Антитіло проти bst2

Реферат: (74) Представник: Войтенко Олександр Петрович, реєстр. №23 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: GOTO, T. ET AL.: 'A novel membrane antigen selectively expressed on terminally differentiated human B cells' BLOOD vol. 84, 1994, pages 1922 - 1930. OHTOMO, T. ET AL.: 'Molecular cloning and characterization of a surface antigen preferentially overexpressed on multiple myeloma cells' BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. vol. 258, 1999, pages 583 - 591. OZAKI, S. ET AL.: 'Immunotherapy of multiple myeloma with a monoclonal antibody directed against a plasma cell-specific antigen, HM1.24' BLOOD vol. 90, 1997, pages 3179 3186. ISHIKAWA, J. ET AL.: 'Molecular cloning and chromosomal mapping of a bone marrow stromal cell surface gene, BST2, that may be involved in pre-B-cell growth' GENOMICS vol. 26, 1995, pages 527 - 534. KAWAI, SHIGETO ET AL.: 'Antitumor activity of humanized monoclonal antibody against HM1.24 antigen in human myeloma xenograft models' ONCOLOGY REPORTS vol. 15, 2006, pages 361 - 367. WO02084290 A1, 24.10.2002 WO02064159 A1, 22.08.2002 WO2005034994 A1, 21.04.2005 WO02057316 A1, 25.07.2002 WO2006013923 A1, 09.02.2006 WO2006054748 A1, 26.05.2006 WO9835698 A1, 20.08.1998 WO9943803 A1, 02.09.1999 UA 105760 C2 (12) UA 105760 C2 Винахід належить до антитіла проти BST2 людини, яке зв'язується з антигеном BST2D людини, що експресується з високими рівнями у ракових клітинах, але по суті не зв'язується з антигеном BST2H людини. Також запропоновано терапевтичні та діагностичні засоби, які включають антитіло цього винаходу, які специфічно виявляють тканини, що експресують BST2D. UA 105760 C2 5 10 15 20 25 30 Галузь техніки Цей винахід стосується антитіл, що зв'язуються з антигеном BST2 людини, та їх застосування. Попередній рівень техніки Відомо, що BST2 - це трансмембранний глікопротеїн, який експресується з високими рівнями у різних ракових клітинах, включаючи мієлому (непатентні документи 1-4). На цей час повідомлялося, що антиген BST2 включає декілька варіантів сплайсингу (патентні документи 15). Також відомо, що з цих варіантів BST2D експресується з високими рівнями у пухлинах (непатентний документ 1). Також відомо, що моноклональне антитіло проти BST2 демонструє цитотоксичність проти клітин внаслідок зв'язування з BST2, що експресується на клітинній поверхні (що відповідає молекулярним видам BST2D) (непатентний документ 2). Крім того, на основі цього принципу були здійснені спроби розробити протипухлинні засоби, які улучають у пухлинні клітини in vivo. Наприклад, було продемонстровано, що ці засоби спричиняють найкращий протипухлинний ефект, який, як очікується, зменшить або знешкодить пухлини у модельних мишей, яким пересаджено клітини мієломи людини (непатентні документи 3 та 4). Патентний документ 1: WO 1999/043803. Патентний документ 2: WO 1998/035698. Патентний документ 3: WO 2002/064159. Патентний документ 4: WO 2005/034994. Патентний документ 5: WO 2006/008886. Патентний документ 6: WO 2006/013923. Непатентний документ 1: Goto T. et al., Blood 84(6): 1922-30, 1994. Непатентний документ 2: Ohtomo T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 258(3): 583-91, 1999. Непатентний документ 3: Ozaki S. et al., Blood 90(8): 3179-86, 1997. Непатентний документ 4: Koishihara Y. et al., Blood 92(s): 107, 1998. Суть винаходу Задачі, які слід розв'язати цим винаходом На цей час повідомлялося про декілька варіантів сплайсингу для антигену BST2 людини, які перелічено нижче. Нуклеотидна послідовність BST2D людини BST2H людини BST2HS людини 35 40 45 50 Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23 Довжина амінокислотної послідовності (180) (158) (100) Повідомлялося про спроби, під час яких застосовувалися антитіла, які розпізнають BST2D людини, який є одним з варіантів сплайсингу, для лікування деяких типів пухлин, таких як мієлома. Наприклад, "антитіло проти НМ1.24" - це представник моноклонального антитіла проти BST2, яке продемонструвало, що воно є терапевтично ефективним проти мієломи. "Антитіло проти НМ1.24" отримали як моноклональне антитіло, застосовуючи клітини мієломи людини як імуноген. Наступний аналіз епітопів виявив, що "антитіло проти НМ1.24" розпізнає амінокислоти від позиції 116 до позиції 127 (SEQ ID NO: 24) BST2D людини, наведеного як SEQ ID NO: 2. Амінокислотна послідовність цієї ділянки є спільною з BST2Н людини (Фіг. 1). Антитіло, що має таку специфічність розпізнавання антигену, ймовірно, зв'язується з клітинами та тканинами, що експресують також BST2H. Більш детально, наприклад, діагностичні тести можуть виявляти клітини, що експресують BST2H, окрім пухлин, що експресують BST2D людини. Крім того, оскільки воно також зв'язується з клітинами, що експресують BST2H, концентрація антитіла у крові може знижуватися при терапевтичному застосуванні. Мета цього винаходу - це розв'язання цієї проблеми. Конкретно, завдання цього винаходу - це отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з BST2D людини, та їх застосування. Засоби для розв'язання проблем Автори цього винаходу вважають, що при введенні людині може виникати неспецифічна адсорбція антитіла проти НМ1.24 тканинами, відмінними від пухлин, у тілі людини, та концентрація антитіла у крові може знижуватися. Отже, метою авторів цього винаходу було визначити антитіла, що розпізнають послідовності, відмінні від епітопу, який розпізнається антитілом проти НМ1.24. Внаслідок цілеспрямованих дослідів автори цього винаходу зробили 1 UA 105760 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цей винахід. Більш детально, автори цього винаходу вибрали антитіла BST2, використовуючи зв'язування між антитілом BST2 та різними варіантами сплайсингу антигену BST2 людини як індикатор, та успішно отримали специфічні антитіла проти BST2, що не мають неспецифічної адсорбції з тканинами, які є мішенями лікування або діагностування. Очікується, що застосування цих антитіл запобігає зниженню рівня антитіл у крові після введення. Внаслідок цього, бажані терапевтичні ефекти можна отримати навіть при дозі антитіла, що є нижчою, ніж дози традиційних антитіл. Альтернативно, це антитіло дозволяє здійснювати ефективний діагноз для передбачення терапевтичних ефектів. Конкретно, цей винахід стосується антитіл проти BST2 людини, способів їх виробництва та їх застосування, як описано нижче: [1] антитіло проти BST2 людини, яке зв'язується з антигеном BST2D людини, але по суті не зв'язується з антигеном BST2H людини, або його фрагмент, який включає антигензв'язувальний домен; [2] антитіло за [1], яке розпізнає поліпептид, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [3] антитіло, отримане із застосуванням як імуногену пептиду, який включає повну амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або принаймні п'ять або більше послідовних амінокислот з SEQ ID NO: 3, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [4] антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом у білку BST2D, що і будь-яке антитіло від [1] до [3], або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [5] антитіло за будь-яким від [1] до [4], яке є моноклональним антитілом, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [6] моноклональне антитіло, яке продукується гібридомою BST2#4LD, депонованою за номером доступу FERM AP-21303, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [7] антитіло за [1], в якому варіабельні ділянки важкого ланцюга та легкого ланцюга включають як CDR1, CDR2 та CDR3 наступні амінокислотні послідовності: CDR1 варіабельної ділянки важкого ланцюга: SGYYWN (SEQ ID NO: 4); CDR2 варіабельної ділянки важкого ланцюга: YISYDGSNNYNPSLKNR (SEQ ID NO: 5); та CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга: ILGRGY (SEQ ID NO: 6); CDR1 варіабельної ділянки легкого ланцюга: RASQSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO: 7); CDR2 варіабельної ділянки легкого ланцюга: YASNLES (SEQ ID NO: 8); та CDR3 варіабельної ділянки легкого ланцюга: QHSWEIPYT (SEQ ID NO: 9); або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [8] антитіло за [1], яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга SEQ ID NO: 11 та варіабельну ділянку легкого ланцюга SEQ ID NO: 13, або його фрагмент, який включає антигензв'язувальний домен; [9] антитіло з заміщенням, делецією, додаванням та/або вставкою однієї або більше амінокислот в антитілі (А) або (В), наведеному нижче, яке має активність, еквівалентну активності антитіла (А) або (В): (A) антитіло за [1], в якому варіабельні ділянки важкого ланцюга та легкого ланцюга включають як CDR1, CDR2 та CDR3 наступні амінокислотні послідовності: CDR1 варіабельної ділянки важкого ланцюга: SGYYWN (SEQ ID NO: 4); CDR2 варіабельної ділянки важкого ланцюга: YISYDGSNNYNPSLKNR (SEQ ID NO: 5); та CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга: ILGRGY (SEQ ID NO: 6); CDR1 варіабельної ділянки легкого ланцюга: RASQSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO: 7); CDR2 варіабельної ділянки легкого ланцюга: YASNLES (SEQ ID NO: 8); та CDR3 варіабельної ділянки легкого ланцюга: QHSWEIPYT (SEQ ID NO: 9); або (B) антитіло, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга SEQ ID NO: 11 та варіабельну ділянку легкого ланцюга SEQ ID NO: 13, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [10] антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом у білку BST2D, що і будь-яке антитіло від [7] до [9], або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [11] антитіло за будь-яким від [7] до [10], яке є моноклональним антитілом, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [12] антитіло за будь-яким від [1] до [11], яке має CDC проти клітини, яка експресує антиген BST2D людини на клітинній поверхні, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [13] антитіло за будь-яким від [1] до [11], яке має АDCС проти клітини, яка експресує антиген 2 UA 105760 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 BST2D людини на клітинній поверхні, або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [14] полінуклеотид, який кодує антитіло за будь-яким від [7] до [9] або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [15] вектор, який є носієм полінуклеотиду, який кодує антитіло за будь-яким від [7] до [9] або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [16] трансформована клітина, сприймаюча вектор за [15] експресувальним чином; [17] спосіб виробництва антитіла за будь-яким від [7] до [9] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен, при цьому спосіб включає етапи культивування трансформованої клітини за [16] та збирання з культури антитіла або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен; [18] гібридома, що продукує антитіло за будь-яким від [1] до [5]; [19] гібридома BST2#4LD, що депонована за номером доступу FERM AP-21303; [20] спосіб виробництва антитіла, який включає етапи культивування гібридоми за [19] та збирання антитіла з культури; [21] спосіб виробництва специфічного антитіла проти BST2D людини, який включає наступні етапи: (1) контактування антитіла проти BST2D людини з одним з або з обома BST2H людини та BST2HS людини та (2) збирання, у якості специфічного антитіла проти BST2D людини, антитіла проти BST2D людини, яке має одну з або обидві реакційні специфічності: (i) не зв'язується з BST2H людини та (ii) не зв'язується з BST2HS людини; [22] спосіб виробництва специфічного антитіла проти BST2D людини, який включає наступні етапи: (1) імунізацію тварини, яка не є людиною, пептидом, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або принаймні п'ять або більше послідовних амінокислот, вибраних з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 3; та (2) узяття антитіла від тварини за (1), яка не є людиною, або узяття клітин, що продукують антитіло, та збирання антитіла від клітин, що продукують антитіло; [23] терапевтичний засіб для лікування хвороби, спричиненої зростанням тканини, яка експресує антиген BST2D людини, при цьому терапевтичний засіб включає як активний інгредієнт антитіло за будь-яким від [1] до [13] або його фрагмент, який включає антигензв'язувальний домен; [24] терапевтичний засіб проти пухлини, яка експресує антиген BST2D людини, при цьому терапевтичний засіб включає як активний інгредієнт антитіло за будь-яким від [1] до [13] або його фрагмент, який включає антиген-зв'язувальний домен; [25] терапевтичний засіб за [24], де пухлина походить з клітини кісткового мозку; [26] терапевтичний засіб за [25], де пухлина, що походить з клітини кісткового мозку, - це мієлома; [27] терапевтичний засіб за [26], де мієлома - це множинна мієлома; [28] діагностичний засіб для виявлення тканини, яка експресує антиген BST2D людини, який включає антитіло за будь-яким від [1] до [13] або його фрагмент, який включає антигензв'язувальний домен; [29] діагностичний засіб для виявлення пухлини, яка експресує антиген BST2D людини, який включає антитіло за будь-яким від [1] до [13] або його фрагмент, який включає антигензв'язувальний домен; [30] діагностичний засіб за [29], де пухлина походить з клітини кісткового мозку; [31] діагностичний засіб за [30], де пухлина, що походить з клітини кісткового мозку, - це мієлома; [32] діагностичний засіб за [31], де мієлома - це множинна мієлома; [33] спосіб лікування пухлини, що експресує антиген BST2D людини, який включає етап введення антитіла за будь-яким від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антигензв'язувальний домен; та [34] застосування антитіла за будь-яким від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен, для приготування фармацевтичної композиції для лікування пухлини, що експресує антиген BST2D людини. Альтернативно, цей винахід відноситься до застосування антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен, для лікування пухлин, що експресують антиген BST2D людини. Цей винахід також відноситься до 3 UA 105760 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен, для приготування фармацевтичних композицій для лікування пухлин, що експресують антиген BST2D людини. Крім того, цим винаходом пропонуються способи лікування пухлин, що експресують антиген BST2D людини, при цьому ці способи включають етап введення пацієнтам антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен. Крім того, цей винахід відноситься до застосування антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен, для діагностування пухлин, що експресують антиген BST2D людини. Альтернативно, цей винахід відноситься до застосування антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, що включає антиген-зв'язувальний домен, для виробництва діагностичних засобів для пухлин, що експресують антиген BST2D людини. Цим винаходом також пропонуються способи виявлення пухлин, що експресують антиген BST2D людини у тілі, при цьому ці способи включають етап введення пацієнтам антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен. Крім того, цим винаходом пропонуються способи приготування фармацевтичних композицій для лікування пухлин, що експресують антиген BST2D людини, при цьому ці способи включають етап змішування антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антиген-зв'язувальний домен, з фармацевтично прийнятними носіями. Альтернативно, цей винахід відноситься до способів виробництва діагностичних засобів для виявлення пухлин, що експресують антиген BST2D людини у тілі, при цьому ці способи включають етап змішування антитіла за будь-яким одним від [1] до [13] або його фрагмента, який включає антигензв'язувальний домен, з фармацевтично прийнятними носіями. Ефект винаходу Цим винаходом пропонуються специфічні антитіла проти BST2D людини. Антитіла цього винаходу специфічно зв'язуються з клітинами, що експресують BST2D людини, серед декількох варіантів BST2 людини. Відомо, що BST2 людини включає варіанти сплайсингу, такі як BST2H, але антитіла цього винаходу є по суті нездатними зв'язуватися з клітинами, що експресують BST2H людини. Отже, терапевтичне застосування антитіл цього винаходу може дати терапевтичні ефекти навіть при нижчих дозах. Альтернативно, діагностичне застосування антитіл цього винаходу дозволяє більш специфічно виявляти клітини, що експресують BST2D, такі як клітини мієломи. Стислий опис ілюстративного матеріалу Фіг. 1 презентує діаграми, що демонструють білкові структури варіантів сплайсингу BST2. Фіг. 2 демонструє оцінку специфічності антитіл BST2 людини. Клітинні лінії СНО з примусовою експресією двох варіантів сплайсингу білка BST2 людини, BST2(D) та BST2(H), отримали та оцінили стосовно зв'язування антитіла проти НМ1.24 та мишачих антитіл #4LD та #19LD шляхом проточної цитометрії. На цій фігурі зображено результат оцінки. Фіг. 3 демонструє графіки, на яких зображено результати аналізу CDC (комплементзалежної цитотоксичності) антитіла проти НМ1.24 та мишачого антитіла #4LD проти клітин, що експресують BST2. CDC оцінювали із застосуванням BST2(D)-CHO, BST2(H)-CHO та RPMI8226, що походить від мієломи людини. Кількість LDH (лактату дегідрогенази), яка вивільнилася до культурального середовища під час двогодинної інкубації клітин з 0,01-10 мкг/мл антитіла при 37 °C у присутності кролячих комплементів, визначили як цитотоксичність (%). Фіг. 4 демонструє графік, на якому зображено результати аналізу ADCC (опосередкованої антитілами клітинної цитотоксичності) антитіла проти НМ1.24, мишачого антитіла #4LD, химерного антитіла #4LD та мишачого антитіла #19LD проти клітин, що експресують BST2. Клітини-мішені, що застосовувалися у цьому аналізі ADCC, були клітинами BST2(D)-CHO та RPMI8226, та ефекторні клітини були PBMC (мононуклеарами периферійної крові) людини. Кількість витоку LDH до надосадової рідини внаслідок вбивання клітин у діапазоні відношення Е/Т 12,5-100 визначили як ADCC (%). Гуманізоване антитіло проти НМ1.24 (АНМ-антитіло) застосовували як контрольне. Фігура 5 демонструє фотографії, на яких зображено заморожені зрізи тканин селезінки людини, імунологічно забарвлених антитілом #4LD або #19LD. Фіг. 6 демонструє фотографії, на яких зображено результат вестерн-блотингу, який виявляє рекомбінантний His-мічений білок BST2 людини із застосуванням антитіла #4LD (верхні панелі) або антитіла проти His-мітки (нижні панелі). Фіг. 7 демонструє графік, на якому зображено зміни об'єму пухлини після введення 4LD модельним мишам, яким було пересаджено клітини лінії RPMI8226. Стрілки вказують на введення антитіла. Статистичний аналіз здійснювали за допомогою критерію множинного 4 UA 105760 C2 5 порівняння за Dunnett із використанням об'єму пухлини, визначеного в останній день вимірювання. **: P