибується з проспецифічно гібридизуватись зі згаданою значеннємотору 3'-5'-дирекційного типу, функціонально вою мРНК, експресованою клітинами хазяязв'язаного з кодувальною послідовністю, орієнтоми/мішенями, та утворювати стійку молекулу двованою у антизначеннєвому напрямку, тобто, проланцюгової РНК, яка, по суті, не піддається тилежно до нормального або значеннєвого напрятранслюванню. Іншими словами, згадана антина 11 75560 12 ченнєва РНК, експресована клітинами хазяятупово збільшується. Окрім антизначеннєвої посми/мішенями, запобігає транслюванню згаданої лідовності повної довжини можна утворити ряд експресованої значеннєвої мРНК до білків IR1B1 нерівномірно розміщених делецій, за переважним або IR1B4. Антизначеннєва послідовність, яка варіантом, на 5'-кінці згаданої антизначеннєвої входить до складу вектору, може нести повні поспослідовності. Це забезпечує утворення набору лідовність кДНК IR1B1 або IR1B4, або лише її часзрізаних протизначеннєвих послідовностей, які, як тину, доти, доки згадана антизначеннєва частина є і раніше, залишаються комплементарними до, за здатною до гібридизування зі значеннєвою мРНК переважним варіантом, 5'-кінця згаданої значеннєта запобігання її трансляції до білку IR1B1 або вої мРНК і, як наслідок, як і раніше, утворюють IR1B4. Відповідно, термін "антизначеннєва" послімолекулу РНК, яка є дволанцюговою на згаданому довність, який використано у цьому описі та пунк5'-кінці згаданої значеннєвої мРНК (доповнює 3'тах формули винаходу, визначається, як повна кінець згаданої антизначеннєвої РНК) та залишаантизначеннєва послідовність або її частина, яка є ється такою, що не піддається трансляції. Більше здатною до експресування у трансформоватого, антизначеннєві олігонуклеотиди, наприклад, них/трансфектованих клітинах, і яка є також здатолігонуклеотид AS-1 (Послідовність №12), можуть ною до специфічної гібридизації зі "значеннєвою" легко синтезуватись хімічним шляхом та вводимРНК IR1B1 або IR1B4 з утворенням молекули тись до вектору у функціональному зв'язку з продволанцюгової РНК, яка не піддається трансляції. мотором для застосування з метою зниження кліЗгадана антизначеннєва послідовність може тинної експресії in vivo білку IR1B1 або IR1B4. не гібридизуватись з повною довжиною мРНК Згаданими векторами за цим винаходом моIR1B1 або IR1B4. Замість цього, вона може гібрижуть бути будь-які придатні еукаріотичні або продизуватись з вибраними ділянками, наприклад, з каріотичні вектори, які за нормальних умов вико5'-нетрансльованою некодувальною послідовнісристовуються для трансфектування клітин ссавців, тю, кодувальною послідовністю або 3'наприклад, епісомні вектори, вектори, здатні до нетрансльованою послідовністю згаданої "значенреплікації та вектори, здатні до інтеграції до хронєвої" мРНК. За переважним варіантом, згадана мосом, які є добре відомі у цій галузі. Особливо антизначеннєва послідовність гібридизується з 5'переважним вектором для експресії антизначенкодувальною послідовністю та/або 5'нєвої РНК IR1B1 або IR1B4 є епісомна плазміда, некодувальною ділянкою, наприклад, на кепдо складу якої входить регуляторна ділянка вірусу сайтах та сайтах стартового кодону, оскільки на Епштейна-Барра [Дейсс (Deiss) та Кімчі (Kimchi), багатьох прикладах анти значеннєвих олігонукле1991], для використання у ролі промотору, функціотидів спостерігалось, що спрямована доставка онально зв'язаного з кДНК IR1B1 або IR1B4, розстартового кодону є більш ефективною, у той час, міщеною з антизначеннєвою орієнтацією відносно як спрямована доставка внутрішніх послідовносзгаданої регуляторної ділянки. Застосування антитей у межах згаданої кодувальної ділянки не має значеннєвих векторів та олігонуклеотидфосфоротакої ефективності [Вікстром (Wickstrom), 1991]. тіоатів згадується у [Annals of the New York of Ефективність антизначеннєвої послідовності щодо Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, під запобігання трансляції значеннєвої мРНК IR1B4 редагуванням Б.Ε. Губеру (В.Ε. Huber) та Дж.С. може бути легко перевірена за допомогою аналізу Лазо (J.S. Lazo), том 716, 1994 (наприклад, Мілліактивності протеїнаргінінметилтрансферази у кліген (Milligan) та інші, сторінки 228-241]. тинах U266S, як описано у Прикладі 7. Зважаючи За цим винаходом, виживаність тканин або орна розмір геному ссавців, довжина згаданої антизганів, трансплантованих пацієнту, який потребує наченнєвої послідовності IR1B1 або IR1B4 склатакого трансплантуванню, може продовжуватись дає, за переважним варіантом, як мінімум, 17, за шляхом зниження клітинної реакції на IFN. Відторбільш переважним варіантом, як мінімум, 30 пар гнення трансплантованої тканини опосередковуоснов. Однак, придатними можуть бути також ється антигенами гістосумісності, причому синтебільш короткі послідовності, які, наприклад, або зування згаданих антигенів МНС класу І залежить випадково не гібридизувались з іншими послідоввід IFN стимулу. Таким чином, зниження клітинної ностями ссавців, або така "перехресна гібридизареакції на IFN стимул збільшить виживаність транція" не впливає на метаболізм клітини таким чисплантованої тканини. Спосіб продовження вижином та на такому рівні, який перешкоджав би ваності тканинного трансплантату за цим винаходосягненню цілей цього винаходу. дом залучає введення до клітин тканини або Довжина як переважної гібридизаційної мішені органу, призначеного для трансплантування пацітак і переважної антизначеннєвої послідовності єнту, молекули рекомбінантної ДНК, до складу якої легко визначається систематичним експерименвходить послідовність кДНК IR1B1 або IR1B4, або том. Стандартні способи, опис яких наведено, наїх фрагменту, функціонально зв'язаної з промотоприклад, [Аусубелем (Ausubel) та іншими, редакром з антизначеннєвою орієнтацією, завдяки чому тори, Current Protocols in Molecular Biology, антизначеннєва РНК IR1B1 або IR1B4 експресувидавництво Greene Publishing Assoc., Нью-Йорк, ється у таких трансфектованих/трансформованих штат Нью-Йорк, 1987-1996, та Сембруком клітинах. Згадана молекула рекомбінантної ДНК (Sambrook) та іншими, Molecular Cloring: A може вводитись до згаданих клітин тканин і або Laboratory Manual, друге видання, видавництво органу будь-яким чином, добре відомим у цій галуCold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, штат зі і придатним для цієї мети. Після введення згаНью-Йорк (1989)], можна застосовувати для сисданої молекули рекомбінантної ДНК до клітин згатематичного видалення зі згаданого вектору порції даної тканини або органу, згадана тканина або згаданої антизначеннєвої послідовності, яка посорган можуть трансплантуватись пацієнту, який 13 75560 14 потребує такого трансплантату. або рекомбінантними методами. Фармацевтична композиція, до складу якої Поліклональні антитіла є гетерогенними попувходить молекула рекомбінантної ДНК, яка предляціями молекул антитіл, одержаних з сироватки ставляє собою вектор експресії та яка несе кДНК тварин, імунізованих антигеном. Моноклональні IR1B1 або IR1B4, функціонально зв'язану з промоантитіла включають суттєву гомогенну популяцію тором зі значеннєвою орієнтацією, може впорскуантитіл, специфічних до антигенів, причому згадаватись безпосередньо до пухлин, наприклад, пухна популяція включає, по суті, подібні епітопзв'ялин головного мозку та метастатичних пухлинних зувальні ділянки. Mabs можна одержати способавузликів, для того, щоб підвищити рівень реагуми, відомими досвідченим фахівцям у цій галузі. вання клітин цих пухлин на терапію екзогенним [Див., наприклад, Колер (Kohler). та Мільстайн IFN, як спосіб лікування раку. Наслідком підвище(Milstein), Nature, 256:495-497 (1975); патент США ного реагування клітин на терапію екзогенним IFN №4376110; Аусубель (AusubeІ) та інші, редактори, може бути інгібірування росту злоякісних клітин. див. перед тим, Харлоу (Harlow) та Лейн (Lane) Перенесення генів in vivo або ex vivo є добре ANTIBODIЕS: A LABORATORY MANUAL, Cold висвітлено у літературі, наприклад, у [Annals of the Spring Harbor Laboratory (1988); та Колліген New York Academy of Sciences: Gene Therapy for (Colligan) та інші, редактори, CURRENT Neoplastic Diseases, том 716, 1994; див., наприPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, видавництво клад, "Direct Gene Transfer for the Understanding Greene Publishing Assoc. та Wiley Interscience, and Treatment of Human Diserse", Г.Е. Плаутц (G.E. штат Нью-Йорк 1992, 1993]; згадані довідкові джеPlautz), сторінки 144-153, та "Mechanisms of Action рела включено до цього опису у повному об'ємi, як of the p53 Tumor suppressor and Prospects for посилання. Такі антитіла можуть належати до імуCancer Gene Therapy by Reconstitution of p53 ноглобулінів будь-якого класу, у тому числі, IgG, Function", Ремер (Roemer) та інші, сторінки 265IgM, IgE, IgA, GILD та будь-якого їхнього підкласу. 282]. Способи введення молекул рекомбінантної Гібридома, яка продукує mAb за цим винаходом, ДНК до клітин тканини або органу, призначеного може культивуватись in vivo, і in situ або in vivo. для трансплантування, або пухлини, включають Переважним способом продукування на цей час є вектори на основі аденовірусу, ретровірусу, адепродукування mAbs з високим титром in vivo або in новірус-асоційованого вірусу (AAV), а також безsitu. посереднє впорскування ДНК або впорскування Химерними антитілами є молекули, різні діляолігонуклеотиду-ліпосоми. Добре відомі клінічні нки яких було одержано від тварин різних видів, випробування, під час яких вектори на основі ретнаприклад, химерні антитіла, які мають варіабельровірусу впорскували до пухлин головного мозку ну ділянку, яку було одержано з мишачих mAb, та або аденовірус застосовували для інфікування людську імуноглобулінову константну ділянку. Хиклітин верхньої ділянки дихального тракту пацієнмерні антитіла застосовують, головним чином, для ту з фіброзно-кистозною дегенерацією. зниження імуногенності під час застосування та Фармацевтичні композиції, до складу яких для підвищення виходу при продукуванні, напривходить молекула рекомбінантної ДНК, яка кодує клад, коли мишачі mAbs мають більш високий викДНК IR1B1 або IR1B4, або їх фрагменту, зі знахід з гібридом, однак підвищену імуногенність у ченнєвою або антизначеннєвою орієнтацією відлюдей, завдяки чому використовують людсьносно функціонально зв'язаного промотору, є прикі/мишачі химерні mAbs. Химерні антитіла та спозначені до включення усіх композицій, які містять соби їх продукування є відомими у цій галузі [Камолекулу рекомбінантної ДНК у кількості, ефектибіллі (Саbillу) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA вної для досягнення призначеної мети. На додаток 81:3273-3277 (1984); Моррісон (Morrison) та інші, до цього, до складу згаданих фармацевтичних Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); композицій можуть входити придатні фармацевтиБуліанн (Boulianne) та інші, Nature 312:643-646 чно прийнятні носії або наповнювачі, які стабілізу(1984); Кабіллі (Cabilly) та інші, заявка на європають згадану молекулу рекомбінантної ДНК або тент 125023(опубліковано 14 листопада 1984 рополегшують її зведення. ку); Ньюбергер (Neuberger) та інші, Nature 314:268Інше втілення цього винаходу спрямовано на 270 (1985); Танігачі (Taniguchi) та інші, заявка на молекули, які включають антигензв'язувальну дієвропатент 171496 (опубліковано 19 лютого 1985 лянку антитіла, специфічного для IFNAR1року); Моррісон (Morrison) та інші, заявка на євро зв'язувальних білків IR1B1 або IR1B4, або їх фрапатент 173494 (опубліковано 5 березня 1986 року); гментів, для застосування у діагностиці, наприНьюбергер (Neuberger) та інші, заявка РСТ WO клад, для імунологічного аналізу рівня білків IR1B1 8001533 (опубліковано 13 березня 1986 року); Каабо IR1B4 у пухлинній тканині, яку було одержано до (Kudo) та інші, заявка на европатент 184187 шляхом біопсії, абο для використання під час очи(опубліковано 11 червня 1986 року); Моррісон щення згаданих білків засобами афінної хроматог(Morrison) та інші, заявка на європатент 173494 рафії. (опубліковано 5 березня 1986 року); Сахаген Термін "антитіло" включає поліклональні анти(Sahagan) та інші, J. Immunol. 137:1066-1074 тіла, моноклональні антитіла (mAbs), химерні (гіб(1986); Робінсон (Robinson) та інші, міжнародна ридні) антитіла, антиідіотипові (анти-Id) антитіла, заявка WO 9702671 (опубліковано 7 травня 1987 одноланцюгові антитіла та рекомбінантно продуроку); Лю (Liu) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ковані гуманізовані антитіла, а також їх активні 84:3439-3443 (1987); Сан (Sun) та нші, Proc. Natl. фракції, одержані будь-якими відомими способаAcad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Беттер (Better) ми, наприклад, але ними не обмежуючись, ферта інші, Science 240:1041-1043 (1988); та Харлоу ментативним розщепленням, пептидним синтезом (Harlow) та Лейн (Lane) ANTIBODIES: A 15 75560 16 LABORATORY MANUAL, див. перед тим]. яка кодує поліпептидні структури VH та VL лгнцюгів, Антиідіотиповим (анти-Id) антитілом є антитіможуть здійснюватись відповідно до способів, ло, яке розпізнає унікальні детермінанти, пов'язані, опис яких наведено, наприклад, у патентах США як правило, з антигензв'язувальною ділянкою ан№№4,946,778, 5,091,513 та 5,096,815. титіла. Id антитіло можна одержати шляхом імуніТаким чином, згаданий термін "молекула, яка зації тварини того ж самого виду та генетичного включає антигензв'язувальну ділянку антитіла" типу (наприклад, лінія мишей), що і джерело mAb, включає не тільки інтактні імуноглобулінові молеза допомогою mAb, до якого виготовляють анти-Id. кули будь-якого ізотипу та утворені лінією клітин Згадана імунізована тварина буде розпізнавати та будь-якої тварини або мікроорганізму, але також реагувати на ідіотипові детермінанти згаданого їхні реакційноздатні фрагменти, до яких належать, імунізаційного антитіла шляхом продукування анале ними не обмежуються, згаданий Fab фрагтитіла до цих ідіотипових детермінант (анти-Id анмент, згаданий Fab' фрагмент, згаданий F(ab')2 титіло). [Див., наприклад, патент США №4699880]. фрагмент, згадана варіабельна ділянка їхніх важЗгадане анти-Id антитіло може також викориских та/або легких ланцюгів та химерні або однолатовуватись, як "імуноген" для індукування імунної нцюгові антитіла, до складу яких входить така реавідповіді у ще іншої тварини з продукуванням так кційноздатна фракція, а також молекула або званого анти-анти-Id антитіла. Згадане анти-антиклітина будь-якого іншого типу, до якої була фізиId може бути епітопно ідентичним згаданому вихічно вставлена така реакційноздатна фракція, надному mAb, яке індукувало акти-Id. Таким чином, приклад, химерний рецептор Т-клітини або Тшляхом застосування антитіл до ідіотипових детеклітина, яка має такий рецептор, або молекули, рмінант mAb, можна ідентифікувати інші клони, які розроблені для доставки терапевтичних складових експресують антитіла ідентичної специфічності. за допомогою частини згаданої молекули, до Слід розуміти, що антитіла за цим винаходом складу якої входить така реакційноздатна фракція. можуть бути інтактними антитілами, наприклад, Після завершення повного опису згаданого моноклональними антитілами, але це саме епітопвинаходу, цей винахід буде легше зрозумілим зазв'язувальна ділянка згаданого антитіла, ще завдяки посиланню на представлені далі приклади, безпечує необхідну функцію. Таким чином, окрім які наведено з ілюстративною метою і які не приззгаданого інтактного антитіла, можна використовуначені для обмеження цього винаходу. вати його протеолітичні фрагменти, такі, наприПриклад 1: Два людські білки. IR1B1 та IR1B4, клад, як Fab або F(ab')2 фрагменти. Fab та F(ab')2 зв'язуються з рецептором IFN фрагменти не мають Fc фрагменту інтактного анФрагмент кДНК, який кодує ділянку IFNAR1-IC титіла, швидше виводяться з кровообігу і можуть у цілому, ампліфікований за допомогою полімерамати менший рівень неспецифічного зв'язування з зно-ланцюгової реакції за допомогою BamHlтканинами, аніж інтактне антитіло [Валь (Wahl) та значеннєвого праймеру інші, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)]. Такі фрагме(5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (Поснти, як правило, одержують шляхом протеолітичлідовність №5)) та EcoRI aнтизначеннєвого прайного розщеплення за допомогою таких ферментів, меру (5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (Послідовяк папаїн (для одержання Fab фрагментів) або ність №6)), було клоновано у векторі BlueScript пепсин (для одержання F(ab')2 фрагментів). (BS-SK+, компанія Stratagene). BamHI-Sall фрагНа додаток до цього, ДНК, яка кодує варіабемент з цього BS-IFNAR1-IC вводили до вектору льну ділянку згаданого антитіла, може вставляpGBT10 (компанія CloneTedh) та інфазно зливали тись до інших антитіл з метою утворення химерних після Gal4 зв'язувальної ділянки ДHК (pGBT10антитіл [див., наприклад, патент США №4816567) IFNAR1-IC) для двогібридного скринінгу. Згаданий або до рецепторів Т-клітин з метою одержання Тспосіб двогібридного скринінгу [Фіддз (Fields) та клітин з такою ж самою широкою специфічністю Сонг (Song) 1989] здійснювали за модифікованою [див. Ешар 3. (Eshhar Ζ.) та інші, Вг. J. Cancer процедурою Дарфі (Durfee) та інших (1993) з викоSuppl., 10:27-9, 1990; Гросс Г. (Gross G.) та інші, ристанням бібліотеки кДНК рАСТ плазміди з ВProc. Natl Acad. Sci. USA, 86:10024-8, 1989). Можлімфоцитів, трансформованих вірусом Епштейнана також продукувати та використовувати однолаБарра (EBV) людини для котрансформування ренцюгові антитіла. Одноланцюгові антитіла можуть портерного штаму Y153 дріжджів за допомогою бути одноланцюговими складними поліпептидами, pGBT10-IFNAR1-IC. Згаданий дріжджовий штам які мають антигензв'язувальні здатності та до Y153 має два репортерні гени під контролем GAL1 складу яких входить пара а амінокислотних посліактиваційної послідовності 3'-5'-дирекційного типу довностей, гомологічних або аналогічних згаданим (UAS), які транскрибуються лише у разі відновленваріабельним ділянкам легкого та важкого ланцюня активності Gal4 транскрипційного фактору. Для гу імуноглобуліну (зв'язані VН-VL, або одноланцюцього необхідно, щоб згаданий злитий білок, закоговий FV). Як VH, так і VL може копіювати послідовдований згаданою рАСТ плазмідою, яку було ввеності природних моноклональних антитіл; один дено до цього конкретного дріжджового штаму, або обидва згадані ланцюги можуть включати генмав афінність до згаданої IFNAR1-IC ділянку зі но-інженерну конструкцію CDR-FR такого типу, згаданої pGBT10 плазміди. Одним зі згаданих реопис якого наведено у патенті США №5,091,513. портерних генів є GAL1 His3, який забезпечує ріст Окремі поліпептиди, аналогічні згаданим варіабеу живильному середовищі, позбавленому гістидильним ділянкам згаданих легких та важких ланцюну; іншим згаданим репортерним геном є GALгів, утримуються разом за допомогою поліпептидLacZ, який забезпечує -галактозидазну активного лінкеру. Способи продукування таких ність. На додаток до цього, згадані рАСТ плазміди одиночних антитіл, зокрема, де є відомою ДНК, мають згаданий ген Leu2, а згадана pGBT10 плаз 17 75560 18 міда має ген TRP1, який забезпечує ріст у живильченням IR1B4 та IFNAR1-IC, не демонструвала ному середовищі, позбавленому лейцину та трипгалактозидазної активності. Таким чином, IR1B4 тофану, відповідно. Колонії відбирали у синтетичтакож є специфічно здатним до комбінування зі ному живильному середовищі SC мінус Тrр, Leu, згаданою ІС ділянкою згаданого IFNAR1 IFN рецеHis у присутності 25мМ 3-амінотриазолу (який допторного ланцюга. датково забезпечував відбір гістидинових протоПриклад 2: Послідовність білку IR1B1 демонтрофів). Після цього згадані колонії на стадії росту струє EF-відгалуження кальційзв'язувальних діляперевіряли на -галактозидазну активність шлянок хом аналізу за допомогою X-gal фільтру [Бріден Згаданий інсерційний сегмент кДНК згаданих (Breeden) та Нейсміт (Naysmith), 1985]. pACT-IR1B1 плазмід вирізували за допомогою реБуло одержано дев'ять позитивних дріжджостриктази ХhoІ, клонували до Bluescript BS-KS вих клонів; їхні рАСТ плазміди було виділено шлявектору та піддавали секвенуванню з промоторів хом трансфектування клонів НВ101 Е. соЇі та відТ7 та Т3 за допомогою набору DyeDeoxy бору leu+ трансформантів. Для кожної дріжджової Terminator Cycle Sequencing kit на сеrвенаторі ДНК було виділено два таких клони НВ101 Е. соЇі. 373А DNA Sequencer (компанія Applied Часткове секвенування ДНК згаданих рАСТ плазBiosystems). Найдовша плазміда мала послідовмід зі згаданих клонів Е. соІі показало, що вони ність з 830 нуклеотидів (Фігура 3) після Gal4 актирозподілялися на дві групи послідовностей кДНК, ваційної ділянки і у її межах було знайдено лінкерякі було позначено, як IR1B1 та IR1B4. Згадані ну послідовність згаданої рАСT плазміди та рАСТ плазміди груп IR1B1 та IR1B4 було піддано відкриту рамку зчитування з 191 амінокислоти (Фівипробуванням на специфічність шляхом котрангура 3). Пошук у реальному масштабі часу баз сформування згаданого дріжджового репортерноданих білків було здійснено за допомогою алгориго штаму SFY526 [Бартел (Bartel) та інші, 1993] за тму BlastP [Альтшуль (Altschul) та інші, 1990] та допомогою pAS плазмід, які включали lamin, cdk2 програми Bioaccelerator Alignment [Геніков та р53 або інші контрольні інсерційні сегменти (Henikoff) та Геніков (Henikoff), 1992]. Найвищу (компанія CloneTech). Колонії, які виросли у SC-trp, кількість балів одержали для кальтрактину [CATR HUMAN, номер доступу Swiss Protein SW New -leu, перевіряли на експресії) -галактозидази. Зі Р41208] з 62,1% схожості та 32,4% ідентичності від згаданих специфічно позитивних рАСТ плазмід амінокислот 52 до 173 та для кальцінейрину В інсерційні сегменти вирізали за допомогою Xhol, (CALB NAEGR, номер доступу Swiss Protein клонували до BS-KS (комланія Stratagene) та підP42322; CALB_HUMAN, номер доступу Р06705) з давали секвенуванню з Т7 та Т3 промоторів за 59,8% схожості та 32,5% ідентичності від амінокидопомогою набору DyeDeoxy Terminator Cycle слот 50 до 171. Sequencing Kit на секвенаторі 373А DNA На Фігурі 4 показано порівняльний аналіз перSequencer (компанія Applied Biosystems). винної структури IR1B1 з людським кальцінейриНа Фігурі 1 показано результати для рАСТ ном В (CALB) та кальтрактином (CATR). EFклону IR1B1, котрансфектованого до дріжджового відгалуження (спіраль-петля-спіраль) кальційзв'яштаму SFY526 з різними pAS або pGBT10 плазмідзувальних ділянок показано напівжирними та підкними "затравками". Дріжджові клітини росли у згаресленими літерами. IR1B1 має два сайти з EFданому елективному живильному середовищі SC відгалуженнями, але дві перші ділянки з EFtrp, -leu на штрихах 1-9 згаданого фільтру. Забарвідгалуженнями не є консервативними. IR1B1 повлення реактивом X-gal (5-бром-4-хлор-3-індолілказує гомологію як з кальцінейрином В (представ-D-галактопіранозид) було позитивним лише на лено вертикальними лініями на Фігурі 4), так і з штрихах 2 та 4. Як показано на Фігурі 1, штрих 4 є кальтрактином (представлено двокрапками на контрольним дріжджовим штамом з активним lacZ Фігурі 4). Зрозуміло, однак, що IR1B1 є новим та геном. Штрих 2 є комбінацією злитих білків IR1B1 відмінним людським білком, який раніше не було та IFNAR1-IC. Лише IR1B1 (штрихова культура 9) ідентифіковано. або будь-яка інша комбінація, за виключенням Приклад 3: IR1B1 є IFN-індукованим генним IR1B1 та IFNAR1-IC, не демонструвала продуктом Клітини U266S мієломи людини (прибгалактозидазної активності. Таким чином, IR1B1 є лизно, 3 106 клітин у 5мл суспензійних культурах) специфічно здатною до комбінування зі згаданою обробляли рекомбінантним IFN- 8 (2 108 МіжнаІС ділянкою згаданого IFNAR1 IFN рецепторного родних Одиниць/мг з бактерій) або рекомбінантланцюга. Подібним же чином, на Фігурі 2 показано реним IFN- (3 106 Міжнародних Одиниць/мг з клітин зультати для рАСТ клону IR1B4, котрансфектоваяєчнику китайського хом'яка (СНО)) у дозі 750 Міного до дріжджового штаму SFY526 з різними pAS жнародних Одиниць/мл впродовж 2 годин або 18 або pGBT10 плазмідними "затравками". Дріжджові годин. Після обробки за допомогою IFN згадані клітини росли у згаданомуелективному живильклітини збирали та екстрагували за допомогою Тrіному середовищі SC -tip, Іeu на штрихах 1-9 згареактиву (компанія Molecular Research Center, Циданого фільтру і забарвлення реактивом X-gal нциннаті, Огайо), який представляє собою пробуло позитивним лише на штрихах 3 та 7. Як покадукт, до складу якого входить гуанідину тіоціанат зано у нижній обрамованій частині Фігури 2, штрих та фенол. Екстраговану РНК осаджували за допо7 є контрольним дріжджовим штамом з активним могою етанолу, денатурували за допомогою форlacZ геном. Штрих 3 є комбінацією злитих білків мальдегіду, аналізували засобами електрофорезу IR1B4 та IFNAR1-IC. Подібно результатам, які буу формальдегід-агарозних гелях (10мкг РНК/лунку) ло одержано з IR1B1, лише IR1B4 (штрихова культа піддавали блотингу на установці GeneScreen тура 1) або будь-яка інша комбінація, за виклюPlus (компанія Dupont, New England Nuclear, 19 75560 20 Billerica, Массачусетс). Для здійснення назерн30°С. Згадані продукти перед використанням обблотингу було використано IR1B1 кДНК (106 імпуробляли за допомогою рибонуклеази. Згаданий льсів на хвилину), мічену за допомогою набору GST-IFNAR1-IC злитий білок було одержано шляRediprime kit (компанія Amersham, Великобритахом клонування BamHI-EcoRI, інсерцією BSнія), з застосуванням 32P-dCTP (дезоксицитидін-5'IFNAR1-IC (див. перед тим) до тих же самих ділятрифосфат) та довільним приміруванням. нок pGEX2 (компанія Pharmacia Biotech). GST та На Фігурі 5 показано, що IR1B1 кДНК гібридиGST-IFNAR1-ІС було експресовано у Е. соЇі та визувалась до РНК (1,1 тисячі пар основ). Кількість ділено у зв'язаному вигляді з глутатіонінIR1B1 мРНК значно зросла через 2 години після агарозними кульками (компанія Sigma). Антисигнальні М2 агарозні кульки було одеробробки клітин U266S за допомогою IFN- . Однаr, жано від компанії Kodak Scientific Imaging Systems. через 18 годин після обробки за допомогою IFN згадана IR1В1 мРНК зі згаданих клітин зникла, що Моноклональні ачтитіла IFNaR3 до згаданої свідчить про те, що одержана індукція є прискорекомпоненти згаданого IFN-рецептору (IFNАR1) ною та скороминущою. Багато IFN-індукованих були щедрим дарунком доктора О. Коламонікі (О. мРНК продовжують накопичуватись у згаданих Colamonici) та інших, 1990) і їх було використано у клітинах впродовж більше ніж 24 годин після оброзведенні 1:100. Кролячі антитіла до згаданого Сробки за допомогою IFN [Ревел (Revel) та Чебат кінцевого пептиду IFNAR1-IC (Аb 631) було одер(Chebath), 1986]. жано та використано для імунопреципітування Було перевірено, щоб однакова кількість РНК IFNAR1 з Brij екстрактів (0,75мл) 2 107 клітин була присутньою у кожній смузі. Як показано у U266S та U266R мієломи людини з антипротеазанижній частині Фігури 5, гібридизація тієї ж самої ми, як докладно вказувалось перед тим [Амбровіч U266S (багатих на IFN рецептори) РНК з 18S ри(Ambrovich) та інші, 1994], за виключенням того, босомним кДНК зондом виявила таку ж саму кільщо під час SDS-PAGE з mAb IFNaR3 було викорикість 18S рРНК у кожній смузі (показано лише часстано кульки протеїну G (компанія Pharmacia) і тину плями, де проходила 18S рРНК). У іншому аналізи проведено на установці Fujix BAS1000 експерименті з використанням 1200 Одиниць/мл Phosphor-Imager, як oписувалось перед тим [ГерIFN для індукування, IR1B1 мРНК також спостеріроч (Harroch) та інші, 1994]. галась з IFN- 8 через 2 години, але не через 30 Вперше було перевірено одержання білкового хвилин (не показано). продукту (приблизно, 32кДа) після імунопреципіБуло встановлено, що згадана IR1B1 мРНК тації згаданих трансляційних продуктів за допомомала той же самий розмір (1,1 тисячі пар основ) у гою антисигнальних антитіл (Фігури 6А та 6В). На різних клітинах людини (клітини U266, Daudi та Фігурах 6А та 6В, там де вказано застосування ТНР-1). Слід звернути увагу на те, що цей розмір є антисигнальних антитіл (позначкою +), це означає, близьким до розміру мРНК кальтрактину, але не що згаданий радіоактивний трансляційний продукт до розміру мРНК кальцінейрину В (2,5 тисячі пар мРНК згаданого сигнального злитого білку IR1B4 основ). Невеликий розмір згаданої мРНК відпові(транскрибованого in vitro з відповідної геннодає тому, що IR1B1 представляє собою невеликий інженерної конструкції на основі ДНК) вступав до білок з масою, яка становить, приблизно, 20кДа. реакції з антисигнальним М2 антитілом, зв'язаним Приклад 4: IR1B4 білок зв'язується з IFNAR1 in з агарозними кульками (продукт компанії Kodak vitro Scientific Imaging Systems). Згаданий трансляційЗв'язування IR1B4 зі згаданою ІС-ділянксю ний білок, який містив у собі IR1B4, злитий зі згаIFNAR1 перевіряли шляхом синтезування згаданоданою сигнальною амінокислотною послідовністю, го IR1B4 білку з білковою міткою (сигнальна послізв'язували зі згаданими антисигнальними антитідовність) з застосуванням трансляції in vitro у рельними кульками та після центрифугування згадатикулоцитарних лізатах та реагування згаданого них кульок згаданий білок елюювали за допомогою білку з рекомбінантним IFNAR1-IC злитим білком у SDS буферу та піддавали SDS-PAGE. Згадані реЕ. соЇі. Згадану pACT-IR1B4 ДНК з Прикладу 1, акції було використано, як контроль для демонрозрізану за допомогою Xhol та доповнену ферместрації присутності очікуваного злитого білку. нтом Кленова, клонували у згаданому РЕСЕ сигКульки глутатіон-сефарози (компанія Sigma), нальному векторі експресії [Елліс (Ellis) та інші, на яких було зв'язано глутатіон S-трансферазу 1986], який було розрізано за допомогою EcoRI та (GST), злиту з IFNAR1-IC, додавали до транслядоповнено. Згаданий Notl-BamHI фрагмент, який ційної реакційної суміші ретикулоцитарного лізату. включав злитий зі збереженням рамки зчитування Згадані кульки центрифугували та промивали і сигнальний білок IR1B4, поновно клонували у BSзгадані білки, зв'язані з GST кульками, вивільняли SK, який було розрізано за допомогою Nоtl-BamHI за допомогою додецилсульфату натрію (SDS 1%) у 5'-3' напрямку від згаданих ТЗ промоторів. Поста аналізували засобами електрофорезу у поліаклідовність згаданого сигнального злитого білку риламідному гелі у присутності додецилсульфату перевіряли шляхом секвенування зі згаданого ТЗ натрію (SDS-PAGE). Спостерігали, що згаданий промотору. Транскрипцію in vitro (набір Promega білок (32кДа), який було мічено за допомогою 358kit) здійснювали за допомогою згаданої ТЗ полімеметіоніну, був зв'язаний з GST-IFNAR1-IC, але не рази та 1мкг переведеної за допомогою ВатНІ до виключно з GST (Фігура 6А). Це демонструє, що лінійної форми ДНК BS сигнального IR1B4. ТрансIR1B4 зв'язується безпосередньо зі згаданою виляцію in vitro здійснювали у кролячих ретикулоциділеною IFNAR1-IC пептидною ділянкою. тарних лізатах (набір Promega kit) за допомогою Для перевірки того, що IR1B4 взаємодіє зі зга[35S]метюніну (компанія Amersham) та 5мкг транскданим IFNAR1 білком у тому вигляді, у якому він є риптів РНК впродовж 1 години при температурі присутнім у клітинних мембранах людини, детер 21 75560 22 гентні екстракти клітин U266 мієломи людини змігодини додавали кульки протеїну А (40мкл 50% шували з міченими 35S-метіоніном трансляційними реактиву ІРА-400 fast flow, компанія Repligen]. Згапродуктами IR1B4 мРНК з ретикулоцитарних лізадані кульки промивали та інкубували у 0,1мл 25мМ тів. Згаданий IFNAR1 білок імунопреципітували за Трис-буферу-НСІ, рН 7,5, 1мМ EDTA (етилендіамідопомогою моноклонального антитіла IFNaR3, нтетраоцтова кислота), 1мМ EGTA (етиленспецифічного до згаданого ектодомену IFNAR1 біс(оксоетиленнітрило)тетраоцтова кислота), [від Коламонікі (Colamonici) та інших, 1990]. Ре50мкМ (0,25мікроКюрі ) 14С-(метил)-S-аденозилзультати аналізу засобами SDS-PAGE показали метіоніну (компанія Amersham) та 100мкг гістонів присутність IR1B4 (32кДа) сигнальної смуги (Фігура (Тип ІІА з телячого тимусу, компанія Sigma) впро6В) у разі, коли детергентні екстракти походили від доdж 30 хвилин при температурі 30°С. МетилуванU266S (багатих на IFN рецептор), але не тоді, коли ня гістонів in vitro здійснювали за умов, опис яких вони походили від U266R клітин - лінії мутантних було наведено [Лін (Lin) та іншими (1996)]. Рівень радіоактивності у згаданій гістоновій смузі було IFN- , -резистентних клітин, деряватизованих з аналізовано після SDS-PAGE (15% акриламіду) та клітин U266, дефіцитних на IFN рецептори [Абраекспозиції у апараті Phosphor-Imager. Мічення згамович (Abra xiovich) та інші, 1994]. Згадана 32кДа даних гістонів 14С-метилом спостерігали з кулькасмуга спостерігалась також у разі, колу U266S ексми, які було покрито анти-IFNAR1, але не з культракти реагували з Аb 631 проти С-кінцевого пепками у згаданій контрольній реакції (Фігура 10). тиду IFNAR1 і IFNAR1 осаджували антисигнальТаким чином, білкова метилтрансферазна активним білком, коли Cos-7 клітини переносили за ність є конституціонально пов'язана зі згаданим допомогою flg-IR1B4 та людських IFNAR1 кДНК. Ці IFN рецепторним ланцюгом цих людських клітин. результат і демонструють, що IR1B4 специфічним Подібну ферментативну активність було виявлено, чином зв'язується з інтактним IFNAR1 з людських коли IFNAR1 було піддано імунопреципітуванню клітин. Приклад 5: IR1B4 кДНК та послідовності білків через п'ять хвилин після додання IFN- до згадаЗгадана послідовність нуклеотидів згаданої них U266S клітин. IR1B4 кДНК має відкриту рамку зчитування, яка Приклад 7: Залучення IR1B4/PRMT1 до дії IFN кодує білок довжиною у 351 амінокислоту (Фігура Антизначеннєвий олігодеоксинуклеотидфос7). Ця людська кДНК розпізнавала конституціонафоротіоат [Стайн (Stein) та інші, 1989], комплемельно експресовану полі-А+ мРНК (1,5 тисячі пар нтарний до згаданої послідовності нуклеотидів 12основ) у різних людських клітинах, у тому числі, у 33 довкола згаданого стартового кодону IR1B4 клітинах U266 мієломи. Пошук у реальному масшкДНК (AS-1, антизначеннєва послідовність 5'табі часу баз даних білків було здійснено за допоGGCTACAAAATTCTCCATGATG-3'; Послідовність могою алгоритму BlastP [Альтшуль (AltschuІ) та №12) було синтезовано хімічним шляхом. Згадані інші, 1990] та програми Bioaccelerator Alignment олігонуклеотидази додавали до U266S клітин, які [Геніков (Henikoff) та Γеніков (Henikoff), 1992] і було було висіяно на 96-лункові мікропланшети встановлено, що IR1B4 є унікальним членом про(8000клітин/лунку/0,2мл RPMI, 10% FCS (фетальтеїнаргінінметилтрансферазного сімейства. Згана сироватка телят)) з кінцевою концентрацією дана щуряча PRMT1 кДНК, опис якої було наведе10мкМ у день 0 з повторним доданням при 5мкМ у но [Лін (Lin) та іншими (1996, Genbank sequence день 2. IFN- додавали з розрахунку 64 або 125 I.D. 1390024; номер доступу U60882)], є гомологічМіжнародних Одиниць/мл у день 0. Через 3 дні ною лише на 81,4% за результатами аналізу за культивування до кожної лунки було додано 20мкл допомогою комп'ютерної програми ALIGN. На амібарвнику Alamar Blue, колориметричного індикатонокислотному рівні (Фігура 8) згадані IR1B4/PRMT ру густини клітин, принцип дії якого засновано на чітко відрізняються своєю аміно-кінцевою ділянкою реакції окиснення-відновлення (компанія від PRMT1, причому перші 19 амінокислот є повніBioSource, Camarillo, Каліфорнія), і інкубування стю відмінними. N-кінцева послідовність лише продовжували на протязі 6-7 годин. Колір вимірюIR1B4 не дала будь-яких свідчень на користь того, вали за допомогою мікропланшет-рідеру для твещо IR1B4 є гомологічним до PRMT1. Було встанордофазного імуноФерментного аналізу (ELISA) влено, що інший людський білок, опіс якого було (експериментальний фільтр 530нм, еталонний наведено, НСР-1 [Нікава (Nikawa) та інші, 1996; фільтр 630нм) з багаторазовим зчитуванням пономер доступу Genbank D66904] також є гомологідвійних лунок. Кореляцію кривих росту було перечним до IR1B4. Однак, НСР-1 має іншу амінокисвірено за кількістю живих клітин та шляхом визналотну послідовність від залишків 147-175 (Фігура чення оптичної густини. Для визначення 9). НСР-1 було спочатку ідентифіковано на основі метилтрансферази, клітини з об'єднаних лунок його здатності до доповнення мутації ire15 у дріжпіддавали лізису шляхом заморожуванняджів і його ферментативну функцію раніш не було відтаювання у 25мкл/лунку 25мМ Трис-буферуідентифіковано [Нікава (Nikawa) та інші, 1996]. НСІ, рН 7,4, 1мМ EDTA, 1мМ EGTA, 40мкг/мл лейТаким чином, IR1B4 є новим людським білком. пептину та апротиніну, 20мкг/мл пепстатину, 1мкМ Приклад 6: IR1B4 білок, зв'язаний з IFNАR1-IC. фенілметилсульфонілфториду (PMSF). Реакції має метилтрансферазну активність здійснювали у 50мкл об'ємі з 25мкл клітинних ексМетилтрансферазна активність може бути коітрактів, 100мкМ пептиду R1 [Найбауер (Najbauer) мунопреципітована з екстрактів людських клітин та інші, 1993; одержано від компанії Genosys, КемIFNAR1 рецептором. Brij-детергенті екстракти брідж, Великобританія], 3мікроКюрі [3Н](метил) SU266S клітин реагували впродовж ночі при темпеаденозилметіоніну (компанія Amersham, ратурі 4°С з/без анти-IFNAR1 антитіла Аb 631 [Аб73Кюрі/ммоль) впродовж 30 хвилин при темперарамович (Abramovich) та інші, 1994]. Впродовж 1 турі 30°С. Після електрофорезу у поліакриламід 23 75560 24 ному (16%) гелі у присутності додецилсульфату Інші білкові субстрати можуть піддаватись метилунатрію, фіксування у 50% метанолі, 10% оцтовій ванню через згаданий IFN рецептор, у тому числі інші компоненти згаданого IFN рецепторного комкислоті та обробки за допомогою Amplify (компаплексу та фактори транскрипції. Лін (Lin) та інші нія Amersham), впродовж 8 днів здійснювали авто(1996) спостерігали, що зв'язування щурячого радіографію. За результатами вимірів шляхом PRMT1 з білками, індукованими фактором росту, включення мічених радіоактивним тритієм метильактивує PRMT1 та модифікує його субстратну спених груп до згаданого R1 пептидного субстрату цифічність, можливо, шляхом видалення деяких (Фігура 11), ця AS-1 антизначеннєва ДНК була пригнічувальних білків, пов'язаних з PRMT1 у циздатною до різкого зменшення протеїнаргінінметоплазмі клітин. Можні, очікувати подібної ж актитилтрансферазної активності у U266S клітинах; її вації IR1B4, який зв'язано зі згаданим IFNAR1 ланбуло використано для дослідження ролі, яку може цюгом згаданого IFN рецептору. відігравати цей фермент у дії IFN. Активність пригВисновки нічення росту IFN було обрано тому, що її можна Наведено опис нового білку IR1B4, який взаєбезпосередньо кількісно визначати на клітинах і модіє з інтрацитоплазматичною ділянкою згаданотому, що спостерігали взаємодію щурячої PRMT1 го IFNAR1 ланцюгу рецептору інтерферону типу І. з пов'язаними з ростом генними продуктами [Лін Цей білок індукується дуже швидко і скороминуще (Lin) та інші, 1996]. Додання згаданого антизнапісля обробки людських клітин за допомогою JFN. ченнєвого-1 олігонуклеотиду AS-1, який є комплеIR1B1 характеризується присутністю EFментарним до згаданої послідовності довкола згавідгалужень (спіраль-петля-cпіраль), які є ознакою даного стартового кодону IR1B4/PRMT кДНК, кальційзв'язувальних білків. Перенесення іонів зменшувало ефект пригнічення росту IFN- на кальцію визначає механізм дії інтерферонів, зокU266S клітини мієломи людини (Фігура 12). Це рема, у разі початкових клітинних реакцій, змін означає, що у присутності антизначеннєвого AS-1 морфології клітини та організації цитоскелету оброблені IFN клітини демонстрували підвищену [Тамм (Tamm) та інші, 1987]. Ферменти, активовані швидкість росту (з виключенням будь-якого токсиіонами кальція, можуть продукувати вторинні мечного ефекту фосфоротіоатів). Відсутність IFN сенджери, наприклад, діацил-гліцерол, у відповідь незначно впливала на ріст. Згаданий значеннєвий на інтерферони. На додаток до цього, кальмодуліолігонуклеотид S-3, який відповідає тій же самій ноподібні білки регулюють кількість протеїнкіназ і ділянці кДНК, мав лише незначний ефект (S-3, спостерігали функціонування цих шляхів у клітин, Фігура 12), порівняно до антизначеннєвого-1. Знаякі було піддано обробці інтерфероном [Тамм ченнєвий S-3 також мав лише незначний пригнічу(Tamm) та інші, 1987]. Імовірно, що згаданий IFN вальний ефект на рівень ферментативної активрецепторзв'язувальний білок IR1B1 залучено до ності (Фігура 11). Інший антизначеннєвий таких Са++-залежних ефектів інтерферонів на кліфосфоротіоатний олігонуклеотид AS-2 (Послідовтини. ність №13), спрямований до середини згаданої За допомогою двогібридного скринінгу білків, кДНК та комплементарний до нуклеотидів 572-592 які взаємодіють зі згаданою IFNAR1-IC ділянкою, Послідовності №7, ефекту майже не мав (Фігура було ідентифіковано таакож інший білок IR1B4, 12). Майже п'ятикратне зниження ефекту пригніякий виявився членом протеїнаргінінметилтрансчення росту IFN на мієломні клітини, які було феразного сімейства ферментів [PRMT1; Лін (Lin) зроблено частково дефіцитними на активність та інші, 1996]. Відомо, що цей фермент метилує PRMT за допомогою антизначеннєвого-1 олігонукцілий ряд РНК та ДНК-зв'язувальних білків, зокрелеотиду, демонструє, що зв'язок згаданого ма, гетерологічні ядерні рибонуклеопротеїни IR1B4/PRMT ферменту зі згаданою 1С ділянкою (hnRNPs). Згадані hnRNPs залучено до перенезгаданого IFNAR1 рецептору має функціональне сення мРНК з ядра до цитоплазми, до альтерназначення для дії IFN на клітини. тивного сплайсингу перед-мРНК та посттранскриЦі експерименти продемонстрували також, що пційного контролю [Лю (Liu) та Дрейфус (Dreyfuss), згаданий IR1B4 білок метилює пептидні субстрати 1995]. Згадані IR1B1 та IR1B4/PRMT1 білки, які згаданого PRMT класу ферментів, наприклад, R1 "причалюють" до згаданої IFNAR1-IC ділянки, випептид Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly явили нові сигнальні механізми інтерферонів, які [Послідовність №11; Найбауер (Najbauer) та інші, існують разом з відомими Jak-Stat шляхами, опис 1993], який було використано у експерименті, який яких було наведено [Дарнеллом (Darnell) та іншиілюструється Фігурою 11. Метилування білків на ми (1994)]. аргінінових залишках поряд з гліциновими залишПісля завершення повного опису цього винаками (як, наприклад, у вищезгаданого пептиду) ходу, фахівцям у цій галузі буде зрозумілою можможе бути різновидом модифікування білків, яке, ливість здійснення того ж самого у широкому діаподібно фосфорилуванню, служить для передачі пазоні еквівалентних параметрів, концентрацій та сигналів до клітини. Згадана hnRNP група білків є умов і без відходження від духу та об'єму цього мішенню для PRMT ферментів, однак, оскільки ці винаходу та без непотрібного експериментування. білки впливають на процесинг, сплайсинг, трансУ той час, як цей винахід було описано у зв'язпортування та стабільність мРНК [Лю (Liu та ку з його специфічними варіантами втілення, слід Дрейфус (Dreyfuss), 1995], їхнє метилування може розуміти, що він є придатним для додаткових мовідігравати роль у посттранскрипційному контролі дифікацій. Ця заявка призначена для охоплення експресії генів. Згаданий IR1B4/PRMT білок, який будь-яких варіантів, застосувань або адаптацій було розкрито тут як такий, що зв'язується з ланзгаданого винаходу з наслідуванням, у цілому, цюгом згаданого IFN рецептору, може опосередпринципів цього винаходу та з включенням таких ковувати зміни у експресії генів у відповідь на IFN. 25 75560 26 відхилень від цього опису, які входять до відомої (B) Комп'ютер: IBM PC сумісний або звичної практики у тій галузі, до якої належить (C) Операційна система: PC-DOS/MS-DOS цей винахід, і які можуть бути віднесені до суттє(D) Програма: Patentln Release #1.0, версія вих викладених перед тим особливостей, що виті#1.30 кають з об'єму пунктів формули винаходу, яка до(vi) Дані про заявку: дається. (A) Номер заявки: US Усі цитовані у цьому описі довідкові джерела, (B) Дата подачі заявки: у тому числі журнальні статті або реферати, опуб(vii) Дані про попередні заявки: ліковані або відповідні заявки на патенти США або (A) Номер заявки: US 60/035,636 зарубіжні патенти, видані зарубіжні патенти або (B) Дата подачі заявки: 15 січня 1997 року патенти США, або будь-які інші довідкові джерела, (viii) Інформація щодо повіреного/агента включено до цього опису у повному об'ємі як по(представника): силання, з усіма даними, таблицями, фігурами та (A) Ім'я: Брауді Роджер Л. текстом, які представлено у цитованих довідкових (B) Реєстраційний номер:25 618 джерелах. На додаток до цього, до цього опису у (C) Номер діла/реєстру:Revel=14 РСТ повному об'ємі включено як посилання довідкові (іх) Інформація щодо зв'язку: джерела, які було згадано у довідкових джерелах, (A) Телефон: 202-628-5197 цитованих у цьому описі. (B) Телефакс: 202-737-3528 Посилання на етапи відомих способів, етапи (2) Інформація для послідовності №1: традиційних способів, відомі способи або тради(і) Характеристика послідовності: ційні способи ні у якому разі не є визнанням того, (A) Довжина: 830 пар основ що будь-який аспект, опис або варіант втілення (B) Тип: нуклеїнова кислота цього винаходу розкрито, описано або запропоно(C) Кількість ниток: одна вано у відповідній галузі. (D) Топологія: лінійна Наведений перед тим опис специфічних варі(іі) Тип молекули: кДНК антів втілення цього винаходу з такою повнотою (іх) Особливості: розкриває загальну природу згаданого винаходу, (A) Назва/ключ: CDS що інші можуть, з застосуванням професійних (B) Місцезнаходження: 43615 знань у цій галузі (у тому числі, вмісту наведених у (хі) Опис послідовності: Послідовність №1 цьому описі довідкових джерел), легко модифікувати та/або адаптувати для різних варіантів застосування згадані специфічні варіанти втілення, без непотрібного експериментування, без відходження від загальної концепції цього винаходу. Таким чином, припускається, що згадані адаптації та модифікації будуть знаходитись у межах значення та діапазоні еквівалентів розкритих варіантів втілення, з основою, яку буде становити вчення та настанови, наведені у цьому описі. Слід розуміти що застосована у цьому описі фразеологія або термінологія є призначеною лише для опису, а не для обмежень, завдяки чому згадана термінологія або фразеологія наведеного опису повинна витлумачуватись досвідченим фахівцем у світлі вчення та настанов, наведених у цьому описі, у поєднанні зі знаннями пересічного фахівця у цій галузі. Лістинг послідовності (1) Загальна інформація * (і) Заявник: Ревел, Майкл Чебат Джудіт Абрамович Кароліна (іі) Назва винаходу: Нові білки, які зв'язують рецептор 1 інтерферону, ДНК, яка кодує ці білки, та способи модулювання клітинної реакції на інтерферони (ііі) Кількість послідовностей: 13 (iv) Адреса для листування: (A) Адресат: Брауді та Неймарк (B) Вулиця: 419 Seventh Street, N.W., Suite 300 (C) Місто: Вашингтон (D) Штат: Округ Колумбія (Ε) Країна: США (F) Поштовий код (індекс): 20004 (ν) Форма, яка зчитується комп'ютером: (A) Тип носія: Гнучкий диск (2) Інформація для послідовності №2: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 191 амінокислота (B) Тип: амінокислота (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: Послідовність №2 27 (2) Інформація для послідовності №3: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 170 амінокислот (B) Тип: амінокислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: Послідовність №3 75560 28 (2) Інформація для послідовності №5: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 31 пара основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (хі) Опис послідовності: Послідовність №5 (2) Інформація для послідовності №6: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 25 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (хі) Опис послідовності: Послідовність №6 (2) Інформація для послідовності №4: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 172 амінокислоти (B) Тип: амінокислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: Послідовність№4 (2) Інформація для послідовності №7: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 1308 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Особливості: (A) Назва/ключ: CDS (B) Місцезнаходження: 16...1098 (хі) Опис послідовності: Послідовність №7 29 75560 30 (2) Інформація для послідовності №9: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 353 амінокислоти (B) Тип: амінокислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: Послідовність №9 (2) Інформація для послідовності №8: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 361 амінокислота (B) Тип: амінокислота (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: Послідовність №8 (2) Інформація для послідовності №10: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 360 амінокислот (B) Тип: амінокислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: Послідовність №10: 31 (2) Інформація для послідовності №11: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 10 амінокислот (B) Тип: амінокислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: Послідовність №1І: (2) Інформація для послідовності №12: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 22 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (хі) Опис послідовності: Послідовність №12: (2) Інформація для послідовності №13: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 21 пара основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Кількість ниток: одна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК 75560 32 (хі) Опис послідовності: Послідовність №13: 33 75560 34 35 75560 36 37 75560 38 39 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 75560 Підписне 40 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601