Виділене антитіло людини або його антиген-зв’язувальна частина, що зв’язує tnfa

Реферат: Винахід належить до антиген-зв'язувальної частини антитіла, що зв'язує TNFα людини, dAb фрагменту виділеного антитіла людини, що зв'язує TNFα людини, виділеного антитіла людини, UA 102988 C2 (12) UA 102988 C2 фармацевтичної композиції, способу лікування захворювання, ізольованої нуклеїнової кислоти, рекомбінантного вектора експресії, клітини-хазяїна, способу синтезу антитіла. UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рівень техніки Фактор  некрозу пухлин (TNF  ) є цитокіном, що виробляється багатьма видами клітин, включаючи моноцити та макрофаги, що було спершу досліджено за його здібністю стимулювати некроз певних мишачих пухлин (див, наприклад, Old, L. (1985) Science 230:630-632). Поступово було показано, що фактор, що називався кахектин, пов'язаний з кахексією, є тією ж самою молекулою, що і TNF  . TNF  використовували при опосередкуванні шоку (див., наприклад, Beutler, В. та Сеrаmі, А. (1998) Annu. Rev. Biochem. 57:505-518; Beutler, В. та Сеrаmі, А. (1998) Annu. Rev. Immunol. 7:625-655). Більш того, TNF  використовували у патофізіології багатьох інших захворювань та розладів людини, включаючи сепсис, інфекції, автоімунні захворювання, відторгнення трансплантата та захворювання трансплантат проти хазяїна (див., наприклад, Moeller, A., et аІ. (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No. 5,231,024 Moller et all; патент ЄПВ No.260 610 B1 Moeller, A., et al., Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452; Tracey, K.J. та Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503). Внаслідок згубної ролі TNF  людини (hTNF  ) в багатьох розладах людини було розроблено терапевтичні стратегії для інгібування або протидії активності hTNF  . Зокрема, вважали, що антитіла, які зв'язують та нейтралізують hTNF  , є засобом інгібування активності hTNF  . Деякі з таких перших антитіл були мишачими моноклональними антитілами (мАТ), які секретувались гібридомами, одержаними з лімфоцитів мишей, імунізованих hTNF  (див., наприклад, Hahn Т., et al., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:3814-3818; Liang, C-M., et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137:847-854; Hiarai, M., et al. (1987) J. Immunol. Methods 96:5762; Fendly, B.M., et al. (1987) Hybridoma 6:359-370; Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No. 5,231,024 Moeller et al.; патент ЄПВ №186 833 B1 Wallach, D.; патент ЄПВ №218 868 Al Old et al; патент ЄПВ №260 610 Bl Moeller, A. et al). В той час, як такі мишачі анти-9 hTNF  антитіла часто демонструють високу афінність до hTNF  (наприклад, Кд = 10 М) та здатні нейтралізувати активність hTNF  , їх використання in vivo може бути обмежено такими проблемами, пов'язаними з уведенням мишачих антитіл людині, як коротке напівжиття сироватки, нездатність запускати деякі ефекторні функції людини та викликання небажаної імунної відповіді проти мишачих антитіл у людини (реакція "анти-мишачі антитіла людини" НАМА). Як спроба уникнути проблем, пов'язаних з використанням повністю мишачих антитіл для людини, мишачі анти-hTNF  антитіла були змінені завдяки генній інженерії для того, щоб вони були більш "людиноподібні". Наприклад, були одержані химерні антитіла, в яких варіабельні райони ланцюгів антитіла походять від мишачих антитіл, а константні райони ланцюгів антитіла походять від антитіл людини (Khight, D. M., et al. (1993) Моl. Immunol. 30:1443-1453; РСТ Публікація № WO 92/16553 Daddona, P. E., et al.). Додатково були одержані також олюдненні антитіла, в яких гіперваріабельні домени варіабельних районів антитіл походять від миші, але залишок варіабельних районів та константні райони антитіла походять від людини (РСТ Публікація № WO 92/11383 Adair, J. R., et al.). Однак, оскільки в цих химерних олюднених антитілах все ще залишаються деякі мишачі послідовності, вони можуть викликати небажану імунну реакцію, реакцію людини проти химерного антитіла (НАСА), особливо при введенні протягом довгого періоду, зокрема, при хронічних захворюваннях, таких як ревматоїдний артрит (див, зокрема, Elliott, M.J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M. J., et al. (1994) Lancet 344:1105-1110). Найкращим інгібуючим агентом hTNF  для мишачих мАТ або їх похідних (зокрема, химерних та олюднених антитіл) були б повністю анти-hTNF  антитіла людини, оскільки такий агент не викликатиме реакції НАМА навіть при використанні протягом довгого часу. Були одержані моноклональні автоантитіла проти hTNF  при використанні гібридомної технології людини (Boyle, P, et al. (1993) Cell Immunol. 152:556-568; Boyle, P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152:569-581; заявка ЄПВ №614 984 A2 Boyle et al.). Однак, повідомлялось, що ці гібридомапохідні моноклональні автоантитіла мають афінність до hTNF  , яка надто мала для встановлення її традиційними способами, та не здатні зв'язувати розчинний hTNF  та нейтралізувати індуковану hTNF  цитотоксичність (див. Boyle, et al., вищевказане посилання). Більш того, успіх гібридомної технології людини залежить від природної присутності в людській периферійній крові лімфоцитів, які виробляють автоантитіла, специфічні до hTNF  . Певні досліди виявили автоантитіла сироватки проти hTNF  в людських препаратах (Fomsgaard, A., et al. (1989) Scand. J. Immunol. 30:219-223; Bendtzen, K., et al. (1990) Prog. Leukocyte Biol. 10B:447-452), в той час, як інші не виявили (Leusch, H-G., et al. (1991) J.Immunol. Methods 139:145-147). 1 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Альтернативою до анти-hTNF  антитіл, природно існуючих, є рекомбінантні анти-hTNF  антитіла. Були описані рекомбінантні антитіла людини, які зв'язують hTNF  з порівняно -7 -2 -1 низькою активністю (а саме, Кд ~ 10 М) та високим спадом швидкості (а саме, Ксп ~10 с ) (Griffiths, A.D., et аІ. (1993) EMBO J. 12:725-734). Однак, внаслідок їх порівняно швидкої кінетики дисоціації, ці антитіла не можуть бути зручними для терапевтичного використання. Додатково, було показано, що рекомбінантні анти-hTNF  антитіла людини не нейтралізують активність hTNF  , а скоріше посилюють зв'язування hTNF  з поверхнею клітин та посилюють інтерналізацію hTNF  (Lidbury, A., et аІ. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; Публікація РСТ No. WO 92/03145 Aston, R. et al.). Відповідно, існує потреба в антитілах людини, таких як рекомбінантні антитіла людини, що зв'язують розчинний hTNF  з високою афінністю та повільною кінетикою дисоціації, та здібні нейтралізувати активність hTNF  , включаючи індуковану hTNF  цитотоксичність (in vitro та in vivo) та індуковану hTNF  активацію клітин. Опис винаходу Даний винахід забезпечує антитілами людини, переважно рекомбінантними антитілами людини, які специфічно зв'язують hTNF  людини. Антитіла даного винаходу характеризуються зв'язуванням з hTNF  з високою афінністю та повільною кінетикою дисоціації та нейтралізацією активності hTNF  , включаючи викликану hTNF  цитотоксичність (in vitro та in vivo) та викликану hTNF  активацію клітин. Антитіла даного винаходу надалі характеризуються за зв'язуванням з hTNF  , але не з hTNF  (лімфотоксин), та за наявністю здібності зв'язувати інші hTNF  приматів та hTNF  не приматів разом з hTNF  людини. Антитіла даного винаходу можуть бути цільноланцюговими (а саме, IgG1 або IgG4 антитіла), або можуть включати тільки антиген-зв'язуючу частину (а саме, фрагменти Fab, F(ab')2 або scFv). Найкращі рекомбінантні антитіла даного винаходу, позначені як D2E7, мають домен CDR3 легкого ланцюгу, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3, та домен CDR3 важкого ланцюгу, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4. Антитіла D2E7 мають переважно варіабельний район легкого ланцюгу (LCVR), що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, та варіабельний район важкого ланцюгу (HCVR), що включає амінокислотну послідовність SEQ ED NO:2. В одному з втілень даний винахід забезпечує ізольованими людськими антитілами або їх -8 антиген-зв'язуючими частинами, які дисоціюють від людського hTNF  з Кд 1 × 10 М або менше -3 -1 та Ксп константою швидкості 1 × 10 с або менше, що одержано способом резонансу поверхневого плазмону, та нейтралізують цитотоксичність hTNF  людини в стандартному -7 досліді L929 in vitro з ІС50 1 × 10 М або менше. Добре, якщо ізольовані людські антитіла або їх -4 -1 антиген-зв'язуючі частини дисоціюють з hTNF  людини з Ксп 5 × 10 с або менше, або ще -4 -1 краще з Ксп 1 × 10 с або менше. Краще, якщо ізольовані антитіла людини або їх антигензв'язуючі частини нейтралізують цитотоксичність hTNF  людини в стандартному досліді in vitro -8 -9 L929 з ІС50 1 × 10 М або менше, навіть переважніше з ІС50 1 × 10 М або менше, та ще -10 переважніше з ІС50 5 × 10 М або менше. В іншому втіленні даний винахід забезпечує антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами, що мають такі характеристики: -3 -1 а) дисоціація з людського hTNF  з Ксп 1 × 10 с або менше, що досліджено резонансом поверхневого плазмону; б) вони мають домен CDR3 легкого ланцюгу, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 або модифіковану SEQ ID NO:3 шляхом одиничної заміни аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 чи 8, або від одного до п'яти консервативних амінокислотних заміщень в положеннях 1, 3, 4, 6, 7, 8 та/або 9; в) мають домен CDR3 важкого ланцюгу, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4, або модифіковану SEQ ID NO:4 шляхом одиничного заміщення аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 або 11, або від одного до п'яти заміщень в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 та/або 12. Переважніше, дані антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини дисоціюють від hTNF  людини -4 -1 з Ксп 5 × 10 с або менше. Все ж таки більш переважно, щоб антитіла або їх антиген-зв'язуючі -4 -1 частини дисоціювали з hTNF  людини з Ксп 1 × 10 с або менше. Ще в одному втіленні даний винахід забезпечує людськими антитілами або їх антиген-зв'язуючими частинами з LCVR, які мають домен CDR3, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3, або модифіковану SEQ ID NO:3 шляхом заміни одного аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 чи 8, та з HCVR, що має домен CDR3, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 або модифіковану SEQ IS NO:4 шляхом заміни одного аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11. Переважніше, LCVR надалі має домен CDR2, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5, а HCVR надалі має домен CDR2, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:6. Ще 2 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 переважніше, щоб LCVR мав надалі домен CDR1, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:7, а HCVR мав домен CDR1, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:8. В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами з LCVR, що включають амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, та HCVR, що включають амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2. В певних втіленнях дані антитіла мають константну частину важкого ланцюгу IgGl або константну частину важкого ланцюгу IgG4. В ще одному втіленні такі антитіла є Fab фрагментами, F(ab')2 фрагментами або одноланцюговим Fv фрагментом. В ще інших втіленнях даний винахід забезпечує антитілами або їх антиген-зв'язуючими частинами, в яких домен CDR3 LCVR включає амінокислотну послідовність, вибрану з наступної групи: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 з або без HCVR, що має домен CDR3, який включає амінокислотну послідовність, обрану з групи: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 та SEQ ID NO:35. Ще в одному втіленні даний винахід забезпечує виділеними антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами, що нейтралізують активність TNF  людини, але не TNF  людини (лімфотоксин). В переважному втіленні антитіла людини або їх антиген-зв'язуюча частина нейтралізує активність TNF  людини, TNF  шимпанзе та TNF  принаймні одного примата, вибраного з групи, до якої входять TNF  бабуїна, TNF  мавпи, TNF  павіана, та TNF  резуса. Переважно, дані антитіла також нейтралізують активність TNF  принаймні одного не примата. Наприклад, в одному з втілень ізольовані антитіла людини або їх антигензв'язуючі частини також нейтралізують і активність собачого TNF  . В іншому втіленні ізольовані антитіла людини або їх аниген-зв'язуючі частини також нейтралізують активність TNF  свині. В ще одному втіленні ізольовані антитіла людини або їх антиген-зв'язуючі частини також нейтралізують активність TNF  миші. Інший аспект даного винаходу торкається молекул нуклеїнових кислот, що кодують антитіла даного винаходу або їх антиген-зв'язуючі частини. Переважною нуклеїновою кислотою даного винаходу, що кодує D2E7 LCVR, є нуклеотидна послідовність, яка показана на Фіг. 7 та SEQ ID NO:36. Іншою переважною нуклеїновою кислотою даного винаходу, що кодує D2E7 HCVR, є нуклеотидна послідовність, яка показана на Фіг. 8 та SEQ ID NO:37. Вектори рекомбінантної експресії, які несуть нуклеотидні послідовності, кодуючі антитіла даного винаходу, та клітинихазяї, в які такі вектори були уведені, також охоплюються даним винаходом, як і способи одержання антитіл винаходу шляхом культивування клітин-хазяїна винаходу. Ще одним аспектом даного винаходу є способи інгібування активності TNF  людини завдяки використанню антитіл винаходу або їх антиген-зв'язуючих частин. В одному з втілень даний спосіб включає контактування людського TNF  з антитілом винаходу або його антигензв'язуючою частиною, таким чином, що інгібується активність TNF  людини. В іншому втіленні спосіб включає уведення антитіл винаходу або їх антиген-зв'язуючих частин людині, яка страждає на розлад, при якому активність TNF  є згубною, так, що активність TNF  в організмі людини інгібується. Таким розладом може бути, наприклад, сепсис, автоімунне захворювання (а саме, ревматоїдний артрит, алергія, множинний склероз, автоімунний діабет, автоімунний увеіт та нефротичний синдром), інфекційне захворювання, злоякісне утворення, відторження трансплантата або захворювання трансплантат-проти-хазяїна, пульмональний розлад, кістковий розлад, кишковий розлад або серцевий розлад. Короткий опис фігур На Фіг. 1А та 1В зображено амінокислотні послідовності варіабельного району легкого ланцюга D2E7 (D2E7 VL; також показано на SEQ ID NO:1), мутанти по аланіну D2E7 VL (LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7 та LD2E7*.A8), варіабельний район легкого ланцюга О2Е7-родинних антитіл 2SD4 (2SD4 VL; також показано на SEQ ID NO:9) та інший О2Е7-родинні варіабельні райони легкого ланцюгу (ЕР В12, VL10E4, VL100A9, VL100D2, VL10F4, LOE5, VLLOF9, VLLOF10, VLLOG7, VLLOG9, VLLOH1, VLLOH10, VL1B7, VL1C1, VL1C7, VL0.1F4, VL0.1H8, LOE7, LOE7.A та LOE7.T). На Фіг. 1А показані домени FR1, CDR1, FR2 та CDR2. На Фіг. 1В зображено домени FR3, CDR3 та FR4. Домени CDR1 ("CDR L1"), CDR2 ("CDR L2") та CDR3 ("CDR L3") легкого ланцюга обведені прямокутником. На Фіг. 2А та 2В зображено амінокислотні послідовності варіабельного району важкого ланцюга D2E7 (D2E7 VH; також показано на SEQ ID NO:2), мутанти по аланіну D2E7 VH (HD2E7*.A1, HD2E7*.A2, HD2E7*.A3, HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6, HD2E7*.A7, HD2E7*.A8 та HD2E7*.A9), варіабельний район важкого ланцюга D2E7-родинних антитіл 2SD4 (2SD4 VH; 3 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 також показано на SEQ ID NO:10), та інший D2E7-родинні варіабельні райони важкого ланцюга (VH1B11, VH1D8, VH1A11, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6, VH1G1, 3С-Н2, VH1-D2.N та VH1D2.Y). На Фіг. 2А зображено домени FR1, CDR1, FR2 та CDR2. На Фіг. 2В зображено домени FR3, CDR3 та FR4. Домени важкого ланцюга CDR1 ("CDR H1"), CDR2 ("CDR H2") та CDR3 ("CDR Н3") обведені прямокутником. Фіг. 3 є графічним зображенням інгібування викликаної TNF  цитотоксичності L929 антиhTNF  антитілами людини D2E7, що порівнюють з мишачими анти-hTNF  антитілами МАК 195. На Фіг. 4 графічно зображено інгібування зв'язування rhTNF  з рецепторами hTNF  на клітинах U-937 анти-hTNF  антитілами людини D2E7, що порівнюють з мишачими анти-hTNF  антитілами МАК 195. На Фіг. 5 графічно показано інгібування індукованої TNF  експресії ELAM-1 на HUVEC антиhTNF  антитілами людини D2E7, що порівнюють з мишачими анти-hTNF  антитілами МАК 195. На Фіг. 6 у вигляді стовпчиків графічно показано захист від індукованої TNF  летальності мишей, чутливих до D-галактозаміну, шляхом уведення анти-hTNF  антитіл людини D2E7 (чорні стовпчики), що порівнюють з мишачими анти-hTNF  антитілами МАК 195 (заштриховані стовпчики). На Фіг. 7 зображено нуклеотидну послідовність варіабельного району легкого ланцюга D2E7 з розрахованою амінокислотною послідовністю знизу під нуклеотидною послідовністю. Райони CDR LI, CDR L2 та CDR L3 підкреслені. На Фіг. 8 зображено нуклеотидну послідовність варіабельного району важкого ланцюга D2E7 з розрахованою амінокислотною послідовністю знизу під нуклеотидною послідовністю. Райони CDR H1, CDR H2 та CDR Н3 підкреслені. На Фіг. 9 графічно показано вплив обробки антитілами D2E7 на середній розмір суглоба трансгенних мишей Tg197 як моделі поліартриту. Детальний опис винаходу Даний винахід належить до ізольованих антитіл людини або їх антиген-зв'язуючих частин, які зв'язуються з TNF  людини з високою афінністю, низькою швидкістю розпаду та високою нейтралізуючою здібністю. Різноманітні аспекти даного винаходу належать до антитіл та фрагментів антитіл і їх фармацевтичних композицій, а також до нуклеїнових кислот, векторів рекомбінантної експресії та клітин-хазяїна для приготування таких антитіл та фрагментів. Способи використання антитіл даного винаходу для дослідження людського TNF  або гальмування активності людського TNF  , in vivo або in vitro, також охоплюються даним винаходом. З метою кращого розуміння даного винаходу спочатку визначають деякі терміни. Термін "TNF  людини" (абревіатура hTNF  або просто hTNF), як тут використовують, належить до цитокіну людини, якій існує як 17кДа в секретованій формі та як 26кДа в мембраназв'язаній формі, біологічно активна форма якого складається з тримера нековалентно зв'язаних молекул 17кДа. Структуру hTNF  описують, наприклад, Реnnіса, D., et аl., (1984) Nature 312:724-729; Davis, J. M., et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338:225-228. Термін TNF  людини включає рекомбінантний TNF  людини (rhTNF  ), який можна одержати за стандартним способом рекомбінантної експресії або купити (R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN). Термін "антитіло" так, як тут використовують, належить до молекул імуноглобулінів, що складаються з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) та двох легких (L), зв'язаних дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельного району важкого ланцюга (скорочення HCVR або VH) та константного району. Константний район важкого ланцюгу складається з трьох доменів – СН1, СН2 та СН3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельного району (скорочення LCVR або VL) та константного району легкого ланцюгу. Константний район легкого ланцюгу включає один домен - CL. Райони VH та VL надалі розділяють на гіперваріабельні райони, означені як комплементарно детерміновані райони (CDR), в яких присутні райони, що є більш консервативними, що позначають як матричні райони (FR). Кожний VH та VL складається з трьох CDR та чотирьох FR, які розміщені починаючи від аміно-кінця до карбокси-кінця в такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термін "антиген-зв'язуюча частина" антитіла (або просто "частина антитіла") в контексті опису належить до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здібність специфічно зв'язувати антиген (а саме, hTNF  ). Було показано, що антиген-зв'язуюча функція антитіла може бути представлена фрагментами цільно-ланцюгового антитіла. Приклади зв'язуючих 4 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагментів, що підпадають під термін "антиген-зв'язуюча частина" антитіла, включають (1) Fab фрагмент, моновалентний фрагмент, що складається з VL, VH, CL та СНІ доменів; (2) F(ab')i фрагмент, бівалентний фрагмент, що включає два Fab фрагмента, зв'язаних дисульфідним містком в шарнірній ділянці; (3) Fd фрагмент, що складається з доменів VH та СН1; (4) Fv фрагмент, що складається з доменів VL та VH однієї гілки антитіла; (5) dAb фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546), який включає домен VH; (6) ізольований комплементарний детермінований район (CDR). Більш того, хоча два домена фрагмента Fv, VL та VH, кодуються окремими генами, їх можна об'єднати, використовуючи рекомбінантні способи за допомогою синтетичної зв'язки. що зробить їх спроможними утворювати єдиний білковий ланцюг, в якому райони VL та VH розташовані так, що можуть утворювати моновалентну молекулу (відому як одноланцюгова Fv (scFv); див., напр. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; та Huston et al. (1988) Proc. Natl. Аса. Sci. USA 85:5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також входять до терміну "антиген-зв'язуюча частина" антитіла. Також охоплюються інші одноланцюгові антитіла, такі як діатіла. Діатіла є бівалентними, біспецифічними антитілами, в яких домени VH та VL експресовані в одному поліпептидному ланцюгу, але з використанням зв'язки, яка надто мала, щоб дозволити парування між цими двома доменами на тому самому ланцюгу, тим самим сприяючи тому, щоб домени парувались з комплементарними доменами іншого ланцюгу, та створюючи два сайта зв'язування (див, напр. Hollinger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Далі, антитіло або його антиген-зв'язуюча частина може бути частиною більш крупної імуноадгезивної молекули, сформованої ковалентним або нековалентним сполученням антитіла або частини антитіла з одним або більше білком чи пептидом. Приклади таких імуноадгезивних молекул включають район кора стрептавідіна для утворення тетравимірної молекули scFv (Kiprianov, S. M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) та використання залишку цистеїну, пептида-маркера та С-кінцевої вільної ділянки полігістидину для утворення бівалентних та біотінованих молекул scFv (Kiprianov et al. (1994) Моl. Immuol. 31: 1047-1058). Такі частини антитіл, як Fab та F(ab") 2 фрагменти, можна одержати з цілих молекул антитіл, використовуючи традиційні способи, такі як розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, цілих антитіл. Більш того, антитіла, частини антитіл та імуноадгезивні молекули можна одержати з використанням стандартної технології рекомбінантних ДНК так, як тут описано. Термін "антитіло людини" в контексті винаходу включає антитіла, що мають варіабельні та константні райони, які походять від послідовностей імуноглобулінів зародка людини. Антитіла людини даного винаходу можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються послідовностями імуноглобулінів зародка людини (напр., мутації, що представлені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом in vitro або соматичною мутацією in vivo), наприклад в CDR і, особливо, CDR3. Однак, термін "людське антитіло" в контексті винаходу не включатиме антитіла, де послідовності CDR, які походять від зародкових або інших ліній ссавців, таких як миша, були пришиті на людських матричних послідовностях. Термін "рекомбінантне антитіло людини" в контексті винаходу включає всі антитіла, які одержують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними засобами, такі як експресовані з використанням векторів рекомбінантої експресії, поміщених у клітину-хазяїна (описано далі в Розділі II), антитіла, одержані з комбінаторної бібліотеки рекомбінантних антитіл людини (описується далі в Розділі III), антитіла, виділені з тварин (напр., мишей), які є трансгенними для генів імуноглобулінів людини (див., напр, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acid. Res. 20:6287-6295) або антитіла, одержані, експресовані, створені або ізольовані будь-яким іншим способом, який включає сплайсинг послідовностей гена імуноглобуліну людини до інших послідовностей ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні та константні райони, що походять від послідовностей імуноглобулінів зародка людини. В певних втіленнях, однак, такі рекомбінантні антитіла людини підлягають мутагенезу in vitro (або, якщо використовують тваринну послідовність, трансгенну до людського Ig, соматичному мутагенезу in vivo), і, таким чином, амінокислотні послідовності районів VH та VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, що походять від та є родинними послідовностями VH та VL зародкової лінії людини, та можуть не існувати природно в людських антитілах зародкової лінії in vivo. "Ізольоване антитіло" в контексті винаходу належить до антитіла, яке суттєво вільно від інших антитіл, що мають іншу антигенну специфічність (напр., ізольовані антитіла, що специфічно зв'язують hTNF  , є суттєво вільним від антитіл, які специфічно зв'язують відмінні від hTNF  антитіла). Ізольовані антитіла, які специфічно зв'язують hTNF  , можуть, однак, мати перехресну реактивність з іншими антигенами, такими, як молекули TNF  інших ліній (обговорюється надалі). Більш того, ізольовані антитіла можуть бути суттєво вільними від інших клітинних матеріалів та/або речовин. 5 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "Нейтралізуюче антитіло" (або "антитіло, що нейтралізує активність hTNF  ") належить в контексті винаходу до антитіл, чиє приєднання до hTNF  призводить до інгібування його біологічної активності. Таке інгібування біологічної активності hTNF  можна дослідити шляхом вимірювання одного чи більше індикаторів біологічної активності hTNF  , наприклад, індукованої hTNF  цитотоксичності (або iv vitro або in vivo), індукованої hTNF  клітинної активації та зв'язування hTNF  з рецепторами hTNF  . Ці показники біологічної активності hTNF  можна оцінити завдяки кільком стандартним дослідам in vitro та in vivo, відомим з рівня техніки (див. Приклад 4). Переважно, здібність антитіл нейтралізувати активність hTNF  вимірюється по інгібуванню індукованої hTNF  цитотоксичності клітин L929. Як альтернативний параметр активності hTNF  можна оцінювати здібність антитіл інгібувати індуковану hTNF  експресію ELAM-1 на HUVEC як вимірювання індукованої hTNF  клітинної активації. Термін "резонанс поверхневого плазмону" в контексті винаходу належить до поверхневого феномену, що дозволяє аналізувати біоспецифічну взаємодію в реальному часі шляхом детекції зміни концентрації білка в біосенсорному матриксі, наприклад, використовуючи систему BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Sweden and Piscataway, NJ). Для подальшого опису див. Приклад 1 та Jonsson U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnson, В., et al. (1995) J. Моl. Recognit. 8:125-131; Johnson, В., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277). Термін "Ксп" в контексті винаходу належить до константи спаду швидкості для дисоціації антитіла з комплексу антиген/антитіло. Термін "Кд" в контексті винаходу належить до константи дисоціації специфічної реакції антиген-антитіло. Термін "молекула нуклеїнової кислоти" в контексті винаходу включає молекули ДНК та РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою та дволанцюговою, але переважно дволанцюговою ДНК. Термін "ізольована молекула нуклеїнової кислоти" в контексті винаходу при посиланнях на нуклеїнові кислоти, кодуючі антитіла або частини антитіл (напр. VH, VL, CDR3), які зв'язують hTNF  , належить до молекули нуклеїнової кислоти, в якій нуклеотидні послідовності, кодуючі дані антитіла або частини антитіл, є вільними від інших нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла або частини антитіл, які зв'язують відмінні від hTNF  антигени, чи інші послідовності можуть природно обрамляти дану нуклеотидну кислоту в людській геномній ДНК. Так, наприклад, ізольована нуклеїнова кислота даного винаходу, що кодує район VH антиhTNF  антитіл, містить інші послідовності, що кодують інші райони VH, які зв'язують відмінні від hTNF  антигени. Термін "вектор" в контексті винаходу належить до молекули нуклеїнової кислоти, що здібна транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, до якої вона причеплена. Одним типом векторів є "плазміда", якою називають кільцеву дволанцюгову петлю ДНК, в яку можна вставити додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, де додаткові сегменти ДНК можуть вбудовуватись в геном вірусу. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині хазяїна, в якій вони представлені (напр., бактеріальні вектори, що мають бактеріальний оріджин реплікації, та епісомальні мамілярні вектори). Інші вектори (напр., неепісомальні мамілярні вектори) можна інтегрувати в геном клітини-хазяїна при інтродукції в клітині-хазяїні, та завдяки цьому реплікуються разом з геномом хазяїна. Більш цього, деякі вектори здатні спрямовувати експресію генів, до яких вони оперативно пришиті. Такі вектори тут називають "векторами рекомбінантної експресії" (або просто "векторами експресії"). Загалом, вектори експресії, що використовують в технології рекомбінантних ДНК, часто знаходяться у формі плазмід. В даному описі "плазміду" та "вектор" можна використовувати поперемінно, оскільки плазміда є найбільш широко використовуваною формою вектора. Однак, даний винахід включає і такі інші форми векторів експресії як вірусні вектори (напр., реплікон-дефіцитні ретровіруси, аденовіруси та адено-зв'язані віруси), що виконують такі самі функції. Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") в контексті винаходу означає клітину, в якій представлений вектор рекомбінантної експресії. Треба зрозуміти, що такі терміни відносяться не тільки до певної дослідної клітини, але і до потомства такої клітини. Оскільки певні модифікації можуть зустрічатись у наступних поколіннях внаслідок або мутацій або впливу зовні, таке потомство може, фактично, не бути ідентичним батьківській клітині, але входить до рамок визначення "клітина-хазяїн" в контексті винаходу. Різні аспекти даного винаходу описуються детально надалі в підрозділах. І. Антитіла людини, що зв'язують людський TNF  6 UA 102988 C2 5 10 Даний винахід забезпечує антитілами або їх антиген-зв'язуючими частинами, які зв'язують людський TNF  з високою афінністю, низькою швидкістю спаду та високою нейтралізуючою ємністю. Переважно, людські антитіла даного винаходу є рекомбінантними нейтралізуючими людськими анти-hTNF  антитілами. Найбільш переважні рекомбінантні нейтралізуючі антитіла даного винаходу називаються D2E7 та мають послідовності VL та VH, що вказані на Фіг. 1А, 1В та Фіг. 2А, 2В відповідно (амінокислотна послідовність району VL D2E7 також показана в SEQ ID NO:1, амінокислотна послідовність VH D2E7 також показана в SEQ ID NO:2). Зв'язуюча здібність D2E7 порівняно з мишачими анти-hTNF  мАТ МАК 195, які показують високу афінність та повільну кінетику дисоціації, та інших анти-hTNF  антитіл людини, родинних до послідовності D2E7, 2SD4, зведена в таблиці внизу: Антитіла D2E7 IgG1 2SD4 IgG4 MAK 195F(ab")2 15 20 25 30 35 40 45 50 k у т,М1с 1 К сп, с 1 -5 8,81 × 10 -3 8,4 × 10 -5 8,70 × 10 5 1,91 × 10 5 4,20 × 10 5 1,90 × 10 К д ,М Стехіометрія -10 6,09 × 10 -8 2,00 × 10 -10 4,60 × 10 1,2 0,8 1,4 Антитіла D2E7 та родинні антитіла також демонструють хорошу ємкість нейтралізації активності hTNF  , що було вивчено в декількох дослідах in vitro та in vivo (див. Приклад 4). Наприклад, такі антитіла нейтралізують індуковану hTNF  цитотоксичність клітин L9.9 з -7 -10 величиною ІС50 в районі приблизно від 10 М до 10 М. D2E7 при експресії як цілі IgG1 антитіла нейтралізують індуковану hTNF  цитотоксичність клітин L929 с IC50 приблизно 1,25 × -10 10 М. Більш того, нейтралізуюча дія D2E7 має місце, якщо антитіла екпресуються як Fab, F(ab')2 або scFv фрагменти. D2E7 також інгібують індуковану hTNF  клітинну активацію, що -10 вимірюється за індукованою hTNF  експресією ELAM-1 нa HUVEC (ІС50=приблизно 1,85 × 10 -10 М), та зв'язування hTNF  з hTNF  -рецепторами на клітинах U-937 (ІС50=приблизно 1,56 × 10 М). На закінчення, D2E7 інгібують зв'язування hTNF  з як з р55 так і р75 рецептором hTNF  . Більш того, ці антитіла інгібують викликану hTNF  летальність in vivo у мишей (ED50=12,5мкг/миша). Що торкається специфічності зв'язування D2E7, ці антитіла зв'язують TNF  людини в різних формах, включаючи розчинний hTNF  , трансмембранний hTNF  та hTNF  , зв'язаний з клітинними рецепторами. D2E7 не зв'язує специфічно інші цитокіни, такі як лімфотоксин (TNF  ), IL-1  , IL-1  , IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFN  та TGF  . Однак, D2E7 не показують перехресної реактивності до факторів некрозу пухлини з інших видів. Наприклад, антитіла нейтралізують активність TNF  принаймні п'яти приматів (шимпанзе, бабуїна, мавпи, павіана та резуса) з ІС50, приблизно рівною як і в разі нейтралізації hTNF  (див. Приклад 4, підрозділ Е). D2E7 також нейтралізують активність мишачого TNF  , хоча і приблизно в 1000 разів слабше, ніж TNF  людини (див. Приклад 4, підрозділ Е). D2E7 також зв'язують собачий та свинячий TNF  . В одному з аспектів винахід належить до D2E7 антитіл та їх частин, D2Е7-родинних антитіл та їх частин та інших антитіл людини та їх частин з еквівалентними D2E7 властивостями такими, як високо афінне зв'язування з hTNF  з низькою кінетикою дисоціації та високою нейтралізуючою ємкістю. В одному з втілень винахід забезпечує ізольованими антитілами -8 людини або їх антиген-зв'язуючими частинами, що дисоціюють з TNF  людини з КД 1 × 10 М -3 -1 або менше та константою спаду швидкості К сп 1 × 10 с або менше, обидві виміряні за методом резонансу поверхневого плазмону, та нейтралізують цитотоксичність людського TNF  -7 в стандартному досліді in vitro на L929 з ІС50 1 × 10 М або менше. Переважно, ізольовані -4 -1 антитіла людини або їх антиген-зв'язуючі частини дисоціюють з TNF  людини з К сп 5 × 10 с -4 -1 чи менше, навіть ще переважніше, з Ксп 1 × 10 с або менше. Переважніше, ізольовані антитіла людини або їх: антиген-зв'язуючі частини нейтралізують цитотоксичність TNF  людини в -8 стандартному досліді in vitro з L929 з ІС50 1 × 10 М або менше, навіть переважніше з ІС50 1 × -9 -10 10 М або менше та ще переважніше з ІС50 5 × 10 М та менше. В переважному втіленні антитіла є ізольованими рекомбінантними антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами. В іншому переважному втіленні дані антитіла також нейтралізують індуковану TNF  клітинну активацію, що досліджувалось, використовуючи стандартний дослід in vitro для TNF  індукованої експресії ELAM-1 на ендотеліальних клітинах пупкової вени (HUVEC). 7 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Резонанс поверхневого плазмона для визначення КД та К сп можна провести так, як показано в прикладі 1. Стандартний дослід in vitro на L929 для визначення ІС50 показано на Прикладі 4, підрозділі А. Стандартний дослід in vitro для індукованої TNF  експресії ЕІАМ-1 на ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC) описаний в Прикладі 4, підрозділі С Приклади рекомбінантних антитіл людини, які задовольняють або про які передбачається, що вони задовольняють, наведені вище критерії кінетики та нейтралізації, включають антитіла, що мають наступні пари [VH/VL], послідовності яких показані на Фіг. 1А, 1В, 2А та 2В (див. також Приклади 2, 3 та 4 для аналізів кінетики та нейтралізації): [D2E7 VH/D2E7 VL]; HD2E7*.A1/D2E7 VL], [HD2E7*.A2/D2E7 VL], [HD2E7*. A3/D2E7 VL], [HD2E7*. A4/D2E7 VL], [HD2E7*. A5/D2E7 VL], [HD2E7*. А6/D2Е7 VL], [HD2E7*. A7/D2E7 VL], [HD2E7*. A8/D2E7 VL], [HD2E7*. A9/D2E7 VL], [D2E7. VH/LD2E7*.A1], [D2E7. VH/LD2E7*.A4], [D2E7. VH/LD2E7*.A5], [D2E7. VH/LD2E7*.A7], [D2E7. VH/LD2E7*.A8], [HD2E7*. A9/LD2E7*.A1], [VH1-D2/LOE7], VH1-D2.N/LOE7.T], [VH1D2.Y/LOE7.A], [VH1-D2.N/LOE7.A], [VH1-D2/EP B12] та [3C-H2/LOE7]. В рівні техніки добре відомо, що домени CDR3 легких та важких ланцюгів антитіл грають важливу роль в специфічності/афінності зв'язування антитіл з антигеном. Відповідно, в іншому аспекті даний винахід належить до антитіл людини, які мають повільну кінетику дисоціації для асоціації з hTNF  та що мають домени CDR3 легких та важких ланцюгів, які структурно ідентичні або родинні таким самим з D2E7. Як показано в прикладі 3, положення 9 D2E7 VL CDR3 може займати Аlа або Thr без суттєвого впливу на К сп . Відповідно, консенсусний мотив для D2E7 VL CDR3 включає амінокислотну послідовність: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO:3). Додатково, положення 12 D2E7 VH CDR3 може займати Туr або Asn без суттєвого впливу на К сп . Відповідно, консенсусний мотив для D2E7 VH CDR3 включає амінокислотну послідовність: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO:4). Більш того, як показано в Прикладі 2, домен CDR3 легких та важких ланцюгів D2E7 піддається заміщенню одним залишком аланіну (в положеннях 1, 4, 5, 7 або 8 в VL CDR3 або в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11 в VH CDR.3) без суттєвого впливу на К сп . Далі, спеціалісти в даній області зрозуміють, що беручи здатність доменів CDR3 D2E7 VL та VH до замін аланіном, можлива заміна інших амінокислот в доменах CDR3, якщо зберігається низька константа спаду швидкості антитіл, особливо заміни на консервативні амінокислоти. "Заміна консервативної амінокислоти" так, як тут використовується, означає, що один амінокислотний залишок заміщується іншим амінокислотним залишком, що має подібний боковий ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бокові ланцюги, були описані в рівні техніки, включаючи основні бокові ланцюги (а саме, лізин, аргінін, гістидин), кислотні бокові ланцюги (а саме, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незаряджені полярні бокові ланцюги (а саме, гліцин, аспарагін, глутамін, серін, треонін, тірозин, цистеїн), неполярні бокові ланцюги (а саме, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метионін, триптофан), бета-розгалужені бокові ланцюги (а саме, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичні бокові ланцюги (а саме, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Переважно, можна робити не більше від одної до п'яти замін консервативних амінокислот в доменах D2E7 VL та/або VH. Більш переважно, можна робити не більше ніж від одної до трьох консервативних амінокислот в доменах D2E7 VL та/або VH. Додатково, заміни консервативних амінокислот не повинно робити в положеннях, критичних для зв'язування з hTNF  . Як показано в Прикладі 3, положення 2 та 5 CDR3 D2E7 VL та положення 1 та 7 CDR3 D2E7 VH виявились критичними для взаємодії з hTNF  , і, таким чином, заміни консервативних амінокислот не робились в даних положеннях (хоча заміна аланіну в положенні 5 CDR3 VL D2E7 прийнятна, як описано вище). Відповідно, в іншому втіленні даний винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами з наступними характеристиками: -3- -1 а) дисоціюють з TNF  людини з К сп 1 × 10 c або менше, що визначають за поверхневим плазмону резонансом; б) мають домен CDR3 легкого ланцюгу, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 або модифіковану SEQ ID NO:3 шляхом одиничної заміни аланіну в положенні 1, 4. 5, 7 або 8 або шляхом заміни від однієї до п'яти консервативних амінокислот в положеннях 1, 3, 4, 6, 7, 8, та/або 9; в) мають домен CDR3 важкого ланцюга, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 або модифіковану SEQ ID NO:4 шляхом одиничної заміни аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6. 8, 9, 10 або 11 або шляхом заміни від одної до п'яти консервативних амінокислот в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 та/або 12. 8 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Більш переважно, антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини дисоціюють з TNF  льодини з -4 -1 К сп 5 × 10 с або менше. Навіть більш переважно, антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини -4- -1 дисоціюють з TN  людини з К сп 1 × 10 c або менше. В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами з варіабельним районом легкого ланцюгу (LCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 або модифіковану SEQ ID NO:3 шляхом одиничної заміни аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 або 8, та з варіабельним районом важкого ланцюгу (HCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 або модифіковану послідовність SEQ ID NO:4 шляхом одиничної заміни аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11. Переважно. LCVR надалі має домен CDR2, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5 (тобто, D2E7 VL CDR2) та HCVR надалі має домен CDR2, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:6 (тобто, D2E7 VH CDR2). Навіть переважніше, LCVR надалі має домен CDR1, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:7 (тобто, D2E7 VL CDR1), та HCVR надалі має домен CDR1, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:8 (тобто, D2E7 VH CDR1). Райони рамки для VL переважно належать до родини VKI людської зародкової лінії, більш переважно, з гена Vk людської зародкової лінії А20, та найбільш переважно з послідовностей рамки D2E7 VL, зображених на Фіг. 1А та 1В. Райони рамки для VH переважно належать до родини людської зародкової лінії VH3, переважніше до VH-гена зародкової людської лінії DP-31, та найбільш переважно, до послідовностей рамки D2E7 VH, зображених на Фіг. 2А та 2В. В іншому втіленні винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами з варіабельним районом легкого ланцюгу (LCVR), що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 (D2E7 VL), та варіабельним районом важкого ланцюгу (HCVR), що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 (D2E7 VH). В певних втіленнях дані антитіла включають такий константний район важкого ланцюгу, як константні райони IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. Переважно, константний район важкого ланцюгу є константним районом важкого ланцюгу IgG1 або IgG4. Більш того, дані антитіла можуть включати константний район легкого ланцюгу, що є або каппа або лямбда константним районом легкого ланцюгу. Переважно дані антитіла включають константний район легкого ланцюгу каппа. Навпаки, частина антитіл може бути, наприклад, Fab фрагментом або одноланцюговим Fv фрагментом. В інших втіленнях, даний винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх ангиген-зв'язуючими частинами, що мають D2Е7-родинні VL або VH домени CDR3, наприклад, антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини з варіабельним районом легкого ланцюгу (LCVR), який має домен CDR3, що включає амінокислотну послідовність, обрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SIQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 та SEQ ID NO:26, або варіабельним районом важкого ланцюгу (HCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотні послідовності, обрані з групи, яка складається з SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 та SEQ ID NO:35. В іншому втіленні даний винахід забезпечує рекомбінантними антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами, які нейтралізують активність TNF  людини, але не TNF  . Переважно, антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини також нейтралізують активність TNF  шимпанзе та принаймні TNF  одного примата, вибраний з групи, яка включає TNF  бабуїна, TNF  мартишки, TNF  павіана та TNF  резуса. Переважно, дані антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини нейтралізують TNF  людини, шимпанзе та/або іще одного примата в -8 -9 стандартному досліді in vitro з L929 з ІС50 1 × 10 М або менше, переважно 1 × 10 М або -10 менше, та ще більш переважно 5 × 10 М або менше. В одному підвтіленні дані антитіла також нейтралізують активність собачого TNF  , переважно в стандартному досліді in vitro з L929 з -7 -8 ІС50 1 × 10 М або менше, більш переважно 1 × 10 М або менше та, навіть, переважніше 5 × -9 10 М або менше. В іншому підвтіленні дані антитіла також нейтралізують активність TNF  -5 -6 свині, переважно з ІС50 1 × 10 М або менше, переважніше, 1 × 10 М або менше та ще -7 переважніше 5 × 10 М або менше. В іще одному втіленні дані антитіла нейтралізують -4 -6 активність мишачого TNF  , переважно з ІС50 1 × 10 М або менше та, ще переважніше, 5 × 10 М та менше. Антитіла даного винаходу або їх частини можуть бути модифіковані або пришиті до іншої функціональної молекули (напр., іншого пептиду або білка). Відповідно, антитіла винаходу або їх частини можуть призначатись для включення дериватів та інших модифікованих форм антиTNF  антитіл людини, описаних тут, включаючи імуноадгезивні молекули. Наприклад, антитіла 9 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даного винаходу або їх частини можна функціонально зв'язувати (хімічним зв'язуванням, генетичним плавленням, нековалентним поєднанням або інакше) до однієї або більше молекулярної одиниці, такої як наприклад, інше антитіло (напр., біспецифічне антитіло або діантитіло), агент, що можна детектувати, цитотоксичний агент, фармацевтичний агент та/або білок чи пептид, що може опосередковувати зв'язування антитіла або його частини з іншою молекулою (такою як район поверхні стрептавідина або якірний полігістидин). Один з видів дериватів антитіл одержують завдяки перехресному зв'язуванню двох або більше антитіл (одного виду або різних видів, наприклад, для створення біспецифічних антитіл). Підходящі зшиваючі агенти можуть бути гетеробіфункціональні, що мають дві окремі реактивні групи, розділені підходящим спейсером (напр., m-малеімідобензоїл-N-гідроксисукцинімідний ефір), або гомобіфункціональні (напр., дісукцинімідил суберат). Такі зшивки можна одержати в Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Корисними агентами, які можна детектувати, з якими можна зв'язати антитіла винаходу або їх частини, включають флуоресцентні речовини. Ілюстративні флуоресцентні агенти, що можна детектувати, включають флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, 5-двметиламін-1-нафталенсульфонил хлорид, фікоерітрин та подібні речовини. Антитіла можна також зв'язати з ферментами, що можна детектувати, такими, як лужна фосфатаза, пероксидаза хріну, глюкозоксидаза та т.п. Якщо антитіла зв'язують з ферментом, що можна детектувати, їх детектують шляхом додавання додаткових реагентів, які фермент використовує для виробки продукту реакції, що можна детектувати. Наприклад, якщо агент пероксидази хріну, що можна детектувати, присутній, додавання пероксиду водню та діамінобензидину призводить до кольорового продукту реакції. Антитіла можна також зв'язати з біотіном та детектувати шляхом непрямого вимірювання зв'язування авідин-стрептавідин. II. Експресія антитіл Антитіла винаходу або їх антиген-зв'язуючі частини можна приготувати рекомбінантною експресією генів легкого та важкого ланцюгів імуноглобулінів в клітині-хазяїні. Для того, щоб провести експресію антитіл рекомбінантно, проводять трансфекцію клітини-хазяїна одним або більше векторами рекомбінантної експресії, які несуть фрагменти ДНК, що кодують легкий та важкий ланцюги антитіл так, що легкий та важкий ланцюг експресуються в клітині-хазяїні та, переважно, секретуються в середовище, в якій культивують клітину-хазяїна та з якої можна виділити антитіла. Використовують стандартні методики рекомбінантних ДНК для одержання генів важкого та легкого ланцюгів антитіл, інкорпорації цих генів у вектори рекомбінантної експресії та інтродукції цих векторів в клітину-хазяїна так, як це описано в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, (1989) та в патенті США №4,816, 397 Boss et al. Для експресії D2E7 або D2Е7-родинних антитіл спершу одержують фрагменти ДНК, що кодують варіабельні райони легкого та важкого ланцюгів. Ці ДНК можна одержати ампліфікацією та модифікацією варіабельних послідовностей легкого та важкого ланцюгів зародкової лінії, використовуючи ланцюгову полімеразну реакцію (PCR). Послідовності ДНК зародкової лінії для генів варіабельних районів легкого та важкого ланцюгів людини відомі в рівні техніки (див, напр., базу даних послідовностей зародкової лінії людини "Vbase", також див Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fofty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops"/ Моl Biol 227:776-798; Cox, J.P.L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VK Segments Reveals a Strong Bias in Their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; зміст кожної з яких точно включений тут шляхом посилання). Для того, щоб отримати фрагмент ДНК, який кодує варіабельний район важкого ланцюгу D2E7 або D2Е7родинних антитіл, член родини VH3 генів зародкової лінії людини VH ампліфікують в стандартній PCR. Більш переважно, ампліфікують послідовність зародковоїлінії VH DP-31. Для того, щоб одержати фрагмент ДНК, що кодує варіабельний район легкого ланцюгу D2E7 або D2E7-родинних антитіл, ампліфікують член родини VKI гена людини зародкової лінії VL шляхом стандартної PCR. Найбільш переважно, ампліфікують послідовність А20 VL зародкової лінії. Праймери PCR, зручні для використання для ампліфікації послідовності VH зародкової лінії DP31 та VL зародкової лінії А20, можна створити на основі нуклеотидних послідовностей, поміщених вище як посилання, використовуючи стандартні способи. Одержавши фрагменти VL та VH зародкової лінії, можна провести мутацію цих послідовностей так, щоб вони кодували D2E7 або D2Е7-родинні амінокислотні послідовності, що тут описані. Спочатку амінокислотні послідовності, що кодуються послідовностями ДНК VH 10 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та VL зародкової лінії порівнюють з D2E7 або D2E7-родинними амінокислотними послідовностями VH та VL для ідентифікації тих залишків амінокислот в D2E7 або 02Е7родинних послідовностях, які відрізняються від зародкової лінії. Потім, проводять мутацію по придатним нуклеотидам послідовності ДНК зародкової лінії так, що мутована послідовність зародкової лінії кодує D2E7 або D2Е7-родинну амінокислотну послідовність, використовуючи даний генетичний код для дослідження тою, які нуклеотидні зміни потрібно зробити. Мутагенез послідовностей зародкової лінії приводять стандартними способами, такими як PCRопосередкований мутагенез (в якому мутовані нуклеотиди, інкорпоровані в праймери PCR так, що продукт PCR містить мутації) або сайт-спрямований мутагенез. Більш того, слід сказати, що якщо послідовності "зародкової лінії" отримані шляхом ампліфікації PCR, кодують амінокислотні зміни в районі рамки з істинної конфігурації зародкової лінії (тобто, розбіжності в ампліфікованій послідовності, як порівняно з істинною послідовністю зародкової лінії, наприклад, як результат соматичної мутації), може бути бажаним змінити дані розбіжності амінокислот назад до істинної послідовності зародкової лінії (тобто, "зворотні мутації" залишків рамки до конфігурації зародкової лінії). При одержанні фрагментів ДНК, що кодують D2E7 або D2Е7-родинні сегменти VH та VL (шляхом ампліфікації та мутагенезу VH та VL генів зародкової лінії, як описано вище), з цими фрагментами ДНК можна маніпулювати завдяки стандартному способу рекомбінантних ДНК, наприклад, для конвертації генів варіабельного району до генів цільно-ланцюгового антитіла, гену Fab фрагменту або гену scFv. При цих маніпуляціях фрагменти ДНК, що кодують, VL та VH, операбельно зв'язують з іншим фрагментом ДНК, що кодує інший білок, такий, як константний район антитиіла або шарнірна ділянка. Термін "операбельно зв'язаний" в контексті винаходу означає, що два фрагмента ДНК сполучені так, що амінокислотні послідовності, які кодуються даними двома фрагментами ДНК, залишаються в рамці. Ізольовану ДНК, яка кодує район VH, можна конвертувати в ген повного важкого ланцюгу шляхом операбельного зв'язування з ДНК, що кодує VH, до іншої молекули ДНК, що кодує константні райони важкого ланцюгу (СН1, СН2 та СН3). Послідовності генів, які кодують константні райони людського важкого ланцюгу, відомі в рівні техніки (див., напр., Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) та фрагмента ДНК, що оточують ці райони, можна одержати стандартною ампліфікацією PCR. Константний район важконо ланцюгу може бути константним районом IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD, але більш переважно IgG1 або IgG4. Для гена важкого ланцюгу Fab фрагмента ДНК, що кодує VH, можна оперативно зв'язати з іншою молекулою ДНК, що кодує тільки константний район СН1 важкого ланцюгу. Ізольовану ДНК, яка кодує район VL, можна конвертувати до гену повного легкого ланцюгу (як і гену легкого ланцюгу Fab), шляхом оперативного зв'язування ДНК, що кодує VL. до іншої молекули ДНК, яка кодує константний район CL легкого ланцюгу. Послідовності генів константних районів легких ланцюгів людини відомі в рівні техніки (див. напр. Kabat, E.A., et al. (1991J Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), та фрагменти ДНК, що оточують ці райони, можна одержати стандартною ампліфікацією PCR. Константний район легкого ланцюгу може бути каппа або лямбда, але переважно каппа районом. Для створення гену scFv фрагменти ДНК, які кодують VL та VH, оперативно зв'язують з іншим фрагментом, який кодує гнучку зв'язку, напр., кодує амінокислотну послідовність (Глі4Сер)3 так, що послідовності VH та VL можна експресувати в одному білковому ланцюгу, де райони VL та VH сполучаються гнучкою зв'язкою (див., напр., Bird et al., (1988) Science 242:423426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). Для того, щоб експресувати антитіла винаходу або їх фрагменти, ДНК, що кодує частини або цілі легкі та важкі ланцюги, одержані так, як описано вище, поміщають в експресійні вектори так, що ці гени є оперативно зв'язаними з послідовностями контролю транскрипції та трансляції. В контексті винаходу термін "оперативно зв'язаний" означає, що ген антитіла поміщений в вектор так, що послідовності контролю транскрипції та трансляції всередині вектора виконують свої належні функції по регуляції транскрипції та трансляції гену антитіла. Вектори експресії та послідовності контролю за експресією обирають в залежності від експресії клітини-хазяїна, що використовується. Ген легкого ланцюгу антитіла та ген важкого ланцюгу антитіла можна помістити в окремий вектор або, що більш типово, обидва гени поміщають в той самий експресійний вектор. Гени антитіл поміщають в експресійний вектор стандартними способами (напр., зшивкою комплементарних сайтів рестрикції в фрагменті гену антитіла та векторі, або зшивкою по тупим кінцям, якщо немає сайтів рестрикції). До втручання D2E7 та D2Е7-родинних 11 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей легкого та важкого ланцюгів вектор експресії може вже нести послідовності константних районів антитіл. Наприклад, одним з підходів до конвертації D2E7 та D2Е7родинних послідовностей VH та VL до повних генів антитіл є поміщення їх до векторів експресії, що вже кодують константні райони важкого та легкого ланцюгів, відповідно, таким чином, що сегмент VH є оперативно зв'язаний з сегментом(ами) СН в цьому векторі, та сегмент VL є оперативно зв'язаний з сегментом CL в цьому векторі. Додатково або альтернативно, вектор рекомбінантної експресії може кодувати сигнальний пептид, що сприяє секреції ланцюгу антитіла з клітини-хазяїна. Ген ланцюгу антитіла можна клонувати у вектор так, що даний сигнальний пептид буде зв'язаним в рамці з амінокінцем гену ланцюгу антитіла. Сигнальний пептид може бути сигнальним пептидом імуноглобуліну або гетерологічним сигнальним пептидом (тобто, сигнальним пептидом з білка, що не є імуноглобуліном). Разом з генами ланцюгів антитіла вектори рекомбінантної експресії даного винаходу несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюгів антитіла в клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" включає промотори, енхансери та інші елементи контролю експресії (напр., сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюгів антитіл. Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, СА (1990). Для спеціалістів в даній області буде зрозумілим, що дизайн векторів експресії, включаючи вибір регуляторної послідовності, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна, що трансформують, бажаного рівня експресії білка, та ін. Переважні регуляторні послідовності для експресії мамілярних клітин-хазяїна включають вірусні елементи, які спрямовують високий рівень експресії білка в мамілярних клітинах, такі як промотори та/або енхансери, що походять з цитомегаловірусів (CMV) (такі як промотор/енхансер CMV), Вірусу мавпи 40 (SV40) (такі як промотор/енхансер SV40), аденовірусу (напр., головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) та поліоми. Для подальшого опису вірусних регуляторних елементів див. патент США №5,168,062 Stinski з спів., патент США №4,510,245 Bell з спів., патент США №4,968,615 Schaffher з спів. На додаток до генів ланцюгів антитіл та регуляторних послідовностей вектори рекомбінантної експресії даного винаходу можуть нести додаткові послідовності, такі як ті, що регулюють реплікацію вектора в клітині-хазяїні (напр., оріджини реплікації) та гени селективних маркерів. Ці гени селективних маркерів полегшують селекцію клітин-хазяїна, в яких був представлений даний вектор (див. напр., патенти США №4,399,216, 4,634,665 та 5,179,017 всі Axel з спів.). Наприклад, звичайно ген селективного маркера надає резистентності до ліків, таких як G418, гідроміцин або метотрексат, в клітині-хазяїні, в яку був представлений даний вектор. Переважні гени селективних маркерів включають ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для використання на клітинах-хазяїнах dhfr з селекцією/ампліфікацією метотрексатом) та ген пео (для селекції G418). Для експресії легкого та важкого ланцюгів вектор(и) експресії, які кодують важкий та легкий ланцюги, поміщають трансфекцією в клітину-хазяїна стандартними способами. Різні форми терміну "трансфекція"включають широке різноманіття способів, що звичайно використовують для інтродукції екзогенних ДНК в прокаріотичні або еукаріотичні клітни-хазяїна, а саме, електропорацію, кальцій-фосфатне осадження, трансфекцію DEAE-декстраном та інші. Хоча теоретично можливо провести експресію антитіл винаходу або в прокаріотичних або в еукаріотичних клітинах-хазяїнах, переважною є експресія антитіл в еукаріотичній клітині, і найбільш переважною в клітинах-хазяїнах ссавців, тому що в таких еукаріотичних клітинах та, особливо, мамілярних клітинах з більшою вирогідністю, ніж у прокаріотичних клітинах, антитіла будуть зібрані та секретовані в належним чином згорнутій та імунологічно активній формі. Сповіщалось (Boss M.A. and Wood C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13), що експресія прокаріотами генів антитіл є неефективною для вироблення високої кількості активних антитіл. Переважними мамілярними клітинами-хазяями для експресії рекомбінантних антитіл винаходу є клітини яєчника китайського хом'яка (СНО-клітини) (включаючи dhfr-CHO-клітини, описані в Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, які використовують з DHFRселективним маркером, як напр., описано в R.J.Kaufman and P.A.Sharp (1982) Моl. Biol. 159:601621), клітини мієломи NS0, клітини COS та клітини SP2. Якщо вектори рекомбінантної експресії, які кодують гени антитіл, представлені в клітинах-хазяїнах ссавців, антитіла отримують шляхом культивування клітин-хазяїна протягом проміжку часу, що є достатнім для експресії антитіл в клітинах-хазяїнах або, більш переважно, секреції антитіл в культуральне середовище, в якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можна виділити з культурального середовища за допомогою стандартних способів очистки білка. 12 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Клітини-хазяїна також можна використовувати для одержання частин інтактних антитіл, таких як Fab фрагменти або scFv молекули. Буде зрозумілим, що варіації в описаній вище процедурі знаходяться в межах даного винаходу. Наприклад, може бути потрібно провести трансфекцію клітини-хазяїна ДНК, яка кодує або легкий або важкий ланцюг (але не обидва) антитіл даного винаходу. Метод рекомбінантних ДНК можна використовувати для видалення деяких або усіх ДНК, що кодують один або обидва, легкий та важкий ланцюги, які не є необхідними для зв'язування з hTNF  . Молекули, що експресовані з таких обрізаних молекул ДНК, також підпадають під антитіла даного винаходу. Додатково, біфункціональні антитіла можна одержувати шляхом зшивки антитіла винаходу з другим антитілом стандартними способами хімічної зшивки так, що один важкий та один легкий ланцюг є антитілами винаходу, а інший важкий та інший легкий ланцюг є специфічними для іншого антигену, ніж hTNFa. В переважній системі для рекомбінантної експресії антитіл винаходу або їх антигензв'язуючих частин вектор рекомбінантної експресії, який кодує як важкий ланцюг антитіла так і легкий ланцюг антитіла представляють в dhfr-CHO-клітини шляхом кальційфосфатопосередкованої трансфекції. У векторі рекомбінантної експресії кожен з генів важкого та легкого ланцюгів антитіла оперативно зв'язаний з регуляторним елементом енхансером/промотором (напр., з SV40, CMV, аденовірусу та подібного, такий як регуляторний елемент CMV енхансер/AdMLP промотор або SV40 енхансер/AdMLP промотор) для забезпечення високого рівню транскрипції генів. Вектор рекомбінантної експресії також несе ген DHFR, який дозволяє проводити селекцію СНО-клітин, які були транфековані вектором, використовуючи селекцію/ампліфікацію метотрексатом. Дані відібрані трансформати - клітинихазяїна є культурою, що дозволяє експресію важкого та легкого ланцюгів антитіл та виділення інтактних антитіл з культурального середовища. Стандартні молекулярнобіологічні способи використовують для приготування векторів рекомбінантної експресії трансфекції клітинихазяїна, селекції трансформатов, культивування клітин-хазяїна та виділення антитіл з культурального середовища. Виходячи з вищезгаданого, іншим аспектом винаходу є композиції нуклеїнової кислоти, вектора та клітини-хазяїна, які можна використовувати для рекомбінантної експресії антитіл винаходу та їх частин. Нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний район легкого ланцюгу D2E7, показано на Фіг. 7 та SEQ ID NO:36. Домен CDR1 LCVR включає нуклеотиди 70102, домен CDR2 включає нуклеотиди 148-168 та домен CDR3 включає нуклеотиди 265-291. Нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний район важкого ланцюгу D2E7, зображена на Фіг. 8 та SEQ ID NO:37. Домен CDR1 HCVR включає нуклеотиди 91-105, домен CDR2 включає нуклеотиди 148-198 та домен CDR3 включає нуклеотиди 295-330. Спеціалістам в цій галузі буде очевидним, що нуклеотидні послідовності, що кодують D2Е7-родинні антитіла або їх частини (напр., такий домен CDR, як CDR3) можна одержати з нуклеотидних послідовностей, що кодують LCVR та HCVR D2E7, використовуючи генетичний код та стандартний способи молекулярної біології. В одному втіленні винахід забезпечує ізольованою нуклеїновою кислотою, яка кодує домен CDR3 легкого ланцюгу, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 (напр., D2E7 VL CDR3), або SEQ ID NO:3, модифіковану заміною одного аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 або 8 заміною від однієї до п'яти консервативних амінокислот в положеннях 1, 3, 4, 6. 7, 8 та/або 9. Ця нуклеїнова кислота може кодувати тільки район CDR3, або, більш переважно, кодує варіабельний район легкого ланцюгу повного антитіла (LCVR). Наприклад, нуклеїнова кислота може кодувати LCVR, який має домен CDR2, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5 (напр., D2E7 VL CDR2) та домен CDR1, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:7 (напр., D2E7 VL CDR1). В іншому втіленні винахід забезпечує ізольованою нуклеїновою кислотою, яка кодує домен CDR3 важкого ланцюгу, який включає амінокислотну послідовність SEQ ED NO:4 (напр., D2E7 VH CDR3), або SEQ ID NO:4, модифіковану заміною одного аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 або 11 заміною від одної до п'яти консервативних амінокислот в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 та/або 12. Ця нуклеїнова кислота може кодувати тільки район CDR3, або, більш переважно, кодує варіабельний район легкого ланцюгу повного антитіла (HCVR). Наприклад, нуклеїнова кислота може кодувати HCVR, яка має домен CDR2, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:6 (напр., D2E7 VH CDR2) та домен CDR1, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:8 (напр., D2E7 VH CDR1). В ще одному втіленні винахід забезпечує ізольованими нуклеїновими кислотами, які кодують D2Е7-родинний домен CDR3, який включає амінокислотну послідовність, що обрана з групи, яка складається з SEQ ID NO:3, SEQ ID NO0:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID 13 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 та SEQ ID NO:35. В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольовану нуклеїнову кислоту, яка кодує варіабельний район легкого ланцюгу антитіла, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 (тобто, D2E7 LCVR). Переважно ця нуклеїнова кислота включає нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:36, однак спеціалісту буде зрозуміло, що внаслідок виродження генетичного коду амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 можуть кодувати інші нуклеотидні послідовності. Дана нуклеїнова кислота може кодувати тільки LCVR або може також кодувати константний район легкого ланцюгу антитіла, оперативно зв'язаний з LCVR. В одному з втілень дана нуклеїнова кислота знаходиться в векторі рекомбінантної експресії. В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольованою нуклеїновою кислотою, яка кодує варіабельний район важкого ланцюгу антитіла, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 (тобто, D2E7 HCVR). Переважно ця нуклеїнова кислота включає нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:37, однак спеціалісту буде зрозуміло, що внаслідок виродження генетичного коду амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 можуть кодувати інші нуклеотидні послідовності. Дана нуклеїнова кислота може кодувати тільки HCVR або може також кодувати константний район важкого ланцюгу антитіла, оперативно зв'язаний з HCVR. Наприклад, така нуклеїнова кислота може включати константний район IgG1 та IgG4. В одному з втілень дана нуклеїнова кислота знаходиться в векторі рекомбінантної експресії. Даний винахід також забезпечує векторами рекомбінантної експресії, які кодують як важкі, так і легкі ланцюги антитіл. Наприклад, в одному втіленні даний винахід забезпечує вектором рекомбінантної експресії, який кодує: а) легкий ланцюг антитіла, що має варіабельний район, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 (тобто, D2E7 LCVR); та б) важкий ланцюг антитіла, що має варіабельний район, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 (тобто, D2E7 HCVR). Даний винахід також забезпечує клітину-хазяїна, в якій представлені один або більше векторів рекомбінантної експресії. Переважно, клітина-хазяїн є мамілярною клітиною, ще переважніше - клітиною СНО, NSO або COS. Далі даний винахід забезпечує способом синтезу рекомбінантного людського антитіла даного винаходу шляхом культивації клітини-хазяїна винаходу в прийнятному культуральному середовищі до тих пір, поки синтезується рекомбінантне антитіло людини винаходу. Спосіб надалі включає виділення рекомбінантного антитіла людини з культурального середовища. III. Селекція рекомбінантних антитіл людини Рекомбінантні антитіла людини винаходу, як і D2E7 та D2Е7-родинні антитіла, що тут описуються, можна одержати при скринінгу комбінаторної бібліотеки рекомбінантних антитіл, переважно бібліотеки фага scFv, одержаної з використанням ДНК людини VL та VH, що одержують з мРНК, яка походить з лімфоцитів людини. Спосіб одержання та скринування такої бібліотеки відомі в рівні техніки. На додаток до комерційно доступних наборів для одержання бібліотек фагів (напр., the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog No. 27-940001; Stratagene SurfZAP tm phage display kit, catalog no. 240612), приклади способів та реагентів, особливо підходящих для одержання та скринування бібліотек антитіл можна знайти, наприклад, в Lander et al., US Patent No.5,223,409; Kang et al., PCT Publication No. WO 92/18619; Dower et al., PCT Publication No. WO 91/17271; V/nter et al PCT Publ. No. WO 92/20791; Markland et al., PCT Pub. No. WO 92/15679; Brdtling et al., PCT Publ.No. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT Pub. No. WO 92/01047; Garrard et al., PCT P., No. WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al., (1992) J. Моl. Вiol. 226:889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352:624628; Gram et al (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid.Res. 19:4133-4137; Barbas et al., (1991) PNAS 88:7978-7982. В переважному втіленні для виділення антитіл людини з високою афінністю та низькою константною спаду швидкості для hTNF  , спершу використовували мишачі анти-hTNF  антитіла, що мають високу афінність та низьку константу спаду швидкості для hTNF  (напр., МАК 195, гібридома яких має депозитний номер ЕСАСС 87 050801), для селекції послідовностей важких та легких ланцюгів людини, що мають подібну зв'язуючу активність до hTNF  , використовуючи епітопні відбитки або спрямовану селекцію, способи, описані в Hoogenboom et al., PCT Publ. No. WO 93/06213. Бібліотеки антитіл, що використовуються в цих способах, є переважно scFv бібліотеками, які одержані та скриновані так, як описано в McCafferty et al. PCT Pub. No. WO 92/01047; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; Griffiths 14 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 et al. (1993) EMBO J. 12:725-734. Бібліотеки scFv антитіл переважно скринують, використовуючи рекомбінантний TNF  людини як антиген. При відборі вихідних сегментів VL та VH людини проводять експерименти "змішування та підбор" ("mix and match"), в якому спершу обираються різні пари сегментів VL та VH та скринуються на зв'язування з hTNF  , для вибору переважної комбінації пари VL/VH. Додатково, для подальшого покращення афінності та/або зниження константи спаду швидкості для зв'язування hTNF  , можна викликати мутацію в сегментах VL та VH переважних пар VL/VH, переважно, в районі CDR3 VH та/або VL, способом, аналогічним процесу соматичної мутації in vivo, що відповідає за афінне дозрівання антитіл під час природної імунної відповіді. Таке афінне дозрівання in vitro може супроводжуватись ампліфікацією районів VH та VL, використовуючи праймери PCR, комплементарні VH CDR3 та VL CDR3, відповідно, чиї праймери були "причеплені" до випадкової суміші нуклеотидних основ в певних позиціях так, що кінцеві продукти PCR кодують сегменти VH та VL, в яких були представлені випадкові мутації в районах CDR3 VH та/або VL. Такі випадково мутовані сегменти VH та VL можна рескринувати на зв'язування з hTNF  та можна відібрати послідовності, які демонструють високу афінність та низьку швидкість спаду для зв'язування з hTNF  . Амінокислотні послідовності легких та важких ланцюгів обраних антитіл можна порівнювати з амінокислотними послідовностями легких та важких ланцюгів антитіл зародкової лінії. У випадках, коли певні залишки рамки обраних ланцюгів VL та VH відрізняються від конфігурації зародкової лінії (напр., внаслідок соматичної мутації генів імуноглобуліну, що використовуються для одержання бібліотеки фагів), може бути бажаним "зворотньо мутувати" ("backmutate") змінені залишки рамки обраних антитіл до конфігурації зародкової лінії (тобто, змінити амінокислотні послідовності рамки обраних антитіл так, щоб вони були ідентичні амінокислотній послідовності рамки зародкової лінії). Таку "зворотню мутацію" (або "germlining") залишків рамки можна здійснити за допомогою стандартних молекулярно-біологічних способів для внесення специфічних мутацій (напр., сайт-спрямований мутагенез; PCR-опосередкований мутагенез та подібне). Після скрінінгу та виділення анти-hTNF  антитіл винаходу з бібліотеки рекомбінантних імуноглобулінів можна одержати з пакету даних нуклеїнову кислоту, яка кодує обране антитіло (напр., з геному фагів) та субклонувати в інший експресійний вектор стандартним способом рекомбінантних ДНК. При бажанні дану нуклеїнову кислоту можна надалі використовувати для створення інших форм антитіл винаходу (напр., прив'язати їх до нуклеїнової кислоти, що кодує додаткові домени імуноглобулінів, такі як додаткові константні райони). Для експресії рекомбінантного антитіла людини, виділеного при скринуванні комбінаторної бібліотеки, ДНК, що кодує антитіло, клонують в вектор рекомбінантної експресії та поміщають в мамілярну клітину-хазаїна, як описано більш детально в Розділі II вище. IV. Фармацевтичні композиції та фармацевтичне уведення Антитіла винаходу та їх частини можна помістити в фармацевтичні композиції, зручні для уведення суб'єкту. Звичайно, така фармацевтична композиція включає антитіло винаходу або його частину та фармацевтично прийнятний носій. Термін "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-який та всі розчинники, дисперсійне середовище, оболонку, антибактеріальні та антигрибкові агенти, ізотонічні та пролонгуючі абсорбцію агенти та таке ін., що є фізіологічно сумісним. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають один або більше з наступних: вода, фізіологічний розчин, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, декстроза, гліцерин, етанол, та таке ін., а також їх комбінації. В багатьох випадках буде переважним включати ізотонічні агенти, наприклад, цукру, поліспирти такі, як манітол, сорбітол, або хлорид натрію, в дану композицію. Фармацевтично прийнятні носії можуть надалі включати мінорну кількість допоміжних речовин таких, як агенти, що набухають, емульгатори, консерванти або буфери, що подовжують строк зберігання або ефективність даних антитіл або їх частин. Композиція даного винаходу може знаходитись в різних формах. Вони включають, наприклад, рідку, напівтверду та тверду форми, такі як рідкий розчин (напр. розчин для ін'єкцій та тугоплавкий розчин), дисперсії та суспензії, таблетки, пілюлі, порошки, ліпосоми та супозіторії. Переважна форма залежить від майбутнього шляху уведення та терапевтичного використання. Типовими переважними композиціями є розчини для ін'єкцій та інфузії, композиції, схожі на ті, що використовують для пасивної імунізації людей іншими антитілами. Переважним шляхом уведення є парентеральний (тобто, внутрішньовенно, підшкірно, інтраперитонеально, внутрішньом'язово). В переважному втіленні антитіла уводять внутрішньовенною ін'єкцією або інфузією. В іншому переважному втіленні антитіла уводять внутрішньом'язово або підшкірно. Звичайно, терапевтичні композиції повинні бути стерильними та стабільними в умовах виробництва та зберігання. Композицію можна виробляти як розчин, мікроемульсію, дисперсію, ліпосоми або іншу впорядковану 15 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 структуру, зручну для високих концентрацій ліків. Стерильні розчини для ін'єкцій можна приготувати включенням активного компонента (напр., антитіла або частин антитіла) в належній кількості в підходящому розчиннику з одним або комбінацією інгредієнтів, вказаних вище, що є необхідними, після стерилізації фільтрацією. Загалом, дисперсії готують включенням активної речовини в стерильний засіб транспорту, який містить основне дисперсійне середовище та інші необхідні інгредієнти з вказаних вище. В разі стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій переважними способами одержання є вакуумне висушування та ліофілізація, яка дає порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з передчасно стерилізованого фільтруванням його розчину. Густину, властиву розчину, можна встановити, наприклад, використанням покриття, такого як лецитин, встановленням належного розміру частинок в разі дисперсії та використанням сурфактантів. Пролонгованого всмоктування композицій для ін'єкцій можна досягти включенням до композиції агента, який затримує всмоктування, наприклад, солей моностеарату та желатину. Антитіла винаходу та їх частини можна уводити різними способами, відомими з рівня техніки, однак, для багатьох терапевтичних використань переважним шляхом/способом уведення є внутрішньовенна ін'єкція або інфузія. Як буде зрозуміло спеціалісту в цій галузі, шлях/спосіб уведення буде залежати від бажаного результату. В певних втіленнях активний компонент можна приготувати з носієм, який буде захищати цю речовину від швидкого вивільнювання, як композиція з контрольованим вивільненням, включаючи трансплантати, трансдермальний пластир та мікрокапсульовані системи уведення. Можуть бути використані такі біодеградуючі біосумісні полімери, як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри та полімолочна кислота. Спеціалістам відомо багато способів для одержання таких композицій. Див., наприклад, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. В певних втіленнях антитіла винаходу або їх частини можна уводити орально, наприклад, з інертним розріджувачем або їстівним носієм, що засвоюється. Речовину (та інші інгредієнти, при бажанні) можна заключити в тверді желатинові капсули, спресувати в таблетки або безпосередньо включити в індивідуальну дієту. Для орального терапевтичного уведення речовину можна інкорпорувати з інертним наповнювачем та використовувати у формі неперетравлюваних таблеток, бокальних (ротових) таблеток, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток та т.п. Для уведення речовини винаходу відмінним від парентерального шляхом може бути необхідно покрити речовину матеріалом, або уводити разом з нею матеріал для запобігання її інактивації. Додаткові активні речовини також можна включати в такі композиції. В певних втіленнях антитіла винаходу або їх частини готують разом або/та уводять разом з одним або більше додатковим терапевтичним агентом, який є корисним для лікування розладів, в яких активність TNF  є небажаною. Наприклад, анти-hTNF  антитіла винаходу або їх частини можна одержувати або/та уводити разом з одними або більше додатковими антитілами, які зв'язують інші мішені (напр., антитіла, що зв'язують інші цитокіни або зв'язують молекули поверхні клітин), одним або більше цитокінами, розчинним рецептором TNF  (див., напр., публікацію РСТ № WO 94/06476) та/або одним або більше хімічними агентами, які інгібують виробку TNF  або його активність (такі як циклогексаніліден похідні, як описано в публікації РСТ № WO 93/19751). Більш того, один вид або більше антитіл даного винаходу можна використовувати в комбінації з двома або більше попередніх терапевтичних агентів. При такій комбінованій терапії можна переважно використовувати більш низькі дози терапевтичних агентів, що уводять, таким чином запобігаючи можливій токсичності або ускладненням, пов'язаним з різними монотерапіями. Необмежені приклади терапевтичних агентів для ревматоїдного артриту, з якими антитіла винаходу або їх частини можна комбінувати, включають наступні: нестероїдні протизапальні ліки (NSAID); цитокін-супресивні анти-запальні ліки (CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNF  антитіла; Celltech/Вауег); сА2 (химерні анти-TNF  антитіла; Centocor); 75кДа TNFRIgG (75кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок; Irnmunex; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J.Invest. Med. (1996) Vol.44, 235A); 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецепторIgG плавлений білок; Hoffmann-LaRoche); roEC-CE9.1/SB 210396 (не виснажені приматизовані анти-СD4 антитіла; IDЕС/SmithKline; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 та/або DAB 389-IL-2 (IL-2 плавлені білки; Seragen; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); анти-Тас (олюднені aнти-IL-2R  ; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (анти-запальний цитокін; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; рекомбінантний IL-10 (антизапальний цитокін; DNAX/Schering); антагоністи IL-4; IL-10 та/або IL-4 (наприклад антитіла агоністи); IL-1RA (антагоніст рецептора IL-1; Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNFR (розчинний TNFзв'язуючий білок; див, наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; 16 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Amer. J. Physiol. Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol.268, pp. 37-42); R973401 (інгібітор типу IV фосфодіестерази; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); MK-966 (інгібітор СОХ-2; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S81); ілопрост (Iloprost) (див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S82); метотрексат: талідомід (див, наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S282) та ліки групи талідоміду (напр., Целген, celgen); лефлюнамід (анти-запальний та цитокіновий інгібітор; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S131; Inflamation Research (1996) Vol. 45, pp.103-107); транексамінова кислота (інгібітор активації плазміногену; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S284); T-614 (інгібітор цитокіну; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S282); простагландін E1 (див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S282); Тенідап (нестероїдні анти-запальні ліки; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S280); Напроксен (не стероїдні протизапальні ліки; див., наприклад, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Мепоксікам (нестероїдні протизапальні ліки); Ібупрофен (нестероїдні протизапальні ліки), Пероксикам (нестероїдні произапальні ліки); Діклофенак (нестероїдні протизапальні ліки); Індометацин (нестероїдні протизапальні ліки); Сульфазалазин (див., наприклад, Ariritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S281); Азатіоприн (див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S281); ICE інгібітор (інгібітор ферменту, конвертуючого інтерлейкін-ір); zap-70 та/або lck інгібітор (інгібітор тирозин-кінази zap-70 або lck); інгібітор VEGF та/або VEGF-R (інгібітори фактора росту васкулярних ендотеліальних клітин або рецептора фактора росту васкулярних ендотеліальних клітин; інгібітори ангіогенезу); кортикостероїдні протизапальні ліки (напр., SB203580); інгібітори TNF-конвертази; анти-ІL-12 антитіла; інтерлейкін-11 (див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S296); інтерлейкін-13 (див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S308); інгібітори інтерлейкіна17 (див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (supplement), S120); золото; пеніциламін; хлорохін; гідроксихлорохін; хлорамбуцил; циклофосфамід; циклоспорин; загальне лімфоїдне опромінювання; антитимоцитний глобулін; анти-СD4 антитіла; CD5-токсини; пептиди, що уводять орально, та колаген; динатрієвий лобензарит; Цитокін регулюючі агенти (CRAs) HP228 та НР466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ІСАМ-1 антисмислові фосфортіоатні олігодезоксинуклеотиди (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); розчинний рецептор комплемента 1 (ТР10; Т Cell Sciences, Inc.); преднізолон; орготеїн; глюкозаміно-гліканполісульфат; міноциклін; aнти-IL2R антитіла; морські та ботанічні ліпіди (жирні кислоти риб та рослинного насіння; див., напр, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); ауранофін; фенілбутазон; меклофенамінова кислота; флуменамінова кислота; внутрішньовенний імуноглобулін; зілейтон; мікофенолієва кислота (RS061443); такролімус (FK-506); сіролімус (рапаміцин); аміприлоза (терафектин); кладрибін (2-хлордезоксиаденозин) та азарибін. Необмеженими прикладами терапевтичних агентів для захворювань запалень кишкового тракту, з якими можна комбінувати антитіла винаходу або їх частини, включають такі: буденозид; фактор епідермального росту; кортикостероїди; циклоспорин; сульфазалазін; 6меркаптопурин; азатіорін; метронідазол; інгібітори ліпоксигенази; мезаламін; олсазалін; бальзалазід; антиоксиданти; інгібітори тромбоксану; антагоністи рецептора IL-1; анти-IL-1  моноклональні антитіла; анти-ІL-6 моноклональні антитіла; фактори росту; інгібітори еластази; сполуки пірідиніл-імідазолу; CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNF  антитіла; Celltech/Bayer); сА2 (химерні анти-TNF  антитіла; Centocor); 75кДа TNFR-IgG (75кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок; Immunex; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J.Invest. Mecl. (1996) Vol. 44, 235A); 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок; Hoffmann-LaRoche); інтерлейкін-10 (SCH 52000; Scliering Plough); IL-4; агоністи IL-10 та/або IL-4 (напр., антитіла - агоністи); інтерлейкін-11: глюкоронід- або декстран-кон'юговані преліки преднізолону, дексаметазону або буіезоніду; ІСАМ-1 антисмислові фосфоротіоатні олігодезоксинуклеитиди (ISIS 2302; Is is Pharmaceuticals, Inc.); розчинний рецептор коплемента 1 (ТР10; Т Cell Sciences, Inc.); мезалазін, що повільно вивільнюється; метотрексат; антагоністи фактору активації тромбоцитів (PAF); ципрофлоксацин та лігнокаїн. Необмежені приклади терапевтичних агентів для множинного склерозу, з якими антитіла винаходу або їх частини можна комбінувати, включають такі: кортикостероїди; преднізолон; метилпреднізолон; азатіопрін; циклофосфамід; циклоспорин; метотрексат; 4-амінопіридин; тіназідин; інтерферон-  1а (AvonexTM; Biogen); інтерферон-  1b (BetaseronTM; Chiron/Berlex); Сополімер 1 (Cop-1; CopaxoneTM; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); гіпербаричний кисень; внутрішньовенний імуноглобулін; клабринін; CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNF  антитіла; Celltech/Вауег); сА2 (химерні анти-TNF  антитіла; Centocor); 75кДа TNFR-IgG (75кДа 17 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TNF рецептор-IgG плавлений білок; Immunex; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J.Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок; Hoffmann-LaRoche); інтерлейкін-10 (SCH 52000; Schering Plough); IL-4; агоністи IL-10 та/або IL-4 (напр., антитіла - агоністи). Безліч прикладів терапевтичних агентів для сепсіса, з якими можна комбінувати антитіла винаходу, або їх частини, включають наступні: гіпертонічний фізіологічний розчин; антибіотики; внутрішньовенний гамма глобулін; тривала гемофільтрація; карбапенеми (а саме, меропенем); такі антагоністи цитокінів, як TNF  , IL-1  , IL-6 та/або IL-8; CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNF  антитіла; Celltech/Вауег); cA2 (химерні анти-TNF  антитіла; Centocor); 75кДа TNFRIgG (75кДа TNF рецептор-IgG плавлений білок; Immunex; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J.Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор IgG плавлений білок; Hoffmann-LaRoche); Цитокін регулюючі агенти (CRAs) HP228 та НР466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); SK & F 107647 (низькомолекулярний пептид; SmithKline Beecham); чотирьох-валентний гуанілгідразон CNI-1493 (Picower Institute); інгібітор тканинного фактора шляху (TFPI; Chiron); PHP (хімічно модифікований гемоглобін; APEX Bioscience); хелатоутворювачі та хелати заліза, включаючи комплекс діетилентриамін пентаоцтова кислота - залізо (III) (DTPA залізо (III); Molichem Medicines); лізофілін (синтетичний низькомолекулярний метилксантин; Cell Therapeutics, Inc.); PGG-глюкан (водорозчинний P 1.3 глюкан; Alpha-Beta Technology); аполіпопротеїн A-1, відновлений ліпідами; хіральні гідроксамові кислоти (синтетичні бактерициди, які інгібують біосинтез ліпіду А); анти-ендотоксинові антитіла; Е5531 (синтетичний антагоніст ліпіду A; Eisai America, Inc.); rВРI 21 (рекомбінантний N-кінцевий фрагмент людського бактерицидного/підвищуючого проникливість білка) та синтетичні антиендотоксинні пептиди (SAEP; BiosYnth Research Laboratories). Безліч прикладів терапевтичних агентів для респіраторного дистрес-синдрома дорослих, з якими можна комбінувати антитіла винаходу, або їх частини, включають наступні: анти-IL-8 антитіла; сурфактант заміщуюча терапія; CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNF  антитіла; Celltech/Вауеr); сА2 (химерні анти-TNF  антитіла; Centocor); 75кДа TNFR-TgG (75кДа TNF рецептор-IgG плавлений білок; Immunex; див., наприклад, Artritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J.Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок; Hoffmann-LaRoche). Використання антитіл винаходу або їх частин в комбінації з іншими терапевтичними агентами обговорюється надалі в підрозділі IV. Фармацевтичні композиції даного винаходу можуть включати "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіл винаходу або їх частин. "Терапевтично ефективною кількістю" називається кількість, що є ефективною в необхідних дозах та періодах часу для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіл або їх частин може змінюватись в залежності від таких факторів, як стан хвороби, вік, стать та вага індивіда, а також здібність антитіл або їх частин викликати бажану відповідь у індивіда. При терапевтично ефективній кількості небажані ефекти антитіл або їх частин перекриваються терапевтичним позитивним ефектом. "Профілактично ефективною кількістю" називається кількість, ефективна в дозах та періодах часу, необхідних для досягнення бажаного профілактичного результату. Звичайно, оскільки профілактичні дози використовують у пацієнта до або на ранніх стадіях захворювання, профілактично ефективна кількість буде менше, ніж терапевтично ефективна кількість. Дозовий режим можна впорядкувати для забезпечення оптимальної бажаної відповіді (тобто, терапевтичної або профілактичної відповіді). Наприклад, можна уводити одну таблетку, кілька окремих доз через певний час, або дозу можна пропорційно знизити або підвищити, як того потребує терапевтична ситуація. Особливо зручно готувати парентеральні композиції в одиничній дозованій формі для простого уведення та уніфікації дозування. Дозованою формою в рамках винаходу називається фізично дискретні одиниці, що підходять для одиничного дозування ссавців, яких лікують, при чому кожна одиниця містить передбачену кількість активного компонента, розрахованого для одержання терапевтичного ефекту, в комплексі з потрібним фармацевтичним носієм. Специфікація дозованих форм винаходу диктується та прямо залежить від (а) унікальних характеристик активної речовини та особливостей терапевтичного або профілактичного ефекту, що потрібно досягти, та (б) обмежень, властивих даній області, для включення такої активної речовини для лікування чутливості індивідів. Наприклад, необмежені рамки для терапевтичної або профілактичної кількості антитіл винаходу або їх частин є 0,1-20мг/кг, переважніше 1-10мг/кг. Слід сказати, що величина дози може змінюватись в залежності від типу та тяжкості стану, що треба зняти. Далі буде зрозумілим, що для багатьох особливих пацієнтів специфічний режим доз повинен бути 18 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підібраний протягом часу, відповідного індивідуальній потребі, а професійний підбір при підборі та уведенні композицій, та рамки доз, поміщених далі, є тільки прикладами без обмежень масштабу та практики композицій формули. IV. Використання антитіл винаходу. Внаслідок своїй здатності зв'язувати hTNF  , анти-hTNF  антитіла винаходу або їх частини можна використовувати для детекції hTNF  (наприклад, в біологічних пробах, таких, як сироватка та плазма), використовуючи традиційний імуноаналіз, такий як твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), радіоімуноаналіз (RIA) або тканинну імуногістохімію. Винахід забезпечує способом визначення hTNF  в біологічних пробах, що включає контактування біологічної проби з антитілами винаходу або їх частинами та детекцію або антитіл (або їх частин), зв'язаних з hTNF  , або незв'язаних антитіл (або частин антитіл), за допомогою чого досліджують hTNF  в біологічних пробах. Антитіла прямо чи непрямо мітять речовиною, що можна спостерігати, для полегшення детекції зв'язаних та незв'язаних антитіл. Зручні речовини, що можна спостерігати, включають різноманітні ферменти, простатичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали. Приклади зручних ферментів включають пероксидазу хріну, лужну фосфатазу,  -галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади зручних комплексів простатичних груп включають стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади зручних флуоресцентних матеріалів включають умбелліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізоціанат, родамін, діхлортриазініламін флуоресцеїн, дансіл хлорид або фікоерітрин; приклади люмінісцентинх матеріалів включають люмінол; приклади зручних 125 131 35 3 радіоактивних матеріалів включають I, I, S та Н. Альтернативно до мічення даних антитіл hTNF  можна дослідити в біологічній рідині конкурентним імуноаналізом, використовуючи стандарти rhTNF  , помічені речовиною, що можна спостерігати, та немічені анти-hTNF  антитіла. В даному досліді сполучають біологічну пробу, мічені стандарти rhTNF  та анти-hTNF  антитіла та вимірюють кількість мічених стандартів rhTNF  , зв'язаних з неміченими антитілами. Кількість hTNF  в біологічному зразку є зворотно пропорційною кількості мічених стандартів rhTNF  , зв'язаних з неміченими антиhTNF  антитілами. Антитіла D2E7 винаходу можна також використовувати для детекції TNF  відмінних від людини видів, особливо TNF  приматів (а саме, шимпанзе, бабуїна, мавпи, павіана та резуса), свині та миші, оскільки D2E7 можуть зв'язуватись з кожним з цих TNF  s (обговорюється далі в Прикладі 4, підрозділі Е). Антитіла винаходу або їх частини здатні нейтралізувати активність hTNF  як in vitro, так і in vivo (див. Приклад 4). Більш того, принаймні деякі з антитіл винаходу, такі як D2E7, можуть нейтралізувати активність TNF  інших видів. Відповідно, антитіла винаходу або їх частини можна використовувати для інгібування активності TNF  , наприклад, в культурі клітин, що містить TNF  , в людському організмі або інших мамілярних об'єктах, які мають TNF  , з якими перехресно реагують антитіла винаходу (а саме, шимпанзе, бабуїна, мартишки, павіана та резуса, свині або миші). В одному з втілень даний винахід забезпечує способом інгібування активності TNF  , який включає контактування TNF  з антитілами винаходу або їх частинами так, що інгібується активність TNF  . Переважно, TNF  є TNF  людини. Наприклад, в культуральне середовище культури клітин, яка містить або може містити TNF  , можна додати антитіла винаходу або їх частини для інгібування активності TNF  . В іншому втіленні винахід забезпечує способом інгібування активності TNF  у суб'єкта, що страждає на розлад, при якому активність TNF  є згубною. TNF  залучений в патофізіологію багатьох розладів (див., напр., Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No. 5,231,024 Moeller et аl.; Європейська Патентна публікація No. 260 610 Moeller et al.). Даний винахід забезпечує способами для активності TNF  , що страждає на такий розлад, при чому цей спосіб включає уведення суб'єкту антитіл винаходу або їх частин так, що активність TNF  у суб'єкта інгібується. Переважно, TNF  TNF  льодини, а суб'єкт є людиною. Суб'єкт, навпаки, може бути ссавцем, який експресує TNF  , з яким перехресно реагують антитіла винаходу. Надалі суб'єкт може бути ссавцем, якому уводили hTNF  (напр., уведенням hTNF  , або експресією трансгенного hTNF  ). Антитіла винаходу можна уводити людині з терапевтичними цілями (обговорюється далі). Більш того, антитіла винаходу можна уводити ссавцю, що не є людиною, який експресує TNF  , з яким перехресно реагують дані антитіла (напр., примати, свиня або миша) для ветеринарних цілей або в тваринних моделях людських хвороб. Відносно останнього, такі тваринні моделі можуть бути корисними для дослідження терапевтичної ефективності антитіл винаходу (напр., дослідженням доз та курсу уведення). 19 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В даному контексті термін "розлади, при яких активність TNF  є згубною", включає захворювання та інші розлади, при яких показано або підозрюється, що присутність TNF  у суб'єкта, що страждає на такий розлад, є відповідальною за патофізіологію розладу або фактором, що привносить в погіршення розладу. Відповідно, розлад, при якому активність TNF  є згубною, є розладом, в якому очікується, що інгібування активності TNF  полегшить симптоми та/або прогрес розладу. Такі розлади можна виявити, наприклад, по підвищенню концентрації TNF  в біологічній рідині суб'єкта, що страждає на розлад (напр., підвищенню концентрації TNF  в сироватці, плазмі, синовіальній рідині, і т.д. суб'єкта), яку можна дослідити, наприклад, використовуючи анти-TNF  антитіла так, як описано вище. Є багато прикладів розладів, в яких активність TNF  є згубною. Використання антитіл винаходу та їх частин при лікуванні специфічних розладів обговорюється надалі: А. Сепсис Фактор некрозу пухлини має встановлену роль у патофізіології сепсису з біологічним ефектом, який включає гіпотонію, міокардіальну супресію, синдром васкулярної течі, некроз органів, стимуляцію вивільнення токсичних вторинних медіаторів та активацію каскаду згорнення (див., наприклад, див., напр., Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No. 5,231,024 Moeller et аl.; Європейська Патентна публікація No. 260 610 Moeller et al., Тгасеу, K. J. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russel, D. and Thompson, R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). Відповідно, людські антитіла винаходу та їх частини можна використовувати для лікування сепсису в будь-якій клінічній формі, включаючи сепсисний шок, ендотоксичний шок, грам-негативний сепсис та синдром токсичного шоку. Більш того, для лікування сепсису анти-hТNF  -антитіла винаходу або їх частини можуть уводитися разом з одним або більше терапевтичних агентів, які надалі можуть пригнічувати сепсис, таким, як інгібітор інтерлейкіна-1 (як це описано в публікаціях РСТ WO 92/16221 та WO 92/17583), цитокін інтерлейкін-6 (див. публікацію РСТ WO 9311793) або антагоніст фактора активації тромбоцитів (див., напр., Європейську патентну публікацію ЕР 374 510). Інші комбіновані терапії для лікування сепсису обговорюються надалі в підрозділі III. Додатково, в переважному втіленні aнти-hTNF  -антитіла винаходу або їх частини уводяться людині з підгрупи пацієнтів з сепсисом, що мають концентрацію IL-6 сироватки або плазми приблизно 500пг/мл та більше, переважно 1000пг/мл, під час лікування (див., публікацію РСТ WO 95/20978 Daum, L., et al.). В. Автоімунні захворювання Показано, що фактор некрозу пухлини грає роль в патофізіології багатьох автоімунних захворювань. Наприклад, знайдено, що TNF  грає роль в активації запалення тканин та викликанні супутніх порушень при ревматоїдному артриті (див., напр., Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No. 5,231,024 Moeller et al.; Європейська Патентна публікація No. 260 610 Moeller et al., Tracey, K. J. and Cerami, А. вищевказане посилання; Amid, W.P. and Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38:151-160; Fava, R.A., et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261266). TNF  також залучений до підсилення гибелі острівних клітин та опосередкуванні інсулінової резистентності при діабеті (див., напр., Тгасеу and Cerami, вищевказане посилання; публікацію РСТ WO 94/08609). TNF  також залучений до опосередкування цитотоксичності до олігодендроцитів та індукції запальних тромбоцитів при множинному склерозі (див., напр., Тrасеу and Cerami, вищевказане посилання). Химерні та олюдненні мишачі анти-hTNF  антитіла проходять клінічне випробовування для лікування ревматоїдного артриту (див., напр., Elliott, M. J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M. J., et al. (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E. C., et al. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342). Антитіла людини винаходу та їх частини можна використовувати для лікування автоімунних захворювань, особливо тих, що пов'язані з запаленням, включаючи ревматоїдний артрит, ревматоїдний спондиліт, остеоартрит та подагричний артрит, алергію, множинний склероз, автоімунний діабет, автоімунний ювеіт та нефротичний синдром. Звичайно, антитіла або їх частини уводять системно, хоча при деяких розладах може бути вигідним локальне уведення антитіл або їх частин в місце запалення (напр., локальне уведення в суглоби при ревматоїдному артриті або місцеві аплікації при діабетичній виразці, одні або в комбінації з похідними циклогексан-ілідена так, як описано в публікації РСТ WO 93/19751). Антитіла винаходу і їх частини можна уводити з одним або більше терапевтичними агентами, корисними в лікуванні автоімунних захворювань, як описано надалі в підрозділі III. С. Інфекційні захворювання Фактор некрозу пухлини бере участь в опосередкуванні біологічних ефектів, які спостерігаються в багатьох інфекційних захворюваннях. Наприклад, TNF  опосередковує 20 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 межове запалення та капілярний тромбоз та інфаркт при малярії. TNF  також опосередковує мозкове запалення, викликане порушенням гемато-інцефалічного бар'єру, запуск синдрому септичного шоку та активацію венозного інфаркту при менінгіті. TNF  також бере участь в викликанні кахексії, стимулюванні вірусної проліферації та опосередкуванні ураженні центральної нервової системи при синдромі надбаного імунодефіциту (СНІД). Відповідно, антитіла винаходу та їх частини можна використовувати при лікуванні інфекційних захворювань, включаючи бактеріальний менінгіт (див., напр., Європейську патентну публікацію ЕР 585 705), церебральну малярію, СНІД та СНІД-пов'язаний комплекс (ARC) (див., напр., Європейську патентну заявку ЕР 230574), а також вторинну після трансплантації цитомегаловірусну інфекцію (див., напр., Fietze, E., et al. (1994) Transplantation 58:675-680). Антитіла винаходу та їх частини також можна використовувати для зняття симптомів, пов'язаних з інфекційними хворобами, включаючи лихоманку та міалгію, викликаний інфекцією, (такий як грип) та кахексію, викликану інфекцією (напр., вторинною до СНІДу та ARC). D. Трансплантація Фактор некрозу пухлини є ключовим медіатором при відторгненні алотрансплантата та захворювання трансплантат проти хазяїна (GVHD) та опосередкуванні реакції відторгнення, яку спостерігають, якщо антитіла щурів ОКТЗ, спрямовані проти комплексу CD3 рецептора Т-клітин, використовують для інгібування відторгнення трансплантатів нирок (див., напр, Eason, J.D., et al. (1995) Transplantation 59:300-305; Suthanthrian M. and Strom T.B. (1994) New Engl. J. Med. 331:365-375). Відповідно, антитіла винаходу та їх частини можна використовувати для інгібування відторгнення трансплантата, включаючи відторгнення алотрансплантатів та ксенотрансплантатів та інгібування GVHD. Хоча антитіла та їх частини можна використовувати як такі, більш переважно їх використовують в комбінації з одним або більше іншим агентом, який інгібує імунну відповідь проти аллотрансплантата або інгібує GVHD. Наприклад, в одному з втілень антитіла винаходу або їх частини використовують в комбінації з ОКТЗ для інгібування ОКТЗ-стимульованої реакції. В іншому втіленні антитіла винаходу або їх частини використовують в комбінації з одними або більше антитілами, спрямованими на інші цілі, що включені до регулювання імунної відповіді, такі як молекули поверхні клітин CD25 (  -рецептор інтерлейкіна-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ІСАМ-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (В7-1) та/або CD86 (В7-2). В ще одному втіленні даного антитіла винаходу або їх частини використовують в комбінації з одним або більше загальним імуносупресивним агентом, таким як циклоспорин А або FK506. E. Злоякісні утворення Фактор некрозу пухлин бере участь у викликанні кахексії, що викликає ріст пухлин, поширює метастичний потенціал та опосередковує цитотоксичність злоякісних утворень. Відповідно, антитіла винаходу та їх частини можна використовувати для лікування злоякісних утворень для інгібування пухлинного росту або метастазу та/ або для зняття кахексії, що є вторинною до злоякісного утворення. Дані антитіла або їх частини можна уводити системно або локально у місце пухлини. F. Розлади дихальної системи Фактор некрозу пухлин бере участь в патофізіології респіраторного дистрес-синдрома дорослих (ARDS), включаючи стимулювання лейкоцит-ендотеліальної активації, спрямовуючи цитотоксичність до пневмоцитів та викликаючи васкулярний синдром. Відповідно, антитіла винаходу або їх частини можна використовувати для лікування різноманітних розладів системи дихання, включаючи респіраторний дистрес-синдром дорослих (див., напр., публікацію РСТ № WO 91/04054), легеневий шок, хронічне запалення дихальної системи, саркоідоз легенів, фіброз та сілікоз легенів. Дані антитіла або їх частини можна уводити системно або локально на поверхню легенів, наприклад у вигляді аерозолю. Антитіла даного винаходу або їх частини можна уводити з одним або більшою кількістю додаткових терапевтичних агентів, корисних при лікуванні розладів дихальної системи, як описано в підрозділі III. G. Розлади кишкового тракту Фактор некрозу пухлин бере участь у патофізіології розладів шлунково-кишкового тракту (див., наприклад, Tracy, K. J., et al. (1986) Science 234:470-474; Sun, X.-M., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:1328-1331; MacDonald, T. T., et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:301-305). Химерні мичачі анти-hTNF  антитіла пройшли клінічні випробовування при лікуванні кишкового захворювання (van Dullemen, H. M., et al. (1995) Gastroenterology 109:129-135). Антитіла людини даного винаходу або їх частини також можна використовувати для лікування розладів кишкового тракту, таких як ідіопатична запальна хвороба, яка включає два синдрома, хворобу Крона та виразковий коліт. Антитіла винаходу та їх частини також можна уводити з одним або 21 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 більше терапевтичними агентами, корисними при лікуванні розладів кишкового тракту, як описано в підрозділі III. Н. Розлади серцевої системи Антитіла винаходу або їх частини можна використовувати для лікування різноманітних кардіологічних розладів, включаючи ішемію серця (див., наприклад, публікацію заявки на Європейський патент № ЕР 453 898) та серцеву недостатність(слабкість серцевих м'язів) (див., наприклад, Публікацію РСТ № WO 94/20139). І. Інші розлади Антитіла винаходу та їх частини також можна використовувати для лікування інших хвороб та розладів, в яких активність TNF  є згубною. Прикладами інших хвороб та розладів, в яких активність TNF  має значення у патофізіології та, отже, які можна лікувати, використовуючи антитіла винаходу або їх частини, є запальні захворювання суглобів та захворювання всмоктування кісток (див., наприклад, Bertolini D.R., et al., (1986) Nature 319:516-518; Konig A., et al. (1988) J. Bone Miner. Res. 3:621-627; Lerner, U.H., and Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8:147-155; Shankar, G. and Stern P.H. (1993) Bone 14:871-876), гепатит, включаючи алкогольний (див., напр., McClain, C.J. and Cohen D.A. (1989) Hepatology 9:349-351; Felvar M.E., et al. (1990) Alcohol. Clin Exp. Res. 14:255-259; and Hansen, J. et al., (1994) Hepatology 20:461-474), вірусний гепатит (Sheron, N., et al. (1991) J. Hepatol. 12:241-245; Hussain, M.J., et al. J. Clin. Pathol. 47:1112-1115) та скоротечний гепатит; порушення згортання (див., напр., van der Poll, T. et al. (1990) N. Engl. J. Med. 322:1622-1627; van der Poll T. et al., (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60), запалення (див., напр., Giroir, B.P., et al. (1994) Am. J. Physiol. 267:H118-124; Liu, X.S., et al. (1994) Burns 20:40-44), ураження перфузії (див. напр., Scales, W.E., et al. (1994) Am. J. Physiol. 267:G1122-1127; Serrick, C, (1994) Transplantation 58:1158-1162; Yao, Y.M., et al. (1995) Resuscitation 29:157-168), келоїдні утворення (McCauley, R.L., et al. (1992) J. Clin. Immunol. 12:300-308), утворення рубців; пірексія; періодонтальне захворювання; ожиріння та радіаційна токсичність. Даний винахід надалі демонструється наступними прикладами, які не є обмежуючими. В міст всіх засилок, патентів та опублікованих патентних заявок поміщений тут шляхом посилання. ПРИКЛАД 1. Кінетичний аналіз зв'язування антитіл людини з hTNF  Зв'язування в реальному часі між лігандом (біотинільований рекомбінантний TNF  людини (rhTNF  ), іммобілізований на біосенсорній матриці) та аналітом (антитілами у розчині) вимірювали резонансом поверхневого плазмону (SPR) в системі ВІАсоrе (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NY). Ця система використовує оптичні властивості SPR для визначення змін концентрації білка всередині декстранового біосенсорного матриксу. Білки ковалентно зв'язують з декстрановим біосенсорним матриксом у відомих концентраціях. Антитіла уводять через декстрановий матрикс, а специфічне зв'язування між уведеними антитілами та іммобілізованими лігандами призводить до підвищення концентрації білка в матриксі та кінцевої зміни сигналу SPR. Такі зміни в сигналі SPR визначають в резонансних одиницях (RU) та зображають в часовій залежності вздовж осі Ү сенсограми. Для проведення іммобілізації біотинільованого rhTNF  на біосенсорному матриксі стрептавідин ковалентно зв'язують через вільні аміногрупи з декстрановим матриксом, спершу активуючи карбоксильні групи на матриксі за допомогою 100мМ N-гідроксисукциніміду (NHS) та 400мМ гідрохлориду N-eтил-N'-(3-диетиламінопропил)карбодііміду (EDC). Надалі, стрептавідин пропускають крізь активований матрикс. Тридцять п'ять мікролітрів стрептавідину (25мкг/мл), розведеного в ацетаті натрію, рН 4,5, пропускають крізь активований біосенсор та вільні аміни білка зв'язуються прямо з активованими карбоксильними групами. EDC-ефіри матрикса, які не прореагували, дезактивували 1 М етаноламіном. Біосенсорні чіпи з стрептавідином комерційно доступні (Pharmacia BR-1000-16, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Біотинільований rhTNF  синтезували при розчиненні 5,0мг біотина (N-гідроксисукцинімідний ефір D-біотиніл-  амінокапронової кислоти; Boehringer Mannheim Cat. No. 1008 960) в 500мкл диметилсульфоксида для одержання розчину 10мг/мл. Десять мкл біотину на мл rhTNF  (в концентрації 2,65мг/мл) додавали до молярного співвідношення 2:1 біотину до rhTNF  . Реакційну суміш акуратно перемішували та проводили реакцію протягом двох годин при кімнатній температурі в темряві. Колонку PD-10 з Сефадексом G-25M (Pharmacia Catalog No. 17-0851-01) врівноважували 25мл холодного PBS (забуференого фізіологічного розчину) та загружали 2мл rhTNF  -біотина на колонку. Колонку елюювали 10 × 1мл холодного PBS. Фракції збирали та прочитували при оптичній густині OD280 (1,0 OD=1,25мг/мл). Відповідні фракції об'єднували та зберігали при -80 °C до використання. Біотинільований rhTNF  є також 22 UA 102988 C2 5 10 15 комерційно доступним (R & D Systems Catalog No. FTA00, Minneapolis, MN). Біотинильований rhTNF  , що планують імобілізувати на матриксі через стрептавідин, розводили в робочому PBS буфері (Gibco Cat. No. 14190-144, Gibco BRL, Grand Island, NY) з додаванням 0,05 % (BIAcore) сурфактанта Р20 (Pharmacia BR-1000-54, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Для визначення здатності rhTNF  -специфічних антитіл зв'язувати іммобілізований rhTNF  проводили дослід по зв'язуванню так, як описано нижче. Аліквоти біотинильованого rhTNF  (25нМ; аліквоти по 10мкл) наносили на сірептавідин-зв'язаний декстрановий матрикс при швидкості току 5мкл/хв. Перед нанесенням та одразу ж після нанесення через кожний проточний осередок пропускали PBS. Різницю в сигналі між базовою лінією та приблизно 30 сек після завершення нанесення біотинільованого rhTNF  брали за критерій зв'язуючого об'єму (приблизно 500 RU). Вимірювали пряме зв'язування rhTNF  -специфічних антитіл до імобілізованого біотинільованого rhTNF  . Антитіла (20мкг/мл) розводили в буфері PBS для нанесення та наносили аліквоти по 25мкл на матрикси з іммобілізованим білком при швидкості току 5мкл/хв. До нанесення антитіл та одразу ж після PBS буфер пропускали через кожний осередок. Різницю між базовою лінією та сигналом після завершення нанесення антитіл брали як критерій зв'язуючого об'єму кожної проби. Біосенсорні матрикси регенерували, використовуючи 100мМ НСl перед нанесенням слідуючої проби. Для дослідження константи спаду швидкості ( К сп ), підвищення 20 швидкості (Кп), константи асоціації ( Ка ) та константи дисоціації (Кд ) використовували програму BIAcore kinetic evaluation software (версія 2.1). Показові результати зв'язування D2E7 (IgG4 цільно ланцюгові) з біотинільованим rhTNF  , порівняно з мишачим мАТ МАК 195 (F(ab")2) показані в таблиці 1. Таблиця 1 Зв'язування D2E7 IgG4 або МАК 195 з біотинільованим rhTNFa Антитіла [AT], нМ rhTNF  , зв'яз RU Антитіла, зв'яз, RU rhTNF  /AT Ксп, c (Avg) -1 -5 D2E7 373 420 434 450 460 486 489 470 1215 1569 1633 1532 1296 936 536 244 1,14 1,30 1,31 1,19 0,98 0,67 0,38 0,18 8,45 × 10 -5 5,42 × 10 -5 4,75 × 10 -5 4,46 × 10 -5 3,47 × 10 -5 2,63 × 10 -5 2,17 × 10 -5 3,68 × 10 -5 (4,38 × 10 ) МАК 195 25 267 133 67 33 17 8 4 2 400 200 100 50 25 13 6 3 375 400 419 427 446 464 474 451 881 1080 1141 1106 957 708 433 231 1,20 1,38 1,39 1,32 1,09 0,78 0,47 0,26 5,38 × 10 -5 4,54 × 10 -5 3,54 × 10 -5 3,67 × 10 -5 4,41 × 10 -5 3,66 × 10 -5 7,37 × 10 -5 6,95 × 10 -5 (4,94 × 10 ) -5 В другій серії експериментів молекулярну кінетику реакцій між цільно-ланцюговою формою IgG1 D2E7 та біотинільованим rhTNF  аналізували кількісно, використовуючи технологію ВІАсоrе, як описано вище, а одержані кінетичні константи швидкості зведені в таблицях 2, 3 та 4. 23 UA 102988 C2 Таблиця 2 Уявні константи швидкості дисоціації реакції між D2E7 та біотинільованим rhTNF -1 Експеримент 1 2 3 Середня КД (с ) -5 9,58 × 10 -5 9,26 × 10 -5 7,60 × 10 -5 8,81  1,06 × 10 Таблиця 3 Уявні константи швидкості асоціації реакції між D2E7 та біотинільованим rhTNF -1 Експеримент 1 2 3 Середня -1 Ка (М • с ) 5 1,33 × 10 5 1,05 × 10 5 3,36 × 10 5 1,91±1,26 × 10 Таблиця 4 Уявні кінетичні константи швидкості та афінності D2E7 та біотинільованого rhTNF Експеримент 1 2 3 Середня 5 10 -1 -1 -1 Ка (М • с ) 5 1,33 × 10 5 1,05 × 10 5 3,36 × 10 5 1,91±1,26 × 10 КД(с ) -5 9,58 × 10 -5 9,26 × 10 -5 7,60 × 10 -5 8,81±1,06 × 10 КД (М) -10 7,20 × 10 -10 8,82 × 10 -10 2,26 × 10 -10 6,09±3,42 × 10 Константи швидкості дисоціації та асоціації підраховували, аналізуючи райони дисоціації та асоціації сенсограм за допомогою програми ВІА analysis. Для реакції між D2E7 та молекулою біотинільованого rhTNF приймали традиційну кінетику реакції: нульовий порядок дисоціації та перший порядок асоціації. Для аналізу брали до уваги взаємодію тільки між однією рукою бівалентних антитіл D2E7 та однією одиницею тривимірного біотинільованого rhTNF для вибору молекулярної моделі для аналізу кінетичних даних. Проводили три незалежні експерименти, а результати аналізували незалежно. Середня уявна константа швидкості дисоціації ( k д ) -5 -1 взаємодії D2E7 та біотинільваним rhTNF дорівнювала 8,81±1,06 × 10 с , а середня уявна 5 -1 -1 константа швидкості асоціації ( k а ) була 1,91±1,26 × 10 М • с . Уявну істинну константу 15 20 25 30 дисоціації розраховували за формулою К Д  k d / k a . Так, значуща КД D2E7 для rhTNF, що -10 походить від кінетичних параметрів, була 6,09±3,42 × 10 М. Мінорні розбіжності в кінетичних величинах для форми IgG1 D2E7 (представлені в Табл. 2, 3 та 4) та форми IgG4 D2E7 (представлені в Таблиці 1 та Прикладах 2 та 3) не можна вважати істинними розбіжностями, що виникають від присутності константних районів або IgG1 або IgG4, але скоріше можна віднести до більш чіткого визначення концентрації антитіл, що використовували для кінетичних аналізів з IgG1. Відповідно, можна вважати, що кінетичні величини для форми IgG1 D2E7, наведені тут, є більш чіткими кінетичними параметрами для антитіл D2E7. ПРИКЛАД 2. Скануючий мутагенез по аланіну домена CDR3 D2E7 Серію одиничних мутацій по аланіну проводили стандартним способом в домені CDR3 D2E7 VL та D2E7 VH районах. Мутації легкого ланцюгу представлені на Фіг. 1В (LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7 і LD2E7*.A8, в яких мутації по аланіну знаходяться в положеннях 1, 3, 4, 5, 7 або 8, відповідно, в домені CDR3 D2E7 VL). Мутації у важкому ланцюгу представлені на Фіг. 2В (HD2E7*.A1, HD2E7*.A2, HD2E7*.A3, HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6, HD2E7*.A7, HD2E7*.A8 та HD2E7*.A9, що мають мутації по аланіну в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 або 11, відповідно, в CDR3 D2E7 VH). Кінетика взаємодії rhTNF  з антитілами, складеними з диких D2E7 VH та VL, порівнювали з кінетикою антитіл, складених з 1) дикого D2E7 VL, що з'єднується з аланін-заміщеним D2E7 VH; 2) дикого D2E7 VH, що 24 UA 102988 C2 з'єднується з аланін-заміщеним D2E7 VL; або аланін-заміщений D2E7 VL з'єднаний з аланінзаміщеним D2E7 VH. Всі антитіла аналізували у вигляді цільно-ланцюгової молекули IgG4. Кінетику реакції антитіл з rhTNF  вивчали резонансом поверхневого плазмону, як описано в прикладі 1. Константи К сп для різних пар VH/VL зведені в Таблиці 5. 5 Таблиця 5 Зв'язування мутантів по аланіну D2E7 з біотинільованим rhTNF  VH D2E7 VH HD2E7*.A1 HD2E7*.A2 HD2E7*.A3 HD2E7*.A4 HD2E7*.A5 HD2E7*.A6 HD2E7*.A7 HD2E7*.A8 HD2E7*.A9 D2E7 VH D2E7 VH D2E7 VH D2E7 VH D2E7 VH D2E7 VH HD2E7*.A9 10 15 20 -1 К сп (с ) -5 9,65 × 10 -4 1,4 × 10 -4 4,6 × 10 -4 8,15 × 10 -4 1,8 × 10 -4 2,35 × 10 -4 2,9 × 10 -4 1,0 × 10 -4 3,1 × 10 -4 8,1 × 10 -5 6,6 × 10 не досліджується -4 1,75 × 10 -4 1,8 × 10 -4 1,4 × 10 -4 3,65 × 10 -4 1,05 × 10 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL D2E7 VL LD2E7*.A1 LD2E7*.A3 LD2E7*.A4 LD2E7*.A5 LD2E7*.A7 LD2E7*.A8 LD2E7*.A1 Ці результати свідчать, що більшість з положень доменів CDR3 D2E7 VH та VL районів можна заміщувати на один залишок цистеїну. Заміщення одиничного аланіну в положенні 1, 4, 5 або 7 CDR3 D2E7 VL чи в положенні 2, 5, 6, 8, 9 чи 10 домена CDR3 D2E7 VH не впливає суттєво на швидкість спаду зв'язування hTNF  порівняно з диким батьківськими антитілами D2E7. Заміщення в положенні 8 CDR3 D2E7 VL або в положенні 3 CDR3 D2E7 VH сприяє 4кратному підсиленню К сп , а заміщення аланіну в положеннях 4 або 11 CDR3 D2E7 VH дає 8кратне підсилення К сп , що говорить про те, що ці положення є критичними для зв'язування з hTNF  . Однак, одинична заміна аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 чи 8 CDR3 D2E7 VL або в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11 CDR3 D2E7 VH все ж таки призводить до утворення -3 анти-hTNF  антитіл, які мають К сп 1 × 10 або менше. ПРИКЛАД 3. Аналіз зв'язування антитіл, що походять від D2E7 Ряд антитіл, що походять від послідовності D2E7, аналізували на зв'язування з rhTNF  , пoрівняно з D2E7, резонансом поверхневого плазмону так, як описано в Прикладі 1. Амінокислотні послідовності районів VL, що аналізували, представлені на Фіг. 1А та 1В. Амінокислотні послідовності районів VH, що аналізували, представлені на Фіг. 2А та 2В. К сп для різних пар VH/VL (в позначеному вигляді, або як цільно-ланцюгові IgG1 або IgG4 антитіла або як scFv) зведені в таблиці 6: Таблиця 6 Зв'язування антитіл, що походять від D2E7, з rhTNF  VH D2E7 VH VH1-D2 VH1-D2 VH1-D2.N VH1-D2.Y VH1-D2.N Вигляд IgG1/IgG4 IgG1/IgG4 scFv IgG4 IgG4 IgG4 VL D2E7 VL LOE7 LOE7 LOE7.T LOE7.A LOE7.A 25 -1 Ксп(c ) -5 9,65 × 10 -5 7,7 × 10 -4 4,6× 10 -5 2,1 × 10 -5 2,7 × 10 -5 3,2 × 10 UA 102988 C2 VH1-D2 VH1-D2 ЗС-Н2 2SD4 VH 2SD4VH VH1A11 VH1B12 VH1B11 VH1E4 VH1F6 VH1D8 VH1G1 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH ЕРВ12 2SD4 VL LOE7 LOE7 2SD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL ЕРВ12 VL10E4 VL100A9 VL100D2 VL10F4 VLLOE5 VLL0F9 VLL0F10 VLLOG7 VLLOG9 VLLOH1 VLLOH10 VL1B7 VL1C1 VL1C7 VL0.1F4 VL0.1H8 -4 8,0 × 10 -3 1,94 × 10 -3 1,5 × 10 -3 6,07 × 10 -2 1,37 × 10 -2 1,34 × 10 -2 1,01 × 10 -3 9,8 × 10 -2 1,59 × 10 -2 2,29 × 10 -3 9,5 × 10 -2 2,14 × 10 -3 6,7 × 10 -3 9,6 × 10 -2 1,33 × 10 -2 1,41 × 10 -2 1,11 × 10 -2 1,16 × 10 -3 6,09 × 10 -2 1,34 × 10 -2 1,56 × 10 -2 1,46 × 10 -2 1,17 × 10 -2 1,12 × 10 -2 1,3 × 10 -2 1,36 × 10 -2 2,0 × 10 -2 1,76 × 10 -2 1,14 × 10 scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv -4 -1 5 10 15 20 25 Повільні константи спаду швидкості (тобто, Ксп ≤1 х х 10 с ) для цільно-ланцюгових антитіл (наприклад, вигляду IgG), які мають VL обрані із D2E7, LOE7.T та LOE7.A, які мають або треонін або аланін в положенні 9, показують, що положення 9 CDR3 D2E7 VL може займати один з цих залишків без суттєвого впливу на К сп . Відповідно, консенсусний мотив CDR3 D2E7 VL включає амінокислотну послідовність: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO:3). Більш того, повільні -4 -1 константи спаду швидкості (тобто, Ксп ≤1 х х 10 с ) для антитіл, які мають VH, обрані із D2E7, VH1-D2.N та VH1-D2.Y, що містять або тирозин або аспарагін в положенні 12, показують, що положення 12 CDR3 D2E7 VH можуть займати обидва ці залишки без суттєвого впливу на К сп . Відповідно, консенсусний мотив для CDR3 D2E7 VH включає амінокислотну послідовність: V-SY-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO:4). Результати, які наведені в Табл. 6, демонструють, що у формі scFv антитіла, які мають 2SD4 -3 -1 АБО CDR3 VH райони, демонструють більш високі К сп (тобто, Ксп ≤1 х х 10 с ) порівняно з антитілами, що містять D2E7 VL або VH CDR3 райони. Всередині VL CDR3 2SD4 відрізняється від D2E7 в положеннях 2, 5 та 9. Як згадувалось раніше, однак, положення 9 може займати Ala (як 2SD4) або Thr (як D2E7) без суттєвого впливу на К сп . Так, при порівнянні 2SD4 та D2E7, положення 2 та 5 D2E7 VL CDR3, обидва аргініни, можна охарактеризувати як критичні для асоціації антитіл з hTNF  . Ці залишки можуть прямо брати участь як контактні залишки в сайті зв'язування антитіл або вносити критичний вклад до встановлення просторової архітектури молекули антитіла в цьому районі. Беручи до уваги важливість положення 2, заміна Arg (в LOE7, якій має такий самий VL CDR3, як і D2E7) на Lys (в ЕР В12) прискорює швидкість спаду на два порядки. Беручи до уваги положення 5, заміна Arg (в D2E7) на Аlа (в LD2E7*.A5), як описано в Прикладі 2, також прискорює швидкість спаду на два порядки. Далі, без Arg в положенні 2 та 5 (в 2SD4) швидкість спаду є швидшою у два порядки. Однак. Слід сказати, що хоча положення 5 є важливим для покращеного зв'язування з hTNF  , зміни в цьому положенні можуть нейтралізуватись змінами в інших положеннях, як видно із VLLOE4, VLLOH1 або VL0.1H8. Всередині VHI CDR3 2SD4 відрізняється від D2E7 в положеннях 1, 7 та 12. Як згадувалось раніше, однак, положення 12 може займати Asn (як 2SD4) або Туr (як D2E7) без суттєвого 26 UA 102988 C2 5 10 15 20 25 30 впливу на К сп . Так, при порівнянні 2SD4 та D2E7, положення 1 та 7 D2E7 VH CDR3, обидва аргініни, можна охарактеризувати як критичні для асоціації антитіл з hTNF  . Як сказано вище, ці залишки можуть прямо брати участь як контактні залишки в сайті зв'язування антитіл або вносити критичний вклад до встановлення просторової архітектури молекули антитіла в цьому районі. Обидва положення є важливими для зв'язування з hTNF  , оскільки при використанні 3С-Н2 VH CDR3 (в якому валін заміщують на аланін в положенні 1 відносно D2E7 VH CDR3), scFv має більш швидку в три рази швидкість спаду порівняно з використанням D2E7 VH CDR3, але ця швидкість спаду є все ж таки у 4 рази повільнішою, ніж при використанні 2SD4 VH CDR3 (який несе зміни в обох положеннях 1 та 7 у D2E7 VH CDR3). ПРИКЛАД 4. Функціональна активність D2E7 Для вивчення функціональної активності D2E7 використовували антитіла в кількох дослідах, в яких вимірюють здатність даних антитіл інгібувати активність hTNF  , як in vitro так і in vivo. А. Нейтралізація цитотоксичності, яка викликана hTNF  , в клітинах L929 Людський рекомбінантний TNF  (rhTNF  ) викликає цитотоксичність клітин до мишачих клітин L929 після інкубаційного періоду 18-24 години. Людські анти-hTNF  антитіла вивчали в досліді з L929 завдяки коінкубації антитіл з rhTNF  та клітинами, що вказані далі. 96-луночний планшет, що містив 100мкл анти-hTNF  антитіл, розводили по 1/3 зверху вниз по планшету в двох паралелях, використовуючи середовище RPMI, яке містило 10 % фетальну бичачу сироватку (FBS). П'ятдесят мікролітрів rhTNF  додавали для кінцевої концентрації 500пг/мл в кожній лунці. Планшети інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Далі, 50мкл 4 чутливих до TNF  мишачих фібробластів L929 додавали до кінцевої концентрації 5 × 10 клітин на лунку, включаючи 1мг/мл Актіноміцину-D. Контролі включали середовище плюс клітини та rhTNF  плюс клітини. Ці контролі та стандартну криву TNF  , що сягає від 2нг/мл до 8,2пг/мл, використовували для визначення якості досліду та забезпечення вікна нейтралізації. Потім планшет інкубували протягом ночі (18-24 години) при 37 °C в 15 % СО2. З кожної лунки відбирали 100мкл середовища та додавали 50мкл 3(4,4-диметилтіазол-2іл)2,5-діфеніл-тетразоліум броміду в концентрації 5мг/мл (МТТ; доступний у Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в PBS. Планшети інкубували протягом 4 годин при 37 °C. Потім додавали по п'ятдесят мікролітрів 20 % додецил сульфату натрію (SDS) до кожної лунки та інкубували планшети при 37 °C протягом ночі. Вимірювали оптичну густину при 570/630 нм криві були побудовані для кожної проби та стандартними способами досліджували ІС 50. Показові результати для людських антитіл, які мають різні пари VL та VH, порівняно з мишачими мАТ МАК 195, показано на Фіг. 3 та в табл. 7 нижче. Таблиця 7 Нейтралізація цитотоксичності, яка викликана hTNF  , в клітинах L929 VH D2E7 D2E7 2SD4 2SD4 VH1-D2 VH1-D2 VH1-D2.Y VH1-D2.N VH1-D2.Y VH1-D2.N МАК 195 МАК 195 35 40 Структура scFv IgG4 scFv/IgG1/IgG4 scFv scFv scFv/IgG1/IgG4 IgG4 IgG4 IgG4 IgG4 scFv F(ab")2 VL D2E7 D2E7 2SD4 LOE7 2SD4 LOE7 LOE7.T LOE7.T LOE7.A LOE7.A МАК 195 МАК 195 IC50, M -10 1,1 × 10 -11 4,7 × 10 -7 3,0 × 10 -8 4,3 × 10 -8 1,0 × 10 -10 3,4 × 10 -11 8,1 × 10 -10 1,3 × 10 -11 2,8 × 10 -11 6,2 × 10 -8 1,9 × 10 -11 6,2 × 10 Результати на Фіг. 3 та табл. 7 показують, що людські анти-hTNF  антитіла D2E7 та різні похідні від D2E7 антитіла нейтралізують викликану TNF  цитотоксичність L929 з ємкістю, приблизно рівною до ємкості мишачих анти-hTNF  мАТ МАК 195. В іншій серії експериментів здатність IgG1 форми D2E7 нейтралізувати викликану TNF  цитотоксичність L929 вивчали так, як описано вище. Результати трьох незалежних дослідів та їх середня величина зведені в таблиці 8: 27 UA 102988 C2 Таблиця 8 Нейтралізація викликаної TNF  цитотоксичності L929 IgG1 D2E7 Експеримент 1 2 3 середня величина 5 10 15 20 25 30 35 ІС50 [М] -10 1,26 × 10 -10 1,33 × 10 -10 1,15 × 10 -10 1,25  0,01 × 10 Ця серія експериментів підтвердила, що D2E7 в повноланцюговій формі IgG1 нейтралізує -10 викликану TNF  цитотоксичність L929 з середнім значенням ІС50 [M] 1,25  0,01 × 10 . В. Інгібування зв'язування TNF  з рецептором TNF  на клітинах U-937 Здатність людських анти-hTNF  антитіл інгібувати зв'язування hTNF  з рецептором hTNF  на поверхні клітин вивчали, використовуючи клітинну лінію U-937 (АТСС No. CRL 1593), лінію гістіоцитів людини, яка експресує рецептори hTNF  . U-937 вирощували на середовищі PRMI 1640 з додаванням 10 % фетальної бичачої сироватки (Hyclone A-1111, Hyclone Laboratories, Logan, UT), L-глютамін (4нМ), розчин буфера HEPES (10мМ), пеніцилін (100мкг/мл) та стрептоміцин (100мкг/мл). Для вивчення активності цільноланцюгових антитіл IgG клітини U937 предінкубували з PBS з 1мг/мл людських антитіл IgG (Sigma I-4506, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) протягом 45 хвилин на льоду та потім клітини промивали тричі буфером для 6 зв'язування. Для дослідів по зв'язуванню рецептора клітини U-937 (5 × 10 клітин/лунка) інкубували в буфері для зв'язування (PBS з 0,2 % бичачим сироваточним альбуміном) в 96луночному планшеті для мікротитрування (Costar 3799, Costar Corp., Cambridge, MA) разом з 125 -10 І-міченим rhTNF  (3 × 10 М; 25мкКю/мл; одержано у NEN Research Products, Wilmington, DE), з або без анти-hTNF  антитіл в загальному об'ємі 0,2мл. Планшети інкубували на льоду протягом 1,5 години. Потім 75мкл кожної проби переносили у 1,0мл пробірки (Sarstedt 72.700, Sarstedt Corp., Princeton, NJ), які містили дибутилфталат (Sigma 1-4506, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) та дінонилфталат (ICN 210733, ICN, Irvine, CA). Пробірки з 300 мкл дибутилфталату та динонилфталату в об'ємному співвідношенні 2:1, відповідно. Вільний (тобто, не зв'язаний) 125 І-мічений rhTNF  видаляли центрифугуванням протягом 5 хвилин. Потім, кінець кожної пробірки, що містив осад, зрізали за допомогою спеціальних ножиць для пробірок (Bel-Art 125 210180001, Bel-Art Products, Pequannock, NJ). Осад клітин містить І-мічений rhTNF  , зв'язаний з р60 або р80 рецептором TNF  , тоді як водна фаза над масляною сумішшю містить 125 надлишок вільного І-міченого rhTNF  . Всі осади клітин збирали в пробірку для вимірювання (Falcon 2052, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) та просчитували на сцинциляційному лічильнику. Показові результати представлені на Фіг. 4. Величина ІС 50 для інгібування D2E7 -10 зв'язування hTNF  з рецептором hTNF  на клітинах U-937 є приблизно 3 × 10 М в цих експериментах. Ці результати показують, що людські анти-hTNF  антитіла D2E7 інгібують зв'язування hTNF  з рецептором rhTNF  на клітинах U-937 в концентрації, приблизно рівній концентрації мишачих анти-hTNF  мАТ МАК 195. В іншій серії експериментів здатність IgGl форми D2E7 інгібувати зв'язування rhTNF  з рецептором hTNF  на клітинах U-937 вивчали так, як описано вище. Результати трьох незалежних дослідів та їх середня величина зведені в таблиці 9: Таблиця 9 Інгібування зв'язування hTNF  на клітинах U-937 IgG1 D2E7 Експеримент 1 2 3 середня величина 40 ІС50 [М] -10 1,70 × 10 -10 1,49 × 10 -10 1,50 × 10 -10 1,56±0,12 × 10 Ця серія експериментів підтвердила, що D2E7 в повноланцюговій формі IgG1 інгібує -10 зв'язування рецептора TNF  на клітинах U-937 з середнім значенням ІС50 [М] 1,56±0,12 × 10 . 28