Композиції на основі антитіла проти vegfr-3

Реферат: Цим винаходом пропонуються моноклональні антитіла проти VEGFR-3, фармацевтичні композиції, що містять згадані антитіла, та застосування вказаних антитіл у лікуванні захворювання. UA 109148 C2 (12) UA 109148 C2 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід спрямований на антитіла, що специфічно зв'язуються з рецептором 3 судинного ендотеліального фактору росту (VEGFR-3), зокрема в цьому описі запропоновані амінокислотні та нуклеїновокислотні послідовності антитіл проти VEGFR-3, фармацевтичні композиції, і застосування згаданих антитіл у способах лікування медичного стану, що опосередковується VEGFR-3. Вважають, що фактори росту та рецептори, специфічні для ендотеліальних клітин, несуть головну відповідальність за стимуляцію росту ендотеліальних клітин, їх диференціацію, а також за певні клітинні функції. До складу однієї з докладно вивчених родин факторів росту входять судинні ендотеліальні фактори росту (VEGFs). VEGFR-3 являє собою єдиний тирозинкіназний рецептор (RTK), експресія якого у нормальних тканинах дорослого організму обмежується головним чином ендотелієм лімфатичних судин. Фактори росту VEGF-C та VEGF-D, що утворюються, специфічно зв'язуються з VEGFR-3. Протеолітичне розщеплення N- та C-кінцевих ділянок цих білків вивільнює зрілі VEGF-CΔNΔC та VEGF-DΔNΔC, які набувають підвищеної спорідненості до VEGFR3. Ці ліганди активують передачу сигналів VEGFR-3 та ініціюють лімфангіогенез (тобто утворення нових лімфатичних судин з попередньо існуючих лімфатичних судин). Спосіб експресії лігандів VEGFR-3 дозволяє припустити їх залучення не лише до розвитку та підтримання нормальної судинної системи, але також і до ангіогенезу та лімфангіогенезу пухлин. Крім того, експресія VEGFR-3 була виявлена на кровоносних капілярах у межах пухлин. Таким чином, моноклональні антитіла (mAbs), які пригнічують зв'язування VEGF-C та/або VEGFD з VEGFR-3, мають здатність до пригнічення ангіогенезу пухлин. Крім того, було показано, що блокування активності VEGFR-3 пригнічує VEGF-Cстимульований лімфангіогенез пухлин. У раків багатьох типів першою ділянкою метастазування є лімфатичні вузли, і тому блокування VEGFR-3 має здатність до пригнічення метастазування пухлин. Persaud, et al., J. Cell Science 117:2745-56 (2004), описують певні властивості людського моноклонального антитіла проти VEGFR-3, але не розкривають ні послідовності будь-якого з таких антитіл, ні антигенних детермінант, з якими можуть зв'язуватись такі антитіла. Таким чином, залишається потреба у високоспоріднених антитілах проти VEGFR-3, які зв'язують нові антигенні детермінанти у межах VEGFR-3 і які є здатними до блокування зв'язування лігандів та активації рецептора. Окрім того залишається потреба у антитілах проти VEGFR-3, що є здатними демонструвати протипухлинну ефективність проти пухлин різноманітного типу без значних негативних побічних ефектів. Цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з людським VEGFR-3, де: a) зв'язування згаданого антитіла з людським VEGFR-3 зменшене щонайменше на 90 % одиночною мутацією Pro-219 людського VEGFR-3 на Leu; та b) зв'язування згаданого антитіла з людським VEGFR-3 зменшене щонайменше на 50 % одиночною мутацією Val-175 людського VEGFR-3 на Ala. За варіантом, якому віддають перевагу, рівень зв'язування між антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом і людським або мутантним VEGFR-3 досліджують шляхом експресії розчинного екстрацелюлярного домену людського або мутантного VEGFR-3 у вигляді гібридного білка з лужною фосфатазою з подальшим визначенням кількості кожного гібридного білка, що є здатним до зв'язування з антитілом, за допомогою хемілюмінесцентного аналізу з лужною фосфатазою. Цей винахід також пропонує фармацевтичну композицію, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або допоміжною речовиною. Крім того, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або допоміжною речовиною і факультативно містить щонайменше один інший терапевтичний інгредієнт. Цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом для застосування як лікарський засіб. Цей винахід, крім того, пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом для застосування у лікуванні або запобігання раку яєчнику, людського еритролейкозу, раку голови та шиї, раку молочної залози, гіпернефроїдного раку, раку підшлункової залози, раку легень, раку ободової кишки та метастазів до лімфатичних вузлів. Цей винахід також пропонує спосіб лікування раку, вибраного з групи, яку складають рак яєчнику, людський еритролейкоз, рак голови та шиї, рак молочної залози, гіпернефроїдний рак, 1 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рак підшлункової залози, рак легень, рак ободової кишки та метастази до лімфатичних вузлів у ссавця, який включає введення ссавцю, який потребує такого лікування, ефективної кількості антитіла або його антигензв'язувального фрагменту за цим винаходом. Цей винахід, крім того, пропонує застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагменту для виготовлення лікарського засобу для лікування раку, вибраного з групи, яку складають рак яєчнику, людський еритролейкоз, рак голови та шиї, рак молочної залози, гіпернефроїдний рак, рак підшлункової залози, рак легень, рак ободової кишки та метастази до лімфатичних вузлів. Цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом у комбінації з іншим протираковим агентом, вибраним з-посеред цисплатину, 5фторурацилу, лейковорину, оксаліплатину та доцетакселу, для одночасного, окремого або послідовного застосування у терапії. Цей винахід крім того пропонує спосіб лікування раку, вибраного з групи, яку складають рак яєчнику, людський еритролейкоз, рак голови та шиї, рак молочної залози, гіпернефроїдний рак, рак підшлункової залози, рак легень, рак ободової кишки та метастази до лімфатичних вузлів у ссавця, який включає введення пацієнту, який цього потребує, терапевтично ефективної комбінації антитіла або його антигензв'язувального фрагменту за цим винаходом і іншого протиракового агента, вибраного з-посеред цисплатину, 5-фторурацилу, лейковорину, оксаліплатину та доцетакселу. Антитіла за цим винаходом зв'язують другий імуноглобуліно (Ig)-подібний домен VEGFR-3 ссавців. Згаданий другий Ig-подібний домен людського VEGFR-3 відповідає залишкам 138-226 непроцесованого рецептора. Дивись Pajusola, et. al., Cancer Res. 52:5738-5743 (1992). Термін "другий Ig-подібний домен VEGFR-3 ссавців/людей/мишей" (та його варіанти) означає природні форми домену (наприклад, очищені з клітини, що експресує вказаний домен за нормальних умов), а також рекомбінантні варіанти, наприклад, закодовані природними або синтетичними точковими мутантами чи їх скороченими варіантами. Антитіла за цим винаходом зв'язують антигенну детермінанту на другому Ig-подібному домені людського VEGFR-3, де P219 являє собою домінуючу складову антигенної детермінанти, V175 являє собою другорядну складову антигенної детермінанти і L221 являє собою додаткову складову антигенної детермінанти. (Нумерація цих залишків відповідає непроцесованому людському VEGFR-3, за повідомленням Pajusola, et al., supra, та базі даних EMBL, номер депонування X 68203). Ці дані частково засновані на спостереженні, суть якого полягає у тому, що включення мутацій V175A або P219L чи L221V (тобто заміна залишків-ортологів мишачого VEGFR-3) до людського VEGFR-3 ліквідує або значно зменшує зв'язування антитіл за цим винаходом з людським VEGFR-3-мутантом. Більше того, антитіла за цим винаходом, що зв'язують антигенну детермінанту людського VEGFR-3 (де P219 являє собою домінуючу складову антигенної детермінанти, V175 являє собою другорядну складову антигенної детермінанти і L221 являє собою додаткову складову антигенної детермінанти), є здатними до блокування зв'язування ліганду VEGF-C з VEGFR-3 і, отже, нейтралізації активності рецептора. Таким чином, цей винахід пропонує нову нейтралізуючу антигенну детермінанту на людському VEGFR-3, що надає можливість продукування нових нейтралізуючих антитіл проти людського VEGFR-3, які є здатними до блокування зв'язування людського VEGF-С з рецептором. Цей винахід таким чином пропонує антигенну детермінанту людського VEGFR-3, де P219 являє собою домінуючу складову антигенної детермінанти, V175 являє собою другорядну складову антигенної детермінанти, і L221 являє собою додаткову складову антигенної детермінанти. Цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує антигенну детермінанту людського VEGFR-3, яка містить амінокислотні залишки P219 та V175. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує антигенну детермінанту людського VEGFR-3, до складу якої входять амінокислоти P219, V175 та L221. Така антигенна детермінанта зв'язується антитілами за цим винаходом (наприклад, Антитілом 1) і, отже, цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що реагує з тією ж самою антигенною детермінантою людського VEGFR-3, що і антитіло, яке має легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 15, і важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16. Антитіло, що реагує з тією ж самою антигенною детермінантою людського VEGFR-3, що і певні антитіла за цим винаходом (наприклад, Антитіло 1), буде конкурувати за зв'язування з людським VEGFR-3 і, відповідно, цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що конкурує з антитілом, яке має легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 15, і важкий ланцюг, який містить 2 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16, за зв'язування з людським VEGFR-3. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло за цим винаходом також зв'язується з мутантним мишачим VEGFR-3, що має послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 20 (яка охоплює мутацію L219P), та з мутантним мишачим VEGFR-3, що має послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 21 (яка охоплює мутацію A175V), де зв'язування з мутантним мишачим VEGFR-3, що має послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 20, збільшене більше ніж у 50 разів у порівнянні зі зв'язуванням з мишачим VEGFR-3 дикого типу (послідовність SEQ ID NO: 19), та зв'язування з мутантним мишачим VEGFR-3, що має послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 21, збільшене більше ніж у 10 разів, у порівнянні зі зв'язуванням з мишачим VEGFR-3 дикого типу. За варіантом, якому віддають перевагу, рівень зв'язування між антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом і мишачим VEGFR-3 дикого типу або мутантним мишачим VEGFR-3 аналізують шляхом експресії розчинного екстрацелюлярного домену мишачого VEGFR-3 дикого типу або мутантного мишачого VEGFR-3 у вигляді гібридного білка з лужною фосфатазою з подальшим визначенням кількості кожного гібридного білка, що є здатним до зв'язування з антитілом, із застосуванням хемілюмінесцентного дослідження з лужною фосфатазою. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло за цим винаходом або його антигензв'язувальний фрагмент має високу спорідненість до людського VEGFR-3. Наприклад, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, за результатами визначення поверхневого плазмонного резонансу за допомогою біосенсора BIACORE  2000 при температурі 20C, має -9 -11 значення Kd для людського VEGFR-3 у межах від 110 M до 5,610 M. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, за результатами визначення поверхневого плазмонного резонансу за допомогою біосенсора BIACORE  2000 при -10 -11 температурі 20C, має значення Kd для людського VEGFR-3 у межах від 110 M до 5,610 M. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує антитіло проти VEGFR-3 або його антигензв'язувальний фрагмент, що пригнічує зв'язування людського VEGF-CΔNΔC з людським VEGFR-3 з IC50 від 2 нМ до 1,3 нМ. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує антитіло проти VEGFR-3 або його антигензв'язувальний фрагмент, що пригнічує VEGF-CΔNΔC-стимульовану мітогенну реакцію з IC50 від 10 нМ до 5 нМ. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, антитіло проти VEGFR3 або його антигензв'язувальний фрагмент пригнічує VEGF-CΔNΔC-стимульовану мітогенну реакцію з IC50 від 8 нМ до 5 нМ, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, від 6 нМ до 5 нМ, у дослідженні, опис якого наведено у Прикладі 5. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує людський VEGFR-3, і яке(який) містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR) і варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), де LCVR містить гіперваріабельні ділянки (CDRs) LCDR1, LCDR2 та LCDR3, та HCVR містить гіперваріабельні ділянки (CDRs) HCDR1, HCDR2 та HCDR3, де LCDR1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, LCDR2 містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 2, LCDR3 містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 3, HCDR1 містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 6, HCDR2 містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 7 і HCDR3 містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 8. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує людський VEGFR-3, і що містить поліпептид LCVR, представлений послідовністю SEQ ID NO: 5, і поліпептид HCVR представлений послідовністю SEQ ID NO: 10. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує людський VEGFR-3, і що містить легкий ланцюг, що містить поліпептид, представлений послідовністю SEQ ID NO: 15, і важкий ланцюг, що містить поліпептид, представлений послідовністю SEQ ID NO: 16. За варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує людський VEGFR-3, і що містить два легкі ланцюги, що містять поліпептид, представлений послідовністю SEQ ID NO: 15, і два важкі ланцюги, що містять поліпептид, представлений послідовністю SEQ ID NO: 16. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що конкурує з антитілом за цим винаходом за зв'язування з людським VEGFR-3. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його 3 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигензв'язувальний фрагмент, що являє собою людське антитіло. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що являє собою людське генно-інженерне антитіло. Визначення Термін "антитіло" у значенні, вживаному у цьому описі, означає моноклональні антитіла, які можуть бути повністю людськими антитілами або людськими генно-інженерними антитілами, або фрагментами розщеплення, визначеними ділянками та їхніми варіантами, у тому числі антитілами-міметиками, частинами антитіл, що імітують структуру та/або функцію антитіла або визначеного фрагменту чи його частини, у тому числі одноланцюговими антитілами та їх фрагментами, що зберігають здатність до зв'язування з другим Ig-подібним доменом людського VEGFR-3. Наприклад, фрагменти антитіл, здатні до специфічного зв'язування другого Igподібного домену людського VEGFR-3, що охоплюються цим винаходом, включають Fabфрагменти (одержані, наприклад, шляхом папаїнового розщеплення), Facb-фрагмент (одержаний, наприклад, шляхом плазмінового розщеплення), F(ab") 2-фрагменти (одержані, наприклад, шляхом пепсинового розщеплення) та дисульфід-стабілізовані варіабельні фрагменти (dsFv) або одноланцюгові варіабельні фрагменти (scFv), одержані методами молекулярної біології. Фрагменти антитіл охоплюють також, наприклад, антитіла з делетованим доменом, діатіла та триатіла, що зберігають здатність до зв'язування з другим Ig-подібним доменом людського VEGFR-3. Антитіла охоплюють молекули імуноглобуліну, що містять чотири поліпептидних ланцюги, два важких (H) ланцюги та два легких (L) ланцюги, взаємозв'язаних дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної ділянки важкого ланцюга (що скорочено позначається у цьому описі як HCVR) і константної ділянки важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга містить три домени, CH1, CH2 та CH3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (що скорочено позначається у цьому описі як LCVR) і константної ділянки легкого ланцюга. Легкі ланцюги антитіл будь-якого виду хребетних можуть бути віднесені до одного з двох чітко розрізнюваних типів, а саме, каппа (κ) та лямбда (λ), на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. Словосполучення "варіабельна ділянка легкого ланцюга (LCVR)” у значенні, вживаному у цьому описі, охоплює як варіабельні ділянки легких ланцюгів типу каппа (Vκ), так і варіабельні ділянки легких ланцюгів типу лямбда (Vλ). Константна ділянка легкого ланцюга включає в себе один домен, CL. HCVR та LCVR охоплюють ділянки з гіперваріабельними послідовностями, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність (CDRs), що перемежовуються ділянками, що є більш консервативними, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна варіабельна ділянка важкого ланцюга (HCVR) і варіабельна ділянка легкого ланцюга (LCVR) складається з трьох CDRs та чотирьох FRs, розташованих від амінокінця до карбоксильного кінця у такому порядку: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Для цілей цього винаходу CDRs LCVR скорочено позначають як LCDR1, LCDR2 та LCDR3, а CDRs HCVR скорочено позначають як HCDR1, HCDR2 та HCDR3. У залежності від амінокислотної послідовності константного домену їх важких ланцюгів, антитіла можуть бути віднесені до різних класів. Еснує п'ять основних класів інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM. Декілька з них можуть бути додатково підрозділені на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA та IgA2. Константні ділянки важкого ланцюга, що відповідають антитілам різних класів, називають альфа (α), дельта (Δ), епсилон (ε), гамма (γ) і мю (μ), відповідно. Структура субодиниць та об'ємні конфігурації імуноглобулінів різних класів є добре відомими. Цей винахід охоплює антитіла, які входять до складу будь-якого зі згаданих класів або підкласів (ізотипів). Словосполучення "моноклональне антитіло" у значенні, вживаному у цьому описі, означає антитіло, яке одержують з популяції по суті однорідних антитіл, наприклад, індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є по суті ідентичними, за виключенням можливих природних мутацій або незначних посттрансляційних варіацій, що можуть бути присутніми. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і спрямовуються проти одного антигенного сайту (відомого також як антигенна детермінанта або епітоп), який, за ідеєю, наведеною у цьому описі, міститься у другому Ig-подібному домені VEGFR-3 ссавців. Крім того, на відміну від препаратів традиційних (поліклональних) антитіл, які, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант, кожне моноклональне антитіло спрямовується проти однієї детермінанти на антигені. Визначання "моноклональне" є ознакою особливості антитіла, як такого, що було одержане з по суті однорідної популяції антитіл, і не повинне розглядатись як таке, що вимагає продукування антитіла будь-яким конкретним способом. Термін "людське антитіло" у значенні, вживаному у цьому описі, означає антитіла, що мають 4 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельні і константні ділянки, що відповідають імуноглобуліновим послідовностям людської зародкової лінії (як описано у Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Термін "людське антитіло" у значенні, вживаному у цьому описі, не охоплює антитіла, у яких послідовності CDR, одержані із зародкової лінії ссавців інших видів, таких як миші, були пересаджені на людські каркасні послідовності. Модифікації амінокислотної послідовності Антитіла 1, розкриті у цьому описі, охоплені обсягом цього винаходу, зокрема у зв'язку з поліпшеннями зв'язувальної спорідненості та/або інших біологічних властивостей антитіл. У цьому контексті термін "людське генно-інженерне антитіло" у значенні, вживаному у цьому описі, означає додаткові антитіла, що мають функціональні властивості, подібні до функціональних властивостей Антитіла 1 (наприклад, здатність до зв'язування людського VEGFR-3 на антигенній детермінанті, що містить P219 та V175), і які мають каркасні ділянки, що оточують CDRs, і є по суті людськими або повністю людськими, та одержані з Антитіла 1. По суті людськими каркасними ділянками у контексті цього винаходу є каркасні ділянки, що мають щонайменше 80 % ідентичність послідовності з каркасними ділянками Антитіла 1. За варіантом, якому віддають перевагу, такі по суті людські каркасні ділянки мають щонайменше приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або приблизно 99 % ідентичність послідовності з каркасними ділянками Антитіла 1. Опис послідовностей людської зародкової лінії наведений у WO 2007/044411. Наприклад, каркасні ділянки легкого ланцюга зародкової лінії можуть бути вибраними з групи, до складу якої входить: Al1, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2 та O8, та каркасні ділянки важкого ланцюга зародкової лінії можуть бути вибраними з групи, до складу якої входить: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH I-18, VH I-69, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 та VH5-5I. Людські генно-інженерні антитіла, одержані з Антитіла 1, можуть включати делеції та/або інсерції та/або заміни залишків у межах послідовності Антитіла 1. Однак кінцева генноінженерна конструкція повинна зберігати необхідні функціональні характеристики Антитіла 1 (наприклад. здатність до зв'язування людського VEGFR-3 на антигенній детермінанті, що містить P219 та V175). Людські генно-інженерні антитіла, що мають функціональні властивості, які подібні до функціональних властивостей Антитіла 1, можуть бути одержані із застосуванням декількох різних способів, де кожний зі способів розпочинається з Антитіла 1 (тобто антитіла, яке має послідовності LCVR та HCVR, представлені послідовністю SEQ ID NO: 5 та послідовністю SEQ ID NO: 10 відповідно), як з матриці або вихідного антитіла для одержання додаткових антитіл. За першим способом CDRs Антитіла 1 пересаджують на іншу людську каркасну ділянку, що має високий ступінь ідентичності послідовності з каркасними ділянками Антитіла 1. Едентичність послідовності нової каркасної ділянки буде, у цілому, на щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 % або щонайменше 99 % ідентичною відповідній каркасній ділянці Антитіла 1. Результатом цього пересадження може бути зниження зв'язувальної спорідненості порівняно з Антитілом 1. У такому разі каркасна ділянка може бути піддана зворотній мутації до каркасної ділянки Антитіла 1 у певних позиціях, виходячи із специфічних критеріїв, опублікованих Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991). Едентифікація залишків для розгляду можливості зворотної мутації може здійснюватись таким чином: у разі, коли амінокислота підпадає під будь-яку з наведених нижче категорій, каркасну амінокислоту людської зародкової послідовності, яку застосовують ("каркас-акцептор"), замінюють на каркасну амінокислоту з каркасу Антитіла 1 ("каркас-донор"): (a) амінокислота на людській каркасній ділянці каркасу-акцептору є незвичною для людських каркасів у цьому положенні, у той час як відповідна амінокислота Антитіла 1 є типовою для людських каркасів у цьому положенні; (b) положення амінокислоти є безпосередньо прилеглим до однієї з CDRs; або (c) будь-який атом бічного ланцюга каркасної амінокислоти знаходиться на відстані приблизно 5-6 ангстремів (міжцентрова відстань) від будь-якого атому амінокислоти CDR у тривимірній моделі імуноглобуліну. У разі, коли кожна з амінокислот людської каркасної ділянки каркаса-акцептора та відповідна амінокислота у каркасі Антитіла 1 є незвичайною для людських каркасів у цьому положенні, така амінокислота може бути заміненою на амінокислоту, типову для людських каркасів у цьому положенні. Ці критерії зворотної мутації надають можливість відновлення активності Антитіла 1. За другим способом людські генно-інженерні антитіла, одержані з Антитіла 1, які зберігають функціональні властивості Антитіла 1 (наприклад, здатність до зв'язування людського VEGFR-3 5 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на антигенній детермінанті, що містить P219 та V175), можуть бути одержані шляхом мутації CDRs Антитіла 1 (або довільним, або зміщеним чином для запобігання виродження амінокислотного коду) з одночасним збереженням каркасних ділянок Антитіла 1. За варіантом, якому віддають перевагу, згадані мутації (делеції, інсерції та/або заміни) амінокислотних послідовностей CDRs людських генно-інженерних антитіл, одержаних з Антитіла 1, обмежуються максимум трьома мутаціями, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, двома мутаціями, або, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, однією мутацією послідовностей CDR людського генно-інженерного антитіла, у разі порівняння з послідовностями CDR Антитіла 1. У разі присутності більше однієї мутації, згадані мутації можуть бути розподілені серед послідовностей CDR різноманітними шляхами. Наприклад, усі мутації можуть припадати на одну послідовність CDR (наприклад, LCDR1), кожна мутація може припадати на іншу послідовність CDR, або дві мутації можуть знаходитись у одній послідовності CDR, а третя мутація може знаходитись у іншій послідовності CDR. Результатом цього є утворення комбінаторної бібліотеки людських генно-інженерних антитіл, де згадані послідовності CDR є мутованими у одному або декількох положеннях, як описано вище, з одночасним збереженням каркасних ділянок Антитіла 1. Згадана бібліотека може піддаватись скринінгу для виявлення додаткових варіантів, що мають подібні або поліпшені функціональні властивості, у разі порівняння з Антитілом 1. Ще один зі способів одержання людських генно-інженерних антитіл з Антитіла 1 (і які зберігають функціональні властивості Антитіла 1, наприклад, здатність до зв'язування людського VEGFR-3 на антигенній детермінанті, яка містить P219 та V175) полягає у об'єднанні двох способів, описаних вище, і внесенні змін як до каркасних ділянок, так і до CDRs. Еншими словами, після пересадження CDRs Антитіла 1 на іншу каркасну ділянку, специфічні каркасні залишки можуть бути піддані зворотній мутації на додаток до внесення змін до CDRs. Загальний принцип цієї методики описано у роботі Wu, et al., (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162. Амінокислотні заміни також можуть вносити зміни до посттрансляційних процесів, яких зазнають людські генно-інженерні антитіла, таких як змінювання кількості або положення сайтів глікозилування. Замінені варіанти можуть бути одержані шляхом заміни одного або декількох залишків гіперваріабельної ділянки Антитіла 1. Один з таких способів одержання замінених варіантів відомий як "визрівання афінності" із застосуванням фагового дисплею. Декілька сайтів гіперваріабельної ділянки (наприклад, 6-7 сайтів) піддають мутації для одержання усіх можливих амінокислотних замін на кожному сайті. Одержані таким чином варіанти антитіл є відтвореними у моновалентній формі з нитчастих фагових частинок, як гібриди з продуктом гену III M 13, запакованим у кожній частинці. Після цього фаговодисплейні варіанти піддають скринінгу для визначення їхньої біологічної активності (наприклад, зв'язувальної спорідненості), як розкривається у цьому описі. Дослідження, розкриті у цьому описі, можуть застосовуватись для скринінгу людських генноінженерних антитіл, одержаних з Антитіла 1, для ідентифікування тих антитіл, що мають in vitro та in vivo функції, які розкриваються у цьому описі. Згаданими антитілами за цим винаходом можуть бути ізольовані антитіла. Езольоване антитіло є по суті вільним від іншого клітинного матеріалу та/або хімічних речовин. Термін "антигенна детермінанта" у значенні, вживаному у цьому описі, означає конкретну молекулярну ділянку на поверхні антигену, здатну до ініціювання імунної реакції та зв'язування з конкретним антитілом, продукованим в результаті такої реакції. Антигенна детермінанта може бути лінійною антигенною детермінантою (тобто такою, що складається з суміжних амінокислотних залишків, усі з яких вміщені у межах одного короткого відрізку послідовності), або вона може бути конформаційною антигенною детермінантою (тобто такою, що складається з амінокислотних залишків, які знаходяться у різних частинах лінійної послідовності антигену, але які зводяться докупи з утворенням антитілозв'язувального центру після набуття антигеном його відповідної вторинної та третинної структури). За типовим варіантом антигенна детермінанта складається з невеликої кількості (наприклад, від 2 до 5) ключових амінокислотних залишків, і розрив цих залишків (наприклад, шляхом мутування на окремі амінокислотні залишки) призводить до значного зниження або навіть повного зникнення зв'язування між антитілом та антигенною детермінантою. Антитілами або їхніми антигензв'язувальними фрагментами, що "конкурують" з молекулами, розкритими у цьому описі, є антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що зв'язують людський VEGFR-3 на сайті(-ах), що є ідентичним(-и) або взаємопрекривається(-ються) з сайтом(-ами), на якому(-их) зв'язуються згадані наявні молекули. Конкуруючі людські генноінженерні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть бути ідентифіковані, 6 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, за допомогою аналізу конкуренції антитіл. Наприклад, зразок очищеного або частково очищеного людського VEGFR-3 зв'язують з твердою основою. Потім додають антитіло за цим винаходом та пробне моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, при цьому або згадане пробне антитіло, або антитіло за цим винаходом є міченим. Якщо мічене антитіло і немічене антитіло зв'язуються з окремими та дискретними сайтами на VEGFR-3, мічене антитіло буде зв'язуватись однаковою мірою, незалежно від присутності або відсутності підозрюваного конкуруючого антитіла. Однак, якщо сайти взаємодії є ідентичними або такими, що взаємоперекриваються, немічене антитіло буде конкурувати, і кількість міченого антитіла, зв'язаного з антигеном, буде зменшеною. Якщо немічене антитіло є присутнім з надлишком, мічене антитіло зв'язуватись не буде. Для цілей цього винаходу, конкуруючими людськими генно-інженерними антитілами або їх антигензв'язувальними фрагментами є людські генноінженерні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що зменшують зв'язування представлених антитіл на приблизно 50 %, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або приблизно 99 %. Подробиці методик проведення таких досліджень конкуренції є добре відомими у цій галузі і можуть бути віднайдені, наприклад, у Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pages 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Такі дослідження можна зробити кількісними шляхом застосування очищених антитіл. Стандартну криву одержують шляхом титрування одного антитіла проти себе, тобто одне і те ж саме антитіло застосовують як для мітки, так і для конкурента. Визначають здатність неміченого конкуруючого моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагменту до пригнічення зв'язування міченої молекули на планшеті. Результати наносять на криву, і концентрації, необхідні для досягнення необхідного ступеню пригнічення зв'язування, порівнюють. Людський VEGFR-3 існує у двох формах, які одержують за допомогою транскриптів мРНК різної довжини. Довший транскрипт кодує білок, що містить 65 зайвих амінокислотних залишків на С-кінці, у порівнянні з білком, закодованим коротшим транскриптом, де довший білок є основною формою, яка виявляється у тканинах. Два вказані варіанти є ідентичними за їх Nкінцевими екстрацелюлярними доменами. Термін "людський VEGFR-3", якщо не вказується інше, означає обидва варіанти людського VEGFR-3 дикого типу (тобто послідовність SEQ ID NO: 17 і послідовність SEQ ID NO: 18), які одержують з альтернативних транскриптів мРНК. Нуклеїновокислотна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність LCVR Антитіла 1 позначені як послідовності SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 5, відповідно. Нуклеїновокислотна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність HCVR Антитіла 1 позначені у цьому описі як послідовності SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10, відповідно. Нуклеїновокислотна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність легкого ланцюга Антитіла 1 позначені у цьому описі як послідовності SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12, відповідно. Амінокислотні залишки 1-19 послідовності SEQ ID NO:12 складають секреторну послідовність, придатну для експресії та екстрагування легкого ланцюга з різних ліній клітин-хазяїв ссавців, але які є відсутніми у зрілому антитілі. Амінокислотна послідовність зрілого легкого ланцюга Антитіла 1 позначена у цьому описі як послідовність SEQ ID NO: 15. Нуклеїновокислотна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність важкого ланцюга Антитіла 1 позначені як послідовності SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 14, відповідно. Як і у разі послідовності для легкого ланцюга, амінокислотні залишки 1-19 послідовності SEQ ID NO:14 складають секреторну послідовність, придатну для експресії та екстрагування важкого ланцюга з різних ліній клітин-хазяїв ссавців, але які є відсутніми у зрілому антитілі. Амінокислотна послідовність зрілого важкого ланцюга Антитіла 1 позначена у цьому описі як послідовність SEQ ID NO: 16. Специфічність антитіла може бути визначена на основі спорідненості та/або авідності. Спорідненість, представлена константою рівноваги для дисоціації антигену з антитілом (K d), визначає силу зв'язування між антигенною детермінантою та антигензв'язувальним центром. Авідність є показником сили зв'язування між антитілом та його антигеном. Авідність пов'язана як зі спорідненістю між антигенною детермінантою та її антигензв'язувальним центром на антитілі, так і з валентністю антитіла, яка означає кількість антигензв'язувальних центрів конкретної антигенної детермінанти. Чим меншим є значення Kd, тим більшою є сила зв'язування між антигенною детермінантою та антигензв'язувальним центром. Цей винахід також пропонує полінуклеотид, що кодує важкий ланцюг антитіла за цим винаходом (наприклад, Антитіло 1 – послідовність SEQ ID NO: 13), або полінуклеотиди, що містять будь-яку одну з варіабельних ділянок важкого ланцюга (VH) чи її частину, або будь-яку одну з гіперваріабельних ділянок варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH CDRs), у тому числі 7 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 будь-які її варіанти, антитіла за цим винаходом (наприклад, Антитіла 1). Цей винахід також пропонує полінуклеотид, що кодує легкий ланцюг антитіла за цим винаходом (наприклад, Антитіло 1 – послідовність SEQ ID NO: 11), або полінуклеотиди, що містять будь-яку одну з варіабельних ділянок легкого ланцюга (VL) чи її частину, або будь-яку одну з гіперваріабельних ділянок варіабельної ділянки легкого ланцюга VL CDRs, у тому числі будь-які її варіанти, антитіла за цим винаходом (наприклад, Антитіла 1). Цей винахід також включає експресійні вектори, що містять будь-який з полінуклеотидів, опис яких наведено. Зразкові вектори включають плазміди, фагеміди, косміди, віруси і фагові нуклеїнові кислоти або інші нуклеїновокислотні молекули, що є здатними до реплікації у прокаріотному або еукаріотному хазяїні, такому як клітина, наприклад, клітина ссавця. Типові експресійні вектори містять термінатори транскрипції і трансляції, ініціювальні послідовності та промотори, придатні для регулювання експресії нуклеїновокислотних молекул за цим винаходом. Ці вектори можуть також містити полігенні експресійні кластери, що містять незалежну термінаторну послідовність, послідовності, які надають можливість реплікації вектора як у еукаріотах, так і у прокаріотах, тобто "човникові" вектори, та селекційні маркери як для прокаріотних, так і для еукаріотних систем. Згадані вектори, як правило, містять маркер для надання фенотипової особливості для селекції трансформованих хазяїв, такої як надання стійкості до антибіотиків, наприклад, ампіциліну або неоміцину. Відповідні промотори охоплюють конститутивні промотори та індуцибельні промотори. Репрезентативні експресійні контрольні послідовності/промотори включають систему lac, систему trp, систему tac, систему trc, головні операторні та промоторні ділянки фагу лямбда, контрольну ділянку білка оболонки fd, гліколітичні промотори дріжджів, наприклад, промотор 3фосфогліцераткінази, промотори дріжджових кислих фосфатаз, наприклад, Pho5, промотори дріжджових альфа-факторів спарювання, промотори, одержані з людських цитомегаловірусів, промотор металотіоніну, промотор мишачого вірусу пухлин молочних залоз, промотор вірусу саркоми Рауса, промотор поліедрину і промотори, одержані з поліоми, аденовірусу, ретровірусу та мавпячого вірусу, наприклад, ранній та пізній промотори SV40. Цей винахід також охоплює хазяїв нелюдського походження, таких як клітини, що містять полінуклеотид або вектор за цим винаходом. Термін "хазяїн" означає багатоклітинний організм, окрім людини, або "клітину-хазяїна", що означає клітину або популяцію клітин, до яких вводять полінуклеотид або вектор за цим винаходом. Клітиною-хазяїном за цим винаходом може бути еукаріотна клітина або лінія клітин, таких як клітина або лінія клітин рослини, тварини, хребетної тварини, ссавця, гризуна, миші, примата або людини. Відповідні еукаріотні клітини охоплюють клітини дріжджів та інших грибів, клітини комах, клітини рослин, клітини людей і клітини тварин, у тому числі клітини ссавців, таких як лінії гібридом, клітини COS, клітини NS0 та клітини CHO. Термін "популяція клітин-хазяїв" означає групу культивованих клітин, у які полінуклеотид або вектор за цим винаходом можуть бути введені та у яких можуть бути експресовані. Сюди входять будь-які клітини, які будуть підтримувати експресію полінуклеотиду або вектору за цим винаходом. Хазяїном за цим винаходом може також бути прокаріотна клітина. Відповідні прокаріотні клітини-хазяї охоплюють, наприклад, E. coli, такі як E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI та E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, такі як Bacillus subtilis та Streptomyces. Цей винахід також охоплює способи продукування антитіла за цим винаходом, що включають культивування клітини-хазяїна, що експресує один або декілька полінуклеотидів, що кодують антитіло за цим винаходом, і виділення вказаного антитіла з культурального середовища. Антитіла за цим винаходом можуть бути застосовані як лікарські засоби у медицині з введенням їх різноманітними шляхами. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, фармацевтичні композиції, що містять антитіла за цим винаходом, є призначеними для парентерального введення. Такі фармацевтичні композиції можуть бути одержані способами, добре відомими у цій галузі (дивись, наприклад, Remington: The Science and Practice of th Pharmacy, 19 ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.), і містити розкрите в цьому описі антитіло та фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або допоміжну речовину. Терміни "пригнічувати" або "нейтралізувати" у значенні, вживаному у цьому описі стосовно біологічної активності антитіла за цим винаходом, означають здатність до головним чином протидії, перешкоджання, запобігання, стримування, уповільнення, порушення, ліквідації, зупинення, зниження або звертання біологічної активності VEGFR-3, у тому числі, але без обмеження ним, біологічної активності людського VEGFR-3, як визначено у наведених у цьому описі Прикладі 4 або Прикладі 5. 8 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терміни "лікувати" і "лікування" у значенні, вживаному у цьому описі, означають терапевтичне лікування, мета якого полягає у запобіганні або уповільненні (зменшенні) небажаної фізіологічної зміни, пов'язаної з захворюванням або розладом. Благотворні або бажані клінічні результати охоплюють полегшення тяжкості симптомів, зменшення ступеню розвитку захворювання або розладу, стабілізацію захворювання або розладу (тобто коли захворювання або розлад не посилюються), затримку або уповільнення розвитку захворювання або розладу, зменшення інтенсивності або тимчасове полегшення чи ослаблення захворювання або розладу та ремісію (часткову або повну) захворювання або розладу, виявлювану або невиявлювану. Термін "лікування" може також означати подовження виживаності, порівняно з очікуваною виживаністю у разі неодержання лікування. До тих, хто потребує лікування, належать ті, що вже мають захворювання або розлад, або ті, що мають схильність до захворювання або розладу. Композиції за цим винаходом можуть містити "терапевтично ефективну кількість" антитіла за цим винаходом. Словосполучення "терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну, у дозах та протягом необхідних періодів часу, для досягнення терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів як стан захворювання, вік, стать і маса індивідууму, а також здатність антитіла або фрагмента антитіла до ініціювання необхідної реакції у індивідуума. Терапевтично ефективною кількістю є також така кількість, при застосуванні якої будь-який токсичний або шкідливий вплив антитіла або фрагмента антитіла переважується терапевтично благотворним впливом. Терапія може бути терапією "першої лінії", тобто початковим лікуванням пацієнтів, яких не піддавали попередньому протираковому лікуванню, окремо або у поєднанні з іншими методами лікування; або терапією "другої лінії", як лікування пацієнтів, які вже пройшли одну попередню протиракову схему лікування, окремо або у поєднанні з іншими методами лікування; або терапією "третьої лінії", "четвертої лінії" тощо, окремо або у поєднанні з іншими методами лікування. Терапія може також призначатись пацієнтам, яких вже піддавали попередньому лікуванню, яке було частково успішним, але для яких є непереносним конкретний метод лікування. Терапія може також призначатись як допоміжне лікування, тобто для запобігання рецидиву раку у пацієнтів, які на теперішній момент не мають виявлюваного захворювання або після хірургічного видалення пухлини. Раки, які лікують за цим винаходом, охоплюють первинні пухлини і вторинні або метастатичні пухлини, які метастазувались через лімфатичну систему (в тому числі тих, що метастазувались з легень, молочної залози або передміхурової залози). Раки, які можуть бути піддані лікуванню, охоплюють пухлини, що є неваскуляризованими або ще не є достатньо васкуляризованими, а також васкуляризовані пухлини. Згаданими раками можуть бути несолідні пухлини (наприклад, лейкози та лімфоми) або це можуть бути солідні пухлини. Типи раків, що можуть бути піддані лікуванню антитілами за цим винаходом, охоплюють рак яєчнику, людський еритролейкоз, рак голови та шиї, рак молочної залози, гіпернефроїдниий рак, рак підшлункової залози, рак легень і рак ободової кишки. Окрім того, приймаючи до уваги роль шляху VEGF-С/VEGFR-3 у стимулюванні лімфангіогенезу та приймаючи до уваги те, що для раків більшості типів першою ділянкою метастазування є лімфатичні вузли, слід очікувати, що блокування шляху VEGF-С/VEGFR-3 могло б пригнітити метастазування лімфатичних вузлів, наприклад, у разі раку молочної залози, раку підшлункової залози, раку шлунку або раку ободової та прямої кишки (Roberts et al., Cancer Res., 66(5), 2650-2657 (2006)). Антитіло може вводитись окремо (монотерапія) або у поєднанні з одним або декількома терапевтично ефективними агентами або лікарськими засобами (комбінована терапія). Енший терапевтично ефективний агент може бути кон'югований з антитілом, введений до тієї самої композиції, що і антитіло, або може бути введений як окрема композиція. Енший терапевтично ефективний агент або лікарський засіб може бути введений перед, під час та/або після введення антитіла. Енший терапевтично ефективний агент може бути введений для посилення терапевтичного ефекту антитіла або для зменшення негативної побічної дії антитіла. Способи лікування, опис яких наведений, можуть бути застосовані для лікування будь-якого відповідного ссавця, у тому числі приматів, таких як мавпи та люди, коней, корів, кішок, собак, кроликів і гризунів, таких як пацюки і миші. За одним з варіантів здійснення винаходу ссавцем, якого піддають лікуванню, є людина. У наведених нижче прикладах буде показано, що Антитіло 1 зв'язує антигенну детермінанту людського VEGFR-3, яка містить P219 як домінуючу складову антигенної детермінанти, V175  9 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 як другорядну складову антигенної детермінанти, і L221  як додаткову складову антигенної детермінанти. Окрім того, можна бачити, що Антитіло 2 (еталонне пацюче моноклональне антитіло, яке одержали проти мишачого VEGFR-3) зв'язує антигенну детермінанту мишачого VEGFR-3, що містить залишки L219 і V221. Крім того, приклади також демонструють, що Антитіло 1 має високу спорідненість до людського VEGFR-3 (56 пМ), може блокувати зв'язування ліганду VEGF-C з VEGFR-3, може блокувати VEGF-C-стимульовану мітогенну реакцію і є ефективним у in vivo ксенотрансплантатних моделях раку яєчнику та людського еритролейкозу (HEL). Нарешті, можна також бачити, що Антитіло 2 є ефективним у ксенотрансплантатних моделях раку голови та шиї, раку молочної залози, раку легень, гіпернефроїдного раку (RCC), раку підшлункової залози і раку ободової кишки. ПРИКЛАД 1 Антитіла за цим винаходом можна одержати і очистити із застосуванням різних відповідних способів, що є добре відомими у цій галузі. Наприклад, відповідні клітини-хазяї, наприклад, HEK 293 EBNA або CHO, тимчасово або стабільно трансфекують експресійною системою для секретування антитіл із застосуванням оптимального попередньо визначеного відношення векторів легкого ланцюга:важкого ланцюга або одновекторної системи, яка кодує як легкий ланцюг (наприклад, послідовність SEQ ID NO: 12 для Антитіла 1), так і важкий ланцюг (наприклад, послідовність SEQ ID NO: 14 для Антитіла 1). Просвітлене середовище, до якого секретують антитіло, очищають із застосуванням будь-якої з багатьох загальнозастосовуваних методик. Наприклад, середовище може бути зручним чином завантажене до колонки Sepharose FF з протеїном A або G, яка була зрівноважена сумісним буфером, таким як забуферений фосфатом фізіологічний розчиин (pH 7,4). Згадану колонку промивають для видалення неспецифічних зв'язувальних компонентів. Зв'язане антитіло елююють, наприклад, градієнтом pH (таким як 0,1 M буфер з фосфатом натрію (pH 6,8):0,1 M буфер з цитратом натрію (pH 2,5)). Фракції антитіла виявляють, наприклад, за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), після чого об'єднують. Подальше очищення є факультативним, у залежності від можливого застосування. Антитіло може бути піддано концентруванню та/або фільтруванню у стерильних умовах за традиційними методиками. Розчинний агрегат і мультимери можуть бути ефективно видалені за традиційними методиками, у тому числі шляхом хроматографії за розміром молекул, гідрофобної хроматографії, іонообмінної хроматографії або хроматографії на гідроксилапатитній адсорбційній колонці. Чистота антитіла після цих хроматографічних стадій є більшою ніж 99 %. Згаданий продукт може бути негайно заморожений при температурі -70C або ліофілізований. Нижче наведені амінокислотні послідовності (визначені за способом Кебота) гіперваріабельних та варіабельних ділянок Антитіла 1. Таблиця 1 Амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) легкого ланцюга mAb Антитіло 1 LCDR1 LCDR2 LCDR3 RASQSISSSFLA AASTRAT QQYGRSLS (послідовність SEQ ID NO: (послідовність SEQ ID (послідовність SEQ ID 1) NO: 2) NO: 3) Таблиця 2 Амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) важкого ланцюга mAb Антитіло 1 HCDR1 GNSATWN (послідовність SEQ ID NO: 6) HCDR2 HCDR3 GDSSSWYAFDY RTYYRSKWNHDYAESVKS(послідовність (послідовність SEQ SEQ ID NO: 7) ID NO: 8) 10 UA 109148 C2 Таблиця 3 Амінокислотні послідовності LCVR, HCVR, легкого і важкого ланцюгів mAb Антитіло 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Легкий ланцюг Важкий ланцюг (сигнальна (сигнальна LCVR HCVR послідовність на послідовність на залишках 1-19) залишках 1-19) послідовність SEQ послідовність SEQ послідовність SEQ послідовність SEQ ID NO: 5 ID NO: 10 ID NO: 12 ID NO: 14 ПРИКЛАД 2 У наведеному нижче прикладі описані експерименти, які ведуть до виявлення антигенної детермінанти на рецепторі VEGFR-3, з якою зв'язуються Антитіло 1 і Антитіло 2. Продукування VEGF-CΔNΔC та мишачого і людського sR3-AP. Рекомбінантний зрілий людський VEGF-CΔNΔC одержують як описано у Pytowski, et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(1):14-21. Непроцесовані (тобто Ig домени 1-7) розчинні екстрацелюлярні ділянки людського і мишачого VEGFR-3 (sR3) гібридизують з кДНК, що кодує людську лужну фосфатазу (AP) з одержанням гібридного білка sR3-AP (Persaud et al. (2004) J. Cell Science 117:2745-56; Pytowski, et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(1):14-21). Продукування мишачого-людського химерного sR3-AP і сайт-спрямованих мутантів sR3-AP. Химерні мишачі-людські і людські-мишачі генно-інженерні конструкції 3 N-кінцевих імуноглобуліноподібних (Ig) доменів sR3-AP одержують за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з перекриттям (Ho, et al. (1989), Gene 77:51-59), і клонують до експресійного вектору AP (Persaud, et al., supra; Pytowski, et al., supra). Сайт-спрямований мутагенез генноінженерних конструкцій sR3-AP здійснюють за допомогою набору для проведення сайтспрямованого мутагенезу QuickChange II XL за інструкціями виробника (компанія Stratagene). Наявність необхідних замін перевіряють шляхом секвенування обох ниток згаданої кДНК на мутованій ділянці за допомогою аналізатора ABI Prism 3100 Genetic (компанія Applied Biosystems) та набору для циклічного секвенування BigDye Terminator v3.1 (компанія Applied Biosystems). Експресія розчинних білків VEGFR-3: кДНК, яка кодує екстрацелюлярні ділянки sR3-AP TM™ дикого типу і мутанту, трансфекують клітини лінії FreeStyle 293 (компанія Invitrogen, ą за каталогом R79007), культивовані у суспензії у хімічно визначеному, безбілковому експресійному ™TM середовищі FreeStyle 293 (компанія Invitrogen, ą за каталогом 12338026). У певних випадках вибраний sR3-AP очищують засобами афінної хроматографії з антитілом проти лужної фосфатази, як було описано раніше (Zhu, et al., (1998) Cancer Res. 58:3209-14) або засобами афінної хроматографії з іммобілізованими моноклональними антитілами, Антитілом 1 і Антитілом 2, опис яких наведений. Нормалізація білків sR3 у кондиціонованому середовищі (CM): Кондиціоноване середовище випробовують на активність лужної фосфатази із застосуваням хемілюмінесцентного набору TM Great EscAPe SEAP 2.0 (компанія Clontech, Mountain View, CA) із застосуванням люмінометру Tropix TR7171 (компанія Applied Biosystems, Foster City, штат Каліфорнія). Згадане кондиціоноване середовище розбавляють пропорційно до активності лужної фосфатази у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS), що містить 1 % бичачого сироваткового альбуміну (PBS-BSA), і повторно випробовують для перевірки нормалізації шляхом визначення активності лужної фосфатази та проведення вестерн-блотингу. Дослідження зв'язування sR3-AP: Сто (100) мкл нормалізованого кондиціонованого середовища переносять на 96-лункові титрувальні мікропланшети, сенсибілізовані або VEGFCΔNΔC, або експериментальним антитілом (200 нг/лунку). Після 2 год. інкубації планшети промивають 5 разів, і виявляють хемілюмінесценцією зв'язаний sR3-AP. Зв'язувальну специфічність Антитіла 1 і позначеного як "Антитіло 2" еталонного пацючого моноклонального антитіла проти мишачого VEGFR-3 випробовують за допомогою ELISA із застосуванням іммобілізованих екстрацелюлярних ділянок мишачого та людського VEGFR-3 (Ig домени 1-7). Антитіло 1 і Антитіло 2 зв'язуються міцно і дозозалежно з людським та мишачим VEGFR-3, відповідно. Людське Антитіло 1 демонструє слабку, але відтворювану перехресну реактивність з мишачим VEGFR-3 при концентраціях, що перевищують 10 нМ. У протилежність до цього, Антитіло 2 не демонструє будь-якого виявлюваного зв'язування з людським VEGFR-3. Антигенні детермінанти Антитіла 1 і Антитіла 2 повністю вміщені у межах другого 11 UA 109148 C2 5 10 15 20 імуноглобуліноподібного (Ig) домену VEGFR-3: Лігандзв'язувальні сайти усіх трьох членів родини рецепторів VEGF знаходяться у межах трьох N-кінцевих Ig доменів екстрацелюлярного домену. Видоспецифічність Антитіла 1 і Антитіла 2 застосовують для встановлення того, який з перших трьох Ig доменів містить антигенні детермінанти цих антитіл. Послідовності ДНК, що кодують мишачі і людські Ig домени 1-3, обмінюють у різних комбінаціях з одержанням таких генно-інженерних конструкцій екстрацелюлярного домену VEGFR-3: i) людський дикого типу; ii) мишачий дикого типу; iii) химера 1 (людський Ig1–людський Ig2–мишачий Ig3); химера 2 (людський Ig1–мишачий Ig2– мишачий Ig3); (iv) химера 3 (мишачий Ig1–людський Ig2–мишачий Ig3) і (v) химера 4 (людський Ig1–мишачий Ig2–людський Ig3). Ці генно-інженерні конструкції експресують гібридні білки з лужною фосфатазою (AP) Persaud, et al., supra. Закодовані білки виділяють з кондиціонованого середовища (CM) тимчасово трансфекованих клітин, і нормалізують до однакової концентрації білка і активності лужної фосфатази. Мишачий і людський sR3-AP зв'язують людський VEGF-CΔNΔC з однаковою спорідненістю. Таким чином, здатність різних химер sR3-AP до зв'язування людського VEGF-CΔNΔC випробовують як засіб визначення збереження правильної просторової конформації білка химерних рецепторів. Здатність Антитіла 1 і Антитіла 2 до зв'язування з химерними білками 1-4 показує, що антигенні детермінанти Антитіла 1 і Антитіла 2 повністю вміщені у межах другого Ig домену (Ig2) людського і мишачого VEGFR-3, відповідно. Наприклад, Антитіло 1 не буде зв'язуватись з химерою 2 або химерою 4, які містять послідовність мишачого VEGFR-3 на Ig домені 2. Ідентифікація амінокислот VEGFR-3, що складають антигенні детермінанти Антитіла 1 і Антитіла 2: Ідентифікують дванадцять (12) положень у межах амінокислотної послідовності другого Ig домену VEGFR-3, які різняться між людськими і мишачими білками. Ці положення разом із залишками людських і мишачих білків представлені у Таблиці 4. Таблиця 4 Поло-ження Людський Мишачий 153 A S 167 V I 175 V A 177 W H 184 V L 192 L R 194 S P 199 H R 214 D N 219 P L 221 L V 25 30 35 40 45 50 55 До сайт-спрямованого мутагенезу вдаються з метою індивідуальної заміни кожної з видоспецифічних амінокислот людської та мишачої послідовності на відповідний ортолог протилежного виду; кожний мутований білок у подальшому експресують у контексті білків sR3AP, що кодують перший, другий і третій Ig домени. Картування антигенних детермінант здійснюють за допомогою двох взаємодоповнювальних способів. За першим способом визначають втрату зв'язування Антитіла 1, специфічного по відношенню до людини, і Антитіла 2, специфічного по відношенню до мишей, з їх відповідним людським та мишачим sR3-AP через наявність індивідуальних амінокислотних замін на мишачі або людські ортологи. За другим способом визначають посилення зв'язування Антитіла 1 і Антитіла 2 з sR3-AP протилежного виду, що опосередковується індивідуальними амінокислотними замінами на мишачі або людські ортологи. Залишок вважають сильним кандидатом на створення частини антигенної детермінанти антитіла, якщо результатом описаних вище мутацій є втрата зв'язування за першим способом і посилення зв'язування за другим способом. Для усіх білків-мутантів зв'язування VEGF-CΔNΔC визначають паралельно з перевіркою на суттєві зміни у структурі білків. Експерименти зі зв'язування проводять з потроєнням, і результати обчислюють як середню величину і середнє квадратичне відхилення трьох окремих експериментів. З 12 замін, перевірених у Ig2 домені людського sR3-AP, лише одна (V184L) призводить до повної втрати зв'язування як VEGF-CΔNΔC, так і Антитіла 1. Цю заміну, таким чином, розглядають як таку, що порушує загальну структуру людського sR3-AP. Заміна V175A призводить до приблизно 50 % втрати зв'язування як з VEGF-C, так і з Антитілом 1. Заміна P219L призводить до приблизно 75 % втрати зв'язування з VEGF-C і майже до повної (95 %) втрати зв'язування з Антитілом 1. Заміна L221 на V не впливає на зв'язування людського sR3-AP з VEGF-C, але зменшує зв'язування з Антитілом 1 на приблизно 55 %. Енші заміни не призводять до значної втрати зв'язування ні з VEGF-C, ні з Антитілом 1. Коли перевіряли окремі мутації (мишачі на людські) мишачого sR3-AP на підвищене зв'язування з людським специфічним Антитілом 1, значне підвищення, порівняно із зв'язуванням з мишачим sR3-AP дикого типу, спостерігається у разі замін A175V (12-кратне) та L219P (60-кратне). Жодна інша заміна не призводить до значного підвищення зв'язування порівняно з фоновим зв'язуванням. Таким чином встановлюються критерії для розгляду амінокислот, що містить антигенна 12 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 детермінанта для Антитіла 1, у якій заміна ортологу (людського на мишачий) у людському sR3AP має значно зменшити зв'язування з Антитілом 1 з одночасним зменшенням (але БЕЗ знищення) або зберіганням без змін зв'язування з VEGF-CΔNΔC. Крім того, для амінокислот, що містить антигенна детермінанта для Антитіла 1, заміна ортологу (мишачого на людський) у мишачому sR3-AP має призвести до значного зв'язування з Антитілом 1. Для Антитіла 1 цим критеріям відповідають V175 та P219 людського sR3-AP. V184 виключається, оскільки заміна у людському sR3-AP на мишачий ортолог ліквідує як зв'язування з VEGF-CΔNΔC, так і з Антитілом 1, у той час як відповідна заміна у мишачому sR3-AP на людський ортолог у цьому положенні не призводить до зв'язування з Антитілом 1. Заміна лейцину 221 у людському sR3-AP на відповідний мишачий валін зменшує зв'язування з Антитілом 1 на 55 %. Однак, відповідна заміна у мишачому sR3-AP на людський ортолог у цьому положенні не призводить до зв'язування з Антитілом 1. Таким чином, L221 може здійснити допоміжне удосконалення антигенної детермінанти Антитіла 1, однак не задовольняє усім встановленим вище критеріям. Для вивчення ролі залишку у положенні 221, мутації P219L та L221V у людському sR3-AP об'єднують у одній генно-інженерній конструкції. Зв'язування подвійного мутанту з Антитілом 1 по суті ліквідується, у порівнянні з одиночним мутантом P219L, який зберігає 5 % зв'язування з людським sR3-AP. Узяті разом, ці результати вказують на P219 як на головну, і на V175 як на другорядну складову антигенної детермінанти Антитіла 1 на людському VEGFR-3 і підвищують імовірність того, що L221 також є допоміжною складовою вказаної антигенної детермінанти. Після цього, за допомогою подібного способу здійснюють перевірку для визначення того, які залишки Ig2 домену мишачого VEGFR-3 утворюють антигенну детермінанту Антитіла 2. Знову ж таки, експерименти зі зв'язування здійснюють тричі, і результати обчислюють як середню величину та середнє квадратичне відхилення трьох окремих експериментів. З дванадцяти індивідуальних замін, що змінюють мишачу амінокислоту на відповідну людську амінокислоту, чотири заміни (H177W, P194S, R199H та N214D) значно зменшують зв'язування мишачого sR3AP як з VEGF-C, так і з Антитілом 2. Цікаво, що мутації у положеннях 219 і 221 (L219P і V221L) зменшують зв'язування з Антитілом 2, але не з VEGF-C. Відповідні мутації (людські на мишачі) людського VEGFR-3 у положеннях 219 і 221 (P219L і L221V) забезпечують зв'язування Антитіла 2 з людським sR3-AP на рівнях, відповідно, у приблизно 55 разів і 10 разів більших, аніж зв'язування Антитіла 2 з людською послідовністю дикого типу. Демонструється також, що зв'язування мишачих мутантних білків, що містять людську амінокислоту-ортолог у положеннях 219 і 221, з VEGF-CΔNΔC дещо підвищується або залишається незмінним, у той час як зв'язування цих білків-мутантів з Антитілом 2 ліквідується (219) або зменшується на приблизно 85 % (221). Критерії для розгляду амінокислоти для введення у антигенну детермінанту для Антитіла 2 полягають у тому, що заміна людського ортологу у мишачому sR3-AP має значно зменшити зв'язування з Антитілом 2 з одночасним зменшенням (але БЕЗ знищення) або збереженням без змін зв'язування з 5VEGF-CΔNΔC. Крім того, стосовно амінокислоти для введення у антигенну детермінанту для Антитіла 2, заміна ортологу (людського на мишачий) у людському sR3-AP має призвести до значного зв'язування з Антитілом 2. Для Антитіла 2 цим критеріям відповідають P219 та L221 мишачого sR3-AP. Інший спосіб вираження даних полягає у обчисленні відсотка максимального зв'язування Антитіла 2 з мишачим sR3-AP дикого типу, який є відновлюваним кожною окремою ортологічною (людською на мишачу) мутацією у межах послідовності людського sR3-AP. Це демонструє, що заміна окремо P219L та L221V у межах послідовності людського sR3-AP є призводить до відновлення приблизно 5 % і 1 %, відповідно, від максимального зв'язування з Антитілом 2, яке спостерігається у разі мишачого sR3-AP дикого типу. Тому доходять висновку, що L219 і V221 є складовими антигенної детермінанти Антитіла 2. Видно, що Антитіло 1 і Антитіло 2 зв'язують високоподібні антигенні детермінанти людського VEGFR-3 і мишачого VEGFR-3, відповідно, причому залишок у положенні 219 є ключовим залишком у кожному випадку. Дані у наведених нижче прикладах демонструють, що як Антитіло 1, так і Антитіло 2 є нейтралізуючими антитілами, що є здатними блокувати активність своїх відповідних антигенів, а також пригнічувати ріст пухлин у in vivo ксенотрансплантатних моделях. Такі дані надають додаткові докази для демонстрації того, що нова антигенна детермінанта у Ig2 домені VEGFR-3, ідентифікована у цьому описі, забезпечує ключову переважну особливість, являючи собою нейтралізуючу антигенну детермінанту. Антитіла, що зв'язуються зі згаданою антигенною детермінантою є, таким чином, здатними до блокування зв'язування ліганду, передачі сигналів VEGFR-3 та до пригнічення росту пухлин in vivo. ПРИКЛАД 3: Визначення спорідненості (Kd) антитіл проти VEGFR-3 13 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Кінетику зв'язування Антитіла 1 визначають за поверхневим плазмонним резонансом, який вимірюють із застосуванням біосенсору BIACORE 2000 (BIACORE, Piscataway, NY) при температурі 20C. Розчинний екстрацелюлярний домен людського VEGFR-3 (sR3-AP) іммобілізують на сенсорному чіпі, і Антитіло 1 наносять на поверхню сенсору з концентраціями від 0,8 нМ до 6,25 нМ. Сенсограми оцінюють із застосуванням програми BIA Evaluation 3.2 для визначення швидкості асоціації (ka) та швидкості дисоціації (kd). Константу дисоціації (K d) обчислюють за швидкостями ka та kd за допомогою рівняння: Kd=ka/kd. Кінетичний аналіз за допомогою BIAcore дає значення Kd, що дорівнює 56 пМ для зв'язування Антитіла 1 з іммобілізованим sR3-AP. Таким чином, Антитіло 1 має надзвичайно високу спорідненість до людського VEGFR-3, причому вказана спорідненість за величиною є приблизно на 2 порядки більшою ніж відповідний показник sR3-AP для VEGF-CΔNΔC. ПРИКЛАД 4: Блокування зв'язування VEGF-C з VEGFR-3 антитілами проти VEGFR-3 Для визначення здатності антитіл проти VEGFR-3 до блокування зв'язування VEGF-C з людським VEGFR-3 застосовують дослідження конкурентного блокування VEGF-C. Антитіла або розчинні фагові частинки з концентрацією від 0,001 мкг/мл до 5 мкг/мл змішують з 50 нг sR3-AP, інкубують при кімнатній температурі протягом 1 год., і переносять на 96-лункові титраційні мікропланшети, сенсибілізовані VEGF-CΔNΔC (200 нг/лунку). Через дві години після цього планшети промивають п'ять разів, і додають п-нітрофенілфосфат (компанія Sigma) для кількісного визначення зв'язаних молекул sR3-AP при OD405nm. Обчислюють IC50, тобто концентрацію Fab або IgG, необхідну для 50 % пригнічення зв'язування sR3-AP з VEGF-CΔNΔC. Згадані Fab та IgG форми Антитіла 1 сильно блокують зв'язування sR3-AP з іммобілізованим VEGF-CΔNΔC з IC50 на рівні 2 нМ і 1,3 нМ відповідно. У протилежність до цього контрольне антитіло, мішенню для якого є людський рецептор IGF (інсуліноподібний фактор росту) і яке було одержано з тієї ж самої фагової бібліотеки, є неактивним. ПРИКЛАД 5: Пригнічення VEGF-CΔNΔC-стимульованої мітогенної реакції Антитілом 1 Для перевірки здатності Антитіла 1 до пригнічення трансдукції сигналів, опосередкованої VEGFR-3, одержали лінію клітин NIH-3T3, що експресує химерну форму VEGFR-3, що гібридизує екстрацелюлярний домен людського VEGFR-3 з трансмембранним та цитоплазматичним доменами людського cFMS (кіназамакрофаг-колонієстимулювальний фактор). Ендогенної експресії VEGFR-3 вихідними клітинами не виявлено, а локалізація химерного рецептора на плазматичній мембрані показана дослідженням FACS (клітинний 3 сортер зі збудженням флуоресценції). Клітини VEGFR-3-FMS (510 клітин/лунку) висівають на 96-лункові планшети для культури тканин (компанія Wallac, Gaithersburg, MD) у 200 мл безсироваткового середовища, та інкубують при температурі 37C протягом 72 год. Додають антитіло (до 20 нМ), здійснюють попередню інкубацію при температурі 37C протягом 1 год., після чого додають VEGF-CΔNΔC до кінцевої концентрації 20 нг/мл. Після інкубації протягом 18 3 год. до кожної лунки додають 0,25 мікроКюрі тимідину, міченого тритієм ([ H]-TdR) (компанія Amersham), і додатково інкубують протягом 4 год. Клітини переносять на лід, один раз промивають сироватковмісним середовищем, інкубують протягом 10 хв при температурі 4C з 10 % TCA (трихлороцтова кислота), і солюбілізують у 25 мл 2 % розчину SDS (додецилсульфат натрію). Включену до складу радіоактивність визначають із застосуванням сцинтиляційного 3 лічильника (компанія Wallac, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter). Включення [ H]-TdR клітинами NIH-3T3, що експресують VEGFR-3-cFMS, стимулюють щонайменше трикратно доданням VEGF-CΔNΔC. Мітогенна реакція дозозалежно специфічно блокується Антитілом 1 із значенням IC50, що становить 5 нМ. ПРИКЛАД 6: Моноклональні антитіла проти VEGFR-3 у підшкірній ксенотрансплантатній моделі на лінії клітин людського раку яєчнику У цьому експерименті моноклональні антитіла проти VEGFR-3, Антитіло 1 і Антитіло 2, застосовують самостійно або у комбінації на ксенотрансплантатах лінії клітин людського раку яєчнику OVCAR-8 (NCI-60, Developmental Therapeutics Program, NCI/NIH) на мишах з тяжким комбінованим імунодефіцитом (SCID). Лінія клітин OVCAR-8 є однією з дуже небагатьох ліній клітин людського раку, що експресує людський VEGFR-3. Цим експериментом сподівалися встановити, що Антитіло 2 буде блокувати ангіогенез та лімфангіогенез у стромі зростаючих мишачих пухлин без справляння впливу на саму пухлину. У протилежність до цього очікували, що Антитіло 1 діє лише на людські ракові клітини. Клітини лінії OVCAR-8 вводять підшкірним шляхом до лівого боку 75 "голих" мишей-самиць з 7 3 розрахунку 110 клітин/мишу. Після досягнення пухлинами об'єму 180 мм , через 13 днів після імплантації клітин, мишей довільно розподіляють на п'ять досліджуваних груп (n=12): фізіологічний розчин (Фармакопея США), 0,5 мл/дозу (контрольна група); пацючий IgG у дозі 40 мг/кг; Антитіло 1 у дозі 40 мг/кг; Антитіло 2 у дозі 40 мг/кг; і Антитіло 1 у дозі 40 мг/кг+Антитіло 2 14 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 у дозі 40 мг/кг. Моноклональні антитіла проти VEGFR-3 і контрольний розчин вводять інтраперітонеальним шляхом за схемою Понеділок-Середа-П'ятниця. Результати вимірювання пухлин реєструють двічі на тиждень. Відношення T/C% (експеримент/контроль%) обчислюють для кожної досліджуваної групи як відношення між відносним об'ємом пухлин кожної досліджуваної групи та відносним об'ємом пухлин контрольної групи, що одержує фізіологічний розчин. RM ANOVA (дисперсійний аналіз з повторними вимірами) на 41 день проводять для порівняння росту пухлин серед досліджуваних груп. Антитіло 2 значно пригнічує ріст пухлин OVCAR-8 з T/C% 71 % (P=0,0299). Антитіло 1 у цій моделі має тенденцію у напрямку ефективності (T/C% 74 %), але ступінь пригнічення пухлин не досягає рівня значущості (P>0,05). Це може обумовлюватись широким діапазоном об'ємів 3 пухлин на 41 день (335-1504 мм ) у цій групі, що могло перешкодити досягненню цією групою рівня статистичної значущості. Комбінація Антитіла 1 і Антитіла 2 разом стимулювала пухлинопригнічувальну дію Антитіла 2 (T/C% 47 %, і дія комбінації досягає рівня значущості, порівняно з будь-яким антитілом окремо (P0,0358)). Антитіло 2 значно пригнічує ріст пухлин OVCAR-8, у той час як Антитіло 1 видається ефективним у цій моделі без досягнення рівня статистичної значущості. Однак, оскільки комбінація двох вказаних моноклональних антитіл значно пригнічує ріст пухлин OVCAR-8, порівняно з монотерапією Антитілом 2, зроблений висновок, що Антитіло 1 продемонструвало терапевтичну ефективність у цьому експерименті. Відповідним чином, вказані антитіла за цим винаходом демонструють протипухлинну ефективність у in vivo моделі раку яєчника. ПРИКЛАД 7: Моноклональне антитіло проти VEGFR-3 Антитіло 1 у підшкірній ксенотрансплантатній моделі на клітинах людського еритролейкозу (HEL) В наведеному нижче прикладі встановлена значна протипухлинна дія Антитіла 1 у підшкірній ксенотрансплантатній моделі на клітинах людського еритролейкозу (HEL). "Голим" мишам (Nu/nu) (самиці, 7-8 тижнів), яких помістили по 5-6 у клітку, підшкірним 6 шляхом вводять 510 клітин HEL/мишу. Після досягнення пухлинами об'єму приблизно 400 3 мм , мишей довільно за об'ємом пухлин розподіляють по чотирьом досліджуваним групам (n=11/групу): 1) Фізіологічний розчин (Фармакопея США), 10 мл/кг, 2) Антитіло 1, 60 мг/кг (ударна доза 150 мг/кг на 1 день) 3) Антитіло 1, 20 мг/кг (ударна доза 50 мг/кг на 1 день) 4) Антитіло 1, 6 мг/кг (ударна доза 15 мг/кг на 1 день) Антитіло 1 розводять у фізіологічному розчині (Фармакопея США). Обробки здійснюють інтраперітонеальним шляхом двічі на тиждень у дозі 10 мл розчину/кг маси тіла. Першу дозу, ударну, вводять на 1 день, з подальшим введенням підтримувальної дози двічі на тиждень протягом проведення дослідження. Об'єм пухлин визначають двічі на тиждень. Масу тіла реєструють щонайменше двічі на тиждень протягом проведення дослідження. T/C% обчислюють для кожної досліджуваної групи на 18 день як відношення між відносним об'ємом пухлин кожної досліджуваної групи та відносним об'ємом пухлин контрольної групи, що одержує фізіологічний розчин (Таблиця 5). Ріст пухлин і зміну маси тіла у досліджуваних групах порівнюють шляхом здійснення RM ANOVA (дисперсійний аналіз з повторними вимірами). Обробка Антитілом 1 призводить до дозозалежного пригнічення росту пухлин HEL, причому Антитіло 1 у дозі 60 мг/кг значно пригнічує ріст пухлин (p=0,0031). Обробка Антитілом 1 при проведенні цього дослідження не впливає на масу тіла (Таблиця 5). Відповідно, згадані антитіла за цим винаходом демонструють протипухлинну ефективність у in vivo моделі HEL з одночасним одержанням у цій моделі мінімальних негативних побічних ефектів. Таблиця 5 T/C% на 18 день Контроль (фізіологічний розчин) Антитіло 1, 60 мг/кг Антитіло 1, 20 мг/кг Антитіло 1, 6 мг/кг 50 RM ANOVA Кінцевий середній % RM ANOVA об'єму пухлин зміни маси тіла маси тіла 6,6 52,5 69,6 81,9 0,0031 0,13 0,39 4,6 3,2 4,6 0,21 0,20 0,41 ПРИКЛАД 8: Моноклональне антитіло проти VEGFR-3 Антитіло 2 у комбінації з цисплатином у ксенотрансплантатній моделі плоскоклітинного раку на клітинах CAL27 15 UA 109148 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Для перевірки активності антитіл проти VEGFR-3 при раку голови та шиї застосовують 7 ксенотрансплантатну модель на клітинах CAL27. Суспензію клітин CAL27 (110 клітин/мишу) підшкірним шляхом вводять до лівого боку 60 "голих" мишей-самиць. Після досягнення 3 пухлинами об'єму 180 мм , через вісім днів після імплантації клітин, мишей довільно розподіляють на чотири досліджуваних групи (n=12): 1) Контрольна група, фізіологічний розчин (Фармакопея США), 0,5 мл інтраперітонеально, 3 рази на тиждень; 2) Антитіло 2 у дозі 40 мг/кг, 3 рази на тиждень; 3) Цисплатин у дозі 7 мг/кг, один раз на 7 днів; 4) Антитіло 2 у дозі 40 мг/кг, 3 рази на тиждень+цисплатин у дозі 7 мг/кг, один раз на 7 днів. Результати вимірювання пухлин реєструють двічі на тиждень. Для порівняння росту пухлин серед досліджуваних груп на 61 день проводять RM ANOVA. Для перевірки статистичної значущості для ряду випадків зворотного розвитку пухлин серед досліджуваних груп застосовують критерій хі-квадрат. Монотерапія із застосуванням Антитіла 2 або цисплатину значно пригнічує ріст пухлин CAL27, порівняно з контролем (фізіологічний розчин, Фармакопея США) (P0,0077). Значення T/C% дорівнюють 55 % та 39 % для Антитіла 2 і для цисплатину, відповідно. Комбінована терапія як Антитілом 2, так і цисплатином призводить до значного пригнічення росту пухлин порівняно з монотерапією (P0,0322). Вплив комбінованої терапії є більш-ніж-адитивним, як визначається методом дрібного добутку. Відповідно, зв'язування антитіла проти VEGFR-3 з антигенною детермінантою на Ig2 домені VEGFR-3 демонструє протипухлинну ефективність у in vivo моделі раку голови та шиї як у разі монотерапії, так і у комбінації з цисплатином. ПРИКЛАД 9: Моноклональне антитіло проти VEGFR-3 Антитіло 2 у комбінації з 5фторурацилом/лейковорином у ксенотрансплантатній моделі раку молочної залози на клітинах MDA-MB-231 Для перевірки активності антитіл проти VEGFR-3 при раку молочної залози застосовують ксенотрансплантатну модель на клітинах MDA-MB-231. "Голим" мишам (NIH nu/nu) (самиці 6 віком 8 тижнів) підшкірним шляхом до жирової тканини молочної залози вводять 610 клітин MDA-MB-231 у 0,4 мл (1:1 маса клітин/матригель). Після досягнення пухлинами об'єму 3 приблизно 300 мм мишей довільно розподіляють за розміром пухлин у такі досліджувані групи (n=12): 1) Фізіологічний розчин (Фармакопея США), 10 мкл/г, 3 рази на тиждень; 2) Антитіло 2 у дозі 40 мг/кг, 3 рази на тиждень; 3) 5FU (5-фторурацил) у дозі 125 мг/кг+LV (лейковорин) у дозі 62 мг/кг, один раз на тиждень; 4) Антитіло 2 у дозі 40 мг/кг, 3 рази на тиждень+5FU/LV у дозі 125 мг/кг і 62 мг/кг, відповідно, один раз на тиждень. Усі агенти виготовляють у день проведення обробки і вводять інтраперітонеальним шляхом. Цитотоксичну обробку розпочинають за день до початку обробки антитілом. Результати порівняння об'єму пухлин у контрольній групі, яка одержує фізіологічний розчин, з об'ємом пухлин у мишей, яких піддавали обробці, показують значне пригнічення росту пухлин завдяки введенню Антитіла 2 або Aнтитіла 2+5FU/LV (дивись Таблицю 6). Незважаючи на те, що дія комбінації Антитіла 2+5-FU/LV не перевищує дію при монотерапіях, існує тенденція підвищення протипухлинної дії для згаданої комбінації. Відповідно, зв'язування антитіла проти VEGFR-3 з антигенною детермінантою на Ig2 домені VEGFR-3 демонструє протипухлинну ефективність у in vivo моделі раку молочної залози (порівняно з контролем, який одержував фізіологічний розчин) як у разі монотерапії, так і у комбінації з 5FU/LV. Таблиця 6 Об'єми пухлин значення р T/C% 1 Антитіло 2 у зіставленні з фізіологічним розчином (Фармакопея США) 5FU/LV у зіставленні з фізіологічним розчином (Фармакопея США) Антитіло+5FU/LV у зіставленні з фізіологічним розчином (Фармакопея США) Антитіло 2 у зіставленні з Антитілом 2+5FU/LV 5FU/LV у зіставленні з Антитілом 2+5FU/LV 1 45 p=0,04 49 p=0,17 52 p