Спосіб спрямування клітинної імунної відповіді проти віл-інфікованої клітини ссавця,білковий мембранозв’язаний химерний рецептор,днк,яка кодує химерний рецептор,вектор,що її містить

1. Способ направления клеточного иммунного ответа против ВИЧ-инфицированной клетки млекопитающего, включающий воздействие на нее эффективного количества клеток, экспрессирующи х мембранносвязанный белковый химер-ный рецептор, содержащий (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, состоящий из аминокислот 1-200 последовательности № 31 42760 9. Химерный рецептор по п. 8, отличающийся тем, что фрагмент СD4 состоит из аминокислот 1394 или аминокислот 1-200. 10. Химерный рецептор по п. 8, отличающийся тем, что фрагмент CD4 отделен от внутриклеточной части трансмембранным доменом CD7, который характеризуется последовательностью № 35 рем или по меньшей мере расстоянием в 72 ангстрем. 12. Химерный рецептор по п. 8, отличающийся тем, что Т-клеточный рецептор представляет собой z. 13. Химерный рецептор по п. 8, отличающийся тем, что указанный рецептор включает в себя трансмембранную часть CD7, трансмембранную часть CD5 или трансмембранную часть CD34. 14. Химерный рецептор по п. 8, отличающийся тем, что фрагмент CD4 отделен от указанной клеточной мембраны одной или более белковыми альфа-спиралями. 15. ДНК, кодирующая химерный рецептор по п. 8. 16. Вектор, содержащий ДНК химерного рецептора по п. 15. или шарнирной областью и доменами СН2 и СН3 молекулы IgGI человека, характеризующимися последовательностью №33 11. Химерный рецептор по п. 8, отличающийся тем, что фрагмент CD4 отделен от мембраны клетки по меньшей мере расстоянием в 48 ангст Настоящее изобретение разработано при поддержке правительства по контракту № AI 27849, заключенному с Национальным Институтом Здоровья. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение. Настоящее изобретение относится к функциональным химерам фрагментов CD4 и рецепторов иммунных клеток, способным вызвать лизис ВИЧинфицированных клеток иммунными клетками, но не сообщающим иммунным клеткам восприимчивости к ВИЧ-инфекции. Таким образом, настоящее изобретение дает новое и эффективное средство против ВИЧ-инфекции. В основе ряда иммунных явлений лежит распознавание Т-клетками антигенов при помощи Тклеточных рецепторов. Т-клетки управляют системой, которая называется клеточным иммунитетом. Ее действие состоит в том, что клетки иммунной системы уничтожают чужеродные ткани или зараженные клетки. Существуют различные типы Т-клеток: хелперы и суппрессоры, которые модулируют иммунный ответ, и цитотоксические клетки (или киллеры), которые уничтожают аномальные клетки непосредственно. Т-клетка, распознавшая и связавшая уникальный антиген, проявившийся на поверхности другой клетки, становится активной; она приобретает способность размножаться и, если это цитотоксическая клетка, она может уничтожить связанную клетку. ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 году было выяснено, что ВИЧ является этиологическим фактором СПИДа. С тех пор определение СПИДа несколько раз пересматривалось в отношении того, какие критерии следует включать в диагноз. Однако, несмотря на непостоянство диагностических параметров, простым общим знаменателем СПИДа является заражение ВИЧ с последующим развитием стойких генерализованных симптомов и болезней, определяющих СПИД: вторичных инфекций, новообразований и неврологических расстройств (Harrison's Principles of Internal Medicine, 12 th ed., McGraw Hill (1991)). ВИЧ - это ретровирус человека из группы лентивирусов. Четыре известных ретровируса человека принадлежат к двум различным группам; это Т-лимфотропные (лейкозные) ретровирусы человека HTLV-1 и НТLV-2 и вирусы иммунодефицита человека, ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Вирусы первой группы трансформирующие, а вирусы второй гр уппы – цитопатические. ВИЧ-1 считается наиболее распространенным причинным фактором СПИДа в мире. Гомология последовательностей между ВИЧ-2 и ВИЧ-1 составляет около 40%; ВИЧ-2 состоит в более тесном родстве с некоторыми членами группы вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) (см.: Curran, J. et al., Science, 329: 1357-1359 (1985); Weiss, R. et al., Nature, 324:572-575 (1986)). В репликации и других биологических действиях ВИЧ участвуют обычные ретровирусные гены (env, gag и роl) и еще шесть генов. Как сказано выше, общим знаменателем СПИДа является сильное подавление иммунитета, преимущественно, клеточного. Это подавление иммунитета приводит к возникновению различных заболеваний - к поражению условно-патогенными микроорганизмами и развитию новообразований. Основной причиной ослабления иммунитета при СПИДе является количественный и качественный дефицит в подгруппе Т4 лимфоцитов вилочковой железы (Т-лимфоцитов). Фенотипически клетки этой подгруппы определяются как клетки с поверхностной молекулой CD4, которая как оказалось, является клеточным рецептором ВИЧ (Dalgleish et al., Nature 312:763 (1984)). Вирус иммунодефицита человека поражает в основном клетки типа Т4, но в принципе любая клетка, на поверхности которой экспрессируется молекула CD4, способна связаться с ВИЧ и заразиться им. Обычно клеткам CD4+ Т приписывают роль хелперов/индукторов, так как они подают сигнал об активации клеткам В или побуждают клетки Т с соответственным маркером CD8 к цитотоксическому/супрессорному действию (Reinherz and Schlossman, Cell 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68:5-42 (1982)). ВИЧ связывается специфически и с высокой аффинностью, при помощи последовательности аминокислот вирусной оболочки (gр120), с частью фрагмента V1 молекулы CD4, расположенного у ее аминоконца. После связывания вирус сливает 2 42760 ся с мембраной клетки-мишени и интернализируется. Оказавшись внутри клетки, он при помощи фермента обратной транскриптазы проводит транскрипцию своей геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в ДНК клетки, где существуе т на протяжении жизни клетки как "провирус". Провирус может оставаться в латентном состоянии, но может активироваться, транскрибировать мРНК и геномную РНК, синтезировать и собрать белок, образовать новый вирион и размножиться на поверхности клетки. Хотя точный механизм уничтожения клетки вирусом неизвестен, считается, что основным механизмом ее уничтожения является активное размножение вируса на ее поверхности, приводящее к разрушению плазматической мембраны и нарушению осмотического равновесия. В ходе заражения организм-хозяин вырабатывает антитела к вирусным белкам, в том числе к главным гликопротеинам оболочки gр120 и gр41. Несмотря на действие гуморального иммунитета, болезнь прогрессирует и заканчивается летальным подавлением иммунитета, которое характеризуется множественными вторичными инфекциями, паразитемией, слабоумием и гибелью. Неспособность антител хозяина остановить прогрессирование болезни является самой досадной и грозной ее особенностью и не дает оснований надеяться на успех вакцинации, проводимой с использованием традиционных способов. Действенность гуморального ответа на заражение вирусами иммунодефицита может зависеть от двух факторов. Во-первых, как и другие РНКвирусы (в частности, как ретровирусы), вирусы иммунодефицита сильно мутируют в ответ на иммунный контроль со стороны хозяина. Во-вторых, гликопротеины вирусной оболочки сами по себе являются сильно гликозилированными молекулами и на них мало эпитопов, подходящих для высокоаффинного связывания с антителами. Таким образом, оболочка вируса представляет собой плохую антигенную мишень, и хозяин не имеет возможности ограничить распространение вирусной инфекции за счет выработки специфических антител. Клетки, зараженные вирусом иммунодефицита человека, экспрессируют на поверхности гликопротеин gр120. Gp120 опосредствует слияние клеток CD4+, происходящее аналогично слиянию вируса с клеткой и приводящее к образованию недолговечных многоядерных гигантских клеток. Образование синцитиев зависит от непосредственного взаимодействия гликопротеина оболочки gр120 и белка CD4 (Dalgleish et al., там же; Klatzman, D. et al., Nature 312:763 (1984); McDougal, J.S. et al., Science 231:382(1986); Sodroski, J. et al., Nature 322:470 (1986); Lifson, J.D. et al., Nature 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 321:412 (1986)). К сведениям, говорящим в пользу того, что заражение вирусом клеток-носителей антигена CD4 обусловлено связыванием CD4-gpl20, относится то обстоятельство, что между gр120 и CD4 образуется специфический комплекс (McDougal et al., там же). Другие исследователи утверждают, что клеточные линии, невосприимчивые к ВИЧ-инфекции, были преобразованы в восприимчивые к ней линии путем трансфекции геном человека кДНК CD4 с последующей экспрессией этого гена (Maddon et al., Cell 46:333-348 (1986)). Несколько исследовательских коллективов (Deen et al.. Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al.. Nature 331:76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331: 78-81 (1988); Smith et al., Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)) предложили и успешно продемонстрировали в лабораторных условиях ряд терапевтических программ, предусматривающих использование растворимого CD4 в качестве пассивного средства противодействия адсорбции вируса и передаче его через синцитии; впоследствии были получены слитые белки из иммуноглобулина CD4 с более продолжительным временем полужизни и скромной биологической активностью (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)). Хотя конъюгаты, или слитые белки, иммунотоксина CD4 в лабораторных усло виях обладают сильной цитотоксичностью в отношении зараженных клеток (Chaundhary et al., Nature 335:369-372 (1988); Till et al., Science 242: 1166-1168 (1988)), скрытый характер синдрома иммунодефицита не позволяет надеяться на то, что какое-то одно лекарственное средство будет эффективным в облегчении бремени инфекции, а антигенные свойства чужеродных слиты х белков, скорее всего, ограничат их приемлемость для стратегий лечения, требующих и х неоднократного применения. Исследования с обезьянами, пораженными вирусом иммунодефицита обезьян, показали, что растворимый CD4, если вводить его обезьянам, у которых не наблюдается явный дефицит клеток CD4, может снизить титр вируса иммунодефицита (SIV) и улучшить миелоидный потенциал в лабораторных условиях (Watanabe et al., Nature 337:267-270 (1989)). Однако, по окончании лечения количество вирусов быстро восстанавливалось, а это говорит о том, что для предотвращения выхода иммунной системы из строя может потребоваться пожизненное применение лекарства. Т-клеточные рецепторы и рецепторы Fc Экспрессия на поверхности клетки наиболее распространенной формы Т-клеточных антигенных рецепторов (TCR) возможна за счет совместной экспрессии по меньшей мере 6 различных полипептидных цепей (Weiss et аl., J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 316: 606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)), цепей, связывающих антигены a/b, трех полипептидов комплекса CD3 и z. Если одна из этих цепей отсутствует, стабильная экспрессия остальных составляющи х комплекса не состоится. z является критическим полипептидом для поверхностной экспрессии всего комплекса (Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)) и считается, что она опосредствует хотя бы часть программ клеточной активации, запускаемых в результате распознавания лиганда рецептором (Weissman et al., ЕМВО J. 8 :3651-3656 (1989); Frank et al., Science 249:174-177 (1990)). z - это интегральный полипептид мембраны, гомодимер I типа с молекуляр 3 42760 ной массой 32 килодальтона, имеющий внеклеточный домен из 9 остатков, на котором нет участков для присоединения N-связанного гликана, и внутриклеточный домен из 112 (у мышей) или 113 (у человека) остатков (Weissman et al.. Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). В клетках, экспрессирующих упомянутый антигенный рецептор, в небольших количествах присутствует изоформа полипептида z, названная h (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989)), которая образуется при изменении порядка сплайсинга мРНК (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3233 (1990)). Считается, что гетеродимеры z-h опосредствуют образование инозитфосфатов, а также провоцируемую рецептором, программируемую гибель клеток, называемую апоптозом (Mercep et al., Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)). Подобно цепям z и h, цепь g, связанная с рецептором Fc, экспрессируется на поверхности клеток в комплексе с дополнительными полипептидами, часть которых опосредствует распознавание лиганда, а функция другой части не установлена. Гомодимерная структура цепи g (гамма) и вся ее организация имеет сильное сходство со структурой z, и является составной частью как высокоаффинного рецептора ІgЕ тучных клеток/базофилов - рецептора FcÎRI, - который состоит по меньшей мере из трех различных полипептидных цепей (Blank et al., Nature 337:187-189 (1989); Ra et al., Nature 241:752-754 (1989)), так и одного из низкоаффинных рецепторов IgG, представленного у мышей типом FcgRIIa (Ra et al., J. Biol. Chem. 264:15323-15327 (1989)), а у человека подтипом CD16, который экспрессируется макрофагами и естественными клетками-киллерами, CD16ТМ (CD16, трансмембранный) (Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)) и полипептидом с неустановленной функцией (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Недавно появилось сообщение о том, что g экспрессируется линией мышиных Т-клеток (CTL) и образует гомодимеры и гетеродимеры g-z и g-h (Orloff et al., Nature 347:189-191 (1990)). Рецепторы Fc опосредствуют фагоцитоз иммунных комплексов, трансцитоз и серологически типируемую клеточную цитотоксичность (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6:251-281 (1988); Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Недавно обнаружилось, что одна из изоформ мышиного низкоаффинного рецептора Fc, FcRgIIIB1, опосредствует интернализацию покрытых Іg мишеней в покрытые клатрином ячейки и что другой низкоаффинный рецептор, FcRgIIIA, опосредствует серологически типируемую клеточную цитотоксичность за счет связи с одним или несколькими членами небольшого семейства молекул - "инициаторов" (Miettinen et al., Cell 58:317327 (1989); Hunziker and Mellman, J. Cell Biol. 109:3291-3302 (1989)). Эти молекулы-инициаторы, Т-клеточный рецептор, цепь z, цепь h Т-клеточного рецептора и цепь g рецептора Fc взаимодей ствуют с доменами распознавания лиганда, принадлежащими различным рецепторам иммунной системы, и при агрегации могут самостоятельно запускать клеточные процессы, в том числе лизис клеток (Samelson et al., Cell 43:223-231 (1985); Weissman et al.. Science 239:1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:3319-3323 (1990): Blank et al.. Nature 337:187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342:805-807 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342:805-807 (1989); Hibbs et al., Scince 246:1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:2274-2278 (1990); and Irving and Weiss, Cell 64: 891-901 (1991)). При проведении параллелей между семействами рецепторов Fc человека и мышей стало ясно, что изоформы FcRgIIA и С человека не имеют мышиных аналогов. Отчасти поэтому их функция еще не определена. Поскольку гуморальные агенты, основанные только на CD4, в живом организме могут оказаться лишь ограниченно полезными, изучалась возможность усиления клеточного иммунитета к ВИЧ. Были получены препараты белковых химер, в которых внеклеточный домен CD4 был слит с трансмембранными и/или внутриклеточными доменами Т-клеточного рецептора, рецептора IgG Fc или элементами В-клеточного рецептора, проводящими сигналы (U.S.S.N. 07/847566 и 07/665961, включенные в настоящий документ посредством ссылки). Цитолитические Т-клетки, экспрессирующие химеры, в которых присутствует внеклеточный домен CD4, оказывают сильное, не зависящее от главного комплекса гистосовместимости, разрушительное воздействие на клеточные мишени, экспрессирующие белки оболочки ВИЧ. Исключительно важным и новым компонентом этого подхода явилось выделение отдельных цепей Тклеточного рецептора, рецептора Fc и В-клеточного рецептора, агрегации которых достаточно, чтобы инициировать клеточный ответ. Одним из особенно полезных вариантов осуществления этого подхода явилось изобретение химер CD4 с z, h или g, которые направляют цитолитические Т-лимфоциты на распознавание и уничтожение клеток, экспрессирующих gр120 ВИЧ (U.S.S.N. 07/847566 и 07/665961, включенные в настоящий документ посредством ссылки). В целом настоящее изобретение представляет собой способ нацеливания клеточного иммунного ответа на ВИЧ-инфицированную клетку в организме млекопитающего. Этот способ предусматривает введение в организм млекопитающего эффективного количества лечебных клеток, экспрессирующи х связанный с мембраной белковый химерный рецептор, который включает (а) внеклеточную часть, содержащую фрагмент CD4, способный специфически распознавать и связывать ВИЧ-инфицированные клетки, но неспособный опосредствовать ВИЧ-инфекцию, и (b) внутриклеточную часть, которая способна подать лечебной клетке сигнал уничтожить связанную с рецептором ВИЧ-инфицированную клетку. Настоящее изобретение предусматривает также использование лечебных клеток, экспрессирующи х связанный с мембраной белковый химерный рецептор, включающий (а) внеклеточную часть, которая содержит фрагмент CD4, способ 4 42760 ный специфически распознавать и связывать клетки, зараженные BИЧ, но неспособный опосредствовать заражение, и (b) внутриклеточную часть, которая способна подать лечебной клетке сигнал уничтожить связанную с рецептором ВИЧ-инфицированную клетку, для изготовления медикамента, предназначенного для лечения вызванных ВИЧ заболеваний. Во втором аспекте настоящего изобретения рассматривается клетка, которая экспрессирует белковый связанный с мембраной химерный рецептор, включающий (а) внеклеточную часть, содержащую фрагмент CD4, способный специфически распознавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но не способный опосредствовать заражение ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, способную подать лечебной клетке сигнал уничтожить связанную с рецептором ВИЧ-инфицированную клетку. В предпочтительных вариантах осуществления обоих аспектов фрагмент CD4 образован аминокислотами 1-394 или 1-200 последовательности CD4; этот фрагмент CD4 отделен от внутриклеточной части трансмембранным доменом CD7, изображенным на фиг. 26, или центральным доменом и доменами СН2 и СНЗ молекулы IgGl человека, показанными на фиг. 25; рецептор содержит трансмембранный участок CD7; рецептор содержит трансмембранный участок CD5; рецептор содержит трансмембранный участок CD34; фрагмент CD4 отделен от мембраны лечебной клетки одной или несколькими белковыми альфа-спиралями; фрагмент CD4 отделен от мембраны лечебной клетки расстоянием по меньшей мере в 48 ангстрем или по меньшей мере в 72 ангстрема; внутриклеточная часть - это часть белка Т-клеточного рецептора (например, z), В-клеточного рецептора или рецептора Fc, способная проводить сигналы; лечебные клетки выбираются из числа (а) Тлимфоцитов, (b) цитотоксических Т-лимфоцитов, (с) естественных клеток-киллеров, (d) нейтрофилов, (е) гранулоцитов, (f) макрофагов, (g) тучных клеток, (h) клеток HeLa и (і) стволовых клеток зародыша (ES). В других аспектах настоящего изобретения рассматривается ДНК, кодирующая химерный рецептор, соответствующий настоящему изобретению, и вектор, содержащий эту ДНК химерного рецептора. В приведенном варианте осуществления настоящего изобретения речь идет о химере CD4 и дзета, но для достижения упомянутых здесь целей может быть использована любая рецепторная цепь, действие которой сходно с действием этих молекул, например, цепь из гранулоцитов или Влимфоцитов. К характерным признакам молекулыинициатора деятельности иммунной клетки относятся: способность экспрессироваться самостоятельно (т. е. в виде отдельной цепи), способность сливаться с внеклеточным доменом CD4 таким образом, чтобы полученная химера находилась на поверхности лечебной клетки, и способность запускать клеточные эффекторные процессы при встрече и агрегации с лигандом-мишенью. В настоящее время наиболее удобным способом доставки химер к клеткам иммунной системы является использование приемов генотерапии. Однако, достройка клеток иммунной системы химерными рецепторами за счет смешивания клеток с подходящим образом растворенным и очищенным химерным белком приведет также к образованию популяции сконструированных клеток, способных реагировать на ВИЧ-инфицированные мишени. Подобные подходы использовались, например, для введения молекулы CD4 в эритроциты в лечебных целях. В этом случае популяция сконструированных клеток неспособна к самостоятельному воспроизведению. Настоящее изобретение относится к функциональным и упрощенным химерам фрагментов CD4 с подъединицами Т-клеточного рецептора, В-клеточного рецептора и рецептора Fc, способным нацеливать иммунные клетки на распознавание и лизис ВИЧ-инфицированных клеток. Способ управления клеточным ответом в организме млекопитающего включает введение в организм млекопитающего эффективного количества лечебных клеток (например, цитотоксичных Т-лимфоцитов), способных распознавать и уничтожать ВИЧ-инфицированные клетки. Настоящее изобретение также касается белков химерных рецепторов, направляющих цитотоксичные Т-лимфоциты на распознавание и лизис ВИЧ-инфицированных клеток; клеток, трансформированных при помощи вектора, содержащего химерные рецепторы; и антител к химерным рецепторам. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения, не исчерпывающие его сущности, станут очевидными для специалистов по прочтении нижеследующего подробного описания изобретения. В нижеследующем подробном описании мы будем ссылаться на различные методики, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, в которых изложены эти известные методики и на которые мы будем ссылаться, включаются в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы приводились целиком. К общеизвестным работам, в которых изложены общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, относятся Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old et al.. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989). Определения Под "клонированием" подразумевается использование в лабораторных условиях методов рекомбинации для осуществления вставки определенного гена или другой последовательности ДНК в векторную молекулу. 5 42760 Под "кДНК" подразумевается комплементарная ДНК, или ДНК-копия, собранная на матрице РНК за счет действия зависящей от РНК ДНКполимеразы (обратной транскриптазы). Так "клон кДНК" обозначает двойную последовательность ДНК, комплементарную нужной молекуле РНК, содержащуюся в векторе клонирования. Под "библиотекой кДНК" подразумевается коллекция рекомбинантных молекул ДНК, содержащих вставки кДНК, включающие ДНК-копии мРНК, экспрессируемых клеткой в период создания библиотеки кДНК. Такую библиотеку кДНК можно получить при помощи способов, известных специалистам и описанных, например, у Ausubel et al. (см. выше) и Maniatis et al. (см. выше). Обычно сначала из организма, из генома которого нужно клонировать какой-либо ген, выделяют РНК. Для достижения целей настоящего изобретения лучше использовать линии лимфоцитов млекопитающих, в частности, человека. В настоящее время предпочтительным вектором для этого является штамм WR вируса осповакцины. Под "вектором" подразумевается молекула ДНК, полученная, например, из плазмиды, бактериофага, вируса млекопитающих или насекомых, в которую могут быть вставлены, или клонированы, фрагменты ДНК. Вектор содержит один или несколько сайтов рестрикции и может быть способным к самостоятельной репликации в определенном организме-хозяине (носителе), тогда возможно воспроизводство клонированной последовательности. Так, под "вектором экспрессии ДНК" подразумевается любой самостоятельный элемент, способный управлять синтезом рекомбинантного пептида. К таким векторам экспрессии ДНК относятся бактериальные плазмиды и фаги, а также плазмиды и вирусы млекопитающих и насекомых. Под "практически чистым" подразумевается соединение, например, белок, полипептид или антитело, которое практически не содержит компонентов, которые характерны для него в естественных условиях. Обычно вещество считается практически чистым, если по меньшей мере 60%, а предпочтительно по меньшей мере 75%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% материала, взятого в качестве образца, - это требуемое соединение. Чистоту можно определить любым подходящим способом, например, при помощи хроматографии на колонке, электрофореза на полиакриламидном геле или жидкостной хроматографии высокого разрешения. Если речь идет о нуклеиновых кислотах, то "практически чистыми" называются последовательности, сегменты или фрагменты, не сопряженные непосредственно (т.е. не связанные ковалентной связью) ни с одной из кодирующи х последовательностей, с которыми они непосредственно сопряжены (т.е. связаны с одной на конце 5', ас другой на конце 3') в естественных условиях в геноме организма, из которого получена ДНК, соответствующая настоящему изобретению. "Фрагментом" молекулы, такой как любая из последовательностей кДНК, соответствующи х настоящему изобретению, называется любая подгруппа нуклеотидов молекулы, связанных др уг с другом. "Аналогом" молекулы называется искусст венная молекула, в основном подобная исходной молекуле или ее фрагменту. Молекула называется "в основном подобной" другой молекуле, если последовательности аминокислот в обеих молекулах в основном одинаковы. В основном подобные аминокислотные молекулы обладают подобной биологической активностью. В настоящем документе молекула называется "химическим производным" от другой молекулы, если содержит химические группы, не содержащиеся в исходной молекуле в естественных условиях. Эти гр уппы могут повышать растворимость молекулы, абсорбцию, продлевать время полужизни и т.д. Иногда такие группы уменьшают токсичность молекулы, устраняют или ослабляют нежелательные побочные действия и т.д. Группы, обладающие такими свойствами, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn (1980). "Функциональное производное" гена химерного рецептора, предложенного настоящим изобретением, должно содержать "фрагменты" или "аналоги" этого гена, "в основном подобные" ему по последовательности нуклеотидов и кодирующие молекулу, действие которой подобно, например, действию химеры Т-клеточного, В-клеточного рецептора или рецептора Fc. Предпочтительно, производное сохраняет 40%, более предпочтительно – 70% и наиболее предпочтительно 90% активности химеры рецептора дикого типа. Активность функционального производного от химерного рецептора состоит в специфическом связывании (при помощи внеклеточного участка CD4) с ВИЧинфицированной клеткой и в последующем разрушении этой клетки; кроме того, химерный рецептор не сообщает несущей его клетке восприимчивость к заражению ВИЧ. Активность химерного рецептора можно протестировать любым из описанных в настоящем документе способов. Последовательность ДНК, кодирующая химеру рецептора CD4, соответствующую настоящему изобретению, или функциональные производные этой химеры, может быть рекомбинирована с векторной ДНК в соответствии с традиционной технологией, предусматривающей сшивание по тупым или ступенчатым концам, переваривание рестрикционными ферментами для получения соответствующи х концов, осуществление вставки "липких" концов в нужные места, обработку щелочной фосфа тазой для предупреждения возникновения нежелательных связей и использование для сшивания соответствующи х лигаз. Те хнология проведения таких процедур описана у Maniatis et al. (см. выше) и хорошо известна специалистам. Молекула нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, считается "способной экспрессировать" полипептид, если она содержит последовательности нуклеотидов, в свою очередь содержащие информацию, необходимую для управления транскрипцией и трансляцией, и эти последовательности "оперативно связаны" с последовательностями нуклеотидов, кодирующими полипептид. Оперативная связь - это связь, при которой управляющие последовательности ДНК и те последовательности, которые нужно экспрессировать, соединены таким образом, что экспрессия гена является возможной. Характер управляющих участков, 6 42760 необходимых для экспрессии гена, изменяется от организма к организму, но в общем случае к ним относится промоторный участок, в который в прокариотических организмах включается и промотор (инициирующий транскрипцию РНК), и последовательности ДНК, которые после транскрипции в РНК подают сигнал о начале синтеза белка. Обычно на таких участках находятся 5'-некодирующие последовательности, участвующие в запуске транскрипции и трансляции, такие как блок ТАТА, кэп, последовательность СААТ и т.п. Если нужно, то при помощи описанных выше способов можно получить некодирующий участок 3' для генной последовательности, кодирующей белок. Этот участок может быть сохранен с целью использования последовательностей, управляющи х окончанием транскрипции, например, терминацией и полиаденилированием. Так, сохранение 3'-конечного участка, в естественных условиях примыкающего к последовательности ДНК, кодирующей белок, обеспечивает сигналы терминации. Если эти сигналы терминации трансляции неудовлетворительно работают в клетке-хозяине, то можно заменить функциональный 3'-участок в клетке-хозяине. Две последовательности ДНК (такие как последовательность промоторного участка и последовательность, кодирующая химеру рецептора CD4) считаются оперативно связанными, если характер связи между этими двумя последовательностями ДНК (1) не приводят к мутации со сдвигом рамки, (2) не ослабляет способность последовательности промоторного участка управлять транскрипцией генной последовательности химерного рецептора и (3) не ослабляет способность генной последовательности химерного рецептора транскрибироваться под управлением последовательности промоторного участка. Промоторный участок будет оперативно связан с последовательностью ДНК, если промотор будет способен осуществить транскрипцию этой последовательности ДНК. Таким образом, чтобы экспрессировать белок, необходимы сигналы транскрипции и трансляции, распознаваемые соответствующим хозяином. Настоящее изобретение предусматривает экспрессию белка химеры рецептора CD4 (или его функционального производного) в прокариотических или эукариотических клетках, хотя предпочтительной является экспрессия в эукариотических клетках (в частности, в лимфоцитах человека). Антитела, соответствующие настоящему изобретению, могут быть приготовлены различными способами. Например, клетки, экспрессирующие белок химеры рецептора CD4 или функциональное производное этого белка, можно ввести животному, чтобы спровоцировать выработку сыворотки, содержащей поликлональные антитела, способные связывать химеру. В предпочтительном случае антитела, соответствующие настоящему изобретению, являются моноклональными. Такие моноклональные антитела можно приготовить, используя технологию гибридом (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 61:292 (1976); Hammering et al., в кн.: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-684 (1981)). В общем случае такая процедура предусматривает иммунизацию животного антигеном химеры рецептора CD4. У животного изымают спленоциты и сливают их с подходящей миеломной клеточной линией. В рамках настоящего изобретения может быть использована любая подходящая миеломная клеточная линия. Полученные в результате слияния гибридомные клетки избирательно выдерживают в среде ГАТ (гипоксантин-аминоптеринтимидиновой среде), а затем клонируют путем предельного разбавления, как описано у Wands et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Гибридомные клетки, полученные в результате такого отбора, подвергаются анализу с целью выявления клонов, вырабатывающих антитела, способные связывать химеру. Антитела, соответствующие настоящему изобретению, могут также быть поликлональными или, предпочтительно, регион-специфическими поликлональными антителами. Антитела против химеры рецептора CD4, соответствующие настоящему изобретению, можно использовать для определения количества химерных рецепторов (количества клеток-носителей химерных рецепторов) в организме. Такие антитела очень удобны для использования в стандартном иммунодиагностическом анализе, хорошо известном специалистам и включающим такие иммунометрические приемы, или приемы сэндвичанализа, как прямой, обратный и одновременный сэндвич-анализ. Антитела можно использовать в любом количестве комбинаций. Специалист сумеет это определить и без излишнего экспериментирования провести иммуноанализ приемлемой специфичности, чувстви тельности и точности. К общеизвестным работам, в которых изложены общие принципы иммунологии, относятся Roitt, Essential Immunology, 6th ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2d ed., Macmillan Publishing Co., Publisher, New York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., Publisher, London, (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology," в Burdon et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982); и Kennett et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980). Под "регистрацией" подразумевается установление наличия или отсутствия вещества или определение количества вещества. Таким образом, этот термин относится к использованию материалов, составов и способов, предлагаемых настоящим изобретением для качественных и количественных оценок. Антитела и практически чистый антиген, предлагаемые настоящим изобретением, идеально подходят для оформления в набор. Такой набор может состоять из упаковки, поделенной на отсеки, в которые впритирку входят сосуды (флаконы, ампулы и т.п.) с материалами для анализа. Типы анализов, материалы для которых можно оформить в виде набора, многочисленны. К 7 42760 ним относятся, например, конкурентный и неконкурентный типы анализа. Типичными примерами анализа, в котором можно использовать антитела, предложенные настоящим изобретением, служат радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, твердофазный иммуноферментный анализ и иммунометрический, или сэндвич-анализ. Под терминами "иммунометрический анализ" или "сэндвич-анализ" подразумевается одновременный, прямой и обратный сэндвич-анализ. Специалисты хорошо понимают эти термины. Специалисты поймут также, что антитела, соответствующие настоящему изобретению, будут полезными для проведения других видов и форм анализов, известных в настоящее время или тех, что будут разработаны в дальнейшем. Они также будут отнесены к настоящему изобретению. Выражение "специфически распознает и связывает" означает, что антитело распознает и связывает полипептид химерного рецептора, но практически не распознает и не связывает не относящиеся к нему молекулы препарата, например, биологического препарата. Выражение "лечебная клетка" обозначает клетку, трансформированную химерой рецептора CD4, соответствующей настоящему изобретению, и благодаря этому способную распознавать и уничтожать ВИЧ-инфицированные клетки; предпочтительными лечебными клетками являются клетки кроветворной системы. Выражение "внеклеточный" означает, что хотя бы часть молекулы выступает на поверхность клетки. Термин "внутриклеточный" означает, что хотя бы часть молекулы находится в цитоплазме лечебной клетки. Термин "трансмембранный" означает, что хотя бы часть молекулы пронизывает плазматическую мембрану. Под "внеклеточной частью", "вн утриклеточной частью" и "трансмембранной частью" могут подразумеваться и боковые аминокислотные последовательности, которые заходят в прилегающие отделы клетки. Слово "олигомеризовать" означает соединять с другими белками с целью получения димеров, тримеров, тетрамеров или олигомеров более высокого порядка. Эти олигомеры могут быть гомоили гетероолигомерами. "Олигомеризующий участок" - это участок молекулы, управляющий образованием комплекса (олигомера). Слово "цитолитический" означает способный уничтожать клетки (например, ВИЧ-инфицированные клетки) или способный уничтожать возбудителей инфекции (например, вирусы иммунодефицита человека). Под "вирусом иммунодефицита" подразумевается ретровирус, который в форме дикого типа способен поражать клетки Т4 в организме хозяина-примата и характеризуется морфогенезом и морфологией, свойственными подсемейству лентивирусов. Э тот термин относится, без каких-либо ограничений, ко всем разновидностям вирусов иммунодефицита человека и обезьян, в том числе к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к вирусам иммунодефицита обезьян SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand и SIVspz. Выражение "независимый от ГКГС" означает, что клеточный цитолитический ответ имеет место и в отсутствие антигена ГКГС класса II на поверхности клетки-мишени. Выражение "функциональное производное, способное проводить цитолитический сигнал" обозначает функциональное производное (см. определение, данное выше), способное осуществить по меньшей мере 40%, более предпочтительно 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% биологической активности молекулы дикого типа. Объекты, называемые в настоящем документе "функциональными производными, способными проводить цитолитический сигнал", могут действовать путем непосредственной подачи лечебной клетке сигнала об уничтожении связанной с рецептором клетки или агента (напр., как в случае внутриклеточной части химерного рецептора) или косвенно - тогда они способствуют олигомеризации с белками лечебной клетки, проводящими цитолитический сигнал (как в случае трансмембранного домена). Эффективность таких производных можно испытать при помощи описанных в настоящем документе способов лабораторного анализа. Под выражением "функциональное производное, связывающее оболочку ВИЧ" подразумевается функциональное производное (см. определение, данное выше), способное связать любой белок оболочки ВИЧ. Функциональные производные могут быть идентифицированы при помощи описанных в настоящем документе способов лабораторного анализа. Применение в лечебных целях Трансформированные клетки, предложенные настоящим изобретением, используются в лечебных целях при заражении вирусом иммунодефицита. К способам применения таких трансформированных клеток, практикуемым в настоящее время, относятся адоптивная терапия или терапия переносом клеток. Эти способы позволяют возвращать трансформированные клетки иммунной системы в кровь (Rosenberg, Scientific American 62 (Ma y 1990); Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine 323 (9):570 (1990)). Фармацевтические составы, соответствующие настоящему изобретению, можно вводить любому животному, которому могут принести пользу соединения, предложенные настоящим изобретением. На первом месте среди таких животных стоит человек, хотя возможность применения настоящего изобретения не ограничивается человеком. Сначала дадим пояснение к фигурам. Фиг. 1А - изображение аминокислотной последовательности в окрестности участка слияния между CD4 (остатки 1-369) и различными рецепторными цепями. Подчеркнутая последовательность это место расположения аминокислот, закодированных участком BamHI и участвующи х в слиянии. Начало трансмембранного домена отмечено вертикальной чертой. Последовательность h на аминоконце идентична последовательности z, но отличается от нее на карбоксильном конце (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). Фиг. 1В представляет данные проточного цитометрического анализа поверхностной экспрессии CD4, CD4:z, CD4:g и CD4:h в клетках CV1. Клетки были заражены вирусом, экспрессирующим химеры CD4 или CD16PI, выдержаны 9 часов 8 42760 при 37°С и окрашены антителами MAb Leu3A к CD4, конъюгированными с фикоэритрином. Фиг. 2 представляет поверхностную экспрессию CD16TTM после заражения только CD16TTM (частые точки) или CD16TM совместно с вирусом, экспрессирующим CD4:g (штрихи) или CD4:z (непрерывная линия). Редкие точки соответствуют клеткам, зараженным только CD4:z и окрашенным 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:32753279 (1982)) (антитела MAb к CD16). Фиг. 3 показывает поверхностную экспрессию CD16TM после заражения вирусом, экспрессирующим CD16TM, совместно с вирусами, экспрессирующими следующие химеры z: CD4:z (жирная линия), CD4:z C11G (непрерывная линия), CD4:z (штри ховая линия), CD4:z C11G/D15G (частые точки), и после заражения только CD16TM (редкие точки). Клетки были выдержаны с антителами к CD16 MAb 3G8) и козьими антителами Fab'2 к мышиному IgG, конъюгированными с фикоэритрином. Уровень экспрессии химер z был практически идентичным для различных мутантов, а совместное заражение клеток вирусами, эспрессирующими CD16TM и химеры z, не повлияло в значительной степени на экспрессию химер. Фиг. 4A-D показывает повышение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция после перекрестного связывания мутантных химер z в Т-клеточной линии. Клетки Jurkat E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) были заражены рекомбинантными вирусами осповакцины и проанализированы методом проточной цитометрии. Результаты, отображенные на фигуре, относятся только к популяции CD4+, прошедшей дискриминацию, т.е. к тем клеткам, которые экспрессируют соответствующий химерный белок. Среднее отношение фиолетовой к голубой (краситель Индо1) флуоресценции отражает внутриклеточную концентрацию свободного кальция в популяции в целом, а процентная доля ответивши х клеток показывает у какой части клеток это отношение превышает заранее заданный порог (установленный таким образом, что 10% необработанных клеток дают положительный результат). Фиг. 4А и 4В представляют экспрессию в клетках Jurkat белков CD4:z, (непрерывная линия) или CD16:z (штриховая линия), обработанных антителами MAb Leu3a к CD4 (конъюгат с фикоэритрином), с последующим перекрестным связыванием с козьими антителами к мышиному IgG. П унктирной линией обозначен ответ незараженных клеток на MAb OKT3 к CD3. На фиг. 4С и 4D показана экспрессия в клетках Jurkat белков CD4:z D15G (непрерывная линия); CD4:zC11G/D15G (штри хи) или CD4:zC11G (точки) в результате обработки и анализа, описанных в пояснении к фиг. 4А и 4В. Фиг. 5А-С показывает, что рецепторы CD4:z, CD4:h и CD4:g позволяют цитолитическим Т-лимфоцитам уничтожать мишени, экспрессирующие gр120/41 ВИЧ-1. Фиг. 5А: закрашенные кружки цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:z и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41; незакрашенные кружки – цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:z и выдержанные с незараженными клетками HeLa; закрашенные квадраты - незараженные ци толитические Т-лимфоциты, выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41; незакрашенные квадраты - незараженные цитолитические Т-лимфоциты, выдержанные с незараженными клетками HeLa. Фиг. 5В: закрашенные кружки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:h и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41; незакрашенные кружки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:g и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41; незакрашенные квадраты цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие химеру CD4:z с двойной мутацией C11G/D15G и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41. Фиг. 5С: проточный цитометрический анализ экспрессии CD4 в цитолитических Т-лимфоцитах, упомянутых в связи с фиг. 5В. Для коррекции отношений мишень-эффектор, процентные доли клеток, экспрессирующи х химеру CD4, определяли путем вычитания отрицательной (незараженной) популяции, представленной в соответствующем масштабе, при помощи наложения гистограмм; для сравнения на этой фигуре незараженным клеткам поставлен в соответствие произвольный порог, дающий приблизительно те же доли положительных ответов в други х популяциях, что и вычитание гистограмм. Фиг. 6А-В иллюстрируют специфичность цитолиза, управляемого CD4. Фиг. 6А: закрашенные кружки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:z и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими CD16PI; незакрашенные кружки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4 и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120; закрашенные квадраты цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD16:z и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41; незакрашенные квадраты цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD16PI и выдержанные с клетками HeLa, экспрессирующими gр120/41. Фиг. 6В: закрашенные кружки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:z и выдержанные с клетками Raji (ГКГС, класс II+); незакрашенные кружки - незараженные цитолитические Т-лимфоциты, выдержанные с клетками RJ2.2.5 (Raji - мутанты, класс 11- ГКГС); закрашенные квадраты - незараженные цитолитические Т-лимфоциты, выдержанные с клетками Raji (класс II+ ГКГС); незакрашенные квадраты цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4:z и выдержанные с клетками RJ2.2.5 (класс II- ГКГС). Шкала на ординате растянута. Фиг. 7 А-В - характеристика химерного рецептора CD16:z. Фиг. 7 А - схематическое изображение слитого белка CD16:z. Внеклеточная часть фосфа тидилинозит-связанной формы мономерного CD16 была присоединена к димерному z сразу за трансмембранным доменом. Последовательность аминокислот на месте слияния приведена внизу. Фиг. 7В представляет проточный цитометрический анализ мобилизации кальция после перекрестного связывания химеры CD16:z в клеточных линиях, положительных или отрицательных в отношении Т-клеточных рецепторов. Показано среднее отношение фиолетовой к голубой флуоресценции (мера относительной концентрации ио 9 42760 нов кальция) в популяциях клеток, обработанных антителами в момент времени 0. Закрашенные квадраты - ответ клеток Jurkat на антитела MAb OKT3 к CD3; закрашенные треугольники - ответ CD16:z на антитела MAb 3G8 к CD16 с перекрестным связыванием в мутантных клетках REX33A TCR-; незакрашенные квадраты - ответ на перекрестное связывание CD16:z в мутантной линии JRT3.T3.5 клеток Jurkat TCR-; незакрашенные треугольники - ответ на перекрестное связывание CD16:z в клетках Jurkat; крестики - ответ на нехимерные CD16 в клетках Jurkat; точки - ответ на нехимерные CD16 в клеточной линии REX33A TCR-. Фиг. 8А-В иллюстрируе т делеционный анализ цитолитического потенциала. Фиг. 8А иллюстрирует расположение конечных точек делеции z. Здесь, как и везде, мутации z представлены формулой исходный остаток-место-мутантный остаток, так что D66*, например, обозначает замещение Asp-66 стоп-кодоном. На фиг. 8В представлены результаты оценки цитолиза для неделетированного CD16:z и характерных делений z. Гибридомные клетки, экспрессирующие на поверхности антитела к CD16, были нагружены 51Cr и выдержаны с различным (возрастающим) количеством цитолитических Т-лимфоцитов человека, зараженных рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими химеры CD16:z. Процентная доля высвобожденного 51Cr вычерчена как функция отношения эффектора (цитолитических лимфоцитов) к мишени (гибридомным клеткам). Закрашенные кружки - цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими CD16:z (среднекратный прирост 18,7); закрашенные квадраты - цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими CD16: z Аsр66* (среднекратный прирост 940,2); незакрашенные квадраты - цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими CD16:zGlu60* (среднекратный прирост 16,0); незакрашенные кружки - цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими CD16:zTyr51* (среднекратный прирост 17,4); закрашенные треугольники - цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими CD16:zPhe34* (среднекратный прирост 17,8); незакрашенные треугольники – цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими нехимерный CD16 (среднекратный прирост 591). Хотя в этом эксперименте экспрессия CD16:zАsр66* не соответствовала экспрессии других слиты х белков, цитолиз, опосредствованный клетками, экспрессирующими CD16:z на эквивалентных уровнях, в том же эксперименте дал результаты, практически идентичные тем, которые были получены для клеток, экспрессирующих CDl6:zAsp66*. Фиг. 9A-D показывает, что элиминация потенциала трансмембранных взаимодействий открывает короткий сегмент z, способный опосредствовать цитолиз. Фиг. 9А - это схематическое изображение мономерных двухчастных и трехчастных химер. Сверху изображена конструкция CD16:z, усеченная на остатке 65, в которой отсутствуют трансмембранные остатки Суs и Asp. Ниже изображены конструкции CD16:CD5:z и CD16:CD7:z и соответствующие контрольные конструкции. Пептидные последовательности внутри клеточных доменов приведены внизу. Фиг. 9В иллюстрирует цитолитическую активность делеционных мутаций мономерных химер. Цитолитическая активность клеток, экспрессирующи х CD16:z (закрашенные кружки; среднекратный прирост 495), сравнивалась с активностью клеток, экспрессирующи х CD16:zAsp66* (закрашенные квадраты, среднекратный прирост 527), или мутантов CD16:zCys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (незакрашенные квадраты, среднекратный прирост 338) и CD16:z Cys11Gly/Asp15Gly/Gl y60* (закрашенные треугольники, среднекратный прирост 259). Фиг. 9С иллюстрирует цитолитическую активность, опосредствованную трехчастными слитыми белками. Закрашенные треугольники CD16:zAsp66*; незакрашенные квадраты - CD16:5:z(48-65); закрашенные квадраты - CD16:7:z(48-65); незакрашенные треугольники - CD16:7:z(48-59); незакрашенные кружки - CD16:5; закрашенные кружки -CD16:7. Фиг. 9D иллюстрирует мобилизацию кальция мутантными и трехчастными химерами в мутантной клеточной линии Jurkat JRT3.T3.5, отрицательной в отношении Т-клеточных рецепторов. Незакрашенные кружки - ответ клеток, экспрессирующи х димерные CD16:zAsp66*; закрашенные квадраты ответ клеток, экспрессирующи х CD16:z Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66*; незакрашенные квадраты ответ клеток, экспрессирующих CD16:zCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*; закрашенные треугольники - ответ клеток, экспрессирующих CD16:7:z(48-65); незакрашенные треугольники CD16:z (48-59). Фиг. 10A-F иллюстрирует вклад отдельных аминокислот в активность участка из 18 остатков, проводящего цитолитический сигнал. Фиг. 10А и 10В иллюстрируют цитолитическую активность, а фиг. 10С - мобилизацию ионов кальция, опосредствованную химерами с точечными мутациями в окрестности карбоксиконечного тирозина (Y62). Фиг. 10А и 10В представляют данные о клетках, экспрессирующи х малые и большие количества, соответственно, слитых белков CD16:z. На обоих фигура х использованы одинаковые обозначения и буквенные коды, помещенные справа. Закрашенные кружки - клетки, экспрессирующие CD16:z (среднекратный прирост: А - 21; В - 376); закрашенные квадраты - клетки, экспрессирующие CD16:7:z(48-65) (среднекратный прирост: А - 31, В - 82); незакрашенные квадраты - CD16:7:z(48-65) Glu60Gln (среднекратный прирост: А - 33; В - 92); крестики - CD16:7:z(48-65)Asp63Asn (среднекратный прирост: А - 30; В - 74); закрашенные треугольники - CD16:7:z(48-65)Tyr62Phe (среднекратный прирост: А - 24; В - 88); незакрашенные кружки - CD16:7:z(48-65)Glu61Gln (среднекратный прирост: А - 20; В - 62); незакрашенные треугольники CD16:7:z(48-65)Tyr62Ser (среднекратный прирост: В - 64). Фиг. 10D и 10Е иллюстрируют цитолитичеcкую активность, а фиг. 10F - мобилизацию ионов кальция, опосредствованную химерами с точечными мутациями в окрестности аминоконечного тирозина (Y51). На графиках цитолитической активности и мобилизации кальция использованы одинаковые обозначения, расшифрованные справа. Закрашенные кружки - клетки, экспрессирующие CD16:z (среднекратный прирост: D - 21,2; Е 10 42760 672); закрашенные квадраты - клетки, экспрессирующие CD16:7:z(48-65) (среднекратный прирост: D - 31,3; Е - 179); закрашенные треугольники CD16:7:z(48-65)Asn48Ser (среднекратный прирост: D - 22,4; Е - 209); незакрашенные квадраты CD16:7:z(48-65)Leu50Ser (среднекратный прирост: D - 25,0; Е - 142); незакрашенные треугольники CD16:7:z(48-65)Tyr51Phe (среднекратный прирост: D - 32,3; Е - 294). На фиг. 11А-В дан сравнительный анализ структуры внутренних повторов z и сравнение их способности обеспечивать цитолиз. Фиг. 11А - это схематическое изображение химер, образованных путем деления внутриклеточного домена z на трети и присоединения их к трансмембранному домену химеры CD16:7. Последовательности внутриклеточных доменов приведены ниже, общие остатки заключены в рамки, а родственные остатки отмечены звездочками. На фиг. 11В проиллюстрирована цитолитическая способность этих трех субдоменов z. Закрашенные кружки - клетки, экспрессирующие CD16:z (среднекратный прирост 476); закрашенные квадраты - клетки, экспрессирующие CD16:7:z(33-65) (среднекратный прирост 68); незакрашенные квадраты - CD16:7:z(71-104) (среднекратный прирост 114); закрашенные треугольники - CD16:7:z(104-138) (среднекратный прирост 104). Фиг. 12 - схематическое изображение химер CD16:FcRgII. Фиг. 13А-В иллюстрируют мобилизацию кальция после перекрестного связывания химер CD4:FcRgII и CD16:FcRgII. Фиг. 13А представляет соотношение фиолетовой и голубой флуоресценции клеток, нагруженных чувствительным к кальцию красителем Индо-1, в виде функции от времени, прошедшего с момента перекрестного связывания внеклеточного домена CD16 с антителами. На фиг. 13В приведены результаты подобного анализа роста отношения фиолетовой флуоресценции к голубой для клеток, несущи х химеры CD4:FcRgII, после перекрестного связывания с антителами. Фиг. 14А-В иллюстрируют анализ цитолитических свойств химер CD4:FcRgII и CD16:FcRgII. На фиг. 14 А показана процентная доля 51Сr, высвобожденного гибридомными противо-СD16 клетками (мишенями) при их взаимодействии с возрастающим количеством цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующи х химеры CD16:FcRgII (эффекторов). На фиг. 14В проиллюстрирован аналогичный анализ цитотоксичности, опосредствованной химерами CD4:FcRgII, по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим гликопротеины оболочки ВИЧ. На фиг. 15А-Е показана идентификация остатков в хвосте A FcRgII, которые имеют большое значение для цитолиза. Фиг. 15А - это схематическое изображение делеционных конструкций. Фиг. 15В и 15С иллюстрируют мобилизацию кальция и цитолиз, опосредствованные вариантами химеры CD16:FcRgII А с делениями на карбоксильном конце. Фиг. 15D и 15Е иллюстрируют мобилизацию кальция и цитолиз, опосредствованные трехчастными химерами, у которых постепен но укорачивался аминоконец внутриклеточного хвоста CD16:FcRgII А. Фиг. 16 (последовательность № 24) представляет последовательность аминокислот белка рецептора CDS-дельта; в рамку заключен предпочтительный участок для передачи цитолитического сигнала. На фиг. 17 (последовательность № 25) представлена последовательность аминокислот белка рецептора Т3-гамма; в рамку заключен предпочтительный участок для передачи цитолитического сигнала. На фиг. 18 (последовательность № 26) представлена аминокислотная последовательность белка рецептора mb1; в рамку заключен предпочтительный для передачи цитолитического сигнала участок. На фиг. 19 (последовательность № 27) представлена аминокислотная последовательность белка рецептора В29; в рамку заключен предпочтительный для передачи цитолитического сигнала участок. На фиг. 20А-Е дано схематическое изображение химер CD4. Молекула А - CD4(D1-D4):Ig:CD7; молекула В - CD4(D1,D2):Ig:CD7; молекула С CD4(D1-D4):Ig:CD7:z; молекула D - CD4(D1,D2):Ig: CD7:z и молекула Е - CD4:z. Внеклеточный домен молекулы CD4 человека, соответствующий аминокислотам 1-394 предшественника, был соединен через сайт BamHI к центральному домену и доменам СН2 и СН3 IgGI человека, как описано ранее (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), с той лишь разницей, что для экспрессии в рекомбинантных вирусах осповакцины использовалась кДНК последовательностей Ig человека. Двухдоменные версии химер CD4 получили путем осуществления вставки "переходника" BamHI в уникальный сайт Nhel (соответствующий аминокислоте 200) кДНК предшественника CD4. Последовательности связывания с мембраной состояли из 22 остатков из первого экзона IgGI человека, связанного с мембраной, за которыми следовали остатки 146-203 CD7. Аминокислоты 55-163 z служили в четырехчастны х конструкциях (С и D) инициирующим участком. В четырехчастных конструкциях, содержащих цепь z, вн утриклеточная экспрессия z регистрировалась при помощи антител к внутриклеточному домену, имеющихся в продаже (Coulter). На фиг. 21 проиллюстрирован лизис клетокмишеней, экспрессирующих гликопротеин оболочки ВИЧ-1, опосредствованный Т-клеточным клоном WH3, экспрессирующим различные химеры CD4 в качестве эффекторных молекул. Для испытания цитотоксичности линию WH3 Т-клеток человека с рестрикциями CD8+ CD4- HLA B44 выдержали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMD M), дополненной 10% человеческой сывороткой, как описано выше. Клетки подвергли стимуляции при помощи гамма-облученных (3000 рад) одноядерных клеток-носителей B44 и фитогемагглютинина в концентрации 1 мкг/мл. Через день фитогемагглютинин развели до 0,5 мкг/мл путем добавления свежей среды; через 3 дня среду полностью заменили. Перед использованием в анализе цитотоксичности клетки выращивали не менее 10 дней. Клетки были за 11 42760 ражены соответствующими рекомбинантными вирусами осповакцины, как описано в настоящем документе для vPE16. Инфекцию оставили развиваться в полной среде в течение 3-4 часов, после чего клетки отобрали путем центрифугирования и снова взвесили в концентрации 1´107/мл. В каждую ячейку U-образного титрационного микропланшета, содержащую 100 мкл полной среды, добавили по 100 мкл и разбавили в 2 раза последовательными шагами. Две ячейки для каждого образца не содержали лимфоцитов, чтобы можно было измерить спонтанное высвобождение хрома и суммарное поглощение хрома. Клетки, служащие мишенями, сублинию S3 HeLa (HeLa-S3, Американская коллекция типовых культур) заразили vPE16 в 10-сантиметровых чашках, как описано выше. 106 зараженных клеток отделили при помощи фосфа тно-солевого буфера и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, центрифугировали и взвесили в 100 мкл натрия хромата (51Сr, 1 мКи/мл в фосфатно-солевом буфере) на 1 час при 37°С, затем три раза промыли фосфатносолевым буфером. В каждую ячейку добавили 100 мкл меченых клеток-мишеней. Титрационный микропланшет вращали в течение 1 минуты при 750´g и в течение 4 часов выдерживали при 37°С. После этого клетки в каждой ячейке снова взвесили путем осторожного пипетирования, один образец отобрали, чтобы определить общее количество клеток, и вращали планшет при 750´g в течение минуты. Порции (100 мкл) супернатанта отбирали и анализировали в счетчике гамма-сцинтилляций. К отношению эффектор:мишень была сделана поправка на процент зараженных клеток, определенный при помощи проточной цитометрии. Фиг. 22 иллюстрирует репликацию ВИЧ-1 в трансфицированных клеточных линиях. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие CD4 дикого типа и различные рекомбинантные химеры, были получены из сублинии линии 293 почечных клеток зародыша человека. Штамм культуры IIIB ВИЧ-1 был приготовлен с титром инфицирующих частиц »106/мл, измеренным при помощи титрования в конечной точке с использованием Т-клеточной линии С8166 в качестве индикатора. Заражение проводилось с множественностью заражения около 1 в течение 8-12 часов при 37°С. На следующий день клетки трижды промыли фосфатносолевым буфером, обработали трипсином, пересадили в другие ча шки, а супернатант культуры проверили на титр р24 (результат датировали днем 0). После этого с промежутками в 3-4 дня отбирали супернатанты клеточной культуры для анализа на р24. Клеткам давали свежую среду, содержащую гигромицин В в концентрации 100 мкг/мл. Анализ супернатантов культуры проводили с использованием серийного набора для регистрации антигена р24 ВИЧ-1, основанного на твердофазном иммуноферментном анализе (Coulter), в соответствии с инструкцией изготовителя. Представлены результаты двух независимых экспериментов одинаковой длительности. На фиг. 23 приведены последовательности нуклеиновых и аминокислот для доменов D1-D4 CD4 (CD4 Bam). На фиг. 24 приведены последовательности нуклеиновых и аминокислот для доменов D1-D2 CD4 (CD4 Nhe). На фиг. 25 приведены последовательности нуклеиновых и аминокислот центрального домена и доменов СН2 и СН3 IgGl (Igh23 Ваm) человека. На фиг. 26 приведены последовательности нуклеиновых и аминокислот для трансмембранного домена CD7 (ТМ7 Bam Mlu). На фиг. 27 приведены последовательности нуклеиновых и аминокислот для внутриклеточного домена дзета (Zeta Mlu Not). На фиг. 28 приведены последовательности ДНК и первичная последовательность аминокислот для синтетической альфа-спирали. Пример І Конструирование химер IgGl и рецептора человека Последовательности тяжелой цепи IgGl человека получили путем присоединения последовательности домена СН3 к фрагменту кДНК, полученному из конца 3' трансмембранной формы мРНК антител. Фрагмент конца 3' был получен посредством цепной полимеразной реакции с использованием в качестве субстрата библиотеки кДНК миндалин и олигонуклеотидов, имеющих такие последовательности: (последовательность № 7) и (последовательность № 8), которые соответствовали концам 5' и 3' нужных фрагментов ДНК, соответственно. Олигонуклеотид 5' комплементарен одному из сайтов домена СН1 IgGl человека, а олигонуклеотид 3' комплементарен сайту, следующему в направлении 5' сразу за последовательностями, кодирующими домен, пересекающий мембрану. Продукт цепной полимеразной реакции переварили при помощи BstXI и BamHI и вшили между сайтами BstXI и BamHI полусинтетического гена антитела IgGl, имеющего переменные и постоянные участки. После осуществления вставки фрагмента между BstXI и BamHI амплифицированные части конструкции были заменены до сайта Smal в домене СН3 путем обмена рестрикционными фрагментами, так что из продуктов цепной полимеразной реакции остался только участок между сайтом Smal и олигонуклеотидом 3'. Чтобы получить химерный рецептор IgG1:z человека, ген тяжелой цепи, заканчивающийся на сайте BamHI, присоединили к сайту BamHI химеры z, описанной ниже, так что последовательности антитела оказались во внеклеточной части. Проточная цитометрия клеток COS, трансфицированных плазмидами, кодирующими химеру, показала высокий уровень экспрессии детерминант антител для клеток, дополнительно зараженных плазмидами, кодирующими кДНК легкой цепи, и умеренную экспрессию детерминант антител для клеток, в которых не было плазмид, экспрессирующих легкую цепь. Подобные химеры, состоящие из IgG1 человека, слитого с h или g (см. ниже) или с любым другим участком белка Т-клеточного рецептора или Fc-рецептора, способным проводить сигнал, могут быть сконструированы в общем как описано выше, 12 42760 в кДНК z и h в подобной позиции - на несколько остатков впереди домена, пересекающего мембрану (последовательности № 1, 3, 4, и 6). Для получения белков, слитых с g, сайт Ваm HI вставляли в последовательность приблизительно в том же месте (фиг. 1, последовательности № 2 и № 5). Слитые гены вводили в экспрессионные плазмиды вируса осповакцины с геном gpt Е.соli в качестве селектируемого маркера и вставляли в геном штамма WR осповакцины путем гомологичной рекомбинации и селекции по росту в микофенольной кислоте (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Bayle et al., Gene 65:123-128 (1988)). Проточный цитометрический анализ показал, что рекомбинанты осповакцины вызывают обильную выработку слитых белков CD4:z и CD4:g на поверхности клеток, а экспрессия CD4:h происходит значительно слабее (фиг. 1В). Последнее наблюдение подкреплено недавним сообщением о том, что трансфекция линии мышиных гибридомных клеток плазмидами экспрессии кДНК h дает гораздо менее сильную экспрессию, чем трансфекция сравнимыми плазмидами экспрессии z (Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990)). Иммунопреципитация клеток, зараженных рекомбинантами осповакцины, показала, что слитые белки образуют ковалентные димеры, в отличие от антигена CD4 в естественном виде. Были определены молекулярные массы мономерных слитых белков CD4:z и CD4:g и нативного CD4:63, 55 и 53 килодальтонов, соответственно. Большие массы слитых белков приблизительно соответствуют большим длинам внутриклеточной части, которая длиннее, чем у нативного CD4, на 75 (CD4:z) или на 5 (CD4:g) остатков. Пример III Химеры CD4 могут соединяться с цепями других рецепторов Экспрессии рецептора FcgRIII (CD16TM) макрофагов/естественных клеток-киллеров человека на поверхности трансфектантов способствует сопутствующая трансфекция мышиными (Kurosaki et al., Nature 342:805-807 (1989)) или человеческими (Hibbs et al.. Science 246:1608-1611 (1989)) g, а также z человека (Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989)). Этим сообщениям не противоречит то обстоятельство, что экспрессия химер также способствует экспрессии СD16TM при одновременной трансфекции клеток-мишеней или одновременном заражении рекомбинантными вирусами осповакцины (фиг. 2). Дзета более выражение, чем гамма, способствовала поверхностной экспрессии CD16TM в исследуемой клеточной линии (фиг 2), а нативный CD4 не усиливал поверхностную экспрессию CD16TM. Пример IV Аспарагиновые мутанты z не соединяются с Fc-рецептором Для получения химер, которые не соединяются с существующим антигеном, или рецептором Fc, были приготовлены мутантные слитые белки z, в которых отсутствовал либо вн утримембранный остаток Asp, либо внутримембранный остаток Cys, либо оба эти остатка. Проточная цитометрия показала, что интенсивность экспрессии на поверх с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Чтобы получить единый блок транскрипции, который обеспечивал бы экспрессию и тяжелой, и легкой цепей из одного промотора, создали плазмиду, кодирующую двухцистронную мРНК, из последовательностей, кодирующи х тяжелую и легкую цепи, и нетранслированного 5'-конечного участка мРНК, кодирующей белок в 78 килодальтонов, регулируемый глюкозой, известный также как grp78, или ВіР. Последовательности grp78 были получены при помощи цепной полимеразной реакции с геномной ДНК человека и с затравками, имеющими такие последовательности: (последовательность № 9) и (последовательность № 10) - на концах 5' и 3', соответственно. Цепные полимеразные реакции с этими олигонуклеотидами проводились в присутствии 10% диметилсульфоксида. Фрагмент, полученный в результате цепной полимеразной реакции, переварили при помощи NotI и HincII и вставили между сайтами NotI и Hpal вслед за последовательностями, кодирующими IgG1 человека. Затем, вслед за лидерной последовательностью grp78, используя сайт HincII и еще один сайт вектора, вставили последовательности, кодирующие кДНК легкой цепи каппа IgG человека. Полученная в результате эти х процедур экспрессионная плазмида состояла из полусинтетического гена тяжелой цепи, за которыми следовали лидерные последовательности grp78, затем последовательности кДНК легкой цепи каппа, затем сигналы полиаденилирования, полученные из фрагмента ДНК SV40. Трансфекция клеток COS такими плазмидами дала заметное усиление экспрессии детерминант тяжелой цепи по сравнению с трансфекцией плазмидами, кодирующими детерминанты только тяжелой цепи. Для получения двухцистронного гена, включающего в себя химеру тяжелая цепь/рецептор и легкую цепь, передние последовательности тяжелой цепи можно заменить любым геном химеры тяжелая цепь/рецептор из описанных в настоящем документе. Пример II Конструирование химер рецептора CD4 КДНК z человека (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988b)) и g (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990)) были выделены при помощи цепной полимеразной реакции из библиотек, приготовленных из опухолевой клеточной линии HPB-ALL (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b)) и из естественных клеток-киллеров человека, а кДНК h (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)) была выделена из библиотеки мышиных тимоцитов. КДНК z, h и g присоединяли к внеклеточному домену перестроенной формы CD4, в которой сайт BamHI располагался непосредственно перед доменом, пересекающим мембрану (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b)); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)); внеклеточный домен был присоединен к сайту BamHI, в естественных условиях расположенному 13 42760 ности клеток для различных мутантных химер заметно не отличалась от экспрессии свободного от мутаций предшественника, а эксперименты по иммунопреципитации показали, что общая экспрессия химер сходна. Как и ожидалось, мутантные химеры, в которых отсутствовал трансмембранный цистеиновый остаток, не образовывали димеров с дисульфидными связями. Две мутантные химеры, в которых отсутствовал Asp, были неспособны обеспечить поверхностную экспрессию CD16TM, а мономерные химеры без Cys, но с Asp, допускали одновременную экспрессию CD16TM, но не такую эффективную, как родительский димер (фиг. 3). Пример V Мутантные рецепторы сохраняют способность вызывать кальциевый ответ Чтобы определить, приводит ли перекрестное связывание слитых белков к накоплению свободного кальция в клетке, которое происходит в случае Т-клеточного антигенного рецептора, линию клеток Т-клеточного лейкоза человека, Jurkat E6 (ATCC Accessior Number TIB 152, American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых к ультур), Rockville, MD), заразили рекомбинантами осповакцины и измеряли относительную концентрацию кальция в цитоплазме после перекрестного связывания внеклеточного домена с антителами. Клетки нагрузили чувствительным к кальцию красителем Индо-1 и провели проточный цитометрический анализ (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). На фиг. 4A-D представлены результаты измерений переноса кальция в клетках, зараженных CD4:z и мутантами z Asp- и Cys -. Перекрестное связывание химер с хорошей воспроизводимостью давало повышение внутриклеточной концентрации кальция. CD4:h и CD4:g также вызывали накопление кальция внутри зараженных клеток. Клетки Jurkat слабо экспрессируют CD4 на поверхности, но перекрестное связывание нативного CD4 в присутствии CD16:z или в его отсутствие не влияет на уровень внутриклеточного кальция (фиг. 4 А-В). Пример VI Химеры CD4:z, h и g опосредствуют лизис мишеней, экспрессирующих gр120/41 BИЧ Чтобы определить, способны ли химерные рецепторы запускать эффекторные цитолитические программы, создали модель системы мишень:эффектор, основанной на распознавании рецептором CD4 комплекса gр120/41 оболочки BИЧ. Клетки HeLa заразили рекомбинантными вирусами осповакцины, экспрессирующими gр120/41 (Chakrabarti et al., Nature 320:535-537 (1986); Earl et al., J Virol. 64:2448-2451 (1990)), и пометили 51Cr. Меченые клетки выдержали с клетками линии аллогенных (CD8+, CD4-) цитотоксических Т-лимфоцитов человека, зараженными рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими химеры CD4:z, CD4:h или CD4:g или химеру с двойной мутацией CD4:zCys11Gly:Asp15Gly. На фиг. 5А-С показано, что клетки HeLa, экспрессирующие gр120/41, подверглись специфическому лизису со стороны цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химеры CD4. Незараженные клетки HeLa не подверглись воздействию цитотоксических Т-лимфоцитов, вооруженных химерами CD4, а клетки HeLa, экспрессирующие gр120/41, не были распознаны незараженными цитотоксическими Т-лимфоцитами. Чтобы сравнить эффективность действия различных химер, к отношениям эффектор: мишень были сделаны поправки на долю цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующи х химеры CD4, и на долю клеток HeLa, экспрессирующих gр120/41, определенные при помощи проточной цитометрии. На фиг. 5С проиллюстрирован цитометрический анализ экспрессии CD4 цитотоксическими Т-лимфоцитами, использованными в эксперименте по цитолизу, проиллюстрированном на фиг 5А и 5В. Хо тя средняя плотность поверхностной CD4:z значительно превышала среднюю плотность поверхностной CD4:h, цитолитическая активность клеток, экспрессирующи х эти формы, была одинаковой. С учетом поправки на долю мишеней, экспрессирующи х gр120, эффективность цитолиза, опосредствованного белками CD4:z и CD4:h, сравнима с лучшими результатами, отмеченными для пар мишень:эффектор со специфическим участием Т-клеточного рецептора (среднее отношение эффектор:мишень для 50% высвобождения Т-клетками, экспрессирующими CD4:z, составило 1/9±0,99; n=10). Слитый белок CD4:g был менее активным, как и слитый белок CD4:z, в котором отсутствовали трансмембранные остатки Суs и Asp. Однако, в обоих эти х случаях наблюдался достаточно эффективный цитолиз (фиг. 5В-5С). Для исключения возможности того, что заражение осповакциной способствует ложному распознаванию мишеней цитотоксическими Т-лимфоцитами, подобные цитолитические эксперименты были проведены в таких условиях: клетки-мишени были заражены рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими фосфатидилинозит-связанную форму CD16 (CD16PI), и помечены 51Сr, а цитотоксические Т-лимфоциты были заражены контрольными рекомбинантами, экспрессирующими либо CD16PI, либо CD16:z. На фиг. 6А показано, что Т-клетки, экспрессирующие химеры без CD4, не распознают нативные клетки HeLa или клетки HeLa, экспрессирующие gр120/41, и что Т-клетки, экспрессирующие химеры CD4, не распознают клетки HeLa, экспрессирующие другие поверхностные белки, закодированные в вирусах осповакцины. Кроме того, цитотоксические Т-лимфоциты, экспрессирующие нехимерные CD4, не осуществляют в значительной степени лизис клеток HeLa, экспрессирующих gр120/41 (фиг. 6 А). Пример VII Клетки-носители молекул II класса главного комплекса гистосовместимости не подвергаются воздействию химер Считается, что CD4 взаимодействует с неполиморфной последовательностью, экспрессируемой антигеном II класса главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) (Gay et al.. Nature 328:626629 (1987); Sleckman et al.. Nature 328:351-353 (1987)). Хотя специфическое взаимодействие между CD4 и антигеном класса II в очищенном виде никогда не наблюдалось, при определенных условиях можно продемонстрировать склеивание клеток, экспрессирующих CD4, с клетками, экспрессирующими молекулы класса II (Doyle et al., Nature 14 42760 330:256-259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science 245:743-746 (1989)). Затем проверили, возможно ли уничтожение клеток-носителей молекул класса II. На фиг. 6В видно, что CD4:z не осуществляет специфического лизиса клеток В-клеточной линии Raji, в изобилии экспрессирующи х антиген класса II. Хотя наблюдается умеренный лизис (»5%), RJ2.2.5 - мутант Raji, отрицательный по классу II (Accolla, J. Exp. Med. 157:1053-1058 (1983)), - проявляет подобную восприимчивость, как и клетки Raji, выдержанные с незараженными Т-клетками. Пример VIII Требования к структуре цепи дзета Т-клеточного антигена/Fс-рецептора, вызывающей цитолиз Хотя химеры CD4 и z сообщают цитотоксическим Т-лимфоцитам способность убивать клеткимишени, экспрессирующие gр120 ВИЧ, нужно было найти альтернативу CD4, чтобы недвусмысленно сравнить свойства химер дзета, вводимых в Т-клеточные линии человека. Такие линии могут экспрессировать CD4, затрудняя точное определение соотношения между характером или степенью мобилизации кальция и цитотоксическим потенциалом различных химер. Поэтому были созданы химеры из z и CD16, в которых внеклеточный домен CD16 присоединяется к трансмембранной и внутриклеточной последовательностям z (фиг. 7А). Слитые гены вводились в экспрессионную плазмиду вируса осповакцины, снабженную геном gpt Е.соli в качестве селектируемого маркера, и вставлялись в геном штамма WR осповакцины путем гомологичной рекомбинации и селекции по росту в микофенольной кислоте (Falkner and Moss, J. Virol 62:1849 (1988); Boyle and Coupar, Gene 65:123 (1988)). Т-клеточные линии были заражены рекомбинантами осповакцины и после перекрестного связывания внеклеточных доменов с антителами была измерена относительная концентрация свободных ионов кальция в цитоплазме. Клетки, меченные красителем Индо-1, подвергли и спектрофлуориметрии (всю популяцию), и проточной цитометрии (отдельные клетки) (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440 (1985)); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952 (1986)). На фиг. 7В проиллюстрирован анализ данных, полученных для линии Jurkat клеток Т-клеточного лейкоза человека, зараженных рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими слитый белок CD16:z. Перекрестное связывание химер с хорошей воспроизводимостью повышало внутриклеточную концентрацию кальция, тогда как аналогичная обработка клеток, экспрессирующих нехимерные CD16, не давала эффекта или давала незначительный эффект. Когда химера экспрессировалась в мутантных клеточных линиях, в которых отсутствовал антигенный рецептор, например, в REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)) или в Jurkat JRT3.T3.5 (Weiss et al., J. Immunol. 135:123 (1984)), наблюдался сильный ответ на перекрестное связывание антителами CD16. Подобные результаты были получены для мутантной линии REX20A (Breitmeyer et al., там же (1987); Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) и для мутантной линии клеток Jurkat, отрицательной по CD3/Ti, полученной в нашей лаборатории. Заражение рекомбинантами, экспрессирующими CD16:z, не восстанавливает ответ на антитела против CD3, следовательно, слитый белок действует не за счет спасения внутриклеточных цепей комплекса CD3. Для оценки способности химер управлять клеточным иммунитетом цитотоксические Т-лимфоциты были заражены рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими химеры CD16, и использованы для специфического лизиса гибридомных клеток, экспрессирующи х связанные с мембраной антитела к CD16. Эта реакция представляет собой расширение реакции цитотоксичности для гибридом, первоначально разработанной для анализа эффекторных механизмов клеток-носителей рецепторов Fc (Graziano and Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987; Graziano and Fanger, J. Immunol. 139:3536, 1987; Shen et al., Моl. Immunol. 26:959, 1989; Fanger et al., Immunol.Today 10:92, 1989). Фиг. 8В показывает, что экспрессия CD16:z в цитотоксических Т-лимфоцитах позволяет "вооруженным" лимфоцитам уничтожать гибридомные клетки 3G8 (анти-СD16, Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3275, 1982), а цитотоксические Т-лимфоциты, экспрессирующие фосфатидилинозит-связанную форму CD16, остаются неактивными. Цитотоксические Т-лимфоциты, вооруженные CD16: z, также не уничтожают гибридомные клетки, экспрессирующие антитела к другим антигенам. Чтобы определить минимальную последовательность z, необходимую для цитолиза, приготовили ряд делеционных мутантов, в которых от карбоксильного конца отнимали все большие участки внутриклеточного домена z (фиг. 8А). Можно удалить большую часть внутриклеточного домена z без значительных последствий для цитотоксического потенциала; химера CD16:z полной длины была настолько же активной, насколько химера, усеченная до остатка 65 – CD16:zAsp66* (фиг. 8В). Существенное ослабление цитотоксичности наблюдалось при укорочении z до остатка 59 (химера CD16:zGlu60*), дальнейшее усечение до остатка 50 ослабило активность еще немного. Однако полной потери активности не произошло, даже когда вн утриклеточный домен усекли вплоть до трансмембранного "якоря", состоящего из трех остатков (фиг. 8В). Поскольку z - это димер с дисульфидной связью, одна из причин сохранения цитолитической активности состоит в том, что эндогенные z образовывали гетеродимеры с урезанными последовательностями z, тем самым восстанавливая их активность. Для проверки этого предположения остатки 11 и 15 в последовательности z (Asp и Суs, соответственно) заменили на Gly (Cys11Gly/Asp15Gly) и провели иммунопреципитацию следующим образом. Приблизительно 2´106 клеток CV1 инфицировали в течение одного часа в бессывороточной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DME), рекомбинантами осповакцины с множественностью заражения не менее десяти. Через шесть-восемь часов после заражения клетки отобрали из чашек фосфа тно-солевым буфером/1мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой и пометили их поверх 15 42760 ность 125J, 0,2 мКи на 2´106 клеток по способу Кларка и Эйнфельда (Clark, Einfeld) с использованием лактопероксидазы и H2O2 (Leukocyte Typing II, pp 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Меченые клетки собрали посредством центрифугирования и подвергли лизису в 1% NP-40, 0,1% додецилсульфате натрия, 0,15 М NaCI, 0,05 М трис, рН 8,0, 5 мМ МgСІ2, 5 мМ КСl, 0,2 M иодацетамиде и 1 мМ фенилметилсульфонилфториде. Ядра отобрали посредством центрифугирования и провели реакции иммунопреципитации белка CD16 при помощи антител 3G8 (Fleit et аl., см. выше, 1982; Medarex) и агарозы с мышиным анти-IgG (Cappel, Durham, NC). Образцы подвергли электрофорезу в 8% геле из полиакриламида/додецилсульфата натрия в невосстанавливающих условиях или в 10% геле в восстанавливающих условиях. Эти реакции иммунопреципитации подтвердили, что химера CD16:zCys11Gly/Asp15Gly не образует димерных структур с дисульфидной связью. Проверялась также цитолитическая активность мутантных рецепторов. Мутантная химера, усеченная до остатка 65 (CD16:zCys11Gly/Asp15Gly/Аsр66*) была, в зависимости от условий эксперимента, в 2-8 раз менее активной цитолитически, чем сравнимая химера без мутаций (CD16:zАsр66*), которая обычно также активна, как CD16:z, или в 1-2 раза менее активна (фиг. 9В). Снижение активности мутантных химер сравнимо со снижением активности химер CD4 аналогичной структуры (см. выше) и, скорее всего, объясняется тем, что мономеры z действуют менее эффективно, чем димеры. Химера с мутациями Asp- и Cys -, усеченная до остатка 59, вообще не проявляла цитолитической активности (фиг 9В), что служит подтверждением гипотезы о том, что именно связь с другими цепями, опосредствованная трансмебранными остатками Cys и/или Asp, была причиной неустойчивой цитолитической активности при делениях, расположенных ближе к аминоконцу, чем остаток 65. Проточный цитометрический анализ показал, что делеционные мутанты, в которых недостает трансмембранных остатков Asp и Cys, все же способствуют увеличению внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция в ответ на перекрестное связывание с антителами в мутантной (без Т-клеточных рецепторов) клеточной линии Jurkat (фиг. 9D). Подобные результаты были получены для химер, экспрессированных родительской линией Jurkat. В случае CD16:zCys11Gly/Asp15Gly/Glu60* эти результаты говорят о том, что способность опосредствовать кальциевую чувстви тельность можно при помощи мутации отделить от способности обеспечивать цитолиз. Чтобы полностью исключить возможность участия трансмембранных остатков z, трансмембранные остатки и 17 первых цитоплазматических остатков z заменили последовательностями, кодирующими трансмембранные остатки и первые 14 или 17 цитоплазматических остатков антигенов CD5 или CD7, соответственно (фиг. 9 А). Полученные трехчастные слитые белки CD16:5:z(48-65) и CD16:7:z(48-65) не образовывали димеров с дисульфидными связями, в отличие от более про стых химер CD16:z, так как не имели остатка цистеина в трансмембранном домене z. Обе трехчастные химеры были способны мобилизовать кальций в клетках Jurkat и в клетках Jurkat без Т-клеточных рецепторов (фиг. 9D) и вызывать цитолитичеcкий ответ в цитотоксических Т-лимфоцитах (фиг. 9С и не представленные данные). Однако, отсечение части z до остатка 59 в химере CD16:7:d(48-59) лишает трехчастный слитый белок способности управлять чувствительностью кальция в клетках Jurkat (с Т-клеточными рецепторами или без них) или цитолитической активностью в зрелых цитотоксических Т-лимфоцитах (фиг. 9С и 9D и не представленные данные). Для изучения роли отдельных остатков в активности цепи из 18 остатков мы приготовили несколько мутантных вариантов путем сайтнаправленного мутагенеза и оценили их способность опосредствовать направляемое рецептором уничтожение в условиях слабой (фиг. 10 А и 10D) или сильной экспрессии (фиг. 10В и 10Е) химерного рецептора. На фиг. 10A-F видно, что хо тя ряд относительно консервативных замен (например, замещений кислотных остатков родственными им амидами или тирозина фенилаланином) на участке между остатками 59-63 привел к умеренному ослаблению цитолитической активности, варианты в общем сохранили способность мобилизовать кальций. Однако, в совокупности эти остатки представляют собой важный участок, так как их делеция приводит к потере цитолитической активности. Замена Туr 62 на Phe или Ser приводила и к потере цитолитической активности, и к утрате кальциевой чувствительности. На аминоконце сегмента из 18 остатков замена Туr 51 на Phe делала невозможной как мобилизацию кальция, так и цитолитическую активность, а замена Leu в позиции 50 на Ser делала невозможной мобилизацию кальция и лишь частично ослабляла цитолитическую способность. Не ограничивая себя рамками определенной гипотезы, мы предполагаем, что неспособность мутанта Leu50Ser мобилизовать кальций в коротких проточных цитометрических анализах не полностью отражает его способность к опосредствованию значительного повышения внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция в течение более длительного времени, которое затрачивается на цитолитический анализ. Однако, в некоторых линиях цитолитических Тклеток наблюдалась нечувствительная к кальцию цитолитическая активность, и мы не исключаем возможности, что подобное явление обусловило полученный результат. Замена Asn48 на Ser частично ослабила цитотоксичность в нескольких экспериментах и не дала значительного эффекта в остальных. Для изучения потенциальной роли избыточных элементов последовательности z внутриклеточный домен z был разбит на три сегмента: остатки 33-65, 71-104 и 104-138. Каждый из этих сегментов присоединяли к химере CD16:CD7 при помощи сайта MluI, вводимого у дистального конца последовательности мембранного якоря внутриклеточного домена CD7 (см. ниже; фиг. 11А). Сравнение цитолитической активности трех элементов показало, что и х активность практически одинакова (фиг. 11В). Сравнение последователь 16 42760 ностей (фиг. 11А) показывает, что во втором отрезке между тирозинами находится одиннадцать остатков, а в первом и третьем - по десять. Хотя точное объяснение процесса активации Т-клеток не найдено, ясно, что агрегация антигенных рецепторов, или химерных рецепторов, включающи х в себя внутриклеточные последовательности z, инициирует мобилизацию кальция, высвобождение цитокинов и гранул и появление на поверхности клеток маркеров активации. При опосредствовании активации клетки активный сайт z, короткая линейная пептидная последовательность, скорее всего, слишком маленькая для того, чтобы обладать собственной ферментной активностью, вероятно, взаимодействует с одним или, самое большое, с несколькими белками. Ясно также, что мобилизации свободного кальция как таковой недостаточно для активации клетки, поскольку способность к опосредствованию цитолиза можно при помощи мутации отделить от способности к опосредствованию накопления кальция. Как показано в настоящем документе, добавление 18 остатков из внутриклеточного домена z к трансмембранному и внутриклеточному домену двух других белков приводит к созданию химер, способных направлять цитолитическую активность против клеток-мишеней, которые связываются с внеклеточной частью слитых белков. Хотя химеры, имеющие в своем составе отрезок из 18 остатков, приблизительно в восемь раз менее активны, чем химеры, содержащие z целиком, уменьшение активности можно приписать потере трансмембранных взаимодействий, за счет которых обычно z дикого типа образует димеры с дисульфидной связью. То есть, делеционные конструкции с z, имеющие тот же карбоксильный конец, что и отрезок, и не имеющие трансмембранных остатков Суs и Asp, обычно проявляют несколько меньшую активность, чем химеры, содержащие только отрезок из 18 остатков. В элементе, обеспечивающем цитолитическую компетентность, на котором мы сосредоточились, содержится два тирозина и не содержится ни серин, ни треонин, которые ограничивают возможный вклад фосфорилирования в активность. Мутация любого из тирозинов приводит к утрате активности, и хотя предварительные эксперименты не указывают на существенное фосфорилирование тирозина после перекрестного связывания химерных поверхностных антигенов, содержащих участок из 18 остатков, нельзя исключать возможность участия такого фосфорилирования на низком уровне. В дополнение к эффектам, отмеченным для двух тирозиновых остатков, ряд замен аминокислот на карбоксильном конце и аминоконце отрезка ослабляют активность в условиях низкой плотности рецепторов. Последовательности, подобные активному отрезку z, встречаются в цитоплазматических доменах некоторых других трансмембранных белков, в том числе, в молекулах d и g CD3; в белках mb1 и В29, связанных с поверхностным IgM; в цепях b и g высокоаффинного рецептора ІgЕ, FceRI (Reth, Nature 338:383, 1989). Хотя функция этих последовательностей точно не установлена, в случае эффективной экспрессии любая из них способна самостоятельно активировать Т-клетку, и это может быть причиной остаточной чувствительности Т-клеточных рецепторов, наблюдаемой в z-отрицательной мутантной клеточной линии (Sussman et al., Cell 52:85, 1988). Сама последовательность z включает в себя три таких последовательности, приблизительно одинаковой длины, и грубое разбиение внутриклеточного домена на три части показывает, что каждая способна инициировать цитолитический ответ. В последовательности h, сплайсинговой изоформе z (Jin et al., см. выше, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202, 1991), отсутствуе т карбоксильная половина третьего отрезка. Поскольку удаление карбоксильной половины первого отрезка приводит к утрате активности, кажется вероятным, что биологическая активность h определяется в основном первыми двумя отрезками. Хотя при различных способах измерения h также активно, как z, способствует антигензависимой выработке цитокинов (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842, 1991) или нацеливанию цитолиза (см. выше), h не фосфорилируется в ответ на стимуляцию рецептора (Bauer et al., см. выше, 1991). Таким образом, либо для фосфорилирования требуется присутствие все х трех отрезков, либо третий отрезок служит излюбленным субстратом для неизвестной тирозин киназы. Пример IX Передача цитолитического сигнала Fc-рецептором человека Для оценки действия различных подтипов рецептора Fc человека были созданы химерные молекулы, в которых внеклеточный домен антигенов CD4, CD5 или CD16 человека присоединялся к трансмембранным и внутриклеточным доменам подтипов FcRIIgA, B1, B2 и С (номенклатура авторов Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457, 1991). Говоря точнее, последовательности кДНК, соответствующие трансмембранным и цитоплазматическим доменам ранее описанных изоформ FcRIIA, B1 и B2, были амплифицированы из уже существующего клона РС23 или из библиотеки кДНК миндалин человека (составленной стандартными способами) с использованием следующи х олигонуклеотидных затравок. ССС GGA ТСС C AG C AT GGG C AG СТС ТТ (последовательность № 18, FcRII А прямая); CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (последовательность № 19, FcRII А обратная); GCG GGG GGA ТСС CAC TGT CCA AGC ТСС CAG СТС TTC ACC G (последовательность № 20, FcRII B1 и FcRII B2 прямые); GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (последовательность № 21, FcRII B1 и FcRII B2 обратные). Эти затравки содержали сайты расщепления для ферментов BamHI и NotI, соответственно, отстоящие на 6 остатков от конца 5'. Сразу же за сайтом NotI следовал антисмысловой стоп-кодон, либо СТА, либо TTA. Все затравки состояли из 18 или более остатков, комплементарных концам 5' или 3' нужных фрагментов. Фрагмент кДНК, соответствующий цитоплазматическому домену 17 42760 чать на сигнал, подаваемый при перекрестном связывании внеклеточных доменов. Для исследования участия внутриклеточных доменов различных форм FcRgII в цитолизе цитотоксические Т-лимфоциты человека были заражены рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими химеры CD16:FcRgII A, B1, В2 и С. Зараженные клетки культивировали совместно с гибридомными клетками, нагруженными 51Сr (т.е., клетками 3G8 10-2) и экспрессирующими поверхностные антитела к CD16. В этом эксперименте цитотоксические Т-лимфоциты с химерами CD16 уничтожали гибридомные клетки-мишени (тем самым способствуя высвобождению 51Сr), если внеклеточный домен CD16 химеры был присоединен ко внутриклеточному сегменту, способному активировать эффекторную программу лимфоцита; этот эксперимент подробно описан ниже. На фиг. 14А видно, что цитотоксические Т-лимфоциты, вооруженные CD16:FcRgII А или С, но не FcRgII B1 или В2, способны осуществить лизис клеток-мишеней, экспрессирующи х поверхностные антитела к CD16. Чтобы исключить возможность того, что специфический цитолиз в какой-то мере объясняется взаимодействием с группой CD16, мы провели цитолитические эксперименты, в которых внутриклеточные домены FcRII были соединены с внеклеточным доменом CD4. В этом случае мишенями служили клетки HeLa, экспрессирующие белки оболочки ВИЧ gр120/41 (а именно, клетки HeLa, зараженные вектором осповакцины vPE16 (из СПИД-хранилища Национального института по изучению аллергических и инфекционных заболеваний - National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Как и в системе CD16, клетки-мишени, экспрессирующие оболочку ВИЧ, были восприимчивы к лизису со стороны Т-клеток, экспрессирующи х химеру CD4:FcRgII А, но не FcRgII В1 или В2 (фиг. 14В). Внутриклеточные домены FcRgII А и С не обладают значительной гомологией последовательностей с какими-либо другими белками, в том числе и с членами общего семейства FcRg/TCRz. Для выделения элементов последовательности, вызывающи х цитолиз, были приготовлены 5'- и 3'-концевые делеции последовательностей, кодирующи х вн утриклеточный домен (описанные ниже и представленные на фиг. 15А), которые были испытаны на эффективность мобилизации кальция и цитолитическую активность (как описано в настоящем документе). В экспериментах, в которых удалялась аминоконечная часть внутриклеточного домена, трансмембранный домен FcRgll заменяли на трансмембранный домен чужеродного антигена CD7 - для исключения возможного влияния взаимодействий, опосредствованных трансмембранным доменом. На фиг. 15В и 15С показано, что удаление 14 остатков с карбоксильного конца, в числе которых тирозин 298, приводит к полной потере цитолитической активности и к значительному снижению потенциала мобилизации кальция. Дальнейшее усечение - вплоть до тирозина 282 - дало такой же фенотип (фиг. 15В и 15С). Усечение внутриклеточного домена со стороны N-конца до остатка 268 не повлияло в значительной мере ни на профиль кальция, ни на цитолитическую актив FcRIIgC, который отличается от изоформы IIA только одним аминокислотным остатком (L или Р в позиции 268), был получен при помощи сайтнаправленного мутагенеза путем цепной полимеразной реакции с перекрыванием, с использованием таких затравок: (последовательность №22) и (последовательность № 23). Фрагменты - продукты реакции были вставлены в векторы экспрессии на основе вируса осповакцины, содержащие внеклеточные домены CD16 или CD4, соответственно, а затем - в вир усы осповакцины дикого типа путем рекомбинации в локусе тимидин киназы, с отбором для одновременного встраивания гена gpt E.coli, облегчающего идентификацию нужных рекомбинант. Подлинность всех изоформ (фиг. 12) была подтверждена дидезокси методом установления первичной структуры ДНК. Получение белков химерных рецепторов было подтверждено экспериментами по иммунопреципитации. Приблизительно 107 клеток JRT3.T3.5 инфицировали в течение одного часа в бессывороточной среде IMDM, рекомбинантами осповакцины со множественностью заражения не менее 10. Через 12 часов после заражения клетки собрали и пометили их поверхность 125J, 0,5 мКи на 107 клеток, по способу Кларка и Эйнфельда - с использованием лактопероксидазы/глюкозооксидазы (Clark and Einfeld, см. выше). Меченые клетки собрали посредством центрифугирования и подвергли лизису в 1% NP-40, 0,1 мМ MgCl2, 5 мМ КСl, 0,02 М иодацетамиде и 1 мМ фенилметилсульфонилфториде. Ядра отобрали посредством центрифугирования и провели иммунопреципитацию слитых белков CD16 с помощью антител 4G8 и агарозы с мышиным анти-IgG. Образцы подвергли электрофорезу в восстанавливающих условиях. Все молекулы преципитированных химерных рецепторов имели ожидаемую молекулярную массу. Для проверки способности химерных рецепторов к опосредствованию роста внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция мутантную (без Т-клеточных рецепторов) линию клеток Jurkat - линию JRT3.T3.5 заразили рекомбинантными вирусами (как описано в настоящем документе) и измеряли концентрацию свободного кальция в цитоплазме клеток (как описано в настоящем документе) после перекрестного связывания внеклеточных доменов рецепторов моноклональным антителом 3G8 или Leu-3А (как описано в настоящем документе). Эти эксперименты показали, что вн утриклеточные домены FcRgII А и С способны опосредствовать рост концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме после перекрестного связывания внеклеточных доменов, а внутриклеточные домены FcRgII B1 и В2 в подобных условиях остаются неактивными (фиг. 13А и 13В). Гибриды FcRgII А с CD4, CD5 и CD16 проявляли в основном одинаковую способность к возбуждению кальциевого ответа (фиг. 13А-В). Другие клеточные линии, полученные как из моноцитов, так и из лимфоцитов, были способны отве 18 42760 ность, а делеция до остатка 275 заметно ослабила высвобождение кальция, но не оказала значительного влияния на цитолиз (фиг. 15D и 15Е). Дальнейшее усечение, до остатка 282, дало хвосты FcRgII, не способные ни к мобилизации кальция, ни к обеспечению цитолиза (фиг. 15D и 15Е). "Активный элемент", выявленный при помощи этих гр убых мер, оказался относительно большим (36 аминокислот). Он содержит два тирозина, разделенных 16 остатками. Пример Х Направленный цитолиз, осуществляемый лимфоцитами с химерными рецепторами CD4, не способствующими дальнейшему заражению Как сказано выше, существуе т возможность построения эффекторных молекул, направляющих цитолитическую активность цитотоксических Тлимфоцитов и делающих ее независимой от главного комплекса гистосовместимости. Например, химера, состоящая из внеклеточного домена CD4, слитого с цепью z в клоне цитотоксических Т-лимфоцитов человека WH3, специфически уничтожает клетки-мишени, на поверхности которых проявляется гликопротеин оболочки ВИЧ-1, gр120. Поскольку внеклеточный домен молекулы CD4 сообщает клетке восприимчивость к ВИЧ, вооруженные цитотоксические Т-лимфоциты могут стать мишенями для вируса, что снижает их эффективность (Dalgleish et al.. Nature 312:767 (1984); Klatzmann et al., Nature 312:767 (1984)). Чтобы этого не случилось, на основе CD4 были разработаны химерные эффекторные молекулы, которые специфически связываются с ВИЧ-инфицированными клетками для их уничтожения, но не сообщают своей клетке восприимчивости к ВИЧ. Был создан трехчастный слитый белок – посредством генного соположения внеклеточного домена CD4 (фиг. 23) и центрального, второго и третьего константных доменов тяжелой цепи IgGI человека (Zettlmeissl et al., DNA Cell. Biol. 9:347 (1990)) (фиг. 25), которые в этом случае присоединялись к части первого трансмембранного экзона IgGl человека, связанного с мембраной, за которым следовала часть антигена человека CD7, содержащая последовательности, расположенные в CD7 между единственным Ig-подобным доменом и последовательностью остановки переноса, расположенной за трансмембранным доменом (Aruffo and Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (фиг. 26). Первичная последовательность аминокислот внеклеточной группы сегмента CD7 включала богатый пролином участок, стоящий торчком и отодвигающий Ig-подобный домен от поверхности клетки (AruFFo and Seed EMBO J. 6:3313 (1987)) (фиг. 26). Были приготовлены рекомбинантные вирусы осповакцины для экспрессии этой и родственных химер (как описано в настоящем документе). В частности, рекомбинантные вирусы осповакцины были получены путем гомологичной рекомбинации в клетках CV-1. Перед приготовлением высоких титров каждого штамма в клетках CV-1 для каждого штамма выполнили не менее двух циклов визуализации бляшек при помощи ОКТ4 или Leu3A с последующей очисткой бляшек. Трехчастная химера CD4(D1-D4):Ig:CD7 (фиг. 20, молекула "А") эффективно экспрессировалась на поверхности клеток и была испытана на способность выступать в качестве рецептора ВИЧ - в ходе эксперимента по образованию синцитиев на основе осповакцины (Lifson et al., Nature 323:725 (1986); Ashorn et al., J. Virol. 64:2149 (1990)). Клетки HeLa, зараженные рекомбинантным вирусом осповакцины (vPE16), кодирующим гликопротеин оболочки ВИЧ-1 (Earl et al., J. Virol 64:2448(1990) культивировали совместно с клетками HeLa, зараженными либо CD4, CD4:z, либо CD4(D1-D4):Ig:CD7. Шестисантиметровые чашки с клетками HeLa (АТСС, Rockville, MD – Американская коллекция типовых культур) при 50% слиянии инфицировали в течение 1 часа в бессывороточной среде с приблизительной множественностью заражения 10. Клетки выдержали еще 5-6 часов в полной среде, затем отобрали в фосфатносолевой буфер, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусн ую кислоту. Клетки, экспрессирующие оболочку и химеру CD4, смешали в соотношении 1:1 и посеяли в 6-сантиметровые чашки с полной средой. Синцитии подсчитали и сфотографировали через 6-8 часов совместного культивирования. Совместное культивирование CD4 и vPE16 привело к образованию легко обнаружимых гигантских многоядерных клеток. Кроме того, химера, состоящая из внеклеточного домена CD4, слитого с цепью z Т-клеточного рецептора (фиг. 27) (CD4:z) оказалась способной опосредствовать образование синцитиев, а клетки, экспрессирующие CD4(D1-D4):Ig:CD7, не проявляли признаков слияния. Мы испытали также конструкцию, экспрессирующую только первый и второй домены CD4 (фиг. 24), CD4(Dl,D2):Ig:CD7 (фиг. 20, молекула "В"), поскольку в другом контексте эти два аминоконечных домена были необходимы для создания восприимчивости к ВИЧ (Landau et al., Nature 334:159 (1988)). Эта молекула также оказалась невосприимчивой к ВИЧ-опосредствованному образованию синцитиев. Эксперименты по связыванию с растворимой gр120, меченной 125J, показали, что и CD4 (D1-D4):Ig:CD7, и CD4 (D1, D2):Ig:CD7 сохранили аффинность к gр120. Затем мы проверили, будут ли химерные молекулы, противодействующие образованию синцитиев, способны направлять процесс уничтожения клеток, если ввести в эти молекулы группуинициатор, как описано в настоящем документе. Мы слили вн утриклеточный домен z (фиг. 27) с концом 3' CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7 и приготовили соответствующие рекомбинантные вирусы осповакцины. Эти конструкции - CD4(D1D4):Ig:CD7:z и CD4(D1,D2):Ig:CD7:z (фиг. 20, молекулы "С" и "D") -экспрессировались в клоне WH3 цитотоксических Т-лимфоцитов человека и проверялись на способность связывать и уничтожать клетки HeLa, экспрессирующие поверхностный гликопротеин оболочки ВИЧ (способы проверки описаны в настоящем документе). На фиг. 21 показано, что внутриклеточный домен z, слитый с CD4(D1-D4):Ig:CD7 или с CD4(D1,D2):Ig:CD7, сообщает клетке способность убивать мишень; конструкции, в которых нет цепи z, неспособны опосредствовать такую активность. CD4:z, положительный контрольный объект, опосредствовал несколько более сильную цитотоксичность, a CD4(D1,D2):Ig:CD7:z - несколько менее сильную 19 42760 нием 60-70% трансфицировали 10 мкг ДНК этой плазмиды посредством совместной преципитации с фосфатом кальция. Перед трансфекцией плазмиды привели к линейной форме на уникальном сайте Sfil, а концы выровняли ДНК полимеразой Т4. Через 24 часа после заражения клетки разделили на четыре части, а через 48 часов после заражения их подвергли селекции с гигромицином В (Sigma, St. Louis, Mo), 400 мкг/мл. Каждые 3-4 дня клеткам добавляли свежей среды с гигромицином. Резистентные колонии отбирали, размножали и оценивали их экспрессию посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием анти-IgG Fc человека, конъюгированных с флуоресцеином (Organon Teknika, West Chester, PA), или Q4120 - антител, реагирующи х с CD4 человека (Sigma), с последующей проточной цитометрией (Coulter, Hialeah, FL). Для анализов отобрали по два отдельных клона каждой конструкции, уровень поверхностного CD4 в которых был сравним с уровнем в други х клеточных линиях. На фиг. 22 видно, что после взаимодействия с ВИЧ р24 обнаруживался в культурах, стабильно трансфицированных CD4, уже через три дня после заражения. Появление многоядерных гигантских клеток и характерное вспучивание наблюдалось в этих культурах через пять дней после заражения. В нетрансфицированной родительской клеточной линии и ни в одном из двух отдельно приготовленных изолятов трансфектантов CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7 через 32 дня после заражения не было зарегистрировано ни присутствие р24 в значительном количестве, ни появление многоядерных гигантских клеток (фиг. 22). После исследования заражаемости клетки подверглись анализу на поверхностную экспрессию CD4. Плотность поверхностных эпитопов CD4 значительно снизилась в зараженных культурах, экспрессирующих CD4, что соответствует характеру вирусной модуляции, но не изменилась в культурах, экспрессирующи х CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7. Эти эксперименты показывают, что существует возможность создавать химерные молекулы, содержащие два верхних домена CD4, которые, слившись с цепью z Т-клеточного рецептора, приобретают способность специфически связывать и уничтожать ВИЧ-инфицированные клетки, но не являются восприимчивыми к ВИЧ-инфекции, опосредствуемой CD4. Дополнительные исследования позволяют предположить, что способность сопротивляться ВИЧ-инфекции объясняется пространственным расстоянием между внеклеточным доменом молекулы CD4 и двойным липидным слоем. В первом эксперименте мы сконструировали химерную молекулу с делецией "стебля" CD7 и трансмембранного домена; за счет этой делеции был устранен богатый пролином отрезок трансмембранной части CD7. Когда этот домен соединили с внеклеточным доменом CD4, он сохранил свою способность эффективно связываться с внеклеточным доменом молекулы CD4, как показало измерение поверхностной экспрессии молекулы CD4 (описанное в настоящем документе). Однако, способность сопротивляться образованию синцитиев, вызванному действием гликопротеина оболочки ВИЧ, была утрачена. Так, делеция богатого пролином уча цитотоксичность, чем CD4(D1-D4):Ig:CD7:z (фиг. 21). Однако понятно, что обе химеры CD4(D1-D4):Ig:CD7:z и CD4(D1,D2):Ig:CD7:z обладают способностью опосредствовать специфическое уничтожение клеток, экспрессирующи х на поверхности белки оболочки ВИЧ. В эксперименте с осповакциной четырехчастные химеры проявили стойкую неспособность к опосредствованию образования синцитиев. Мы также продемонстрировали, что одного отрезка z, подобно представленному на фиг. 11А, достаточно для сообщения химере CD4(D1-D4) цитолитической способности. Радиоиммунопреципитационный анализ показал, что слитые молекулы - это преимущественно, если не полностью, димеры. В ходе этого анализа для преципитации растворенного экстракта метаболически меченных клеток HeLa, зараженных рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими химеры CD4(D1-D4):Ig:CD7:z и CD4(D1,D2):Ig:CD7:z, использовались шарики протеин-А агарозы. Преципитированный материал разделили на фракции посредством электрофореза на полиакриламидном геле в восстанавливающи х и невосстанавливающих условиях. В частности, приблизительно 5´106 клеток HeLa-33 заразили, как описано выше, vPE16 - через соответствующий штамм вируса осповакцины. Клетки метаболически пометили меткой Tran35S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) , 200 мкКи/мл, выдержав 6-8 часов в цистеин- и метионин-дефицитной среде, и собрали в фосфатно-солевой буфер, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту. Затем клетки центрифугировали и подвергли лизису в 150 мМ NaCI, 50 мМ трис рН 7,5, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте, 0,5% NP-40, 0,1% додецилсульфате натрия, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте, 1 мМ фенилметилсульфонилфториде. После того, как были отцентрифугированы ядра, одну пятую каждого клеточного экстракта адсорбировали в течение 2 часов при 4°С в промытые шарики агарозы, конъюгированной с протеином А. Затем шарики промыли фосфатно-солевым буфером, содержащим 1% NP-40, и элюировали в буфере для образца, содержащем додецилсульфат натрия, в присутствии или в отсутствие меркапто-этанола. Результаты этих экспериментов показали, что большая часть иммунопреципитированных химер CD4(D1-D4):Ig:CD7:z и CD4(D1,D2):Ig:CD7:z при невосстанавливающих условиях мигрирует в виде димеров с ожидаемой молекулярной массой. Чтобы непосредственно оценить способность клеток, экспрессирующи х слитые молекулы с CD4, к воспринятию ВИЧ-инфекции, мы провели длительное исследование заражаемости с трансфицированными клетками, экспрессирующими CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7. Стабильные трансфектанты, экспрессирующие CD4(D1-D4):Ig:CD7, CD4(D1,D2):Ig:CD7 и CD4, были приготовлены в сублинии клеток 293, легко трансфицируемой линии почечных клеток зародыша человека. Химерные молекулы субклонировали в двунаправленные векторы, в которых ген В гигромицина находился под управлением промотора тимидин киназы симплексного вируса герпеса. Десятисантиметровую ча шку клеток со слия 20 42760 стка молекулы CD7, участка, которому свойственно иметь a-спиральную структур у, значительно сократила расстояние между внеклеточным доменом CD4 и двойным липидным слоем, тем самым лишив химеру способности сопротивляться образованию синцитиев. Во втором эксперименте мы продемонстрировали, что способностью сопротивляться образованию синцитиев, вызванному ВИЧ-инфекцией, можно наделить химеру CD4/CD5, ранее выступавшую в роли трансмембранного якоря для внеклеточного домена CD4, но неспособную сопротивляться образованию синцитиев, вызванному ВИЧинфекцией. В этом эксперименте центральный домен и домены СН2 и СНЗ тяжелой цепи IgGI человека были вставлены в молекулу CD4/CD5; полученная химера противодействовала образованию синцитиев, что снова позволяет предположить, что расстояния, равного длине иммуноглобулиновых доменов, достаточно для обеспечения сопротивляемости образованию синцитиев, вызванному ВИЧ-инфекцией. В третьем эксперименте домен CD4 отодвигали на различные расстояния от клеточной мембраны при помощи синтетических a-спиралей различной длины. В частности, были разработаны синтетические олигонуклеотиды, соответствующие повторяющимся a-спиральным участкам из остатков лизина и глутаминовой кислоты, окаймленным двумя остатками аланина (первичные последовательности нуклеотидов и аминокислот приведены на фиг. 28) В ходе предшествующих исследований выяснилось, что такие аминокислотные последовательности часто встречаются в a-спиралях, а значит, можно предположить, что такие повторяющиеся участки принимают a-спиральную структур у и что помещение таких альфа спиралей между трансмембранным доменом и внеклеточным доменом CD4 отодвигает CD4 от клеточной мембраны. Изменяя длину a-спирального сегмента, мы определили (на основании известных величин подъема и поворота спирали) вынос, необходимый для обеспечения сопротивляемости к проникновению ВИЧ-инфекции. Эти результаты представлены в таблице. Таблица A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk В. CD4(D1,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk C. CD4+CD7tm+stk D. CD4+CD7tm (длинная версия) E. CD4+CD7tm (короткая версия) F. CD4+CD5tm G. CD4+CH2+CH3+CD5tm H. CD4+CH3+CD5tm I. CD4+CD34tm J. CD4+cинтeтичecкaя a-спираль (24 ангстрем)+CD34tm К. СD4+синтетическая a-спираль (48 ангстрем)+CD34tm L. СD4+синтетическая a-спираль (72 ангстрем)+CD34tm Образование синцитиев +/-(а) + + + + данных нет данных нет данных нет Экспрессия Thy-1 + + + + данных нет + + +/-(а) а - значительное уменьшение количества синцитиев или клеток, экспрессирующих Th y-1 В этой таблице "CD4" обозначает CD4(D1D4), если не указано иное; "Н", "СН2", и "СН3" обозначают центральный домен и домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgGI человека, соответственно; CD7tm+stk обозначает "стебель" и трансмембранный домен CD7; "CD7tm (длинная версия)" и "CD7tm (короткая версия)" обозначают, соответственно, трансмембранный участок CD7 и трансмембранный участок CD7 без богатого пролином домена (см. выше); "CD5tm" обозначает трансмембранный участок CD5; "CD34tm" обозначает трансмембранный участок CD34. В позициях J-L указана длина a-спирального участка в ангстремах, эти значения выведены на основании того, что на 1 виток a-спирали приходится 3,6 остатка, что соответствует 5,4 Å (или 1,5 Å на остаток). Следовательно, a-спираль из 16 остатков вынесет внеклеточный домен CD4 на 24 ангстрема. Альфа-спирали высотой в 48 и 72 ангстрема были получены путем последовательной конкатемеризации фрагмента BstY1 в уникальный сайт BamH1 на этом участке (см. фиг. 28), с последующим отбором клонов нужной ориентации. Количество образовавшихся синцитиев подсчитывали в экспериментах с совместной культивацией, в которых использовались клетки HeLa; экспрессирующие гликопротеин оболочки ВИЧ-1 из конструкции vPE16 на основе вируса осповакцины (см. выше). Экспрессию Thy-1 измеряли следующим образом. Был сконструирован живой ретровирусный вектор на основе клона hxb.2 ВИЧ-1. В этом векторе второстепенный ген nef заменили последовательностью, кодирующей крысиный thy-1 - эффективно экспрессируемую молекулу, соединенную с мембраной фосфатидилинозитной связью. Вирус, полученный из этого молекулярного клона и обозначенный hxb/thy-1, был заразным, так как давал цитопатологические эффекты и способствовал выработке р24 в супернатантах культуры зараженных клеток С8166 (линия Т-клеточного лейкоза человека, Т-клетки CD4+). Кроме того, после обработки вирусом hxb/thy-1 и преходящей трансфекции CD4 клетки HeLa проявляли признаки экспрессии thy-1 уже через 18 часов после заражения, как и следовало ожидать для объекта, управляемого по образцу nef. Сообще 21 42760 ния, кодируемые геном nef, обычно относятся к классу вирусных регуляторных белков, в которых происходит множественный сплайсинг и отсутствуе т элемент ответа rev. Эти сообщения могут накапливаться в цитоплазме в значительном количестве в виде ранних генов. Ожидалось, что сообщения thy-1 будут вести себя подобным образом, т.е. встречаться на ранних стадиях жизненного цикла вируса. Говоря вкратце, эта система облегчила проверку проникновения ВИЧ, так как экспрессия thy-1 служила его суррогатом. Проводилась преходящая трансфекция клеток HeLa различными химерами CD4 при помощи стандартных способов с использованием диэтиламиноэтил-декстрана. Трансфицированные клетки подвергали обработке hxb/thy-1 через 48 часов после трансфекции и измеряли экспрессию thy-1 через 24-48 часов после заражения. Результаты, представленные в таблице, относятся к эспрессии thy-1, измеренной через 24 часа после заражения при помощи стандартного моноклонального антитела к thy-1 (Accurate). На основании результатов, приведенных в таблице, мы заключили, что внеклеточные домены CD4 лучше всего отодвигать от поверхности клетки по меньшей мере на 48 ангстрем, а предпочтительно по меньшей мере на 72 ангстрема, чтобы клетка могла сопротивляться ВИЧинфекции. При использовании стратегии, подобной генеральной стратегии, описанной в настоящем документе, можно конструировать химеры на основе антител к оболочке ВИЧ, которые будут специфически связывать ВИЧ-инфицированные клетки. Примеры таких антител описаны у Gorny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1624 (1989) и Marasco et al., J. Clin. Invest. 90:1467 (1992). Пример XI Другие белки-инициагоры, полученные из Тклеточного и В-клеточного рецептора Из белков Т-клеточного рецептора CD3 дельта и Т3 гамма и белков В-клеточного рецептора mb1 и В29 можно получить другие внутриклеточные и трансмембранные домены, проводящие сигнал и соответствующие настоящему изобретению. Аминокислотные последовательности этих белков приведены на фиг. 16 (CD3 дельта, последовательность № 24), фиг. 17 (Т3 гамма, последовательность № 25), фиг. 18 (mb1, последовательность № 26) и фиг. 19 (В29, последовательность № 27). Участки последовательностей, которых достаточно для передачи цитолитического сигнала (и поэтому их желательно включать в химерные рецепторы, соответствующие настоящему изобретению), отмечены скобками. Химерные рецепторы, содержащие эти белковые домены, конструируются и используются для осуществления способов лечения, предложенных настоящим изобретением, в общем как описано выше. Пример XII Экспериментальные методы Заражение осповакциной и радиоиммунопреципитация Приблизительно 5´106 клеток CV1 инфицировали в течение одного часа в бессывороточной среде DME рекомбинантами осповакцины со множественностью заражения не меньше десяти (титр определялся по клеткам CV1). После заражения клетки поместили в свежую среду и метаболически пометили 200 мкКи/мл 35S-метионина и цистеина (метка Тrаn 35S-label, ICN; Costo Mesa, CA) в среде Игла, модифицированной по Дульбекко и не содержащей метионина и цистеина (DMEM) (Gibco; Grand Island, NY). Обработка продолжалась шесть часов. Меченые клетки отделили при помощи фосфатно-солевого буфера, содержащего 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, собрали посредством центрифугирования и подвергли лизису в 1% NР-40, 0,1% додецилсульфате натрия, 0,15 М NaCI, 0,05 М трис рН 8,0, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте и 1 мМ фенилметилсульфонилфториде. Ядра отобрали посредством центрифугирования, а белки CD4 иммунопреципитировали при помощи антител ОКТ4 и агарозы с мышиным анти-IgG (Cappel, Durham, NC). Образцы подвергли электрофорезу в 8% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия при невосстанавливающих (NR) и восстанавливающих (R) условиях. Гели, содержащие образцы, меченные 35S, перед авторадиографией пропитали составом En3Hance (New England Nuclear, Boston, MA). Облегченную экспрессию трансмембранной формы CD16, CD16TM измеряли путем сравнения ее экспрессии в клетках CV1, зараженных только СВ16TM, с экспрессией в клетках, зараженных вирусами, кодирующими CD16TM и химерами z или g. После заражения и выдержки в течение 6 или более часов клетки отбирали из чашек в фосфатно-солевой буфер с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой и проводили измерение экспрессии CD16TM и химер способом непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. Анализ переноса кальция Сублинию Е6 клеток Jurkat (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) инфицировали рекомбинантными вирусами осповакцины в течение одного часа в бессывороточной среде IMDM со множественностью заражения 10 и выдерживали от трех до девяти часов в среде IMD M с 10% фосфа тно-солевого буфера. Клетки отбирали центрифугированием и взвешивали в концентрации 3´106 клеток/мл в полной среде, содержащей 1 мМ Индо-1 ацетометоксиэфир (сложный) (Grynkiewiсz et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985)) (Molecular Probes), затем выдерживали 45 минут при 37°С. Клетки, нагруженные Индо-1, центрифугировали, взвешивали в количестве 1´106/мл в бессывороточной среде IMDM и хранили в темноте при комнатной температуре. Анализ на свободные ионы кальция проводили путем одновременного измерения голубой и фиолетовой флуоресценции при проточной цитометрии (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). Для запуска переноса кальция к суспензии клеток в момент времени 0 добавляли либо конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) антитела Leu-3А (против CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) в концентрации 1 мкг/мл, затем неконъюгированные козьи антитела к мышиному IgG в концентрации 10 мкг/мл, либо неконъюгированные моноклональные антитела 3G8 (против CD16) в концентрации 1 мкг/мл, а затем козьи антитела 22 42760 (51Сr, 1 мКи/мл, Dupont Wilmington, DE) на один час при 37°С, время от времени перемешивая, затем три раза промыли фосфатно-солевым буфером. Сто мкл меченых клеток снова взвесили в среде с плотностью 105 клеток/мл и добавили в каждую ячейку. Клетки Rajі и RJ2.2.5 метили также, как и клетки HeLa, Микропланшет вращали в течение 1 минуты при 750´g и выдерживали 4 часа при 37°С. В конце периода инкубации клетки в каждой ячейке осторожно взвешивали посредством пипетирования, отбирали образец для подсчета и вращали микропланшет в течение 1 минуты при 750´g. Порции по 100 мкл супернатанта отбирали и проверяли в гамма-сцинтилляционном счетчике. К проценту уничтожения была сделана поправка на долю инфицированных клеток-мишеней (обычно 50-90%), определенную посредством проточной цитометрии. К отношению эффектор:мишень для инфицированных эффекторных клеток была сделана поправка на процент зараженных клеток (обычно 20-50% для экспериментов с химерным рецептором CD4 и >70% для экспериментов с химерным рецептором CD16). Мутагенез последовательности z in vitro Для получения точечных мутаций в позициях 11 и/или 15 аминокислотной последовательности z были приготовлены синтетические олигонуклеотидные затравки-последовательности от сайта BamHI у начала трансмембранного домена z, преобразующие остаток 11 нативной z из Cys в Gly (C11G), или остаток 15 из Asp в Gly (D15G), или оба остатка (C11G/D15G), которые были использованы в цепных полимеразных реакциях для построения фрагментов с мутациями, которые затем вставлялись в конструкции CD4:z дикого типа. Для получения делеций в последовательности z кДНК z были амплифицированы посредством цепных полимеразных реакций, в которых были использованы синтетические олигонуклеотидные затравки, сконструированные для создания стоп-кодона (UAG) после остатков 50, 59 или 65. Затравки содержали сайт расщепления для фермента NotI, отстоящий на 5 или 6 остатков от конца 5', обычно в последовательности вида CGC GGG CGG CCG СТА (последовательность № 11), где три последних остатка соответствуют стоп-антикодону. За последовательностями NotI и стоп-антикодона шли 18 или более остатков, комплементарных требуемому концу 3' фрагмента. Полученные химеры были обозначены CD16:zY51*, CD16:zE60* и CD16:zD66*, соответственно. Сайт BamHI у начала трансмембранного домена и сайт NotI использовались для генерации фрагментов, которые вставлялись в конструкции CD16:z дикого типа. Мономерные химеры z строились путем высвобождения трансмембранной и примембранной внутриклеточной последовательностей z за счет переваривания ферментами BamHI и SacI конструкции CD4:z Asp- и Cys -, описанной выше, и осуществления вставки этого фрагмента в конструкции CD16:zE60* и CD16:zD66*, соответственно. Трехчастные химерные конструкции CD16:7:z(48-65) и CD16:7:z(48-59) Fаb2' к мышиному IgG, конъюгированные с фикоэритрином, в концентрации 10 мкг/мл. Были собраны гистограммы отношения фиолетового излучения к голубому для популяции РЕ-положительных (зараженных) клеток, которые обычно составляли 40-80% от всех клеток. Ответ Т-клеточного антигенного рецептора в незараженных клетках запускался антителами ОКТ3 без перекрестного связывания. В экспериментах с химерными рецепторами CD16 образцы, в которых наблюдался исходный сдвиг в сторону снижения внутриклеточной концентрации кальция (без антител), исключались из анализа. Гистограммы анализировали путем перевода двоичных данных в коды ASCII при помощи программы Write Hand Man (Cooper City, FL) и последующей обработки при помощи ряда программ на ФОРТРАНе (FORTRAN). Для определения исходного нормализованного отношения фиолетового излучения к голубому (приравниваемого к единице) использовали отношение, наблюдаемое перед добавлением второго реагента-антитела. Его же использовали для определения порогового отношения в покое, которое установили так, чтобы 10% популяции в покое находилось над порогом. Анализ цитолитической активности Т-клеточную линию WH3 человека, цитолитичеcкую линию с рестрикциями CD8+, CD4 -, HLA B44, выдерживали в среде IMDM с 10% человеческой сыворотки и с 100 Ед/мл IL-2 и периодически стимулировали либо неспецифически, облученными (3000 рад) не соответствующими по HLA лимфоцитами периферийной крови и фитогемагглютинином в концентрации 1 мкг/мл, либо специфически, облученными одноядерными клетками с B44. Через день неспецифической стимуляции фитогемагглютинин разбавили до 0,5 мкг/мл свежей средой, а через три дня среду сменили. Между стимуляцией и анализом цитотоксичности клетки культивировали не менее 10 дней. Клетки инфицировали рекомбинантами осповакцины со множественностью заражения не менее 10 в течение одного часа в бессывороточной среде, затем выдерживали три часа в полной среде. Клетки отбирали центрифугированием и взвешивали с плотностью 1´107 клеток/мл. В Uобразной титрационный микропланшет, в каждой ячейке которого содержалось по 100 мкл полной среды, добавляли по 100 мкл взвеси, затем разбавляли вдвое последовательными шагами. Две ячейки на каждый образец не содержали лимфоцитов, чтобы можно было измерить спонтанное высвобождение хрома и его суммарное поглощение. Клетки-мишени, взятые из сублинии HeLa S3, инфицировали в 6- или 10-сантиметровых чашках, с приблизительной множественностью заражения 10, в течение одного часа в бессывороточной среде, затем выдерживали в полной среде в течение трех часов. Затем их выделили при помощи фосфатно-солевого буфера с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой и пересчитали. Порцию в 106 клеток-мишеней (HeLa, Rajі или RJ2.2.5 для экспериментов с химерным рецептором CD4 и клеток 3G8 10-2; Shen et аl., Моl. Immunol. 26:959 (1989) для экспериментов с химерным рецептором CD16) центрифугировали и взвесили в 50 мкл стерильного натрия хромата 23 42760 получен при помощи цепной полимеразной реакции с использованием олигонуклеотида с такой последовательностью: CGC GGG GCG GCC ACG CGT ССТ CGC CAG САС АС А (последовательность № 14). Полученный фрагмент переварили при помощи BamHI и Notl и повторно вставили в конструкцию CD16:7:z(48-65). Фрагменты z, кодирующие остатки с 33 по 65, с 71 по 104 и со 104 по 137, были получены при помощи цепной полимеразной реакции с использованием пар затравок, содержащих сайты Mlul на конце 5' (прямые затравки) и стоп-кодоны, за которыми следуют сайты Notl, также на конце 5' (обратные затравки). В каждом случае сайты рестрикции отстояли на шесть остатков от конца 5' затравки, чтобы расщепление рестрикционным ферментом было гарантированным. z 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT ССТ CGC CAG С АС АС А (последовательность № 15) z 71: CGC GGG ACG CGT GAC ССТ GAG ATG GGG GGA AAG (последовательность № 16) и z 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (последовательность № 17). Построение делеционных мутантов FcRgIIA Мутанты FcRIIA с делециями на карбоксильном конце были сконструированы при помощи цепных полимеразных реакций тем же способом, что и конструкции полной длины, с преобразованием последовательностей, кодирующих тирозин в позициях 282 и 298, в стоп-кодоны (ТАА). Аминоконечные делеции были получены путем амплификации фрагментов, кодирующи х все меньшие части вн утриклеточного домена, при помощи цепных полимеразных реакций, с использованием олигонуклеотидов, позволяющих вставлять полученные фрагменты между рестрикционными сайтами Mlul и NotI ранее сконструированной экспрессионной плазмиды, кодирующей внеклеточный домен CD16, слитый с трансмембранным доменом CD7 (который заканчивается на сайте Mlul - в месте соединения трансмембранного и внутриклеточного доменов). Другие варианты осуществления изобретения Приведенные выше примеры показывают, что агрегации химер z, h или g, доста точно для запуска цитолитического эффекторного клеточного ответа в Т-клетках. Известный диапазон экспрессии z, h и g, в который входят Т-лимфоциты, естественные клетки-киллеры, базофилы, гранулоциты, макрофаги и тучные клетки, позволяет предположить, что сохранившиеся отрезки последовательности могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, общим для клеток кроветворной системы, и что важная составляющая защиты, обеспечиваемой иммунной системой, может быть опосредствована агрегацией рецепторов. Сила цитолитического ответа и отсутствие ответа по отношению к клеткам-мишеням, несущим рецепторы класса II ГКГС, показывает, что химеры, основанные на z, h или g, служат основой генетического вмешательства при СПИДе, которое осуществляется при помощи адоптивной Для приготовления конструкции CD16:zD66* последовательность кДНК z, соответствующую трансмембранному домену и 17 первым остаткам цитоплазматического домена, заменили соответствующими трансмембранным и цитоплазматическим доменами, полученными из кДНК CD5 и CD7. Фрагменты CD5 и CD7 были получены при помощи цепных полимеразных реакций с использованием олигонуклеотидов прямой последовательности, содержащих сайт рестрикционного расщепления BamHI и соответствующи х участку, прилегающему "сверху" к трансмембранному домену CD5 и CD7, соответственно, и представленных ниже олигонуклеотидов обратной последовательности, перекрывающихся с последовательностями CD5 и CD7, соответственно, и последовательности z, содержащей сайт SacI рестрикционного расщепления. CD5:z: CGC GGG СТС GTT АТА GAG CTG GTT CTG GCG CTG СТТ СТТ CTG (последовательность № 12) CD7:z: CGC GGG GAG СТС GTT АТА GAG CTG GTT TGC CGC CGA АТТ СТТ АТС CCG (последовательность № 13) Продукты цепной реакции CD5 и CD7 переварили BamHI и SacI и сшили с CD16:zE60*, переваренной ферментами BamHI и SacI. Этим фрагментом CD7 была заменена последовательность цепи z от BamHI до SacI. Для построения конструкций CD16:CD5 и CD16:CD7 фрагменты CD5 и CD7 готовили при помощи цепной полимеразной реакции с использованием олигонуклеотида, содержащего сайт NotI рестрикционного расщепления и кодирующий стоп-кодон (UAA) после остатков Gln416 и А1а193 CD5 и CD7, соответственно. Фрагменты CD5 и CD7 переварили при помощи BamHI и NotI и вставили в конструкцию CD16:zAsp66*. Мутагенез in vitro аминоконечных остатков отрезка z, проводящего цитолитический сигнал Были получены синтетические олигонуклеотидные затравки с началом от сайта SacI в упомянутом отрезке z, преобразующие остаток 48 нативной z из Asn в Ser (N48S), остаток 50 из Leu в Ser(L50S) и остаток 51 из Туr в Phe (Y51F), и использованы в цепной полимеразной реакции для построения фрагментов, которые повторно вводились в конструкцию CD16:7:z(48-65) дикого типа. Мутагенез in vitro С-конечных остатков отрезка z, проводящего цитолитический сигнал Были получены синтетические олигонуклеотидные затравки от 3'-конечного сайта NotI до стоп-кодона, преобразующие остаток 60 нативной z из Glu в Gln (E60Q), остаток 61 из Glu в Gln (E61Q), остаток 62 из Туr в Phe или Ser (Y62F) или (Y62S) и остаток 63 из Asp в Asn (D63N), и использованы в цепной полимеразной реакции для построения фрагментов, которые были субклонированы в конструкцию CD16:zD66* дикого типа между сайтами BamHI и Notl. Химерные конструкции CD16:7:z(33-65), CD16:7:z (71-104) и CD16:7:z(104-137) Трансмембранный фрагмент CD7, содержащий сайты Mlul и Notl в месте соединения трансмембранного и внутриклеточного домена, был 24 42760 иммунотерапии. Широкое распространение эндогенных z и g и данные о том, что Fc-рецепторы, связанные с g, опосредствуют цитотоксичность в клетках различных типов (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99 (1989)), позволяет рассматривать возможность применения в этих целях различных клеток. Например, нейтрофильные гранулоциты, которые очень недолго (»4 часа) живут в системе кровообращения и обладают очень сильной цитолитической способностью, представляют собой привлекательное место экспрессии таких химер. Заражение нейтрофилов ВИЧ, скорее всего, не приведет к высвобождению вируса, а обилие эти х клеток (они преобладают среди лейкоцитов) должно облегчить организмухозяину задачу защиты. Еще один привлекательный носитель химер - это зрелые Т-клетки, популяция, в настоящее время доступная ретровирусной инженерии (Rosenberg, S.A. Sci. Am. 262:62-69 (1990)). При помощи рекомбинантных IL-2 популяции Т-клеток сравнительно легко размножаются в культуре, и такие размноженные популяции, вернувшись в организм, обычно живут недолго (Rosenberg et al., N. Engi. J. Med. 323:570-578 (1990)). При подходящих условиях распознавание ВИЧ клетками, экспрессирующими химеры CD4, должно служить также митогенным стимулом, чтобы вооруженная популяция клеток могла динамически отвечать на вирусную нагрузку. Хотя здесь мы сосредоточились на поведении слитых белков в цитолитических Т-лимфоцитах, экспрессия этих химер в лимфоцитах-хелперах могла бы стать ВИЧ-стимулируемым источником цитокинов, которые противодействовали бы уничтожению подгруппы хелперов при СПИДе. Появившиеся недавно описания схем конструирования сопротивления инфекции, проявляющегося на этапах, отличных от этапа проникновения вируса (Friedman et al., Nature 335:452454 (1988); Green et al., Cell 58:215-223 (1989); Malim et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al., Cell 59:113-120 (1989); Buonocore et al., Nature 345:625-628 (1990)), позволяют предположить, что клетки с химерными рецепторами CD4 можно перестроить таким образом, что они будут препятствовать выработке вируса за счет экспрессии соответствующи х агентов, действующи х внутри клетки. Способность передавать сигналы Т-лимфоцитам через автономные химеры обеспечивает также способность управлять лимфоцитами, подвергшимся ретровирусной инженерии, в живом организме. Такой раздражитель как перекрестное связывание, опосредствованное, например, специфическими антителами IgM, настроенными на удаление доменов, связывающих комплемент, может позволить увеличивать количество таких лимфоцитов на месте, а лечение подобными специфическими антителами IgG (например, распознающими аминокислотную вариацию, вставленную в химерную цепь) могло бы избирательно истощать сконструированную популяцию. Кроме того, антитела IgM к CD4 не требуют дополнительного перекрестного связывания для мобилизации кальция в клетках Jurkat, экспрессирующи х химеры CD4:z. Возможность регулировать численность клеток в популяции, не прибегая к неоднократной экстракорпоральной амплификации, может значительно расширить область и увеличить эффективность применения Т-клеток, обработанных методами генной инженерии, по сравнению с настоящим моментом. Настоящее изобретение было описано лишь в связи с отдельными вариантами его осуществления, но следует понимать, что существует возможность его модификации, и настоящее изобретение распространяется на видоизменения, другие способы использования или варианты адаптации настоящего изобретения, предусматривающие такие отклонения от изложенного выше, которые возможны в этой области деятельности, допустимы в рамках настоящего изобретения и согласуются с его основными особенностями, определенными формулой изобретения. Сведения о последовательностях 25 42760 26 42760 27 42760 28 42760 29 42760 30