Рекомбінантні молекули лубрицину і їх використання

1. Виділений білок лубрицин, який містить послідовність SEQ ID NО:9, 13, 17, 21 або 25. 2. Виділений білок лубрицин, який містить послідовність SEQ ID NО:26, приєднану до послідовності N-2 повтору(ів) SEQ ID NO:27, де N дорівнює цілому числу від 3 до 25. 3. Білок за п. 2, де N дорівнює цілому числу від 5 до 25. 4. Білок за п. 2, де N дорівнює цілому числу від 10 до 25. 5. Виділений білок лубрицин, який містить послідовність SEQ ID NО:26 плюс SEQ ID NO:28 плюс [(N-2) повтор(и) SEQ ID NО:27] плюс SEQ ID NО:29, де N дорівнює цілому числу від 10 до 25. 6. Виділений полінуклеотид, що кодує білок лубрицин, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 1. 7. Виділений полінуклеотид, що кодує білок лубрицин, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 2. 8. Виділений полінуклеотид, що кодує білок лубрицин, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 3. 9. Виділений полінуклеотид, що кодує білок лубрицин, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 4. 10. Виділений полінуклеотид, що кодує білок лубрицин, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 5. 11. Виділений білок лубрицин, який містить послідовність SEQ ID NО:7, 11, 15, 19 або 23. 2 (19) 1 3 91818 4 28. Експресійний вектор, який містить полінуклеотид за п. 6 або 7, операбельно зв'язаний з послідовністю, регулюючою експресію. 29. Спосіб отримання рекомбінантного білка, що передбачає: культивування клітин, трансформованих експресійним вектором за п. 28, в рідкому культуральному середовищі, і виділення рекомбінантного білка з вказаного середовища. 30. Спосіб за п. 29, де вказане виділення білка передбачає: концентрування білка шляхом фільтрації середовища через мембрану; збір білка, що залишився, з вказаної мембрани, і солюбілізацію зібраного білка в забуференому сольовому розчині, що містить гідрохлорид Lаргініну в концентрації від 0,1 до 2,0 М. 31. Спосіб за п. 30, де концентрація гідрохлориду L-аргініну становить 0,5 М. 32. Виділене антитіло, специфічне відносно білка за п. 1 або 2. Даний винахід стосується нових рекомбінантних молекул лубрицину і їх використання як змащувальних речовийи, антиадгезивних агентів і/або внутрішньосуглобових добавок, наприклад, для введення в синовіальні сполуки, меніск, сухожилля, очеревину, перикард і в плевру. Для оптимального функціонування синовіальних сполук, коефіцієнти тертя між суглобовими тканинами повинні бути надто низькими. Звичайно, суглобовий хрящ має добре змазану поверхню. Однак, при остеоартриті (ОА), зниження рівня суглобової "змазки" може приводити до руйнування хрящового матрикса і до фібриляції, що, в свою чергу, може приводити до порушення функції суглобів і до болів. Зменшення суглобової змазки також приводить до порушення функції суглобів і до болів при інших формах артриту, включаючи ревматоїдний артрит (РА). Що стосується інших тканин (наприклад, сухожиль), то змазана поверхня також може додавати цим тканинам певні оптимальні функціональні властивості. Сухожиллю, для його нормального функціонування, крім необхідної змазаної поверхні також потрібне запобігання прориванню клітин до поверхонь сухожиль. При ураженні і відновленні згинального м'яза сухожилля, найбільш поширеним ускладненням є, наприклад, утворення спайок між сухожиллями. Природний білок лубрицин являє собою білок, споріднений з білком-попередником чинник стимуляції мегакариоцитів (MSF). PRG4 (протеоглікан 4) позначається абревіатурою MSF, яка є в базі даних по номенклатурі людських генів UCL/HGNC/HUGO. Білок PRG4 (тобто, білокпопередник MSF) описаний в патенті США №6433142 і в заявці на патент США №20020137894 (всі патенти і патентні заявки, що цитуються в цьому документі, у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання). Поліпептид, що кодується екзоном 6 гена PRG4, є у високій мірі глікозильованим і, очевидно, його присутність необхідна для того, щоб PRG4споріднений білок служив як змазка, наприклад, між поверхнями суглобового хряща. Дослідження показали, що глікопротеїн PRG4 також синтезується внутрішніми синовіоцитами, які вистилають піхву сухожилля, при цьому, найбільш ймовірно, що цей глікопротеїн також походить від теноцитів (Rees et al., 2002). Вказаний глікопротеїн присутній, в основному, в ділянці волокнистої хрящової тканини сухожилля. Даний глікопротеїн, крім того, що він володіє функцією синовіальної рідини, може відігравати в сухожиллі важливу цитопротективну роль, що полягає в попередженні проривання клітин до поверхонь сухожилля, а також в забезпеченні "змазки" в процесі нормального функціонування сухожилля. Екзон 6 гена PRG4 (який також називається "лубрицином") кодує приблизно 76-78 повторів КЕРАРТТ-подібних послідовностей і 6 повторів ХХТТТХ-подібних послідовностей. Відповідно до даного винаходу, зміна числа порівнянних послідовностей-повторів в рекомбінантних білках лубрицину може бути встановлена в основу розробки поліпшених біотерапевтичних засобів з метою збільшення рівня змазування суглобів і для запобігання небажаним спайкам між тканинами. Даний винахід стосується нових рекомбінантних молекул лубрицину і їх використання як змащувальних речовин, антиадгезивних засобів і/або внутрішньосуглобових добавок. Для оптимізації параметрів експресії і дослідження функціональної необхідності використання всіх приблизно 76-78 повторів КЕРАРТТ-подібних послідовностей, були сконструйовані конструкції для експресії лубрицину, які забезпечують синтез рекомбінантних білків лубрицину з різною мірою О-зв'язаних олігосахаридних заміщень. Це може бути досягнуте шляхом включення різного числа КЕРАРТТ-подібних послідовностей в "корову" кДНК-конструкцію, що складається з екзонів 1-5, 5'- і 3'-фланкуючих областей екзону 6 і екзонів 712. Введення повторюваних вставок в "синтетичні кДНК-кластери", що кодують безліч КЕРАРТТподібних послідовностей, полегшує генерування рекомбінантних конструкцій лубрицину різного розміру. Вихідним об'єктом цих досліджень була конструкція PRG4-Lub:1 (яка містить ДНК "синтетичного кДНК-кластера-1" (SEQ ID NO:1), що кодує чотири послідовності КЕРАРТТ). Рекомбінантні білки лубрицину даного винаходу мають загальну первинну структуру з декількома ізоформами нативного людського лубрицину [див. US6743774, US20040072741 і WO0064930]. Кожна з охарактеризованих ізоформ відрізняється по складу екзонів гена PRG4, які кодують первинну 5 структуру ізоформ. Так, наприклад, екзони 1-12 гена PRG4 кодують ізоформу V0, яка являє собою повнорозмірну ізоформу, а екзони 1-4 і 6-12 кодують ізоформу V1, в якій відсутній тільки сегмент, той, що кодується екзоном 5. Екзони 1-3 і 6-12 кодують ізоформу V2, в якій відсутні сегменти, що кодуються екзонами 4 і 5. І нарешті, екзони 1, 3 і 612 кодують ізоформу V3, в якій відсутні сегменти, що кодуються екзонами 2, 4 і 5. При цьому, ймовірно існують і інші ізоформи, і деякі спорідненим мутантні білки були описані раніше [див. US20020086824]. Зокрема, даний винахід стосується рекомбінантного білка лубрицину, що містить КЕРАРТТподібні послідовності, що повторюються. У своїх переважних варіантах, даний винахід стосується виділеного білка, що містить послідовності SEQ ID N0:9, 13, 17, 21 або 25. Даний винахід також стосується споріднених варіантів виділеного білка, що містить послідовності SEQ ID N0:7, 11, 15, 19 або 23. У інших споріднених варіантах, даний винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, кодуючої реко 91818 6 мбінантний білок лубрицин. У переважних варіантах, даний винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок. У інших споріднених варіантах, даний винахід стосується виділеного полінуклеотиду, послідовність якого, по всій його довжині принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або на 99% ідентична послідовності SEQ ID N0:6, 10, 14, 18 або 22. У споріднених аспектах, даний винахід також стосується виділеного білка, що містить послідовність SEQ ID N0:26, приєднану до послідовності (N-2) повтору(ів) SEQ ID N0:27, де N дорівнює цілому числу від 3 до 200. У інших споріднених варіантах, даний винахід стосується виділеного білка, що містить послідовність SEQ ID N0:26 + SEQ ID N0:28 + [(N-2) повтору(ів) SEQ ID N0:27] + SEQ ID N0:29, де N дорівнює цілому числу від 3 до 200. У інших варіантах споріднених аспектів даного винаходу, описаних в цьому параграфі, більш переважно, щоб N дорівнювало цілому числу від 5 до 50, і ще більш переважно, щоб N дорівнювало цілому числу від 10 до 30. 7 У споріднених варіантах, даний винахід також стосується композиції, що містить терапевтично ефективну кількість рекомбінантного білка лубрицину в фармацевтично прийнятному носії. У деяких варіантах винаходу, вказана композиція додатково містить гіалуронан або гілан. Даний винахід також стосується способу лікування індивідуума, що передбачає: отримання композиції, яка містить рекомбінантний білок лубрицин, і введення вказаної композиції в тканину даного індивідуума. У споріднених варіантах застосування вказаного способу даного винаходу, тканину вибирають з групи, яка складається з хряща, синовіальної рідини, меніска, сухожилля, очеревини, перикарду і плеври. У інших споріднених варіантах способу даного винаходу, вказаний спосіб, крімтого, включає стадію, вибрану з групи, яка складається з: введення індивідууму анестетика; введення індивідууму протизапального лікарського засобу; введення індивідууму антибіотика; відсмоктування у індивідуума рідини; промивання тканини індивідуума і візуалізації тканини вказаного індивідуума. У інших споріднених варіантах винаходу, вказаний індивідуум вибраний з групи, яка складається з мишей, кішок, собак, коней і людини. У інших своїх варіантах, даний винахід також стосується експресійного вектора, що містить полінуклеотид, який кодує рекомбінантний білок лубрицин, де вказаний полінуклеотид функціонально приєднаний до послідовності регуляції експресії. У своїх споріднених варіантах, даний винахід стосується способу отримання рекомбінантного білка лубрицину, що передбачає: культивування клітин, трансформованих експресуючим вектором в рідкому культуральному середовищі, і збір рекомбінантного білка лубрицину з даного середовища. Стадія збору білка може також включати: концентрування білка шляхом фільтрації даного середо 91818 8 вища через мембрану; збір білка, що залишився, з вказаної мембрани, і солюбілізацію зібраного білка в забуференому сольовому розчині, що містить гідрохлорид L-аргініну в концентрації від 0,1 до 2,0 М. У іншому спорідненому варіанті, даний винахід стосується виділеного антитіла, специфічного до рекомбінантного білка лубрицину. Інші відмітні ознаки і переваги даного винаходу будуть очевидні з нижченаведеного опису переважних варіантів винаходу і з формули винаходу. Основна ДНК-конструкція, що використовується для генерування рекомбінантних білків лубрицину, може включати послідовності 5'- і 3'-екзону 6 гену PRG4 в різному порядку. Так, наприклад, основна ДНК-конструкція може включати послідовності, що кодують домени, подібні до доменів соматомедину В, (екзони 2-4) або гемопексин-подібні домени (екзони 7-9) в різному порядку. Варіантами основної ДНК-конструкції, що має послідовності 3'-екзону 6 в різному порядку, можуть бути основні ДНК-конструкції, які включають тільки окремі екзони 7, 8, 9, 10, 11 або 12, або пари екзонів (7 і 8), (7 і 9), (7 і 10), (7 і 11), (7 і 12), (8 і 9), (8 і 10), (8 і 11), (8 і 12), (9 і 10), (9 і 11), (9 і 12), (10 і 11), (10 і 12) або (11 і 12), або триплети екзонів (7, 8 і 9), (7, 8 і 10), (7, 8 і 11), (7, 8 і 12), (7, 9 і 10), (7, 9 і 11), (7, 9 і 12), (7, 10 і 11), (7, 10 і 12), (7, 11 і 12), (8, 9 і 10), (8, 9 і 11), (8, 9 і 12), (8, 10 і 11), (8, 10 і 12), (8, 11 і 12), (9, 10 і 11), (9, 10 і 12), (9, 11 і 12) або (10, 11 і 12), або квадруплети екзонів (7, 8, 9 і 10), (7, 8, 9 і 11), (7, 8, 9 і 12), (7, 8, 10 і 11), (7, 8, 10 і 12), (7, 8, 11 і 12), (7, 9, 10 і 11), (7, 9, 10 і 12), (7, 9, 11 і 12), (7, 10, 11 і 12), (8, 9, 10 і 11), (8, 9, 10 і 12), (8, 9, 11 і 12), (8, 10, 11 і 12) або (9, 10, 11 і 12), або квінтети екзонів (7, 8, 9, 10 і 11), (7, 8, 9, 10 і 12), (7, 8, 9, 11 і 12), (7, 8, 10, 11 і 12), (7, 9, 9 10, 11 і 12) або (8, 9, 10, 11 і 12) або секстет екзонів (7, 8, 9, 10, 11 і 12). Крім того, варіантами основної ДНКконструкції, що має послідовності 5'-екзону 6 в різному порядку, можуть бути основні ДНКконструкції, які включають тільки окремі екзони 1, 2, 3, 4 або 5, або пари екзонів (1 і 2), (1 і 3), (1 і 4), (1 і 5), (2 і 3), (2 і 4), (2 і 5), (3 і 4), (3 і 5) або (4 і 5), або триплети екзонів (1, 2 і 3), (1, 2 і 4), (1, 2 і 5), (1, 3 і 4), (1, 3 і 5), (1, 4 і 5), (2, З і 4), (2, З І 5), (2, 4 і 5) або (3, 4 і 5), або квадруплети екзонів (1, 2, 3 і 4), (1, 2, 3 і 5), (1, 2, 4 і 5), (1, 3, 4 і 5) або (2, 3, 4 і 5), або квінтети екзонів (1, 2, 3, 4 і 5). Даний винахід також охоплює білки, що кодуються основними ДНК-конструкціями, тобто, білки, в яких частина поліпептиду або весь поліпептид, що кодується послідовністю екзону 6, делетовані, і в яких відсутні амінокислоти, що кодуються вставками, які походять від синтетичних кДНК-кластерів. Даний винахід також охоплює полінуклеотиди, гомологічні полінуклеотидам конкретних описаних тут варіантів, наприклад, полінуклеотиди, що мають послідовності, які принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% ідентичні конкретним ДНК-послідовностям. Даний винахід також включає полінуклеотиди, що мають послідовність нуклеїнової кислоти, здатної гібридизуватися з комплементом конкретних ДНК-послідовностей по всій довжині функціонального домену в умовах високої жорсткості. Даний винахід також включає білки, що кодуються цими гомологічними або гібридизуються полінуклеотидами. Для кращого розуміння варіантів даного винаходу, нижче приводяться визначення термінів, що зустрічаються тут. Вираз "повторювана КЕРАРТТ-подібна послідовність" означає амінокислотну послідовність, яка принаймні на 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більш: (а) ідентична послідовності "APTTPKEPAPTTTKSAPTTKEPAPTTTКEPAPTTPK EPAPTTTK" (SEQ ID NО:26; 45 амінокислот) і має принаймні одне заміщення по О-зв'язку; (b) ідентична послідовності "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NO:27; 31 амінокислота) і має принаймні одне заміщення по О-зв'язку; або (с) ідентична послідовності "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NO:28; 22 амінокислоти) і яка має принаймні одне заміщення по О-зв'язку. Повторювана КЕРАРТТподібна послідовність може мати, переважно, два, три, чотири або більше заміщень по О-зв'язку. Існує ряд методів визначення ідентичності між двома полінуклеотидними або поліпептидними послідовностями, і термін "ідентичність" добре відомий фахівцям і має певне значення в залежності від методу, що конкретно застосовується. Описану тут ідентичність послідовностей визначають з використанням комп'ютерної програми BLAST 2 SEQUENCES, що є в NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, див. також Tatusova & Madden (1999)]. Для амінокислотних послідовностей використовуються наступні параметри: очікувана величина=1000; довжина слова=2; команда фільтр=відсутній, а інші параметри використовуються за умовчанням. Для послідов 91818 10 ностей нуклеїнових кислот використовуються ті ж самі параметри, за винятком, того, що довжина слова=8. Для порівняння амінокислотних послідовностей використовуються наступні параметри за умовчанням: матриця=BLOSUM62; штраф за пробіл-пропуск=11; штраф за пробіл-подовження=1 і пробіл х виключення=50. Для порівняння послідовностей нуклеїнових кислот використовуються наступні параметри за умовчанням: “премія" за збіг”=1; штраф за помилкове спарювання=-2; вибір ланцюга=обидва ланцюги; штраф за пробілпропуск=5; штраф за пробіл-подовження=2 і пробіл х виключення=50. Заміщенням по О-зв'язку в рекомбінантному лубрицині може бути заміщення змащувальним олігосахаридом -(1-3)-Gal-GalNac, або іншими молекулами, включаючи штучні або природні вуглеводневі молекули (такі як сульфат кератину або сульфат хондротину). В деяких варіантах винаходу, заміщенням по О-зв'язку може бути заміщення молекулами, які сприяють функціонуванню рекомбінантного лубрицину як носія поверхневоактивного фосфоліпіду (SALP) або інших поверхнево-активних речовин (Hills, 2002). Процент глікозилювання або заміщення визначають по масі (сухій масі). Умови високої жорсткості, що використовуються для гібридизації ДНК:ДНК, означають умови, еквівалентні умовам зв'язування або гібридизації при 42 С в розчині, що складається з 5х SSPE (43,8г/л NaCl, 6,9г/л NaH2PO4 Н2О і 1,85г/л EDTA, рН, доведений до 7,4 шляхом додання NaOH), 0,5% ДСН, 5х реагент Денхардта і 100мкг/мл денатурованої ДНК сперми лосося, з подальшою промивкою в розчині, що містить 0,1х SSPE, 1,0% ДСН, при 42 С, при використанні зонда довжиною приблизно 500 нуклеотидів. Кажуть, що поліпептиди або інші описані тут сполуки є "виділеними", якщо вони присутні в препаратах, які містять принаймні 50мас. % (по сухій масі) сполуки, яка представляє інтерес. Кажуть, що поліпептиди або інші описані тут сполуки є "по суті, чистими", якщо вони присутні в препаратах, які містять принаймні 80мас. % (по сухій масі) сполуки, яка представляє інтерес. Кажуть, що поліпептиди або інші описані тут сполуки є "гомогенними", якщо вони присутні в препаратах, які містять принаймні 95мас. %, а переважно, 99мас. % (по сухій масі) сполуки, яка представляє інтерес. Чистоту вимірюють шляхом електрофорезу в відновлюваному поліакриламідному гелі і інтенсивного фарбування кумасі синім з подальшим моніторингом оптичної густини смуг (тобто, де чистота білка визначається шляхом оптичної денситометрії). Термін "апірогенний" означає "що не містить домішок, які викликають лихоманку, включаючи ендотоксин". Визначення наявності домішок здійснюють за допомогою серії стандартних тестів, дозволених Управлінням по контролем за якістю харчових продуктів, медикаментів і косметичних засобів (США). Використовуваний тут термін "терапевтично ефективна кількість" означає загальну кількість кожного активного компонента, що використовується у відповідній фармацевтичній композиції або 11 у відповідному способі, яка є достатньою для продукування у пацієнта позитивного ефекту лікування і для лікування, попередження або поліпшення відповідного клінічного стану, а також для прискорення продукування у пацієнта позитивного ефекту лікування і для прискорення лікування, попередження або поліпшення такого стану. При застосуванні конкретного активного інгредієнта, що вводиться окремо, цей термін стосується лише одного інгредієнту. При застосуванні комбінації інгредієнтів, цей термін означає комбіновану кількість активних інгредієнтів, яка дає терапевтичний ефект незалежно від того, чи вводяться ці інгредієнти в комбінації послідовно або одночасно. У деяких варіантах даного винаходу можуть бути використані внутрішньосуглобові добавки. Такими добавками є внутрішньосуглобові добавки, які містять сполуки, що не походять від лубрицину, і які використовуються як терапевтичні засоби для лікування суглобів. Так, наприклад, для усунення ОА-асоційованого болю в колінах використовували клінічно прийнятні "добавки, що підвищують в'язкість" з полімерним гіауронаном (НА) і високомолекулярними гіланами (такими як пружнов'язка рідина SYNVISC® "Hylan G-F 20", поширювана фірмою WYETH® Pharmaceuticals). Було показано, що ця підвищуюча в'язкість добавка має високу терапевтичну цінність, особливо для усунення болю в суглобах у пацієнтів, що викликаються навантаженням під дією маси тіла (Wobig et al., 1998). Гілан G-F 20 утворюється при зшитті декількох молекул НА, виділених з гребінців півнів або курей. Добавка, що підвищує в'язкість і містить гілан G-F 20, може бути набагато більш ефективною для ослаблення болю, ніж добавка, що містить НА з більш низькою молекулярною масою (Wobig et al., 1999). Крім того, використання добавки з гіланом G-F20, що підвищує в'язкість і полегшує біль, може виявитися більш переважною при введенні НСПЗЗ тим пацієнтам, які страждають непереносимістю НСПЗЗ (наприклад, пацієнтам з високим ризиком виникнення ускладнень шлунковокишкового захворювання; Espallargues & Pons, 2003). Хоча введення підвищуючої в'язкість добавки з гіланом G-F 20 є безпечною і добре переносимою терапією, яка приводить до короткочасного (тобто, до 3-6 місяців після лікування) ослаблення больових симптомів і поліпшення функції суглобів, однак, така терапія поки не може дати надійну гарантію того, що надалі не буде потрібний протезування коліна у пацієнтів з ОА (Espallargues & Pons, 2003). Приклад 1: Клонування рекомбінантного лубрицину Конструкції. У деяких варіантах винаходу, основна ДНК-конструкція для генерування рекомбінантних молекул лубрицину складається з послідовності, що тягнеться від кодону Met (ATG) до (включно) рестрикційного BssHII-сайту (G^CGCGQ SEQ ID NO:6 (тобто, нуклеотиди 1-1123), і з послідовності, що тягнеться від рестрикційного BspElсайту (T^CCGGA) до (включно) стоп-кодону (ТАА) 91818 12 SEQ ID NO:6 (тобто, нуклеотиди 1269-2946). Ці послідовності, тобто, нуклеотиди 1-1123 і 12692946 SEQ ID NO:6, кодують амінокислоти M1-S373 (екзонами 1-5, що кодуються і приблизно 174 фланкуючими 5'-кодонами екзону 6) і Е848-Р1404 (293, що кодуються приблизно фланкуючими 3'кодонами екзону 6 і екзонами 7-14) природного повнорозмірного лубрицину (тобто, PRG4). Частина екзону 6, видалена з основної ДНК-конструкції, відповідає ДНК-послідовності, що кодує амінокислоти А374-Р847 нативного PRG4 (тобто, приблизно з 940 амінокислот, що кодуються екзоном 6, були видалені 474 амінокислоти). Така відсутня амінокислотна послідовність збагачена КЕРАРТТподібними послідовностями. ДНК-послідовність синтетичного кДНКкластера-1( (SEQ ID NO:1) була додана за допомогою BssHII/BspEI до основної конструкції з отриманням рекомбінантної кДHK-конструкції PRG4-Lub:1 SEQ ID NO:6). Послідовність SEQ ID NО:6 складається з ДНК-вставки Lub:1 (SEQ ID NО:8, яка кодує 51 амінокислоту SEQ ID NО:9 з її чотирма послідовностями КЕРАРТТ), розташованої між ДНК, що кодує амінокислоти M1-S373, і ДНК, що кодує амінокислоти Е848-Р1404 нативного PRG4. Іншими словами, замість А374-Р847 (474 амінокислоти) нативного PRG4, рекомбінантний лубрицин PRG4-LUB:1 включає 51 амінокислоту, які утворюють чотири повнорозмірні послідовності КЕРАРТТ і приблизно три неповних послідовності КЕРАРТТ. ДНК-послідовність синтетичного кДНКкластера-1 (SEQ ID NО:1) була додана за допомогою BsuHII/BspEI до конструкції PRG4-Lub:1 з отриманням кДНК-конструкції "PRG4-Lub:2" (SEQ ID NО:10). кДНК-конструкція PRG4-Lub:1 має один рестрикційний Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG, нуклеотиди №№ 1225-1231 SEQ ID NO:6). При доданні синтетичного кДНК-кластера-2 до кДНК-конструкції PRG4-Lub:1, цей Bsu36I-сайт був зруйнований, однак, синтетичний кластер-2 містить інший внутрішній рестрикційний Bsu36Iсайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 92-98 SEQ ID NO:3). Потім може бути отримана конструкція PRG4-Lub:N+1 шляхом приєднання Bsu36I/BspEI-фрагмент синтетичного кДНКкластера-2 до описаної раніше конструкції PRG4Lub:N в цьому внутрішньому рестрикційному Bsu36I-сайті, який забезпечується синтетичним кДНК-кластером-2. кДНК-кластери синтезували у вигляді одноланцюжкових олігонуклеотидів і гібридизували разом для продукування фрагмента дволанцюжкової ДНК з липкими кінцями. Тому, кінцеві BssHII-, Bsu36I- і BspEI-сайти є неповними. У синтетичному кДНК-кластері-1 (SEQ ID NО:1), послідовність, обмежена залишковими фланкуючими рестрикційними сайтами BssHII-(G^CGCGC) і BspEI(T^CCGGA), включає внутрішній рестрикційний Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG), і ці рестрикційні сайти у вказаних нижче послідовностях підкреслені. 13 91818 14 SEQ ID NО:2, яка утворюється в результаті трансляції послідовності SEQ ID NО:1, включає чотири послідовності КЕРАРТТ, що мають абсолютну відповідність (підкреслені знизу): Аналогічним чином, синтетичний кДНКкластер-2 (SEQ ID NО:3) має залишковий 5'кінцевий рестрикційний Bsu36I-сайт (тобто, CC^TNAGG, представлений тільки послідовністю ТАА), 3'-кінцевий залишковий рестрикційний BspEI-сайт (T^CCGGA) і внутрішній рестрикційний Bsu36I-сайт (CC^TNAGG); ці рестрикційні сайти у вказаних нижче послідовностях підкреслені. SEQ ID NО:4, яка утворюється в результаті трансляції послідовності SEQ ID NО:3, включає три послідовності КЕРАРТТ, що мають абсолютну відповідність (підкреслені знизу): Рекомбінантна кДНК-конструкція PRG4-Lub:1 (SEQ ID NО:6) у векторі pTmed2 (конструкція + вектор складають послідовність SEQ ID NО:5) фланкована рестрикційним Sal1-сайтом (G^TCGAC; нуклеотиди 1027-1032 SEQ ID NО:5) і рестрикційним Notl-сайтом (GC^GGCCGC; нуклеотиди 3984-3991 SEQ ID NО:5). Sal1-сайт вводить модифіковану послідовність ініціації трансляції Козака (СССАСС; нуклеотиди 1032-1037 SEQ ID NО:5) перед кодоном ініціації трансляції ATG (нуклеотиди 1038-1040 SEQ ID NО:5). Між рестрикційним BssHII-сайтом (G^CGCGC; нуклеотиди 21552160 SEQ ID NО:5) і BspEI-сайтом (T^CCGGA; нуклеотиди 2306-2311 SEQ ID NО:5) знаходиться внутрішній клонуючий Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 2262-2268 SEQ ID NО:5). кДНК-конструкція PRG4-Lub:1 (SEQ ID NО:6) транслюється в білок PRG4-LUB:1 (SEQ ID NО:7). Вставка між S373 і Е425 (тобто, Е848 нативного PRG4) цілих білки PRG4-LUB:1 (SEQ ID NО:7) являє собою послідовність SEQ ID NО:9, що складається з 51 амінокислоти. Ця послідовність транслюється з ДНК-вставки Lub:1 (SEQ ID NО:8) і включає чотири повнорозмірних послідовностей КЕРАРТТ. Між рестрикційним BssHII-сайтом (G^CGCGC; нуклеотиди 1118-1123 SEQ ID NО:6) і рестрикційним BspEI-сайтом (T^CCGGA; нуклеотиди 1269-1274 SEQ ID NО:6) знаходиться внутрішній клонуючий Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG: нуклеотиди 1225-1231 SEQ ID NО:6). Як і в рекомбінантній конструкції PRG4-Lub:1 у векторі pTmed2, рекомбінантна кДНК-конструкція PRG4-Lub:2 (SEQ ID NО:10) у векторі pTmed2 фланкована рестрикційним Sail-сайтом (G^TCGAC) і рестрикційним Notl-саитом (GC^GGCCGC), де Sail-сайт вводить модифіковану послідовність ініціації трансляції Козака (СССАСС) перед кодоном ініціації трансляції ATG (нуклеотиди 1-3 SEQ ID NО:10). І аналогічним чином, кожна з рекомбінантних кДНК-конструкцій PRG4-Lub:3 (SEQ ID NО:14), PRG4-Lub:4 (SEQ ID NО:18) і PRG4-Lub:5 (SEQ ID NО:22) у векторі pTmed2 фланкована рестрикційним Sal1-сайтом (G^TCGAC) і рестрикційним Notl-сайтом (GC^GGCCGC), де Sal1-сайт вводить модифіковану послідовність ініціації трансляції Козака (СССАСС) перед кодоном ініціації трансляції ATG (нуклеотиди 1-3 SEQ ID NО:14, 18 і 22, відповідно). У кДНК-конструкції "PRG4-Lub:2", внутрішній клонуючий Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 1318-1324 SEQ ID NО:10) 15 знаходиться між рестрикційним BssHII-сайтом (G^CGCGC; нуклеотиди 1118-1123) і рестрикційним BspEI-сайтом (T^CCGGA; нуклеотиди 13471352). Конструкція PRG4-Lub:2 (SEQ ID NО:10) транслюється в білок PRG4-LUB:2 (SEQ ID NО:11). Вставка між S373 і Е451 (тобто, Е848 нативного PRG4) цілого білка PRG4-LUB:2 (SEQ ID NО:11) являє собою послідовність SEQ ID NО:13, що складається з 77 амінокислот. Ця послідовність транслюється з ДНК-вставки Lub:2 (SEQ ID NО:12). Замість А374-Р847 (474 амінокислоти) нативного PRG4, 77 амінокислот рекомбінантного лубрицину PRG4-LUB:2 утворюють шість повнорозмірних послідовностей КЕРАРТТ і приблизно чотири неповних послідовності КЕРАРТТ. У кДНК-конструкції "PRG4-Lub:3", внутрішній клонуючий Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 1411-1417 SEQ ID NО:14) знаходиться між рестрикційним BssHII-сайтом (G^CGCGC; нуклеотиди 1118-1123) і рестрикційним BspEI-сайтом (T^CCGGA; нуклеотиди 14401445). Конструкція PRG4-Lub:3 (SEQ ID NО:14) транслюється в білок PRG4-LUB:3 (SEQ ID NО:15). Вставка між S373 і Е482 (тобто, Е848 нативного PRG4) цілого білка PRG4-LUB:3 (SEQ ID NО:15) являє собою послідовність SEQ ID NО:17, що складається з 108 амінокислот. Ця послідовність транслюється з ДНК-вставки Lub:3 (SEQ ID NО:16). Замість А374-Р847 (474 амінокислоти) нативного PRG4, 108 амінокислот рекомбінантного лубрицину PRG4-LUB:3 утворюють дев'ять повнорозмірних послідовностей КЕРАРТТ і приблизно п'ять неповних послідовностей КЕРАРТТ. У кДНК-конструкції "PRG4-Lub:4, "внутрішній клонуючий Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 1504-1510 SEQ ID NО:18) знаходиться між рестрикційним BssHII-сайтом (G^CGCGC; нуклеотиди 1118-1123) і рестрикційним BspEI-сайтом (T^CCGGA; нуклеотиди 15331538). Конструкція PRG4-Lub:4 (SEQ ID NО:18) 91818 16 транслюється в білок PRG4-LUB:4 (SEQ ID NО:19). Вставка між S373 і Е513 (тобто, Е848 нативного PRG4) цілого білка PRG4-LUB:4 (SEQ ID NО:19) являє собою послідовність SEQ ID NО:21, що складається з 139 амінокислот. Ця послідовність транслюється з ДНК-вставки Lub:4 (SEQ ID NО:20). Замість А374-Р847 (474 амінокислоти) нативного PRG4, 139 амінокислот рекомбінантного лубрицину PRG4-LUB:4 утворюють дванадцять повнорозмірних послідовностей КЕРАРТТ і приблизно шість неповних послідовностей КЕРАРТТ. У кДНК-конструкції "PRG4-Lub:5, "внутрішній клонуючий Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 1597-1603 SEQ ID NО:22) знаходиться між рестрикційним BssHII-сайтом (G^CGCGC; нуклеотиди 1118-1123) і рестрикційним BspEI-сайтом (T^CCGGA; нуклеотиди 16261631). Конструкція PRG4-Lub:5 (SEQ ID NО:22) транслюється в білок PRG4-LUB:5 (SEQ ID NО:23). Вставка між S373 і Е544 (тобто, Е848 нативного PRG4) цілих білки PRG4-LUB:5 (SEQ ID NО:23) являє собою послідовність SEQ ID NО:25, що складається з 170 амінокислот. Ця послідовність транслюється з ДНК-вставки Lub:5 (SEQ ID NО:24). Замість А374-Р847 (474 амінокислоти) нативного PRG4, 170 амінокислот рекомбінантного лубрицину PRG4-LUB:5 утворюють п'ятнадцять повнорозмірних послідовностей КЕРАРТТ і приблизно сім неповних послідовностей КЕРАРТТ. Важливо зазначити, що процес вбудовування синтетичного кДНК-кластера-2 може повторюватися нескінченно. Кожна ітерація приводить до додання трьох повнорозмірних послідовностей КЕРАРТТ. Рекомбінантні лубрицини PRG4-LUB:6 PRG4-LUB:N конструювали так само як і рекомбінантні лубрицини PRG4-LUB:2 - PRG4-LUB:5, які були сконструйовані вищеописаним способом з використанням послідовностей-вставок. У таблиці 2 в систематизованому вигляді приводяться послідовності BssHII/BspEI-вставка. 17 Хоч авторами була проілюстрована основна ДНК-конструкція з повнорозмірним PRG4, що містить всі 12 екзонів (без центральної частини екзону 6), однак, можуть бути також використані варіанти сплайсингу PRG44 в залежності від бажаної активності і потрібної довжини. Крім того, можуть бути використані і інші рестрикуючі ферменти в аналогічній стратегії, при умові, що вони будуть мати відповідну локалізацію в послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок PRG4. У інших варіантах винаходу, основна ДНК-конструкція не містить нативної послідовності екзону 6, але включає одну або декілька послідовностей від екзону 1 до екзону 5, включно, або послідовностей від екзону 7 до екзону 12, включно, нативного гена PRG4. У інших варіантах винаходу, основна ДНКконструкція ідентична рекомбінантним послідовностям MSF, описаних в US6433142 або US20020137894, за винятком того, що в ній відсутня вся послідовність екзону 6 або її частина. У своєму переважному варіанті, даний винахід стосується кДНК-конструкції, що кодує рекомбінантні лубрицини, які були клоновані в рестрикційний Sal1-сайт (G^TCGAC; нуклеотиди 1027-1032 SEQ ID NО:5) і рестрикційний Notl-сайт (GC^GGCCGC; нуклеотиди 3984-3991 SEQ ID NО:5) в еукаріотичному експресійному векторі pTmed2 (наприклад, 91818 18 рекомбінантна кДНК-конструкція PRG4-Lub:1 (SEQ ID NО:10) в експресійному векторі pTmed2, локалізована в SEQ ID NО:5 в положеннях нуклеотидів 1038-3983). Sal1-сайт вводить перший нуклеотид модифікованої послідовності ініціації трансляції Козака (СССАСС; нуклеотид 1032 SEQ ID NО:5) перед ініціюючим кодоном метіоніну (ATG; нуклеотиди 1038-1040 SEQ ID NО:5). Інші варіанти даного винаходу включають інші комбінації рестрикційних сайтів і інші експресійні вектори. У переважному варіанті винаходу, описаний ітеративний процес передбачає використання синтетичного кДНК-кластера-1 (SEQ ID NО:1) в експресійному векторі pTmed2, який фланкований рестрикційними BssHII-сайтом (G^CGCGC) і рестрикційним BspEI-сайтом (T^CCGGA), і синтетичного кДНК-кластера-1, який включає внутрішній рестрикційний Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 107-113 SEQ ID NО:1). У цьому переважному варіанті, для ітеративного генерування рекомбінантних конструкцій лубрицину, що містять КЕРАРТТ-подібні послідовності, синтетичний кДНК-кластер-2 (SEQ ID NО:3) був вбудований між Bsu36I- і BspEI-сайтами вказаної рекомбінантної конструкції. Синтетичний кДНКкластер-2 (SEQ ID NО:3) фланкований модифікованим залишковим Bsu36I-сайтом (TAAAG) і за 19 91818 лишковим BspEI-сайтом (ACTCCGG). Він також включає внутрішній Bsu36I-сайт (CC^TNAGG, тобто, CC^TAAGG; нуклеотиди 92-98 SEQ ID NО:3). Після клонування синтетичного кДНК-кластера-2 в Bsu36I- і BspEI-сайти рекомбінантної конструкції лубрицину, клонуючий Bsu36I-сайт вихідної конструкції руйнувався, в результаті чого залишався один унікальний клонуючий Bsu36I-caйт в новій конструкції. У цьому переважному варіанті винаходу, амінокислотна послідовність, "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTP KEPAPTTTK" (SEQ ID NO:26; 45 амінокислот) зберігає частину кожного з білків PRG4-LUB:N (де N=цілому числу 1 або більше). Крім того, амінокислотна послідовність "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NО:27; 31 амінокислота) кодується ДНКвставкою, яка стає частиною кожної з кДНКконструкцій PRG4-LUB:N+1 в результаті приєднання синтетичного Bsu36I/BspEI-кДНК-кластер-2 до кДНК-конструкції PRG4-LUB:N. Що стосується білка PRG4-LUB:N, де N дорівнює цілому числу 3, то в переважних варіантах винаходу, амінокислотна послідовність "EPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NО:28; 22 амінокислоти), з'єднує SEQ ID NО:26 з повторами (N-2) SEQ ID NО:27. Крім того, в переважних варіантах винаходу, за амінокислотною послідовністю "КЕРКРАРТТР" (SEQ ID NО:29, 10 амінокислот) безпосередньо йде остання повторювана вставка SEQ ID NО:27 білка PRG4-LUB:N, де N 2. Оскільки вони утворюють принаймні дві послідовності КЕРАРТТ, то кожна з описаних тут послі 20 довностей SEQ ID NО:26, SEQ ID NО:27 і SEQ ID NО:28 являють собою "повторювану КЕРАРТТподібну послідовність" (N-кінець SEQ ID NО:28 пов'язаний із залишком К, внаслідок чого SEQ ID N0:28 утворює дві послідовності КЕРАРТТ в білках PRG4-LUB:N). Тому, в переважному варіанті даного винаходу, рекомбінантний білок лубрицину PRG4-LUB:N (де N дорівнює цілому числу 1 або більше) включає SEQ ID NО:26. Крім того, в переважному варіанті даного винаходу, рекомбінантний білок лубрицину PRG4-LUB:N (де N дорівнює цілому числу 2 або більше) також включає SEQ ID NО:27. У цих переважних варіантах, в кожному з білків PRG4LUB:N, послідовність SEQ ID NО:27 повторюється N-1 разів. У PRG4-LUB:2, SEQ ID NО:26 і SEQ ID NО:27 перекриваються (тобто, вони мають загальну послідовність КЕРАРТТ). У інших переважних варіантах винаходу, де N дорівнює цілому числу 3 (наприклад, де N дорівнює цілому числу 3-200, або, в більш переважних варіантах, де N дорівнює цілому числу 5-50, або, в ще більш переважних варіантах, де N дорівнює цілому числу 10-30), рекомбінантний білок лубрицин містить послідовність SEQ ID NО:28, що складається з 22 амінокислот і з'єднує N-кінцевих 45 амінокислот SEQ ID NО:26 з повтором(ами) (N-2) SEQ ID NО:27, що складається(ються) з 31 амінокислоти, де 10 амінокислот SEQ ID NО:29 знаходяться з боку С-кінця по відношенню до останнього повтору SEQ ID NО:27, що складається з 31 амінокислоти. Таблиця 3 Частота зустрічальності послідовностей в переважних білках PRG4-LUB Білок PRG4-Lub -LUB:1 -LUB:2 -LUB:3 -LUB:4 -LUB:5 -LUB:N SEQ ID NО:26, N-кінцева вставка 1 1 1 1 1 1 SEQ ID NО:28 0 0 1 1 1 1 У переважних варіантах здійснення винаходу, білки PRG4-LUB:N, в основному, мають 3 N повторів послідовності КЕРАРТТ, де N дорівнює числу повторюваних КЕРАРТТ-подібних послідовностей. Рекомбінантний лубрицин PRG4-LUB:5 (який має 3 N=3 5=15 копій послідовності КЕРАРТТ в переважних варіантах винаходу) є найбільшим рекомбінантним лубрицином PRG4-LUB:N, послідовність якого детально описана в даний заявці. Однак, в рекомбінантному лубрицині даного винаходу, N може складати більше 5, наприклад, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200 або більше. Зокрема, білки PRG4-LUB:1, PRG4-LUB:2, PRG4-LUB:3, PRG4-LUB:4 і PRG4-LUB:5, які мають 4, 6, 9, 12 і 15 повнорозмірних послідовностей КЕ SEQ ID NО:27 0 1 1 2 3 N-2 SEQ ID NО:29 С-кінцева вставка 0 1 1 1 1 1 Повтори KEPAPTT 4 6 9 12 15 3 N РАРТТ, відповідно, детально описані в даний заявці. Однак, може бути приєднане і більше число послідовностей КЕРАРТТ шляхом проведення додаткових описаних тут ітеративних процедур вбудовування Lub:N. Авторами даної заявки представлений докладний опис рекомбінантних лубрицинів PRG4-LUB:N з відносно невеликим числом послідовностей КЕРАРТТ або КЕРАРТТ-подібних послідовностей в порівнянні з нативним білком РІЮ4/лубрицином, оскільки більш дрібні білки легше синтезувати і модифікувати. Може також виявитися бажаним збільшення числа КЕРАРТТ-подібних послідовностей в порівнянні з нативним білком PRG4. Це може бути здійснене або шляхом проведення додаткових описаних тут ітеративних процедур вбудовування Lub:N, 21 так, щоб в рекомбінантному білку лубрицині PRG4LUB:N було присутнім більше ніж 78 КЕРАРТТподібних послідовностей, або це може бути здійснене шляхом використання інтактної кДНК PRG4, замість кДНК PRG4 з делетованим екзоном 6, або варіанту кДНК PRG4 зі зрізаним екзоном 6. Таким чином, будь-яка з доданих КЕРАРТТ-подібних послідовностей може бути присутньою в надмірній кількості, що перевищує кількість, яка виявляється в нативном білці PRG4. Процедури вбудовування вставки, здійснювані для генерування більш великих рекомбінантних білків лубрицину з інтактною кДНК PRG4, а також процедури вбудовування вставки, що передбачають використання варіанту кДНК PRG4 з делетованим екзоном 6 або варіанту кДНК PRG4 зі зрізаним екзоном 6, також входять в об'єм даного винаходу. Приклад 2: Експресія і очищення білка "LUB" кДНК-конструкцію PRG4-Lub:1 (SEQ ID NО:6, що містить послідовність синтетичного кДНКкластера 1) експресували в стабільно трансфікованій і заздалегідь адаптованій клітинній лінії СНО DUKX, потім виділяли з кондиціонованого середовища, і солюбілізували в PBS, що містить 500мМ гідрохлориду L-аргініну, як описано нижче. кДНК-конструкцію PRG4-Lub:1 експресували в стабільно трансфікованій клітинній лінії СНО DUKX, і кондиціоноване середовище збирали. Потім дволітровий об'єм цього кондиціонованого середовища концентрували шляхом фільтрації в стиснутому газоподібному азоті (40фунт/кв.дюйм) з використанням фільтра AMICON® M2000™, оснащеного дисковою мембраною PALL FILTRON® OMEGA™ з відсічкою номінальної молекулярної маси (NMWL) або 10кДа, або 30кДа, або 100кДа. Середовище концентрували до об'єму приблизно 100мл, а потім його відсмоктували з дискової мембрани. Після цього, дискову мембрану видаляли з фільтра AMICON® M2000™. "Слизеподібний" ретентат, який акумулювався на поверхні дискової мембрани, збирали за допомогою скребачки для зскрібка клітин і переносили в мікроцентрифугальні пробірки. Зразки в мікроцентрифугальних пробірках центрифугували приблизно при 12000 g протягом 10 хвилин, і водний супернатант видаляли. "Багатий лубрицином" осад розчиняли в забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS), що містить 500мМ гідрохлориду L-аргініну. Концентрація гідрохлориду Lаргініну може складати в межах від 100мМ до 2,0М. Відповідно до вищезгаданої процедури, глікопротеїни PRG4-LUB:2 - PRG4-LUB:5 (і білки PRG4LUB:N, де N=ненегативне ціле число 6 або більше, а також інші глікопротеїни, що містять КЕРАРТТподібні послідовності) збирали безпосередньо з дискових мембран, тобто, без очищення концентрату, що знаходиться зверху дискових мембран. Тобто, ці рекомбінантні глікопротеїни лубрицину виділяли безпосередньо з дискових мембран фільтра PALL FILTRON® OMEGA™ з NMWL=10кДа, 30кДа або 100кДа. У деяких випадках, такі глікопротеїни можуть бути також очищені від концентрату, що знаходиться зверху дискових мембран, хроматографічними методами або електрофоре 91818 22 тичними методами, або обома методами. Рекомбінантні білки і глікопротеїни лубрицину можуть бути також очищені за допомогою хроматографії і іншими відомими методами [наприклад, описаними в US6433142 для білків MSF; див. також Deutscher, 1990 & Scopes, 1994]. Приклад 3: Імуногістохімія Клітинне джерело лубрицину в нормальних суглобах і в суглобах, уражених остеоартритом, додатково досліджували імуногістохімічними методами. Крім того, оцінку на присутність лубрицину на інших поверхнях тканини, включаючи плевру, перикардій, очеревину і оболонки головного мозку, проводили нижченаведеними методами. Хрящ і синовіальну рідину у пацієнтів з остеоартритом брали з їх інформованої згоди при проведенні хірургічної операції по протезуванню коліна. Іншими проаналізованими тканинами були нормальна синовіальна рідина людини і нормальні синовіальна рідина, хрящ, плевра, перикард, очеревина, оболонки головного мозку, головний мозок, сухожилля і зв'язки нормального примату, що не стосується людини (NHP), а також нормальні і уражені остеоартритом меніск, хрящ, синовіальна рідина, зв'язки і сухожилля собак. Отримані тканини фіксували в 4% параформальдегіді відразу після збору або після 24-годинного інкубування в середовищі з доданим монензином (5кМ) і без нього. Для проведення імуногістохімічних досліджень, тканини фіксували в 4% параформальдегіді протягом 24 годин і отримували 6-8-мікронні парафінові зрізи. Субсерію тканин заморожували в сполуці, що використовується для заморозки, з метою проведення оптичної когерентної томографії (ОСТ) і розрізали через інтервали 5-10 мікрон, а потім фіксували ацетоном. Імуногістохімічні і імунофлуоресцентні аналізи проводили з використанням очищеного поліклонального кролячого антитіла проти людського лубрицину (Аb 06А10), генерованого шляхом імунізації зрізаною формою рекомбінантного лубрицину і його очищення на колонці з білком А. Антитіло проти CD 16 (NEOMARKERS®, Fremont CA) використовували для ідентифікації макрофагів (рецептор III Fcy). Антитіло проти CD106/VCAM-1 (NEOMARKERS®) використовували для мічення фібробластів в кріостатних зрізах. Потім, для контрольних зрізів використовували еквівалентні концентрації RIgG (VECTOR LABS™, CA), MIgGI (DAKO®) і MIgG2a (DAKO®). Для візуалізації зв'язування з антитілом застосовували технологію з використанням декстранової системи (ENVISOION+™; DAKO®), і зрізи піддавали контрастному фарбуванню галунами-гематоксабоном Мейєра. Імунофлуоресценцію здійснювали з використанням вищезгаданих "перших" антитіл і зондували "другими" антитілами (Alexa Dyes MOLECULAR PROBESTM, Oregon), а саме, козячим антикролячим антитілом Alexa dye при 546нм і козячим антимишачим антитілом Alexa dye при 488нм. Флуоресцентне зв'язування з антитілом детектували на флуоресцентному мікроскопі NIKON®. Лубрицин детектували по всій поверхні нормальних і уражених остеоартритом суглобового 23 хряща і синовіальної рідини людини. Фібрильована поверхня, уражена остеоартритом, була повністю покрита товстим шаром лубрицину. Імунофлуоресценція CD 106 виявляла сильне фарбування клітинних мембран внутрішніх фібробластів синовіальної рідини; при цьому, білок лубрицин також візуалізували по фарбуванню в синовіальних клітинах. Подвійне імунофарбування на CD106+лубрицин явно вказувало на їх спільну локалізацію у внутрішніх фібробластах синовіальної рідини. Фарбування синовіальних макрофагів на CD 16 продемонструвало присутність цих клітин у всіх шарах синовіальної рідини, але не виявило спільної локалізації з лубрицином. Фарбування суглобових тканин приматів (NHP) і собак (нормальних і уражених ОА) антитілом проти лубрицину виявляло лубрицин, що покриває поверхневий шар синовіальної рідини, хряща, меніска і сухожилля. Хрящ здорових приматів (NHP) також виявляв сильну імунореактивність не тільки в клітинах поверхневої зони, але також і в клітинах перехідної зони без додання монензину, здійснюваного для збільшення запасу внутрішньоклітинного глікопротеїну. Клітини, що вистилають очеревину, перикард і плевру, також виявляли експресію лубрицину, однак, в оболонці головного мозку або в головному мозку, не спостерігалося. У цілому, нормальні і уражені остеоратритом синовіальна рідина, сухожилля, меніск і хрящ були покриті значним шаром лубрицину. На тканинах в суглобах, уражених ОА, явно виявлялася присутність глікопротеїну. Подвійне імунофлуоресцентне фарбування синовіальної рідини людини, яка страждає остеоартритом (ОА), продемонструвало, що внутрішні фібробластні синовіоцити відповідальні за синтез лубрицину. Локалізація білка лубрицину поза суглобовою тканиною не була описана раніше. Присутність поверхневого шару лубрицину була явно продемонстрована на плеврі легень, перикарду і в очеревині. Вважається, що лубрицин володіє змащувальною функцією всередині синовіального суглоба, але він може також виконувати і безліч інших функцій, включаючи, але не обмежуючись ними, змащувальну і антиадгезивну функцію в інших тканинах. Поповнення цих інших тканин лубрицином являє собою біотерапію, яка входить в об'єм даного винаходу. Приклад 4: Рекомбінантний лубрицин, що використовується як механічна змазка У загальних рисах, рекомбінантний лубрицин може бути використаний як змазка, наприклад, разом з ущільнюючим матеріалом і носієм і т. п. Так, наприклад, в патенті США 3973781, озаглавленому "Self-lubricating seal", в патенті США 4491331, озаглавленому "Grooved mechanical face seal", в патенті США 4560174, озаглавленому "Multi lip seal", і в патенті США 4973068, озаглавленому "Differential surface roughness dynamic seals and bearings", в кожному з яких описані ущільнювачі різних конструкцій. Рекомбінантний лубрицин може бути використаний як змазка з вказаними носіями. Зокрема, рекомбінантний лубрицин може бути використаний як змазка для медичних інструмен 91818 24 тів, протезів і імплантатів, особливо, коли потрібна біосумісна змазка. Крім того, він може бути використаний не тільки в медичних цілях, а також для запобігання негативному впливу навколишнього середовища, тобто, в тому випадку, коли може бути потрібна біологічно сумісна змазка. Приклад 5: Композиції, що містять рекомбінантний лубрицин Рекомбінантний лубрицин даного винаходу може бути використаний в фармацевтичній композиції в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм. Така композиція може також містити (крім білка і носія) розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, стабілізатори, солюбілізатори і інші матеріали, добре відомі фахівцям. Термін "фармацевтично прийнятний" стосується нетоксичного матеріалу, який не надає впливу на ефективність біологічної активності активного(их) інгредієнта(ів). Властивості носія будуть залежати від способу введення. Фармацевтична композиція даного винаходу може також містити цитокіни, лімфокіни або інші гемопоетичні фактори, такі як M-CSF, GMCSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, тромбопоетин, фактори стовбурових клітин і еритропоетин. Фармацевтична композиція може також містити і інші агенти, які є або підсилювачами активності білка або активності його комплементу, або терапевтичними агентами. Такі додаткові фактори і/або агенти можуть бути включені в фармацевтичну композицію для продукування синергічного ефекту з білком даного винаходу або для мінімізації побічних ефектів. І навпаки, білки даного винаходу можуть бути включені в композиції, що містять конкретний цитокін, лімфокін, інший гемопоетичний фактор, тромболітичний або антитромботичний фактор, або протизапалювального засобу для мінімізації побічних ефектів. Особливо переважним є використання рекомбінантного білка лубрицину для введення всередину суглоба в комбінації з раніше описаним полімерним гіалуронаном (НА) і планами з більш високою молекулярною масою. Іншими переважними комбінаціями для їх використання як внутрішньосуглобових добавок є комбінації рекомбінантного білка лубрицину з анестетиками (наприклад, лідокаїном), зі стероїдами (наприклад, гексацетонідом триамцинолону) або з радіоізотоп (наприклад, з ітрієм). Іншими переважними комбінаціями для їх використання як внутрішньосуглобових добавок можуть бути аутологічні або гетерологічні клітинні препарати (наприклад, що складаються з культивованих хондроцитів, синовіоцитів або стовбурових клітин, незалежно від того, чи є вони аутологічними або гетерологічними). Рекомбінантний лубрицин даного винаходу може бути активним в мультимерах (наприклад, гетеродимерах або гомодимерах) або комплексах з самим собою або з іншими білками. Отже, фармацевтична композиція даного винаходу може містити білок даного винаходу у вказаній мультимерній або в комплексній формі. Фармацевтична композиція даного винаходу може бути отримана в формі комплексу рекомбі 25 нантного(их) білка(ів) лубрицину даного винаходу разом з білковими або пептидними антигенами. Білковий і/або пептидний антиген може передавати стимулюючий сигнал В- і Т-лімфоцитам. Влімфоцити будуть відповідати на антиген завдяки присутності на їх поверхні імуноглобулинового рецептора. Т-лімфоцити будуть відповідати на антиген завдяки присутності Т-клітинного рецептора (TCR) після презентації антигену білками МНС. МНС і структурно споріднені білки, включаючи білки, що кодуються генами МНС класу І і класу II на клітинах-хазяях, будуть служити для презентації пептидного(их) антигенна(ів) Т-лімфоцитам. Антигенні компоненти можуть також постачатися як очищені комплекси МНС-пептид окремо або разом з ко-стимулюючими молекулами, які можуть передавати сигнал безпосередньо Т-клітинам. Альтернативно, антитіла, здатні зв'язуватися з поверхневим імуноглобуліном і з іншими молекулами на В-клітинах, а також дані антитіла, здатні зв'язуватися з TCR і іншими молекулами на Тклітинах, можуть бути об'єднані з фармацевтичною композицією даного винаходу. Фармацевтична композиція даного винаходу може бути отримана в формі ліпосоми, в якій білок даного винаходу об'єднаний, крім інших фармацевтично прийнятних носіїв, з амфіпатичними агентами, такими як ліпіди, які існують в агрегованій формі, такій як міцели, нерозчинні моношари, рідкі кристали або ламелярні шари у водному розчині. Прийнятними ліпідами для ліпосомної композиції є, але не обмежуються ними, моногліцериди, дигліцериди, сульфатиди, лізолецитин, фосфоліпіди, сапонін, жовчні кислоти і т. п. Отримання таких ліпосомних композицій може бути здійснене будьяким фахівцем і описане в патентах США №№ 4235871, 4501728, 4837028 і 4737323. При здійсненні способу лікування або іншого застосування відповідно до даного винаходу, терапевтично ефективну кількість білка даного винаходу вводять індивідууму (наприклад, ссавцеві), страждаючому даним станом. Білок даного винаходу може бути введений відповідно до способу даного винаходу або окремо, або в комбінації з іншими агентами, що застосовуються в інших способах лікування, що передбачають використання цитокінів, лімфокінів, інших гемопоетичних факторів або клітинних добавок. У разі спільного введення з одним або декількома цитокінами, лімфокінами, іншими гемопоетичними факторами або клітинними добавками, білок даного винаходу вводять або одночасно з вказаними цитокінами, лімфокінами, іншими гемопоетичними факторами, тромболітичними або антитромботичними факторами або клітинними добавками, або послідовно. При послідовному введенні, відповідну схему введення білка даного винаходу в комбінації з вказаними цитокінами, лімфокінами, іншими гемопоетичними факторами, тромболітичними або антитромботичними факторами або клітинними добавками може призначити лікуючий лікар. Введення білка даного винаходу, що використовується в фармацевтичній композиції або для реалізації способу даного винаходу, може бути здійснене різними шляхами, наприклад, шляхом 91818 26 черезшкірної, підшкірної, внутрішньочеревинної, парентеральної або внутрішньовенної ін'єкції, або, в деяких випадках, шляхом перорального введення, інгаляції або місцевого застосування. При цьому, переважним введенням звичайно є ін'єкція в суглобову тканину пацієнта (Schumacher, 2003). При пероральному введенні терапевтично ефективної кількості білка даного винаходу, цей білок може бути приготований в формі таблетки, капсули, порошку розчину або еліксиру. При введенні в формі таблетки, фармацевтична композиція даного винаходу може додатково містити твердий носій, такий як желатин або ад'ювант. Таблетки, капсула і порошок містять приблизно 595%, а переважно, приблизно 25-95% білки даного винаходу. При введенні в рідкій формі, в рідкий носій, такий як вода, можуть бути додані вазелінове масло, жир тварини або рослинного походження, такі як арахісова олія, мінеральне масло, соєва олія або кунжутна олія, або синтетичне масло. Фармацевтична композиція в рідкій формі може також містити фізіологічний розчин, розчин декстрози або розчини інших сахаридів, або гліколи, такий як етиленгліколь, пропіленгліколь або поліетиленгліколь. При введенні в рідкій формі, фармацевтична композиція містить приблизно від 0,5 до 90% мас. % даного винаходу, а переважно, приблизно від 1 до 50% білка даного винаходу. Якщо терапевтично ефективну кількість білка даного винаходу вводять шляхом внутрішньовенної, черезшкірної або підшкірної ін'єкції, білок даного винаходу може бути приготований в формі апірогенного, парентерально прийнятного водного розчину. Такі парентерально прийнятні розчини білка, що мають відповідні рН, ізотонічність, стабільність і т. п., можуть бути отримані кожним фахівцем. Переважна фармацевтична композиція для внутрішньовенної, черезшкірної або підшкірної ін'єкції, крім білка даного винаходу, може містити ізотонічний носій для ін'єкцій, такий як ін'єкційний розчин хлориду натрію, ін'єкційний розчин Рінгера, ін'єкційний розчин декстрози, ін'єкційний розчин декстрози і хлориду натрію, лактатвмісний ін'єкційний розчин Рінгера або інший носій, відомий фахівцям. Фармацевтична композиція даного винаходу може також містити стабілізатори, консерванти, буфери, антиоксиданти або інші добавки, відомі фахівцям. Так, наприклад, даний винахід також передбачає введення ін'єкції в поєднанні або в комбінації з лідокаїном або з іншими місцевими анестетиками, стероїдами або адренокортикоїдами, НА і/або планами, або з радіоізотопами. Кількість білка даного винаходу в фармацевтичній композиції даного винаходу залежить від природи і тяжкості стану, що піддається лікуванню, і від типу лікування, яке даний пацієнт проходив раніше. Зрештою, кількість білка даного винаходу, яка потрібна для введення кожному конкретному пацієнту, призначається лікуючим лікарем. Спочатку, лікуючий лікар призначає низькі дози білка даного винаходу і спостерігає реакцію у відповідь у пацієнта. Потім доза білка даного винаходу може бути збільшена аж до досягнення оптимального терапевтичного ефекту у пацієнта, і з цього моменту дозу більше не збільшують. При цьому, вважа 27 ється, що різні фармацевтичні композиції, що використовуються для здійснення способу даного винаходу, повинні містити приблизно від 0,01мкг до 100мг (переважно, приблизно від 0,1мкг до 10мг, а більш переважно, приблизно від 0,1мкг до 1мг) білка даного винаходу на один кг масу тіла в залежності від способу введення і призначеної терапевтичної схеми лікування. При внутрішньовенному введенні, тривалість внутрішньовенної терапії з використанням фармацевтичної композиції, що містить рекомбінантний лубрицин даного винаходу, може варіюватися в залежності від тяжкості захворювання, що піддається лікуванню, а також від стану і від потенційної ідіосинкратичного відповіді кожного окремого пацієнта. При цьому, вважається, що тривалість кожної процедури по введенню білка даного винаходу може складати близько 12-24 годин безперервного внутрішньовенного введення. Зрештою, тривалість внутрішньовенної терапії з використанням фармацевтичної композиції даного винаходу, визначається лікуючим лікарем. Що стосується композицій даного винаходу, які можуть бути використані для лікування уражень кісток, хряща, сухожиль або зв'язок, то застосовуваний терапевтичний спосіб передбачає місцеве, системне або локальне введення даної композиції у вигляді імплантату або пристрою. Абсолютно очевидно, що терапевтична композиція, що вводиться, яка використовується з метою даного винаходу, повинна бути апірогенною і фармацевтично прийнятною. Крім того, може виявитися бажаним, щоб дана композиція була отримана в інкапсульованій або ін'єктованій в'язкій формі для доставки в уражену ділянку кістки, хряща або тканини. Для загоєння ран і репарації тканини може виявитися відповідним місцеве застосування композиції. У способах даного винаходу, в композицію, описану вище, альтернативно або додатково можливо, також, але необов'язково, включені терапевтично ефективні агенти, які можуть бути введені, одночасно або послідовно разом з композицією, що містить рекомбінантний білок лубрицин даного винаходу. Переважно, щоб вказана композиція включала матрицю, яка була б здатна доставляти білоквмісну композицію на уражену ділянку кістки і/або хряща, і була б здатна створювати структуру для розвитку кістки і хряща, а також могла б оптимально поглинатися організмом пацієнта. Такі матриці можуть бути отримані з матеріалів, що застосовуються в цей час для інших клінічних процедур по імплантації. При використанні матриці, вибір матеріалу для матриці повинен бути здійснений виходячи їх біологічної сумісності, біологічного розкладання, механічних властивостей, косметичних властивостей і міжфазних властивостей. Конкретне застосування даних композицій буде визначати відповідний склад препарату. Потенційними матрицями для даних композицій можуть бути матеріали певної хімічної структури, що біологічно розкладаються, такі як сульфат кальцію, трикальційфосфат, гідроксіапатит, полімолочна кислота, полігліколева кислота і поліангідриди. Іншими потенційними матеріалами є біологічно і добре відомі біологічні 91818 28 сполуки, що розкладаються, такі як колаген кісток або шкіри. Інші матриці складаються з чистих білків або компонентів позаклітинного матрикса. Іншими відповідними матрицями є матеріали певної хімічної структури, що біологічно не розкладаються, такі як агрегований гідроксіапатит, біологічне скло, алюмінати або інші керамічні сполуки. Матриці можуть складатися з комбінації матеріалів будь-якого з вищезгаданих типів, таких як поліакрилова кислота і гідроксіапатит або колаген і трикальційфосфат. Біокерамічні матеріали можуть бути модифіковані по своєму складу, наприклад, по співвідношенню кальцію-алюмінату-фосфату, і ці матеріали можуть бути відповідним чином оброблені для зміни розміру пор, розміру частинок, форми частинок і біологічного розкладання. У інших композиціях, білки даного винаходу можуть бути об'єднані з іншими терапевтично ефективними агентами, що використовується для лікування пошкодження і ран кісток і/або хряща або потрібних тканин. Такими агентами є різні фактори росту, такі як епідермальний фактор росту (EGF), тромбоцитарний фактор росту (PDGF), трансформуючі фактори росту (TGF- і TGF- ) і інсуліноподібний фактор росту (IGF). Терапевтичні композиції можуть також з успіхом застосовуватися у ветеринарії. Крім людини, особливо прийнятними суб'єктами або пацієнтами для лікування рекомбінантними білками лубрицину даного винаходу є, зокрема, домашні тваринні, такі як кішки і собаки, лабораторні тварини, такі як миші і щури, а також коні. Схема введення доз білоквмісної фармацевтичної композиції, що використовується для регенерації тканини, може бути визначена лікуючим лікарем з урахуванням різних факторів, які модифікують дію білків, наприклад, таких як кількість, необхідна для утворення тканинної маси, ділянка ушкодження, стан ураженої тканини, розмір рани, тип ураженої тканини (наприклад, хряща або сухожилля), вік, стать і режим харчування пацієнта, тяжкість інфекції, якщо вона є, час введення і інші клінічні фактори. Доза може варіюватися в залежності від типу матриці, що використовується для відновлення тканини, і від включення в фармацевтичну композицію інших білків. Так, наприклад, ефект від введення дози може бути також досягнутий шляхом додання в кінцеву композицію інших відомих факторів росту, таких як IGF-1 (інсуліноподібний фактор росту І). Моніторинг позитивного ефекту лікування може бути здійснений шляхом періодичної оцінки утворення/або репарації тканини/кістки, наприклад, шляхом рентгенівського аналізу, гістоморфометричного аналізу і мічення тетрацикліном. Полінуклеотиди даного винаходу можуть бути також використані для генної терапії. Такі полінуклеотиди або можуть бути введені in vivo, або ex vivo в клітини для експресії у індивідуума (наприклад, у ссавця). Полінуклеотиди даного винаходу можуть бути також введені іншими відомими методами, що використовуються для введення нуклеїнових кислот в клітину або в організм (включаючи, але не обмежуючись ними, нуклеїнові 29 кислоти в формі вірусних векторів або "оголеної" ДНК). Клітини можуть бути також культивовані ex vivo в присутності нуклеїнових кислот або білків даного винаходу для проліферації або для досягнення потрібного впливу на активність або продукування потрібної активності в таких клітинах. Оброблені клітини можуть бути потім введені in vivo в терапевтичних цілях. Приклад 6: Антитіла проти лубрицину Рекомбінантний білок лубрицину даного винаходу може бути також використаний з метою імунізації тварин для вироблення у них поліклональних і моноклональних антитіл, які специфічно реагують з білками, або, в деяких варіантах винаходу, з їх природними аналогами. Такі антитіла можуть бути отримані з використанням будь-якого повнорозмірного рекомбінантного білка лубрицину або його фрагментів як імуногену. Пептидні імуногени можуть, крім того, містити цистеїновий залишок біля карбокси-кінця і можуть бути кон'юговані з гаптеном, таким як гемоціанін лімфи равлика (KLH). Методи синтезу таких пептидів відомі фахівцям (наприклад, методи, описані Merrifield, 1963 і Krstenansky et al., 1987). Моноклональні антитіла, що зв'язуються з рекомбінантним білком лубрицину даного винаходу, можуть бути цінними діагностичними агентами для імунодетекції споріднених білків. Нейтралізуючі моноклональні антитіла, що зв'язуються з цими спорідненими білками, можуть бути також цінними терапевтичними агентами для лікування асоційованих з лубрицином станів, або, в деяких випадках, для лікування деяких форм раку, де може спостерігатися аномальна експресія лубрицину (наприклад, в синовіомах). Крім антитіл, направлених проти поліпептидної корової частини рекомбінантного білка лубрицину, може виявитися бажаним використання антитіла, направленого проти цукрової частини або глікопротеїнового комплексу рекомбінантного білка лубрицину. Для генерування антитіл, які зв'язуються з глікозаборованим рекомбінантним лубрицином, переважним імуногеном (але не з лубрицином в неглікозаборованій формі) є глікопептид, амінокислотна послідовність якого охоплює високоглікозаборовану частину рекомбінантного лубрицину, наприклад, повторювану КЕРАРТТ-подібну послідовність. Як імуногени також використовуються більш короткі поліпептиди, наприклад, довжиною в 8-15 амінокислот, в тій же самій високоглікозаборованій області. Методи генерування антитіл проти високоглікозаборованих біомолекул відомі фахівцям [наприклад, як описано Schneerson et al., 1980]. Приклад 7: Доставка рекомбінантного лубрицину Для доставки рекомбінантного лубрицину застосовуються стандартні методи. Для внутрішньосуглобового введення, рекомбінантний лубрицин доставляють в синовіальную порожнину при концентрації 20-500мкг/мл в об'ємі приблизно 0,1-2мл на ін'єкцію. Так, наприклад, 1мл рекомбінантного лубрицину в концентрації 200-300мкг/мл ін'єктують в колінний суглоб за допомогою тонкої голки (наприклад, калібром 14-30, а переважно, 18-26). 91818 30 Композиції даного винаходу можуть бути також використані для парентерального введення, такого як внутрішньовенне, підшкірне, внутрішньом'язове або внутрішньочеревинне введення, а в переважних варіантах винаходу, вони можуть бути використані для нанесення на поверхню очеревини, перикарду або плеври. Правильне положення голки є вирішальним фактором для ефективної доставки рекомбінантного білка лубрицину шляхом ін'єкції, здійснюваної для лікування суглобів (Schumacher, 2003). Правильне положення голки може бути здійснене завдяки застосуванню ультразвукової технології. Успішна ін'єкція частіше за все досягається після успішної аспірації рідини. Передбачається, що найбільш надійний доступ в простір колінного суглоба може бути досягнутий шляхом супралатеральної ін'єкції в наднадколінкову сумку. Крім введення рекомбінантного лубрицину, в синовіальну порожнину, шляхом внутрішньосуглобової ін'єкції, можуть бути введені нуклеїнові кислоти, що кодують рекомбінантний лубрицин (наприклад, при застосуванні генної терапії). Для попередження утворення хірургічних спайок, описані тут рекомбінантні лубрицини вводять в формі гелю, піни, волокна або тканин. Рекомбінантний лубрицин, приготований таким способом, наносять на уражені або оголені тканини або на межі розділу уражених або оголених тканин для попередження утворення спайок між протилежними поверхнями. Для більшої ефективності, на цій ділянці повинні залишатися гель або плівка, які будуть запобігати контактам між тканинами протягом тривалого періоду часу, достатнього для того, щоб тканини, при остаточному диспергуванні гелю і його контактуванні з цими тканинами, більше не проривалися одна до одної. Препарат рекомбінантного лубрицину, отриманий в цілях інгібування або запобігання утворенню спайок (наприклад, отриманий в формі мембрани, текстильного матеріалу, піни або гелю), був проаналізований на його здатність запобігати виникненню спайок у щурівмоделей після хірургічної операції по видаленню спайок кишки (Goldberg et al., 1993). Композиції наносили щурам на ділянку в області хірургічного видалення сліпої кишки і порівнювали з необробленим контролем (тобто, з тваринами, яким була видалена сліпа кишка, але які не отримували якого-небудь лікування). Зниження міри утворення спайок у щурячої моделі в присутності композиції рекомбінантного лубрицину в порівнянні з утворенням спайок за відсутності такої композиції вказувало на те, що дана композиція є клінічно ефективною для зменшення утворення спайок між тканинами. Однак, якщо утворення спайок між тканинами (наприклад, при загоєнні хрящових тріщин) є бажаним, то в цьому випадку не треба використовувати рекомбінантний лубрицин. Змазка хрящових поверхонь запобігає зрощуванню хрящів один з одним (Schaefer et al, 2004). Рекомбінантні лубрицини також використовували для покриття штучних кінцівок і суглобів перед їх імплантацією ссавцеві. Так, наприклад, ці протези можуть бути навантажені або залиті в розчин рекомбінантного лубрицину, наприклад, ме 31 тодами, описаними в патентах США №№ 57009020 або 5702456. Однак, при використанні in vivo рекомбінантного лубрицину для забезпечення змазки в області протеза повинні дотримуватися запобіжні засоби. Повідомлялося, що помітне підвищення рівня експресії гена PRG4 (тобто, експресії гена MSF) асоціюється з розхитуванням протеза, при цьому, лубрицин може порушувати тісну взаємодію між кістками і протезом, і тим самим, сприяти розхитуванню протеза (Morawirtz et al., 2003). Приклад 8: Модель з ОА Для оцінки ефективності внутрішньосуглобового введення препаратів лубрицину отримувала мишачу модель з остеоартритом/ерозією хряща. Для хірургічного індукування остеоартриту, мишей анестезували 250мг/кг шляхом внутрішньочеревинного введення триброметанолу (SIGMA® Chemical), і коліна готували для проведення хірургічної процедури в умовах асептики. Потім робили подовжній розріз, медіальний по відношенню до зв'язки надколінка, суглобову капсулу розкривали і знаходили меніско-великогомілкову зв'язку (яка прикріплює медіальний меніск до плато великогомілкової кістки). Тварин однієї з підгруп не піддавали ніякій додатковій обробці, і ця група розглядалася як група, піддана помилковій хірургічній операції. Тваринам експериментальної групи робили медіальний розріз меніско-великогомілкової зв'язки, що приводило до дестабілізації медіального меніска (DMM). У хибно оперованих і у ДММтварин, суглобову капсулу і підшкірну шар зашивали окремо, і рану на шкірі закривали шляхом нанесення тканинного клею NEXABAND® S/C (Abbott, North Chicago, IL). До і після проведення хірургічної операції вводили бупренорфін (BUPRENEX®; Reckitt & Coleman, Kingston-uponHull, UK). Препарати рекомбінантного лубрицину вводили шляхом внутрішньосуглобової ін'єкції з використанням голки калібру 30. Ін'єкції 5-10 мікролітрів на коліно вводили протягом тижня після хірургічної операції. Можуть бути також введені, але необов'язково, додаткові щотижневі ін'єкції. Потім через 4 тижні і через 8 тижнів після операції, тварин умертвляли з використанням діоксиду вуглецю. Для аналізу на прогресування і тяжкість остеоартриту, інтактні колінні суглоби вмішували на 24 години в 4% параформальдегід, а потім декальцифікували в EDTA/полівінілпіролідоні протягом п'яти днів. Суглоби заливали в парафін і отримували фронтальні 6мкм-зрізи по всьому суглобу. Покривні скла забарвлювали сафраніновим швидким зеленим (Safronin O-fast) і проводили аналіз всього суглоба через інтервали в 70-мкм з використанням модифікованої семибальної шкали оцінок (Chambers et al., 2001), де "0"=нормальний хрящ; "0,5"=відсутність забарвлення сафраніном О без структурних змін; "1"=нерівна поверхня суглоба і невелика фібриляція; "2"=фібриляція захоплює шар, який лежить безпосередньо нижче поверхневого шару, і часткова відсутність поверхневого шару; "3"=невелика (80%) втрата некальцифікованого 91818 32 хряща. Оцінка "4" (ерозія кістки) не є характерною ознакою цієї моделі. Всі квадранти цього суглоба (плато медіальної великогомілкової кістки, виросток медіальної стегнової кістки, плато латеральної великогомілкової кістки і виросток латеральної стегнової кістки) були проаналізовані окремо. Для кожного колінного суглоба, сліпим методом було проаналізовано мінімум 12 рівнів. Оцінки являють собою максимальну гістологічну оцінку для кожного окремого суглоба або як підсумовувані гістологічні оцінки. Підсумовувані гістологічні оцінки являють собою суму оцінок для кожного квадранта на кожному гістологічному зрізі по всьому, суглобу. Цей метод аналізу дозволяє оцінювати тяжкість ураження, а також площу поверхні хряща, ураженого ОА-подібним захворюванням (Glasson et al., 2004). Посилання: (1) Chambers et al., 2001, Arthritis Rheum. 44: 1455-65; (2) Deutscher, 1990, Methods in Enzymology, Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press; (3) Espallargues and Pons, 2003, Int'l J. Tech. Assess. Health Care 19: 41-56; (4) Flannery et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Comm. 254: 535-41; (5) Glasson et al, 2004, Arthritis Rheum. 50: 2547-58; (6) Goldberg et al., 1993, In: Gynecologic Surgery and Adhesion Prevention, Willey-Liss, pp. 191-204; (7) Hills, 2002, J. Rheumatology 29: 200-01; (8) Ikegawa et al., 2000, Cytogenet. Cell Genet. 90: 291-297; (9) Jay et al., 2001, J. Orthopaedic Research 19: 677-87; (10) Jay et al., 2002, Glycoconjugate Journal 18: 807-15; (11) Krstenansky et al., 1987, FEES Lett. 211: 10-16; (12) Marcelino et al., 1999, Nature Genetics 23: 319-322; (13) Merberg et al., 1993, Biology of Vitronectins and their Receptors, Pressner et al. (eds.): Elsevier Science Publishers, pp. 45-53; (14) Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54; (15) Morawietz et al., 2003, Virchows Arch. 443: 57-66; (16) Rees et al., 2002, Matrix Biology 21: 593602; (17) Schneerson et al., 1980, J. Exp. Med. 152: 361-76; (18) Scopes, 1994, Protein Purification: Principles and Practice (3rd edition), Springer Verlag; (19) Schaefer et al., 2004, Biorheology 41: 503508; (20) Schumacher, 2003, Arthritis & Rheumatism 49: 413-20; (21) Tatusova and Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-50; (22) Wobig et al., 1998, Gin. Tlier. 20: 410-23; і (23) Wobig et al., 1999, Gin. Ther. 21: 1549-62. 33 91818 34 35 91818 36 37 91818 38 39 91818 40 41 91818 42 43 91818 44 45 91818 46 47 91818 48 49 91818 50 51 91818 52 53 91818 54 55 91818 56 57 91818 58 59 91818 60