Мовчазний fc-варіант анти-cd40 антитіла

Реферат: Винахід стосується мовчазних Fc-варіантів анти-СD40 антитіл, композицій та методів використання зазначених антитіл для лікування патологічних порушень, таких як аутоімунні та запальні порушення, та/або для запобігання або зниження ризику відторгнення трансплантату при трансплантації. UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід відноситься до мовчазних варіантів константного фрагменту (Fc) анти-CD40 антитіл та композицій та методів використання зазначених антитіл для лікування патологічних порушень, таких як аутоімунні та запальні порушення, та/або для запобігання або зниження ризику відторгнення трансплантату при трансплантації. Незважаючи на наявність різних імуносупресивних способів лікування аутоімунних захворювань, залишається велика затребуваність у більш ефективних та безпечних лікарських засобах у численній частині популяції пацієнтів. Наприклад, незважаючи на описану в літературі ефективність терапії щодо зниження числа/інгібування В-клітин, як, наприклад, лікування ритуксимабом або белімумабом ревматоїдного артриту, системного червоного вовчаку, синдрому Шегрена та розсіяного склерозу, ці види терапії ефективні тільки у частини пацієнтів, а у випадку ритуксимабу є супутній ризик розвитку прогресуючої мультифокальної лейкоенцефалопатії. Більше того, численні інші типи лейкоцитів найчастіше залучені у патологію цих аутоімунних захворювань, такі як макрофаги, дендритні клітини та Тклітини, отже, терапевтичний вплив на додаткові типи клітин або ключові імунологічні каскади реакцій, які будуть інгібувати їхню функцію, може виявитися ефективним. Беручи до уваги різноманітні, імунологічно значимі ролі CD40-CD154 у активації та функції цих типів клітин, припускають, що анти-CD40 антитіло виявить позитивний терапевтичний ефект у пацієнтів, що страждають на аутоімунні захворювання, згадані вище, крім забезпечуваного проведеними у цей час методами терапевтичного лікування. Більше того, центральна роль взаємодій CD40CD154 у запальних захворюваннях шлунково-кишкового тракту, таких як хвороба Крона та виразковий коліт, та механістичний зв'язок метаболічного шляху CD40 з патологією при більш рідких порушеннях, таких як аутоімунний васкуліт, вульгарна пухирчатка та ІТП, також підкреслює потенціал анти-CD40 антитіл для застосування. Імунодепресанти, що є у наявності, використовувані після трансплантації паренхіматозних органів, забезпечують відмінну короткострокову ефективність. Гостре відторгнення протягом знову виниклого періоду спостерігають у 5-20 % реципієнтів (залежно від органу, контингенту пацієнтів та схеми лікування) та співвідношення втрачених трансплантатів та гострого відторгнення протягом знову виниклого періоду нижче 5 % для будь-яких параметрів. У цей час, ключові проблеми у медицині пов'язані з переносимістю імуносупресії пацієнтом та життєздатністю трансплантату протягом довгого періоду часу. Після трансплантації нирок 33 % пацієнтів вмирають та/або втрачають трансплантат протягом 5 років; середній вік реципієнтів трансплантату із смертельним результатом становить 58 років. Інгібітори кальциневрину (CNI) залишаються основою імуносупресивної терапії для переважної більшості пацієнтів, яким проведена трансплантація. Незважаючи на те, що нефротоксичність та частота серцево-судинних ускладнень, асоційованих з CNI, є одними з факторів, що сприяють хронічній нефропатії при алотрансплантації, а також настанню смерті пацієнта з функціонуючим трансплантатом, альтернативна первинна імуносупресія була нездатна замінити CNI. У цілому, є можливості для вдосконалення довгострокової імуносупресії трансплантату. Опосередковане В-клітинами імунологічне ушкодження трансплантованих нирок може обумовлювати незадовільні віддалені наслідки, та необхідність розробки нових засобів впливу на відторгнення трансплантату, опосередковуване В-клітинами, усе в більшій мірі визнається медичною громадськістю. Chir12.12 являє собою повністю гуманізоване, що не є агоністом анти-CD40 антитіло (IgG1, капа), яке блокує опосередковану CD154 (також відоме як ліганд CD40; CD40L) активацію лейкоцитів та може опосередковувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC) лейкоцитів людини та В-клітинної лімфоми in vitro (див. WO2006/073443). WO2005/044306 також описує анти-CD40 антагоністичні антитіла, включаючи Chir12.12, для використання, зокрема, у лікуванні аутоімунних та запальних порушень. Більше того, Chir12.12 ефективне в уповільненні відторгнення ниркового алотрансплантату при призначенні у вигляді монотерапії у Macaca fascicularis (яванського макака) [Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]. Однак, Chir12.12 може також опосередковувати збідніння фракції периферичних В-клітин у приматів, що не відносяться до людини (NHP). За теоретичними оцінками анти-CD40 mAb з мовчазною ADCC-активністю мають поліпшений профіль безпеки у порівнянні з вихідними анти-CD40 антитілами, та, зокрема, можуть бути більш придатними за неонкологічними показниками для застосування, такого як аутоімунні захворювання та використання в умовах трансплантації. Таким чином, даний винахід представляє мовчазні Fc-фрагменти анти-CD40 моноклональних антитіл, які зберігають неагоністичні, блокуючі CD40L властивості вихідного анти-CD40 антитіла Chir12.12. 1 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зокрема, винахід представляє виділене антитіло або білок, що включають антиген-зв'язуючу ділянку антитіла, спрямовану проти поліпептиду-мішені CD40 (SEQ ID NO:28), що характеризуються тим, що зазначене антитіло або білок а) зв'язує поліпептид CD40 з KD, рівною 10 нМ або менше, та b) включає мовчазний Fc-фрагмент IgG. У одному варіанті здійснення винаходу зазначене антитіло або білок інгібує індуковане CD40L проведення сигналу з IC50 величиною, рівною 50 нг/мл або менше. У іншому варіанті здійснення винаходу виділене антитіло або білок відповідно до даного винаходу не має або має низьку агоністичну активність відносно проведення сигналу CD40. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло або білок відповідно до даного винаходу включає мовчазний Fc-фрагмент IgG, вибраний із групи, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 або SEQ ID NO:19. В іншому варіанті здійснення винаходу, виділене антитіло або білок відповідно до даного винаходу включає варіабельні ділянки важкого ланцюгу (VH) та легкого ланцюгу (VL), що мають щонайменше 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності по послідовності у порівнянні з VH Chir12.12 (SEQ ID NO:9) та VL Chir12.12 антитіла (SEQ ID NO:10), відповідно. Окремими прикладами антитіл відповідно до даного винаходу є - mAb1, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюгу SEQ ID NO:11 та амінокислотну послідовність легкого ланцюгу SEQ ID NO:12, - mAb2, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюгу SEQ ID NO:13 та амінокислотну послідовність легкого ланцюгу SEQ ID NO:14, або - mAb3, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюгу SEQ ID NO:15 та амінокислотну послідовність легкого ланцюгу SEQ ID NO:16. Виділене антитіло або білок відповідно до даного винаходу можуть бути використані як лікарський засіб. Зокрема, вони придатні для використання у лікуванні аутоімунних порушень, запальних порушень та/або для запобігання або зменшення ризику відторгнення трансплантату при трансплантації. Виділене антитіло або білок відповідно до даного винаходу можуть бути використані, зокрема, у лікуванні розсіяного склерозу, системного червоного вовчаку, синдрому Шегрена, ревматоїдного артриту, відторгнення трансплантату та реакції "трансплантат проти хазяїна". Винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, що включають перераховані вище антитіла або білки відповідно до даного винаходу, у комбінації, щонайменше, з фармацевтично прийнятним ексципієнтом, розріджувачем або носієм. Зазначені фармацевтичні композиції можуть додатково включати інші активні інгредієнти. Винахід також відноситься до ліофілізату або рідкої лікарської форми антитіла або білку відповідно до даного винаходу. Винахід додатково відноситься до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або білок відповідно до даного винаходу, та відповідного клонуючого або експресійного вектору, що включає, щонайменше одну нуклеїнову кислоту, вибрану із групи, що складається з SEQ ID NO:22-27. Винахід також відноситься до клітини-хазяїна, що включає один або декілька клонуючих або експресійних векторів згідно з вищенаведеним визначенням. Винахід додатково представляє процес виробництва антитіла або білку відповідно до винаходу, що включає культивування клітини-хазяїна згідно з вищенаведеним визначенням, очищення та виділення зазначеного антитіла або білку. З метою кращого розуміння даного винаходу в першу чергу дані визначення конкретним термінам. Додаткові визначення викладені по всьому докладному опису. Термін "імунна відповідь" відноситься до реакції, наприклад, лімфоцитів, антигенпрезентуючих клітин, фагоцитарних клітин, гранулоцитів та розчинних макромолекул, що продукуються перерахованими вище клітинами або печінкою (включаючи антитіла, цитокіни та комплемент), що приведе до селективного ушкодження, деструкції або елімінації з людського організмупрониклих патогенів, клітин або тканин, інфікованих патогенами, ракових клітин, або, у випадках аутоімунного або патологічного запалення, нормальних клітин або тканин людини. "Шлях передачі сигналу" або "сигнальна активність" відносяться до біохімічного причиннонаслідкового взаємозв'язку, що, як правило, ініціюється білок-білковою взаємодією, такою як зв'язування ростового фактору з рецептором, що приводить до передачі сигналу від однієї частини клітини іншій частині клітини. В основному, передача сигналу включає специфічне фосфорилювання одного або декількох залишків тирозину, серіну або треоніну у одному або декількох білках у каскаді реакцій, що викликають передачу сигналу. Передостанні процеси звичайно включають ядерні події, що приводять до зміни експресії гену. 2 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "CD40" відноситься до CD40 людини, наприклад, як визначено у SEQ ID NO:28, якщо не описане інше. Термін "антитіло" у тому розумінні, у якому він тут використовується, включає повнорозмірне антитіло та будь-які антиген-зв'язуючі фрагменти (тобто "антиген-зв'язуюча частина") або одноланцюгові варіанти перерахованого вище. "Антитіло", що зустрічається в природі, є глікопротеїном, що включає, щонайменше, два важкі (H) ланцюги та два легкі (L) ланцюги, взаємозв'язані дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюгу (скорочена назва у даному документі VH) та константної області важкого ланцюгу. Константна область важкого ланцюгу складається із трьох доменів, СН1, СН2 та СН3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюгу (скорочена назва у даному документі VL) та константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюгу складається з одного домену, C L. Області VH і VL можуть бути додатково підрозділені на області гіперваріабельності, названі визначуваними комплементарність областями (CDR), впереміж з областями, які є більш консервативними та називаються каркасними областями (FR). Кожна область V H та VL складається із трьох CDR та чотирьох FR, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця у наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важкого та легкого ланцюгів містять зв'язуючий домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) та перший компонент (C1q) класичної системи комплементу. Термін "антиген-зв'язуюча ділянка" антитіла (або спрощено "антигенна ділянка") у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до повнорозмірного антитіла або одного або декількох його фрагментів, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, частиною CD40). Було показано, що антиген-зв'язуюча функція антитіла може виконуватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади фрагментів зв'язування, що підходять під термін "антиген-зв'язуюча ділянка" антитіла, включають фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL та CH1; фрагмент F(ab)2, бівалентний фрагмент, що включає два фрагменти Fab, зв'язані дисульфідним містком у шарнірній області; фрагмент Fd, що складається з доменів VH та CH1; фрагмент Fv, що складається з доменів VL та VH одного плеча антитіла; фрагмент dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), який складається з домену VH; та виділену визначальну комплементарність область (CDR) або будь-які химерні білки, що включають такі антиген-зв'язуючі області. Більше того, хоча два домени фрагменту Fv, VL та VH, кодуються окремими генами, вони можуть бути з'єднані, використовуючи рекомбінантні методи, синтетичним лінкером, що дозволяє їм бути у складі одноланцюгового білку, у якому області V L та VH з'єднані у пари з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюговий фрагмент Fv (scFv); дивись, наприклад, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; і Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також мають бути включені у термін "антигензв'язуюча ділянка" антитіла. Ці фрагменти антитіла одержують, використовуючи стандартні методики, відомі фахівцям у даній галузі техніки, та проводять скринінг даних фрагментів на предмет практичного застосування у такий же спосіб, як і інтактні антитіла. Термін "область Fc IgG" у тому розумінні, у якому він тут використовується, застосовується для визначення С-кінцевої області важкого ланцюгу імуноглобуліну, включаючи область Fc нативної послідовності та варіантні області Fc. Область Fc важкого ланцюгу IgG людини, як правило, визначають як послідовність, що включає амінокислотні залишки, починаючи з позиції С226 або Р230 до карбоксильного кінця антитіла IgG. Нумерація залишків у області Fc відповідає системі нумерації EU Index по Kabat. C-кінцевий лізин (залишок К447) області Fc може бути вилучений, наприклад, під час виробництва або очищення антитіла. Відповідно, композиція антитіл відповідно до винаходу може включати популяції антитіл з усіма вилученими залишками К447, що містять залишки К447 популяції антитіл, та популяції антитіл, що мають суміш антитіл, що містять та не містять залишок К447. Термін "виділене антитіло" у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до антитіла, яке практично не містить інших антитіл, що мають іншу антигенну специфічність (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує CD40, практично не містить антитіл, які специфічно зв'язують відмінні від CD40 антигени). Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує CD40, може, однак, мати перехресну реактивність із іншими антигенами, такими як молекули CD40 з інших (відмінних від людини) видів. Більше того, виділене антитіло може практично не містити іншого клітинного матеріалу та/або хімічних речовин. 3 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла" у тому розумінні, у якому вони тут використовуються, відноситься до виробництва молекул антитіла одномолекулярного складу. Композиція моноклонального антитіла має єдину специфічність зв'язування та афінність у відношенні певного епітопу. Термін "гуманізоване антитіло" у тому розумінні, у якому він тут використовується, включає антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з відмінних від людських послідовностей імуноглобулінів. У більшості випадків, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципієнтне антитіло), у яких залишки з гіперваріабельної області (також відомої як визначуюча комплементарність область або CDR) реципієнта замінені залишками з гіперваріабельної області імуноглобулінів, відмінних від людини видів (донорське антитіло), таких як миша, щур, кролик або відмінні від людини примати, що мають задану специфічність, афінність та здатність. Фраза "визначуюча комплементарність область" відноситься до амінокислотних послідовностей, які одночасно визначають афінність та специфічність зв'язування області природного фрагменту Fv сайту зв'язування нативного імуноглобуліну. Дивись, наприклад, Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917: Kabat et al. (1991) US Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Фраза "константна область" відноситься до фрагменту молекули антитіла, який надає ефекторні функції. У попередній роботі, спрямованій на виробництво неімуногенних антитіл для використання у терапії людських захворювань, мишачі константні області були замінені людськими константними областями. Константні області гуманізованих антитіл суб'єкта були отримані з імуноглобулінів людини. Гуманізація може бути виконана, керуючись методом Winter і співавторів (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327: Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), шляхом заміни щурячих та мутантних щурячих CDR або послідовностей CDR відповідними послідовностями людського антитіла. У деяких випадках, залишки у каркасних областях однієї або декількох варіабельних областей людського імуноглобуліну заміщують відповідними залишками відмінних від людських імуноглобулінів (дивись, наприклад, патенти США №№ 5585089; 5693761; 5693762; і 6180370). Більше того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не можна виявити у реципієнтному антитілі або у донорському антитілі. Гуманізоване антитіло відповідно до винаходу також включає, щонайменше, ділянку константної області імуноглобуліну (Fc), як правило, таку людського імуноглобуліну та, у цьому випадку мовчазну область Fc IgG. Антитіла відповідно до винаходу можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються людськими послідовностями (наприклад, мутації, що з'явилися в результаті випадкового або сайт-специфічного мутагенезу in vitro або у результаті соматичної мутації in vivo). Зокрема, термін "гуманізоване антитіло" включає антитіла, які містять у своєму складі мовчазний варіант області Fc IgG. Термін "гуманізоване моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, що мають єдину специфічність зв'язування, які мають варіабельні області, у яких варіабельні області гуманізовані послідовностями, відмінними від людських. Термін "рекомбінантне антитіло" у тому розумінні, у якому він тут використовується, включає всі людські або гуманізовані антитіла, які синтезовані, експресовані, створені або виділені рекомбінантними способами, як, наприклад, антитіла, виділені із тварини (наприклад, миші), яке є трансгенним або трансхромосомним відносно генів імуноглобулінів людини, гібридоми, створеної з них, антитіла, виділені із клітини-хазяїна, трансформованої з метою експресії людського або гуманізованого антитіла, наприклад, із трансфектоми, антитіла, виділені з рекомбінантної, комбінаторної бібліотеки людських антитіл, та антитіла, синтезовані, експресовані, створені або виділені за будь-якими іншими способами, які включають сплайсинг всього або частини гену імуноглобуліну людини, послідовностей з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні людські або гуманізовані антитіла мають варіабельні області, у яких каркасна або CDR області можуть бути отримані з послідовностей імуноглобулінів людини ембріонального типу. У певних варіантах здійснення винаходу, однак, такі рекомбінантні людські або гуманізовані антитіла можуть бути піддані мутагенезу in vitro (або, коли використовується тварина, трансгенна відносно людських послідовностей Ig, соматичний мутагенез in vivo) та, отже, амінокислотні послідовності областей V H та VL рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, хоча й отримані з людських послідовностей V H та VL ембріонального типу та мають до них відношення, можуть і не зустрічатися у природі in vivo серед репертуару людських антитіл ембріонального типу. "Ізотип" у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до класу антитіл (наприклад, IgM, IgE, IgG такі як IgG1 або IgG4), що обумовлене генами константної області важкого ланцюгу. Різні ізотипи мають різні ефекторні функції. Наприклад, ізотипи дикого типу 4 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IgG1 та IgG3 людини опосередковують антитіло-залежну клітино-опосередковану цитоксичну (ADCC) активність. Фрази "антитіло, що впізнає антиген" та "антитіло, специфічне для антигену" та "антитіло, спрямоване проти антигену" використовуються взаємозамінно у даному документі разом з терміном "антитіло, яке зв'язується специфічно з антигеном". У тому розумінні, у якому використовується у даному документі антитіло або білок, які "специфічно зв'язуються з поліпептидом CD40", призначені для позначення антитіла або білку, які зв'язуються з людським поліпептидом CD40 з KD, рівною 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нМ або менше. Антитіло, яке "перехресно реагує з антигеном, відмінним від CD40", призначене для позначення антитіла, яке зв'язується із цим антигеном з KD, рівною 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нМ або менше. Антитіло, яке "не реагує перехресно з певним антигеном", призначене для позначення антитіла, яке зв'язується із цим антигеном з KD, рівною 100 нМ або більше, або KD, рівною 1 мкМ або більше, або KD, рівною 10 мкМ або більше. У певних варіантах здійснення винаходу такі антитіла, які не реагують перехресно з антигеном, у стандартних реакціях зв'язування демонструють зв'язування із цими білками, яке практично не детектується. Термін "Kassoc" або "Ка" у тому розумінні, у якому він тут використовується, призначений для позначення швидкості асоціації окремо взятої взаємодії антитіло-антиген, тоді як термін "Kdis" або "Кd" у тому розумінні, у якому він тут використовується, призначений для позначення швидкості дисоціації окремо взятої взаємодії антитіло-антиген. Термін "KD" у тому розумінні, у якому він тут використовується, призначений для позначення константи дисоціації, яку одержують із співвідношення Кd до Ка (тобто Кd/Ка) та виражають у вигляді молярної концентрації (М). Значення KD для антитіл можуть бути визначені, використовуючи методи, загальновизнані у даній галузі техніки. Метод визначення K D антитіла полягає у використанні поверхневого плазмонного резонансу або у використанні біосенсорної системи, такої як система Biacore®. Термін "афінність" у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до сили взаємодії між антитілом та антигеном у окремо взятих імунодомінантних сайтах. Усередині кожного імунодомінантного сайту варіабельна область "плеча" антитіла взаємодіє за допомогою слабких нековалентних зв'язків з антигеном у численних сайтах; чим більше взаємодій, тим сильніше афінність. Термін "авідність" у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до інформативного показника загальної стабільності або сили взаємодії комплексу антитілоантиген. Вона контролюється трьома основними факторами: афінністю епітопу антитіла; валентністю як антигену, так і антитіла; структурною конфігурацією взаємодіючих частин. У остаточному підсумку ці фактори визначають специфічність антитіла, тобто ймовірність того, що певне антитіло зв'язується з певним епітопом антигену. Термін "антагоніст CD40" у тому розумінні, у якому він тут використовується, призначений для позначення антитіла або білку, який інгібує індуковану CD40 сигнальну активність у присутності CD40L у аналізі клітин людини, такому як аналіз CD40 L-опосередкованої проліферації PBMC. Такий аналіз описаний більш докладно у нижчеподаних прикладах. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла або білки відповідно до винаходу інгібують індуковане CD40L проведення сигналу зі значенням IC50, рівним 500 нг/мл або менше, переважно, зі значенням IC50, рівним 50 нг/мл або менше, наприклад, зі значенням IC 50, рівним 20 нг/мл або менше, як було виміряно у аналізі CD40 L-опосередкованої проліферації PBMC. Антитіло "без агоністичної активності" у тому розумінні, у якому використовується у даному документі, призначене для позначення антитіла, яке значимо не збільшує CD40-опосередковану сигнальну активність під час відсутності CD40L у клітинному аналізі, такому як аналіз CD40Lопосередкованої проліферації PBMC. Такий аналіз описаний більш докладно в нижчеподаних прикладах. Термін "ADCC" або "антитіло-залежна клітинна цитотоксичність" у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до антиклітинної активності. Активність ADCC може бути виміряна аналізом ADCC, як описано більш докладно у нижчеподаних прикладах. Термін "мовчазне" антитіло у тому розумінні, у якому він використовується у даному документі, відноситься до антитіла, яке проявляє низьку активність ADCC або не проявляє зовсім, що вимірюється аналізом ADCC, як описано у прикладах. У одному варіанті здійснення винаходу термін "відсутня або низька активність ADCC" означає, що мовчазне антитіло проявляє активність ADCC, величина якої нижче 50 % специфічного клітинного лізису, наприклад, нижче 10 % специфічного клітинного лізису, що 5 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вимірюється аналізом ADCC, як описано у прикладах. Відсутність активності ADCC означає, що мовчазне антитіло проявляє активність ADCC (специфічний клітинний лізис), величина якої нижче 1 %. У конкретному варіанті здійснення винаходу мовчазне антитіло відповідно до винаходу не проявляє якої-небудь значимої активності ADCC, вимірюваної аналізом ADCC, як описано у прикладах. Знижені ефекторні функції можуть бути отримані введенням мутації у фрагмент Fc антитіл та були описані у даній області техніки: LALA та N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20(6):685-691); та D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181:6664-69; Strohl, W., supra). Приклади мовчазних Fc IgG1 антитіл включають так званий мутант LALA, що включає мутацію L234A та L235A у амінокислотній послідовності Fc IgG1. Інший приклад мовчазного антитіла IgG1 включає мутацію D265A. Інше мовчазне антитіло IgG1 включає мутацію N297A, результатом якої є аглікозильовані/неглікозильовані антитіла. Термін "селективний" для антитіла або білку відповідно до винаходу у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до антитіла або білку, які зв'язуються з певним поліпептидом-мішенню, але не із близькоспорідненим поліпептидом. Термін "висока афінність" для антитіла у тому розумінні, у якому він тут використовується, відноситься до антитіла, що має величину KD, рівну 1 нМ або менше, для антигену-мішені. Термін "суб'єкт" у тому розумінні, у якому він тут використовується, включає будь-яку людину або відмінну від людини тварину. Термін "відмінна від людини тварина" включає всіх хребетних, наприклад, ссавців, що й не є ссавцями, такі як відмінні від людини примати, вівці, собаки, кішки, коні, корови, кури, амфібії, рептилії тощо. Термін "оптимізований" у тому розумінні, у якому він тут використовується, означає, що нуклеотидна послідовність була змінена для кодування амінокислотної послідовності, використовуючи кодони, кращі у продукуючій клітині або організмі, в основному, еукаріотичній клітині, наприклад, клітині Pichia, клітині Trichoderma, клітині яєчнику китайського хом'ячку (CHO) або клітині людини. Оптимізовану нуклеотидну послідовність конструюють, щоб повністю або якнайбільше зберегти амінокислотну послідовність, яка спочатку кодується вихідною нуклеотидною послідовністю, яка також відома як "батьківська" послідовність. Оптимізована послідовність у даному документі була сконструйована таким чином, щоб містити кодони, кращі для клітин ссавців СНО, однак оптимізована експресія цих послідовностей у інших еукаріотичних клітинах також передбачена у даному документі. Амінокислотні послідовності, що кодуються оптимізованими нуклеотидними послідовностями, також називаються оптимізованими. Відсоток ідентичності між двома послідовностями у тому розумінні, у якому використовується у даному документі, є функцією числа ідентичних позицій, що є загальними для даних послідовностей (тобто, % ідентичності = # ідентичних позицій/загальна кількість # позицій ×100), враховуючи кількість розбіжностей та довжини кожної розбіжності, які повинні бути введено для оптимального накладання двох послідовностей. Порівняння послідовностей та визначення відсотку ідентичності між двома послідовностями може бути виконане, використовуючи математичний алгоритм, як описано нижче. Відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями може бути визначений, використовуючи алгоритм E. Meyers та W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988), який був включений у програму ALIGN (версія 2.0), використовуючи таблицю ваги залишків PAM120, штраф довжини розриву 12 та штраф розриву 4. Альтернативно, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями може бути визначений, використовуючи алгоритм Needleman та Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970), який був включений у програму GAP у пакеті програми GCG (доступно на сайті http://www.gcg.com), використовуючи або матрицю Blossom 62, або матрицю РАМ250, та вагу розриву 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 та вагу довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними послідовностями амінокислот може бути також визначений, використовуючи, наприклад, алгоритми, такі як програма BLASTN для послідовностей нуклеїнових кислот, використовуючи за замовчуванням довжину слова (W) 11, очікування (Е) 10, М=5, N=4 та порівняльний аналіз обох ланцюгів. Рекомбінантні антитіла Антитіла відповідно до винаходу включають гуманізовані рекомбінантні антитіла mAb1mAb3, виділені та структурно охарактеризовані за їх повнорозмірними амінокислотними послідовностями важкого та легкого ланцюгу, як описано нижче у таблиці 1: 6 UA 112417 C2 Таблиця 1 Повнорозмірні амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюгу mAb1-mAb3 Антитіло mAb1 mAb2 mAb3 5 10 Повнорозмірна амінокислотна послідовність важкого ланцюгу SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:15 Повнорозмірна амінокислотна послідовність легкого ланцюгу SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:16 Відповідні варіабельні області, амінокислотні послідовності VH та VL таких виділених антитіл mAb1-mAb3 відповідно до винаходу всі походять із того самого антитіла Chir12.12, раніше описаного, наприклад, у WO2006/073443, та що складається з амінокислотної послідовності V H SEQ ID NO:7 та амінокислотної послідовності VL SEQ ID NO:8. Одна важлива відмінність антитіл відповідно до винаходу у порівнянні з вихідним Chir12.12 полягає в тому, що вони мають область Fc, що складається з мовчазної області Fc IgG, наприклад, мовчазної області Fc IgG1. Зокрема, у таблиці 2 підсумовані дані щодо модифікації області Fc IgG1, виконаної для одержання антитіл mAb1-mAb3, у порівнянні з вихідним антитілом Chir12.12. Таблиця 2 Модифікація області Fc IgG1 для одержання mAb1-mAb3 Антитіло mAb1 mAb2 mAb3 15 20 25 Модифікація області Fc IgG1 N297A D265A L234A/L235A Амінокислотна послідовність області Fc SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 Інші антитіла відповідно до винаходу включають антитіла, що мають амінокислоти, які були мутовані делецією, вставкою або заміною амінокислот, та, тим не менше, мають, щонайменше, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з областями VH та VL Chir12.12, відповідно SEQ ID NO:7 та SEQ ID NO:8, та що включають мовчазну область Fc IgG, наприклад, мовчазну область Fc IgG1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу являє собою мутантний варіант кожного з mAb1-mAb3, де зазначене антитіло мутантного варіанту включає мутантну амінокислотну послідовність, де не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот були мутовані делецією, вставкою або заміною амінокислот у областях V H та VL при порівнянні з областями VH та VL Chir12.12, відповідно SEQ ID NO:7 та SEQ ID NO:8 та зберігаючи ті ж самі константні області як mAb1, mAb2 або mAb3. Повнорозмірні нуклеотидні кодуючі послідовності легкого та важкого ланцюгу mAb1-mAb3 представлено у таблиці 3 нижче. Таблиця 3 Повнорозмірні кодуючі ДНК-послідовності важкого та легкого ланцюгу Антитіло mAb1 mAb2 mAb3 30 Повнорозмірна кодуюча ДНКпослідовність важкого ланцюгу SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:26 Повнорозмірна кодуюча ДНКпослідовність легкого ланцюгу SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:27 Інші нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла відповідно до винаходу, включають нуклеїнові кислоти, які були мутовані нуклеотидною делецією, вставкою або заміною, та, тим не менше, мають, щонайменше, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з кодуючими областями VH та VL Chir12.12, як відображено у послідовностях, описаних, наприклад, у SEQ ID NO:20 та SEQ ID NO:21, відповідно, та включаючи кодуючу послідовність мовчазної області Fc IgG, наприклад, мовчазної області Fc IgG1. 7 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення, винахід включає альтернативні варіанти нуклеїнових кислот, де не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 нуклеотидів були змінені нуклеотидною делецією, вставкою або заміною у кодуючих областях VH та VL з кодуючими областями VH та VL, представлених у послідовностях, описаних, наприклад, у SEQ ID NO:20 і SEQ ID NO:21, відповідно, та зберігаючи ті ж самі кодуючі послідовності константних областей як відповідні кодуючи послідовності mAb1, mAb2 або mAb3. Гомологічні антитіла Крім рекомбінантних антитіл відповідно до винаходу, mAb1-mAb3, винахід також включає гомологічні антитіла або білки, що зберігають задані функціональні властивості антитіл mAb1mAb3. Зокрема, зазначені гомологічні антитіла або білки відповідно до винаходу являють собою антитіла або білки, що включають антиген-зв'язуючу частину антитіла, спрямованого на цільовий поліпептид CD40 (SEQ ID NO:28), які характеризуються тим, що зазначене антитіло або білок а) зв'язується з поліпептидом CD40 з KD, рівною 10 нМ або менше, та b) включає мовчазну область Fc IgG, та де зазначені гомологічні антитіла або білки зберігають задані функціональні властивості вихідних антитіл mAb1-mAb3. Задані функціональні властивості вихідних антитіл mAb1-mAb3 можуть бути вибрані з однієї або декількох наступних властивостей: (i) специфічно зв'язує CD40, наприклад, величина KD рівна 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, або 1 нМ або менше, вимірювана методом Biacore; (ii) є антагоністом CD40, наприклад, воно інгібує індуковане CD40L проведення сигналу, вимірюване аналізом CD40L-опосередкованої проліферації PBMC; (iii) проявляє низьку агоністичну активність або не проявляє зовсім, вимірювану аналізом CD40L-опосередкованої проліферації PBMC; (iv) перехресно реагує з поліпептидом CD40 яванського макака; (v) має низьку активність ADCC або зовсім її не має; та (vi) має підходящі властивості для розробки лікарського засобу. У одному конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені гомологічні антитіла або білки відповідно до винаходу включають мовчазну область Fc IgG1, наприклад, мовчазну область Fc IgG1, вибрану із групи, що складається з SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 або SEQ ID NO:19. У одному конкретному варіанті здійснення, винахід відноситься до антитіла або білку, які мають нуклеотидні послідовності варіабельної області важкого та легкого ланцюгу, або амінокислотні послідовності варіабельної області важкого та легкого ланцюгу, або амінокислотні послідовності або нуклеотидні кодуючі послідовності всіх 6 CDR, які гомологічні відповідним амінокислотним або нуклеотидним послідовностям антитіл mAb1-mAb3, описаних вище, зокрема, у таблиці 1, та зазначене антитіло або білок включає мовчазну область Fc IgG, вибрану з групи, що складається з області Fc mAb1 (SEQ ID NO:17), області Fc mAb2 (SEQ ID NO:18) та області Fc mAb3 (SEQ ID NO:19), де зазначене гомологічне антитіло або білок специфічно зв'язується з CD40, та антитіло або білок має наступні функціональні властивості: є антагоністом CD40, має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, та має низьку активність ADCC або не має її зовсім. Наприклад, винахід відноситься до антитіл або білків, гомологічних mAb1-mAb3, що включають мовчазну область Fc IgG, вибрану із групи, що складається з області Fc mAb1 (SEQ ID NO:17), області Fc mAb2 (SEQ ID NO:18) і області Fc mAb3 (SEQ ID NO:19), та що включають послідовності варіабельного важкого ланцюгу (VH) та варіабельного легкого ланцюгу (V L), де послідовності CDR мають, щонайменше, 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з відповідними послідовностями CDR mAb1-mAb3, відповідно SEQ ID NO:1-6, де зазначене гомологічне антитіло або білок специфічно зв'язується з CD40, та гомологічне антитіло або білок має наступні функціональні властивості: є антагоністом CD40, має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, та має низьку активність ADCC або не має її зовсім. У відповідному конкретному варіанті здійснення винаходу гомологічне антитіло або білок а) зв'язує CD40 з KD, рівною 1 нМ або менше; b) інгібує індуковане CD40L проведення сигналу з величиною IC50, рівною 50 нг/мл або менше, вимірюване у аналізі CD40L-опосередкованої проліферації PBMC, описаному у прикладах; с) має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, вимірювану у біоаналізі, такому як аналіз CD40L-опосередкованої проліферації PBMC, як описано у прикладах; та d) має низьку активність ADCC або не має її зовсім. 8 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, винахід відноситься до антитіл або білків, гомологічних mAb1-mAb3, що включають мовчазну областьFc IgG, вибрану із групи, що складається з області Fc mAb1 (SEQ ID NO:17), області Fc mAb2 (SEQ ID NO:18) та області Fc mAb3 (SEQ ID NO:19), та що включають послідовності варіабельного важкого ланцюгу (VH) та варіабельного легкого ланцюгу (VL), які мають, щонайменше, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з відповідними послідовностями (VH) та (VL) mAb1-mAb3, відповідно SEQ ID NO:7 та SEQ ID NO:8, де зазначене гомологічне антитіло або білок специфічно зв'язує CD40, та антитіло або білок має наступні функціональні властивості: є антагоністом CD40, має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, і має низьку активність ADCC або не має її зовсім. У відповідному конкретному варіанті здійснення винаходу зазначене гомологічне антитіло або білок а) зв'язує CD40 з KD, рівною 1 нМ або менше; b) інгібує індуковане CD40L проведення сигналу з величиною IC 50, рівною 50 нг/мл або менше, вимірюване у аналізі CD40L-опосередкованої проліферації PBMC, описаному у прикладах; с) має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, вимірювану у біоаналізі, такому як аналіз CD40L-опосередкованої проліферації PBMC, описаний у прикладах; та d) має низьку активність ADCC або не має її зовсім. У іншому прикладі винахід відноситься до антитіл або білків, гомологічних mAb1-mAb3, що включають мовчазну область Fc IgG, вибрану із групи, що складається з області Fc mAb1 (SEQ ID NO:17), області Fc mAb2 (SEQ ID NO:18) та області Fc mAb3 (SEQ ID NO:19), та де: варіабельні важкі та легкі ланцюги кодуються нуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 80 %, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 % або на 100 % ідентична відповідній кодуючій нуклеотидній послідовності варіабельним важкому та легкому ланцюгам mAb1-mAb3, де зазначене гомологічне антитіло або білок специфічно зв'язує CD40, та антитіло або білок має наступні функціональні властивості: є антагоністом CD40, має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, і має низьку активність ADCC або не має її зовсім. У відповідному конкретному варіанті здійснення винаходу зазначене гомологічне антитіло або білок а) зв'язує CD40 з KD, рівною 1 нМ або менше; b) інгібує індуковане CD40L проведення сигналу з величиною IC 50, рівною 50 нг/мл або менше, вимірюване у аналізі CD40L-опосередкованої проліферації PBMC, описаному у прикладах; с) має низьку агоністичну активність або не має її зовсім, вимірювану у біоаналізі, такому як аналіз CD40L-опосередкованої проліферації PBMC, описаний у прикладах; та d) має низьку активність ADCC або не має її зовсім. Антитіла з мутантними амінокислотними послідовностями можуть бути отримані мутагенезом (наприклад, сайт-спрямованим або ПЛР-опосередкованим мутагенезом) молекул кодуючої нуклеїнової кислоти з наступним тестуванням кодуємого зміненого антитіла на предмет збереженої функції (тобто викладених вище функцій), використовуючи функціональні аналізи, описані у прикладах нижче. У певних варіантах здійснення винаходу антитіла або білки, гомологічні mAb1-mAb3, як описано вище, мають консервативні модифікації послідовності. Термін "консервативні модифікації послідовності" у тому розумінні, у якому він тут використовується, призначений для позначення амінокислотних замін, у яких амінокислотні залишки заміщені амінокислотними залишками, що мають подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, були визначені у даній галузі техніки. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислі бічні ланцюги (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серін, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярні бічні ланцюги (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілалалін, метіонін), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, один або кілька амінокислотних залишків усередині областей CDR антитіла відповідно до винаходу можуть бути заміщені іншими амінокислотними залишками з того ж самого сімейства бічних ланцюгів, та змінене антитіло може бути протестоване на предмет збереженої функції, використовуючи функціональні методи аналізу, описані у даному документі. 9 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Модифікації можуть бути внесені у антитіло відповідно до винаходу стандартними методами, відомими у даній галузі техніки, такими як сайт-спрямований мутагенез та ПЛРопосередкований мутагенез. Молекули нуклеїнових кислот, кодуючі антитіла або білки відповідно до винаходу Інший аспект винаходу відноситься до молекул нуклеїнових кислот, які кодують антитіла або білки відповідно до винаходу, як описано вище. Приклади нуклеотидних послідовностей легкого та важкого ланцюгів кожного з mAb1-mAb3 можуть бути отримані з таблиці 3 (що демонструє повні нуклеотидні кодуючі послідовності важкого та легкого ланцюгів mAb1-mAb3). Інші приклади нуклеотидних послідовностей легкого та важкого ланцюгів відповідно до винаходу являють собою будь-яку послідовність, що кодує амінокислотні послідовності повнорозмірного важкого та/або легкого ланцюгів mAb1, mAb2 або mAb3, як описано у таблиці 1. Винахід також відноситься до молекул нуклеїнових кислот, які одержують із останніх послідовностей, будучи оптимізованими для експресії білку у клітинах ссавців, наприклад, клітинних лініях СНО. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутнім у цільних клітинах, у клітинних лізатах, або можуть бути нуклеїновими кислотами у частково очищеному або практично чистому вигляді. Нуклеїнова кислота є "виділеною" або "знаходиться у практично чистому вигляді", коли вона очищена від інших клітинних компонентів або інших домішок, наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот або білків, за стандартними методами, включаючи обробку лугом/SDS, фракціонування у CsCl, колонкова хроматографія, електрофорез у агарозному гелі та інші добре відомі у даній області техніки методи. Дивись, F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеїнова кислота відповідно до винаходу може бути, наприклад, ДНК або РНК та може містити або не містити послідовності інтронів. У варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота являє собою молекулу кДНК. Нуклеїнова кислота може бути у складі вектору, такого як вектор фагового дисплея, або у рекомбінантному плазмідному векторі. Нуклеїнові кислоти відповідно до винаходу можуть бути отримані, використовуючи стандартні методи молекулярної біології. Як тільки одержують фрагменти ДНК, що кодують, наприклад, сегменти VH та VL, надалі можна проводити маніпуляції із цими фрагментами ДНК стандартними технологіями рекомбінантної ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельної області у гени повнорозмірного ланцюгу антитіла, гени фрагменту Fab або гену scFv. При цих маніпуляціях, VL- або VH-кодуючий фрагмент ДНК функціонально пов'язаний з іншою молекулою ДНК або із фрагментом, що кодує константну область антитіла mAb1-mAb3, що включає область Fc згідно з SEQ ID NO:17-19. Термін "функціонально зв'язаний" у тому розумінні, у якому він використовується у цьому контексті, означає, що два фрагменти ДНК з'єднані функціонально, наприклад, таким чином, що амінокислотні послідовності, що кодуються двома фрагментами ДНК, залишаються усередині рамки зчитування, або таким чином, що білок експресується під контролем заданого промотору. Виділена ДНК, що кодує область VH, може бути перетворена у ген повнорозмірного важкого ланцюгу шляхом функціонального зв'язування VH-кодуючої ДНК із іншою молекулою ДНК, що кодує константні області важкого ланцюгу (СН1, СН2 та СН3). Послідовності генів константної області важкого ланцюгу людини відомі у даній області техніки (дивись, наприклад, Kabat. E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), та фрагменти ДНК, що містять ці області, можуть бути отримані стандартною ПЛР-ампліфікацією. Константна область важкого ланцюгу може бути вибрана серед ізотипів IgG1, що включають область Fc згідно з SEQ ID NO:17-19. Виділена ДНК, що кодує область VL, може бути перетворена у ген повнорозмірного легкого ланцюгу (а також у ген легкого ланцюгу Fab) шляхом функціонального зв'язування VL-кодуючої ДНК із іншою молекулою ДНК, що кодує константну область легкого ланцюгу, CL. Послідовності генів константної області легкого ланцюгу людини добре відомі у даній області техніки (дивись, наприклад, Kabat. E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), та фрагменти ДНК, що містять ці області, можуть бути отримані стандартною ПЛР-ампліфікацією. Константна область легкого ланцюгу може являти собою константну область капа або лямбда. Одержання трансфектом, продукуючих моноклональні антитіла Антитіла або білки відповідно до винаходу можуть бути отримані у трансфектомі клітинихазяїна, використовуючи, наприклад, комбінацію технології рекомбінантної ДНК та методів 10 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 генної трансфекції так, як це відомо у даній області техніки (наприклад, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Наприклад, для експресії антитіл, молекули ДНК, що кодують часткові або повнорозмірні легкі та важкі ланцюги, можуть бути отримані за стандартними методами молекулярної біології або біохімії (наприклад, хімічним синтезом ДНК, ПЛР-ампліфікацією або клонуванням кДНК, використовуючи гібридому, яка експресує антитіло, що представляє інтерес) та молекули ДНК можуть бути вставлені у експресійні вектори таким чином, що гени стають функціонально пов'язаними з контролюючими транскрипцію та трансляцію послідовностями. У цьому зв'язку, термін "функціонально зв'язаний" означає, що ген антитіла вставлений у вектор таким чином, що контролюючі транскрипцію та трансляцію послідовності усередині вектору виконують задані їм функції регуляції транскрипції та трансляції гену антитіла. Експресійний вектор та контролюючі експресію послідовності вибирають таким чином, щоб вони були сумісні з використовуваною з метою експресії клітиною-хазяїном. Ген легкого ланцюгу антитіла та ген важкого ланцюгу антитіла можуть бути вставлені у окремі вектори або, у більшості випадків, обидва гени вставлені у той самий експресійний вектор. Гени антитіл вставляють у експресійний вектор стандартними методами (наприклад, лігуванням комплементарних сайтів рестрикції у фрагменті гену антитіла та векторі, або лігування по тупих кінцях, якщо немає у наявності сайтів рестрикції). Варіабельні області легкого та важкого ланцюгу антитіл, описані у даному документі, можуть бути використані для створення генів повнорозмірного антитіла шляхом їхньої вставки у експресійні вектори, що вже кодують константні області важкого ланцюгу та константні області легкого ланцюгу заданої послідовності, що відповідає зазначеним константним областям mAb1, mAb2 або mAb3, таким чином, що сегмент VH функціонально пов'язаний із сегментом(ами) CH усередині вектору та сегмент VL функціонально пов'язаний із сегментом CL всередині вектору. Додатково або альтернативно, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію ланцюгу антитіла із клітини-хазяїна. Ген ланцюгу антитіла може бути клонований у вектор таким чином, що сигнальний пептид зв'язаний у рамці зчитування з амінокінцем ланцюгу антитіла. Сигнальний пептид може бути імуноглобуліновим сигнальним пептидом або гетерологічним сигнальним пептидом (наприклад, сигнальним пептидом з білків неімуноглобулінового походження). Крім генів ланцюгів антитіла, рекомбінантні експресійні вектори відповідно до винаходу несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюгів антитіла у клітиніхазяїні. Термін "регуляторна послідовність" передбачений для включення промоторів, енхансерів та інших елементів контролю експресії (наприклад, сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюгів антитіла. Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, у Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Фахівцям у даній галузі техніки зрозуміло, що дизайн експресійного вектору, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна, що підлягає трансформації, рівень експресії цільового білку, тощо. Регуляторні послідовності для експресії у клітині-хазяїні ссавців включає вірусні елементи, які контролюють високі рівні експресії білку у клітинах ссавців, як, наприклад, промотори та/або енхансери, отримані із цитомегаловірусу (CMV), вірусу мавпи 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, основний пізній промотор аденовірусу (AdMLP) та вірусу поліоми. Альтернативно, можуть бути використані регуляторні послідовності невірусного походження, такі як промотор убіквітину або Р-глобіновий промотор. Більше того, регуляторні елементи, що складаються із послідовностей з різних джерел, такі як промоторна система SRa, яка містить послідовності з раннього промотору SV40 та довгого термінального повтору вірусу типу 1 Т-клітинної лейкемії людини (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Крім генів ланцюгів антитіл та регуляторних послідовностей, рекомбінантні експресійні вектори відповідно до винаходу можуть містити додаткові послідовності, такі як послідовності, які регулюють реплікацію вектору у клітинах-хазяїнах (наприклад, точка початку реплікації) та селектуємі маркерні гени. Селектуємий маркерний ген полегшує селекцію клітин-хазяїв, у які був введений вектор (дивись, наприклад, патент США №№ 4399216, 4634665 і 5179017, автором усіх патентів є Axel et al.). Наприклад, як правило, селектуємий маркерний ген надає стійкість до лікарських засобів, таких як G418, гігроміцин або метотрексат, клітині-хазяїнові, у яку був введений вектор. Селектуємі маркерні гени включають ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для використання у dhfr- клітинах-хазяїнах з метотрексатною селекцією/ампліфікацією) та ген neo (для селекції G418). Для експресії легкого та важкого ланцюгів, клітину-хазяїна трансфектують експресійним(ими) вектором(ами), що кодує(ють) важкі та легкі ланцюги, за стандартними 11 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 методами. Різні форми терміну "трансфекція" призначені для включення великої різноманітності методів, звичайно використовуваних для введення екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад, електропорації, кальцій-фосфатної преципітації, DEAE-декстранової трансфекції тощо. Теоретично можливо експресувати антитіла відповідно до винаходу або у прокаріотичній, або у еукаріотичній клітині-хазяїні. Експресія антитіл у еукаріотичних клітинах, наприклад, клітинах-хазяївах ссавців, дріжджах або міцеліальних грибах, обговорюється, оскільки такі еукаріотичні клітини та, зокрема, клітини ссавців частіше, ніж прокаріотичні клітини, здійснюють складання та секрецію правильно складеного та імунологічно активного антитіла. У одному окремому варіанті здійснення винаходу, вектор клонування або експресії відповідно до винаходу включає, щонайменше, одну з нижчеподаних кодуючих послідовностей (а)-(с), функціонально пов'язаних з підходящими промоторними послідовностями: (а) SEQ ID NO:22 та SEQ ID NO:23, що кодують, відповідно, повнорозмірні важкі та легкі ланцюги mAb1; (b) SEQ ID NO:24 та SEQ ID NO:25, що кодують, відповідно, повнорозмірні важкі та легкі ланцюги mAb2; або (с) SEQ ID NO:26 та SEQ ID NO:27, що кодують, відповідно, повнорозмірні важкі та легкі ланцюги mAb3. Клітини-хазяїва ссавців для експресії рекомбінантних антитіл відповідно до винаходу, включають клітини яєчнику китайського хом'ячку (клітини СНО) (включаючи dhfr- клітини СНО, описані Urlab і Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, використовувані з DH FR селектуємим маркером, наприклад, як описано у R. J. Kaufman і P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621), CHOK1 dhfr+ клітинні лінії, NSO клітини мієломи, клітини COS та клітини SP2. Зокрема, для використання з NSO клітинами мієломи, іншою експресійною системою є система експресії гену GS, представлена у публікаціях PCT WO 87/04462, WO 89/01036 та EP 0338841. При введенні рекомбінантних експресійних векторів, що кодують гени антитіл, у клітинихазяї ссавців, антитіла продукуються клітинами-хазяями, що культивуються, протягом періоду часу, достатнього для забезпечення можливості експресії антитіла у клітинах-хазяях або секреції антитіла у культуральне середовище, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можуть бути вилучені з культурального середовища, використовуючи стандартні методи очищення білку (дивись, наприклад, Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37). У одному окремому варіанті здійснення винаходу клітина-хазяїн відповідно до винаходу є клітиною-хазяїном, трансфектованою експресійним вектором, що має кодуючі послідовності, вибрані із групи, що складається з (а)-(с), придатні для експресії mAb1-mAb3, відповідно, функціонально пов'язані із придатними послідовностями промотору: (а) SEQ ID NO:22 та SEQ ID NO:23; (b) SEQ ID NO:24 та SEQ ID NO:25; та (с) SEQ ID NO:26 та SEQ ID NO:27. Останні зі згаданих клітин-хазяїв потім можуть додатково культивуватися у придатних умовах для експресії та продукції антитіла відповідно до винаходу, вибраного із групи, що складається з mAb1-mAb3, відповідно. Біспецифічні молекули У іншому аспекті даний винахід представляє біспецифічні або мультиспецифічні молекули, що включають антитіло анти-CD40 або білок відповідно до винаходу. Антитіло або білок відповідно до винаходу можуть утворювати похідну або бути приєднаними до іншої функціональної молекули, наприклад, іншого пептиду або білку (наприклад, іншого антитіла або ліганду для рецептору), для утворення біспецифічної молекули, яка зв'язується, щонайменше, із двома різними сайтами зв'язування або молекулами-мішенями. Антитіло відповідно до винаходу може фактично бути похідними або бути пов'язаним з більше ніж однією іншою функціональною молекулою для утворення мультиспецифічних молекул, які зв'язуються з більше, ніж двома різними сайтами зв'язування та/або молекулами-мішенями; такі мультиспецифічні молекули також попадають під термін "біспецифічна молекула" у тому розумінні, у якому він використовується у даному документі. Для створення біспецифічної молекули відповідно до винаходу, антитіло або білок відповідно до винаходу можуть бути функціонально зв'язані (наприклад, хімічним приєднанням, генетичним зчепленням, нековалентним зв'язком або іншим способом) з однією або декількома іншими зв'язуючими молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або міметик зв'язування, таким чином, щоб у результаті одержати біспецифічну молекулу. У цьому зв'язку даний винахід включає біспецифічну молекулу, що включає, щонайменше, одну специфічну молекулу зв'язування для CD40, наприклад, одну антиген-зв'язуючу частину 12 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кожного з mAb1-mAb3, та другу специфічну молекулу зв'язування для другого епітопу мішені. Наприклад, інший епітоп мішені являє собою інший епітоп CD40, відмінний від першого епітопу мішені. Іншим прикладом є біспецифічна молекула, що включає, щонайменше, одну першу специфічну молекулу зв'язування CD40, наприклад, одну антиген-зв'язуючу частину кожного з mAb1-mAb3, та другу специфічну молекулу зв'язування для епітопу всередині CD40. Крім того, у випадку винаходу, у якому біспецифічна молекула є мультиспецифічною, молекула може додатково включати третю специфічну молекулу зв'язування на додаток до першого та другого епітопу мішені. Біспецифічні молекули даного винаходу можуть бути отримані шляхом об'єднання складових частин специфічних молекул зв'язування, використовуючи методи, відомі у даній галузі техніки. Наприклад, кожна специфічна молекула зв'язування біспецифічної молекули може бути отримана окремо та потім об'єднана одна з іншою. Коли специфічні молекули зв'язування є білками або пептидами, різноманітні об'єднуючі або перехресно-зв'язуючі агенти можуть бути використані для ковалентного з'єднання. Приклади перехресно-реагуючих агентів включають білок А, карбодіімід, сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATA), 5,5’-дитіобіс(2нітробензойна кислота) (DTNB), о-фенілендималеімід (oPDM), N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)пропіонат (SPDP) та сульфосукцинімідил 4-(N-малеімідометил) циклогексан-1карбоксилат (сульфо-SMCC) (дивись, наприклад, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Інші методи включають ті, що описані у Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), та Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375). Кон'югуючими агентами є SATA та сульфо-SMCC, що є в наявності у Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Коли специфічними молекулами зв'язування є антитіла, вони можуть бути кон'юговані за допомогою зв'язування сульфгідрильних груп С-кінцевих шарнірних областей двох важких ланцюгів. У окремому варіанті здійснення винаходу, шарнірну область модифікують із метою вмісту непарного числа сульфгідрильних груп, наприклад однієї, до кон'югування. Альтернативно, обидві специфічні молекул зв'язування можуть бути кодовані у тому самому векторі, їх експресія та складання можуть відбуватися у одній і тій же клітині-хазяїні. Цей метод особливо зручний у тому випадку, коли біспецифічна молекула являє собою mAb×mAb, mAb×Fab, Fab×F(ab")2 або ліганд × химерний білок Fab. Біспецифічна молекула відповідно до винаходу може бути одноланцюговою молекулою, що включає одне одноланцюгове антитіло та детермінанту зв'язування, або одноланцюговою біспецифічною молекулою, що включає дві детермінанти зв'язування. Біспецифічні молекули можуть включати, щонайменше, дві одноланцюгові молекули. Методи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, у патенті США № 5260203; патенті США № 5455030; патенті США № 4881175; патенті США № 5132405; патенті США № 5091513; патенті США № 5476786; патенті США № 5013653; патенті США № 5258498 і патенті США № 5482858. Зв'язування біспецифічних молекул з їхніми специфічними мішенями може бути підтверджене, наприклад, імуносорбентним ферментним аналізом (ELISA), радіоімунологічним аналізом (REA), методом з використанням клітинного сортеру із збудженням флуоресценції (FACS), біоаналізом (наприклад, інгібуванням росту) або аналізом Вестерн-блот. Кожний із цих аналізів, в основному, визначає наявність комплексів білок-антитіло, що представляють особливий інтерес, шляхом використання міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного до досліджуваного комплексу. Мультивалентні антитіла У іншому аспекті даний винахід представляє мультивалентні антитіла, що включають, щонайменше, дві ідентичні або відмінні одна від іншої антиген-зв'язуючі частини антитіл відповідно до винаходу, що зв'язуються з CD40, наприклад, вибрані з антиген-зв'язуючих частин кожного з mAb1-mAb3. У одному варіанті здійснення винаходу мультивалентні антитіла мають, щонайменше, дві, три або чотири антиген-зв'язуючі частини антитіл. Антиген-зв'язуючі частини можуть бути зв'язані одна з одною за допомогою білкового зчеплення або ковалентного або нековалентного зв'язку. Альтернативно, методи зв'язування були описані для біспецифічних молекул. Чотиривалентні зв'язування можуть бути отримані, наприклад, антитілом, що перехресно зв'язує антитіла відповідно до винаходу, яке зв'язується з константними областями антитіл відповідно до винаходу, наприклад, областю Fc або шарнірною областю. Методи терапії, використовуючи антагоністичні анти-CD40 антитіла відповідно до винаходу Методи винаходу спрямовані на використання анти-CD40 антитіл або білків відповідно до винаходу для лікування суб'єктів (наприклад, пацієнтів), що мають аутоімунне захворювання та/або запальне захворювання, або схильність до розвитку аутоімунного захворювання та/або 13 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запального захворювання, де захворювання та/або запалення опосередковане CD40Lопосередкованим проведенням сигналу CD40 у клітинах, що експресують антиген CD40. Методи визначення експресії CD40 у клітинах добре відомі у даній області техніки та включають, крім іншого, метод ПЛР, імуногістохімію, проточну цитометрію, Вестерн-блот, ELISA та ін. Методи відповідно до винаходу особливо придатні для лікування запальних та/або аутоімунних захворювань, де залучена CD40L-опосередкована стимуляція CD40. Запальні захворювання характеризуються запаленням та деструкцією тканини або комбінацією цих двох процесів. "Запальне захворювання" включає будь-який запальний імуноопосередкований процес, де ініціюючий фактор або мішень імунної відповіді включає чужий(і) антиген(и), включаючи, наприклад, алоантигени, ксеноантигени, вірусні антигени, бактеріальні антигени, невідомі антигени або алергени. Більше того, у контексті даного винаходу, термін "запальне(і) захворювання" включає "аутоімунне(і) захворювання". Під терміном "аутоімунна реакція", у тому розумінні, у якому він використовується у даному документі, в основному, розуміють запальні імуно-опосередковані процеси, залучаючи "власні" антигени. При аутоімунних захворюваннях власний(і) антиген(и) запускає імунні відповіді хазяїна. Крім того, даний винахід включає лікування запалення, пов'язаного з відторгненням тканинного трансплантату. "Відторгнення трансплантату" або "відторгнення пересадженого шматка тканини" відноситься до будь-якої характерної для хазяїна імунної відповіді проти трансплантату, включаючи, крім іншого, HLA-антигени, антигени групи крові тощо. Винахід також може бути використаний для лікування реакції трансплантат проти хазяїна у такий же спосіб, як при трансплантації кісткового мозку, наприклад. При такій реакції трансплантат проти хазяїна кістковий мозок донора включає лімфоцити та клітини, які диференціюються у лімфоцити. Лімфоцити донора розпізнають антигени реципієнта як чужі та здійснюють запальну імунну відповідь. У зв'язку із цим, "патологічний процес трансплантат проти хазяїна" у тому розумінні, у якому використовується у даному документі, або "реакція трансплантат проти хазяїна" відноситься до будь-якої Т-клітино-опосередкованої імунної відповіді, у якій лімфоцити донору реагують на антигени хазяїна. Антагоністичні анти-CD40 антитіла або білки, описані у даному документі, наприклад mAb1, mAb2 або mAb3, можуть бути використані відповідно до методів винаходу для лікування аутоімунних та/або запальних порушень, включаючи, крім іншого, системний червоний вовчак (SLE), дискоїдний вовчак, вовчаковий нефрит, саркоідоз, запальний артрит, включаючи хворобу Стілла, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, синдром Рейтера, анкілозуючий спондилоартрит та подагричний артрит, відторгнення трансплантату органу або тканини, надгостре, гостре або хронічне відторгнення та/або реакцію трансплантат проти хазяїна, розсіяний склероз, синдром гіперімуноглобулінемії Е, вузелковий поліартерііт, первинний біліарний цироз, запальну хворобу кишечнику, хворобу Крона, целіакію (глютенчутливу ентеропатію), первинний синдром Шегрена (pSS), аутоімунний гепатит, перніціозну анемію, аутоімунну гемолітичну анемію, псоріаз, склеродермію, міастенію гравіс, аутоімунну тромбоцитопенічну пурпуру, аутоімунний тиреоідит, базедову хворобу, тиреоідит Хашимото, хворобу імунних комплексів, хронічну утому, синдром імунної дисфункції (CFIDS), поліміозит та дерматоміозит, кріоглобулінемію, тромболізис, кардіоміопатію, вульгарну пухирчатку, легеневий інтерстиціальний фіброз, цукровий діабет типу 1 та типу 2, гіперчутливість уповільненого типу 1, 2, 3 та 4 типів, алергію або алергійні порушення, небажані/непередбачувані імунні відповіді на терапевтичні білки (дивись, наприклад, патентну заявку США № US 2002/0119151 і Koren et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), астму, синдром Чарга-Стросса (алергійний гранулематоз), атопічний дерматит, алергійний та іритативний контактний дерматит, кропив'янку, IgE-опосередковану алергію, атеросклероз, ANCA-асоційовані васкуліти, васкуліт, ідіопатичні запальні міопатії, гемолітичну хворобу, хворобу Альцгеймера, хронічну запальну демієлінізуючу полінейропатію тощо. Раніше було показано, що генетична абляція або фармакологічне інгібування сигнального шляху CD40-CD154 виявляють терапевтичний позитивний ефект або у клінічних, або доклінічних моделях SLE, pSS, ITP, MS, хвороби Крона, вульгарної пухирчатки, аутоімунного васкуліту та RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009;647:8-36); медична потреба яких детально описана нижче. У кращих варіантах здійснення винаходу анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу придатні для лікування: (i) системного червоного вовчаку (вовчакового нефриту), переважно для забезпечення ефективної стероїд-зберігаючої терапії для індукції та підтримки ремісії та для запобігання термінальної стадії ниркової недостатності; (ii) первинного синдрому 14 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Шегрена, переважно у запобіганні деструкції слинних та слізних залоз, і індукції і підтримці ремісії екстрагландулярних проявів; (iii) аутоімунної тромбоцитопенічної пурпури, переважно для лікування пацієнтів, що важко піддаються стандартній терапії; (iv) ANCA-асоційованих васкулітів, переважно індукуючи та підтримуючи ремісію у пацієнтів, що важко піддаються терапії кортикостероїдами та стероїдами у помірних дозах; (v) вульгарної пухирчатки, переважно для індукції та підтримки ремісії у пацієнтів, що важко піддаються терапії кортикостероїдами та стероїдами у помірних дозах; (vi) розсіяного склерозу, переважно для забезпечення більш ефективного лікування з метою запобігання рецидивів та прогресування непрацездатності, та для досягнення нормального стану здоров'я; та (vii) хвороби Крона, переважно для забезпечення більш ефективної терапії для підтримки ремісії, та для лікування пацієнтів, що важко піддаються терапії анти-TNF. У деяких інших варіантах здійснення винаходу, анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу придатні для лікування запальних захворювань легенів, включаючи, крім іншого, відторгнення легеневого трансплантату, астму, саркоїдоз, емфізему, муковісцидоз, ідіопатичний фіброз легенів, хронічний бронхіт, алергійний риніт та алергійні захворювання легенів, такі як алергійний альвеоліт, еозинофільна пневмонія, облітеруючий бронхіоліт внаслідок трансплантації кісткового мозку та/або легені або інших причин, атеросклероз/флебосклероз внаслідок тканинної трансплантації, а також фіброз легенів у результаті колагенових, судинних та аутоімунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит, склеродермія та червоний вовчак. "Лікування" у даному документі означає застосування або призначення анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, суб'єктові, або застосування або призначення фармацевтичної композиції, що включає зазначене анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, відносно виділеної тканини або клітинної лінії із суб'єкта, де суб'єкт має аутоімунне захворювання та/або запальне захворювання, симптом, асоційований з аутоімунним захворюванням та/або запальним захворюванням, або схильність до розвитку аутоімунного захворювання та/або запального захворювання, де метою є зцілення, загоєння, полегшення стану, ослаблення симптомів, внесення змін, лікування, поліпшення, нормалізація та вплив на аутоімунне захворювання та/або запальне захворювання, будь-які асоційовані симптоми аутоімунного захворювання та/або запального захворювання, або на схильність до розвитку аутоімунного захворювання та/або запального захворювання. Під терміном "лікування" також мають на увазі застосування або призначення фармацевтичної композиції, що включає анти-CD40 антитіла або білок відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, суб'єктові, або застосування або призначення фармацевтичної композиції, що включає зазначене анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, відносно виділеної тканини або клітинної лінії із суб'єкта, де суб'єкт має аутоімунне захворювання та/або запальне захворювання, симптом, асоційований з аутоімунним захворюванням та/або запальним захворюванням, або схильність до розвитку аутоімунного захворювання та/або запального захворювання, де метою є зцілення, загоєння, полегшення стану, ослаблення симптомів, внесення змін, лікування, поліпшення, нормалізація та вплив на аутоімунне захворювання та/або запальне захворювання, будь-які асоційовані симптоми аутоімунного захворювання та/або запального захворювання, або на схильність до розвитку аутоімунного захворювання та/або запального захворювання. Під "протизапальною активністю" мають на увазі зменшення або запобігання запалення. Терапія, щонайменше, одним анти-СD40 антитілом або білком відповідно до винаходу викликає фізіологічну відповідь, яка благотворно впливає на лікування аутоімунного захворювання та/або запального захворювання, де у захворювання залучені клітини, що експресують CD 40-антиген. Слід визнати, що методи відповідно до винаходу можуть бути придатні для запобігання фенотипових змін клітин, таких як проліферація, активація тощо. Відповідно до методів відповідно до даного винаходу, щонайменше, одне анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, як визначено вище у даному документі, використовується для стимуляції позитивної терапевтичної відповіді відносно лікування або запобігання аутоімунного захворювання та/або запального захворювання. Під "позитивною терапевтичною відповіддю" у відношенні аутоімунного захворювання та/або запального захворювання мають на увазі поліпшення перебігу захворювання у зв'язку із протизапальною активністю цих антитіл або білків, та/або поліпшення симптомів, асоційованих з даним захворюванням. Тобто можна спостерігати антипроліферативний ефект, запобігання подальшої проліферації CD40-експресуючих клітин, зменшення запальної відповіді, включаючи, крім іншого, знижену секрецію цитокінів запалення, молекул адгезії, протеаз, імуноглобулінів (у прикладах, де CD40-експресуючою клітиною є В клітина), комбінація перерахованого вище і таке інше, підвищену продукцію протизапальних білків, зменшення числа аутореактивних 15 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітин, збільшення імунної толерантності, інгібування виживаності аутореактивних клітин, та/або ослаблення одного або декількох симптомів, опосередкованих стимуляцією CD40-експресуючих клітин. Такі позитивні терапевтичні відповіді не лімітовані способом застосування та можуть включати призначення донорові, донорській тканині (як, наприклад, перфузія органу), хазяїнові або комбінацію перерахованого вище тощо. Оцінку клінічної відповіді можна одержати, використовуючи методи скринінгу, такі як сканування за допомогою магнітної резонансної томографії (MRI), рентгенографія, сканування за допомогою комп'ютерної томографії (СТ), проточна цитометрія або аналіз із використанням клітинного сортеру із збудженням флуоресценції (FACS), гістологія, макропатологічне дослідження, біохімічний аналіз крові, включаючи, крім іншого, зміни, детектуємі ELISA, RIA, хроматографією тощо. Крім цих позитивних терапевтичних відповідей, у суб'єкта, якому проводять терапію антагоністичним анти-CD40 антитілом або білком відповідно до винаходу, можна спостерігати позитивний вплив на симптоми, пов'язані із захворюванням. Під "терапевтично ефективною дозою або кількістю" або "ефективною кількістю" мають на увазі кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, який при застосуванні викликає позитивну терапевтичну відповідь відносно лікування суб'єкта з аутоімунним захворюванням та/або запальним захворюванням. У деяких варіантах здійснення винаходу, терапевтично ефективна доза анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3, знаходиться у діапазоні від 0,01 до 40 мг/кг, від 3 до 20 мг/кг або від 7 до 12 мг/кг. Слід визнати, що метод лікування може включати єдине призначення терапевтично ефективної дози або багаторазові призначення терапевтично ефективної дози антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу. Додатковим варіантом здійснення винаходу є використання анти-CD40 антитіл або білків відповідно до винаходу для діагностичного моніторення рівнів білку у тканині як частина процедури клінічних випробувань, наприклад, визначення ефективності певної схеми лікарської терапії. Визначення може бути полегшене з'єднанням антитіла з детектуємим речовиною. Приклади детектуємих речовин включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали. Приклади придатних ферментів включають пероксидазу хріну, алкалінфосфатазу, Pгалактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади придатних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади придатних флуоресцентних матеріалів включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин; приклад люмінесцентного матеріалу включає люмінол; приклади біолюмінесцентного матеріалу включають люциферазу, 125 131 35 люциферин та екворин; приклади придатних радіоактивних матеріалів включають I, I, S 3 або H. Анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 можуть бути використані у комбінації з будь-якої відомою терапією аутоімунних та запальних захворювань, включаючи будь-яку речовину або комбінацію речовин, які свідомо є придатними, або які вже були використані або у цей момент використовуються, для лікування аутоімунних та запальних захворювань. Такі терапевтичні впливи та терапевтичні речовини включають, крім іншого, хірургічну операцію або оперативне втручання (наприклад, спленектомію, лімфаденектомію, тиреоідектомію, плазмаферез, лейкофорез, трансплантацію клітин, тканини або органу, шлунково-кишкові маніпуляції, перфузію органу тощо), променеву терапію, терапію таку, як стероїдна терапія та нестероїдна терапія, гормонотерапія, цитокінотерапія, терапія з дерматологічними речовинами (наприклад, місцеводіючими засобами, використовуваними для лікування шкірних патологій, таких як алергія, контактний дерматит та псоріаз), імуносупресивна терапія, та інші способи протизапальної терапії моноклональними антитілами тощо. Таким чином, антагоністичні анти-CD40 антитіла або білки, описані у даному документі, призначають у комбінації, щонайменше, з одним іншим видом терапії, включаючи, крім іншого, хірургічну операцію, перфузію органу, променеву терапію, стероїдну терапію, нестероїдну терапію, антибіотикотерапію, протигрибкову терапію, гормонотерапію, цитокінотерапію, терапію з дерматологічними речовинами (наприклад, місцеводіючі засоби, використовувані для лікування шкірних патологій, таких як алергія, контактний дерматит та псоріаз), імуносупресивна терапія, інші способи терапії із застосуванням протизапальних моноклональних антитіл, їх комбінації тощо. Таким чином, у випадку, коли комбінована терапія включає призначення анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, такого як mAb1, mAb2 або mAb3, у комбінації із призначенням іншого терапевтичного засобу, як зі стероїдами як один із прикладів, методи відповідно до 16 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу полягають у спільному застосуванні лікарських засобів, використовуючи окремі композиції або єдину фармацевтичну композицію, та у послідовному застосуванні у будь-якому порядку. У випадку, коли методи відповідно до даного винаходу включають комбіновані терапевтичні схеми, ці лікарські засоби можуть бути застосовані одночасно, тобто анти-CD40 антитіла або білок відповідно до даного винаходу застосовують паралельно або в межах тих самих тимчасових рамок як і інший лікарський засіб (тобто лікарські засоби застосовують паралельно, але анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу не застосовують точно у той самий час, що і інший лікарський засіб). Альтернативно, анти-CD40 антитіло відповідно до даного винаходу або білок відповідно до винаходу може також бути застосований до або після іншої терапії. Послідовне застосування різних лікарських засобів може бути виконане незалежно від того, чи відповідає суб'єкт, який лікується, на перший курс терапії, щоб зменшити ймовірність появи ремісії або рецидиву захворювання. У деяких варіантах здійснення винаходу анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіло, призначають у комбінації з імунодепресантами або протизапальними засобами, де антитіло або білок та терапевтичний(і) засіб(засоби) можуть застосовуватися послідовно, у будь-якому порядку, або одночасно (тобто паралельно або в межах тих самих тимчасових рамок). Приклади придатних імунодепресантів, які можна застосовувати у комбінації з антагоністичними анти-CD40 антитілами або білками відповідно до винаходу, наприклад, антитілом mAb1, mAb2 або mAb3, включають, крім іншого, метотрексат, циклофосфамід, мізорибін, хлорамбуцил, циклоспорин, такий як, наприклад, аерозольний циклоспорин (дивись, публікацію патентної заявки США № US 2002/0006901), такролімус (FK506; Prografrm), мофетилу мікофенолат та азатіоприн (6-меркаптопурин), сіролімус (рапаміцин), деоксиспергуалін, лефлуномід та його малононітриламідні аналоги; імуносупресивні білки, включаючи, наприклад, гібридні білки анти-CTLA4 антитіла та Ig, гібридні білки стимулюючих В-лімфоцити антитіл (наприклад, LYMPHOSTAT-BTM) та Ig (BlyS-Ig), антиCD80 антитіла та етанерцепт (Enbrel (RTM)), а також антитіла проти Т-клітин, такі як анти-CD3 (OKT3), анти-CD4 і т.п. Приклади придатних протизапальних речовин включають, крім іншого, кортикостероїди, такі як, наприклад, клобетазол, галобетазол, гідрокортизон, триамцинолон, бетаметазон, флуоцинолон, флуоцинонід, преднізон, преднізолон, метилпреднізолон; нестероїдні протизапальні засоби (NSAID), такі як, наприклад, сульфасалазин, лікарські засоби, що містять мезаламін (що називаються 5-ASA речовинами), целекоксиб, диклофенак, етодолак, фенопрофен, флурбіпрофен, ібупрофен, кетопрофен, меклофамат, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, піроксикам, рофекоксиб, саліцилати, суліндак та толметин; інгібітори фосфодіетерази-4, протизапальні антитіла, такі як адалімумаб (HUMERA (RTM), антагоніст TNF-α) та інфліксимаб (Ремікейд, антагоніст TNF-α) тощо. Також включені імуномодулятори поточного або потенційного використання при лікуванні аутоімунного захворювання, такі як талідомід або його аналоги, такі як леналідомід. Відторгнення трансплантату та реакція трансплантат проти хазяїна можуть бути надгострими (гуморальними), гострими (Т-клітиноопосередкованими) або хронічними (невідомої етіології) або їх комбінацією. Таким чином, анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, використовуються у деяких варіантах здійснення винаходу, щоб запобігти та/або уникнути відторгнення та/або симптомів, асоційованих зі надгострим, гострим та/або хронічним відторгненням трансплантату будь-якої тканини, включаючи, крім іншого, печінку, нирки, підшлункову залозу, острівкові клітки підшлункової залози, тонкий кишечник, легеню, серце, рогівку, шкіру, кров'яні судини, кістку, гетерологічний або аутологічний кістковий мозок тощо. Тканини трансплантату можуть бути отримані з будь-якого донору та трансплантовані у будь-якого реципієнта-хазяїна, та, відповідно, процедура трансплантації може включати трансплантацію тваринної тканини людям (наприклад, ксенотрансплантати), трансплантацію тканини від однієї людини іншій людині (наприклад, алотрансплантати) та/або трансплантацію тканини з однієї частини тіла людини у іншу (наприклад, аутотрансплантати). Лікування антитілами або білками відповідно до винаходу може також зменшувати ускладнення трансплантації, такі як лихоманка, анорексія, гемодинамічні порушення, лейкопенія, інфільтрацію білими клітинами крові трансплантованого органу/тканини, а також опортуністичні інфекції. У деяких варіантах здійснення винаходу анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, можуть бути використані окремо або у комбінації з імунодепресантами для лікування та/або запобігання відторгнення трансплантату, такого як надгостре, гостре та/або хронічне відторгнення, та/або реакції трансплантат проти хазяїна. 17 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно, у деяких варіантах здійснення винаходу, де анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу використовуються для лікування відторгнення трансплантату, антитіла, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, можуть бути використані у комбінації із придатними імунодепресантами, включаючи, крім іншого, метотрексат; циклофосфамід; мізорибін; хлорамбуцил; циклоспорин, такий як, наприклад, аерозольний циклоспорин (дивись, публікацію патентної заявки США № US20020006901), такролімус (FK506; Prografm), мофетилу мікофенолат та азатіоприн (6-меркаптопурин), сіролімус (рапаміцин), деоксиспергуалін, лефлуномід та його малононітриламідні аналоги; імуномодулятори, включаючи, наприклад, талідомід та його аналоги; та імуносупресивні білки, включаючи, наприклад, гібридні білки антиCTLA антитіл та Ig, гібридні білки стимулюючих В-лімфоцити антитіл (наприклад, LYMPHOSTAT-BTM) та Ig (BlyS-Ig), анти-CD80 антитіла та етанерцепт (Enbrel (RTM)), а також антитіла проти Т-клітин, такі як анти-CD3 (OKT3), анти-CD4 тощо. У зв'язку із цим, спеціально передбачено, що композиції та методи відповідно до винаходу використовуються у комбінації з іншими лікарськими засобами для подальшого поліпшення симптомів та результатів у реципієнтів трансплантату, як, наприклад, у тих, які одержують трансплантати легенів або нирок, наприклад. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, використовуються для лікування відторгнення трансплантату (такого, як, наприклад, надгострого, гострого та/або хронічного відторгнення або реакція трансплантат проти хазяїна у реципієнтів трансплантатулегенів або нирок) окремо або у комбінації із циклоспорином, призначуваним парентерально та/або непарентерально, включаючи, наприклад, циклоспорин перорального застосування, циклоспорин, що вводять ін'єкцією, аерозольний (наприклад, інгаляційний) циклоспорин, та їхні комбінації. У деяких варіантах здійснення винаходу, де, щонайменше складовою терапії є аерозольний циклоспорин, циклоспорин надходить у легені реципієнта інгаляцією циклоспорину у вигляді аерозольного спрею, використовуючи, наприклад, пристосування, що знаходиться під тиском, для доставки препарату або аерозольний апарат. Циклоспорин можуть призначати у вигляді сухого порошку або вологої лікарської форми. Циклоспорин можуть призначати у субтерапевтичній дозі. У деяких інших варіантах здійснення винаходу, анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, можуть бути використані окремо або у комбінації з імунодепресантами для лікування та/або запобігання ревматоїдного артриту. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу, де анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, використовуються для лікування ревматоїдного артриту, зазначені антитіла або білки можуть бути використані у комбінації із придатними імунодепресантами, включаючи, крім іншого, метотрексат, циклофосфамід, мізорибін, хлорамбуцил, циклоспорин, такролімус (FK506; PROGRAFTM), мофетилу мікофенолат та азатіоприн (6-меркаптопурин), сіролімус (рапаміцин), деоксиспергуалін, лефлуномід та його малононітриламідні аналоги; імуномодулятори, включаючи, наприклад, талідомід та його аналоги; та імуносупресивні білки, включаючи, наприклад, гібридні білки антиCTLA антитіл та Ig, гібридні білки стимулюючих В-лімфоцити антитіл (наприклад, LYMPHOSTAT-BTM) та Ig (BlyS-Ig), анти-CD20 антитіла (наприклад, RITUXAN (g)); повністю людське антитіло HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, тозитумомаб/1-131, тозитумомаб (Bexxar (D), ібритумомаб тітуксетан (Zevalin (RTM)); анти-CD80 антитіла, та етанерцепт (ENBREL), а також антитіла проти Т-клітин, такі як анти-CD3 (OKT3), анти-CD4 тощо. Як обговорювалося вище, ефективність лікування може бути оцінена, використовуючи будь-які способи, та включає, крім іншого, ефективність, вимірювану клінічними відповідями, обумовленими критеріями Американської колегії ревматології або будь-якими іншими критеріями. Дивись, наприклад, Felson et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38: 727-35 and van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39:34-40. У ще інших варіантах здійснення винаходу анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, можуть бути використані окремо або у комбінації з імунодепресантами для лікування та/або запобігання розсіяного склерозу. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу, де анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, використовуються для лікування розсіяного склерозу, антитіла можуть використовуватися у комбінації із придатними імунодепресантами, включаючи, крім іншого, метотрексат, циклофосфамід, мізорибін, хлорамбуцил, циклоспорин, такролімус (FK506; PROGRAFTM), мофетилу микофенолат та азатіоприн (6-меркаптопурин), сіролімус (рапаміцин), деоксиспергуалін, лефлуномід та його малононітриламідні аналоги; та імуносупресивні білки, включаючи, наприклад, гібридні білки анти-CTLA антитіл та Ig, гібридні білки стимулюючих В-лімфоцити антитіл (наприклад, 18 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 LYMPHOSTAT-BTM) та Ig (BlyS-Ig), анти-CD20 антитіла (наприклад, RITUXAN (D); повністю людське антитіло HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, AME-133, тозитумомаб/1-131, тозитумомаб (Bexxar (RTM)), ібритумомаб тітуксетан (Zevalin (RTM)); анти-CD80 антитіла, та етанерцепт (ENBREL), а також антитіла проти Т-клітин, такі як анти-CD3 (OKT3), анти-CD4, речовини, залучені у модуляцію рецептору S1P, включаючи, наприклад, фінголімод; тощо. Фармацевтичні композиції та способи застосування Анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу застосовують у концентрації, яка є терапевтично ефективною для запобігання або лікування аутоімунних захворювань та/або запальних захворювань та/або для запобігання або зниження ризиків, асоційованих з відторгненням трансплантату при трансплантації. Для досягнення цієї мети антитіла можуть бути виготовлені, використовуючи ряд прийнятних допоміжних речовин, відомих у даній галузі техніки. Як правило, антитіла або білки призначають у вигляді ін'єкцій, наприклад, або внутрішньовенно, внутрішньочеревинно або підшкірно. Методи виконання цього призначення відомі середньому фахівцеві у даній галузі техніки. Також представляється можливим одержати композиції, які можуть бути застосовані місцево або перорально, або які можуть мати здатність проникати через мембрани слизової оболонки. Внутрішньовенне застосування здійснюють переважно інфузією протягом періоду від приблизно 1 до приблизно 10 годин, більш переважно протягом періоду від приблизно 1 до приблизно 8 годин, ще більш переважно протягом періоду від приблизно 2 до приблизно 7 годин, ще більш переважно протягом періоду від приблизно 4 до приблизно 6 годин, залежно від застосування анти-CD40 антитіла або білку. Початкова інфузія фармацевтичної композиції може бути призначена протягом періоду від приблизно 4 до приблизно 6 годин з наступними інфузіями, проведеними швидше. Наступні інфузії можуть бути призначені протягом періоду від приблизно 1 до приблизно 6 годин, включаючи, наприклад, від приблизно 1 до приблизно 4 годин, від приблизно 1 до приблизно 3 годин або від приблизно 1 до приблизно 2 годин. Фармацевтична композиція відповідно до винаходу створюється таким чином, щоб бути сумісною з передбаченим способом застосування. Приклади можливих способів застосування включають парентеральний (наприклад, внутрішньовенний (IV), внутрішнм'язовий (IM), внутрішньошкірний, підшкірний (SC) або інфузійний), пероральний або легеневий (наприклад, інгаляційний), назальний, трансдермальний (місцевий), трансмукозальний та ректальний спосіб застосування. Розчини або суспензії, використовувані для парентерального, внутрішншкірного або підшкірного застосування можуть включати наступні компоненти: стерильний розріджувач, такий як вода для ін'єкції, сольовий розчин, жирні масла, поліетиленгліколі, гліцерин, пропіленгліколь або інші синтетичні розчинники; антибактеріальні речовини, такі як бензиловий спирт або метилпарабени; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або бісульфіт натрію; хелатуючі агенти, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота; буфери, такі як ацетати, цитрати або фосфати та речовини для коректування тонічності, такі як хлорид натрію або декстроза. Величина рН може бути скоректована кислотами або основами, такими як соляна кислота або гідроксид натрію. Парентеральний засіб може бути введений у ампули, одноразові шприци, або флакони для багаторазового приймання, зроблені зі скла або пластику. Анти-CD40 антитіла або білки відповідно до винаходу звичайно забезпечують стандартним способом фармацевтично прийнятним буфером, наприклад, стерильним сольовим розчином, стерильна буферна вода, пропіленгліколь, комбінації вищезгаданого, та ін. Методи приготування парентерально застосовуваних речовин описані у Remington's Pharmaceutical th Sciences (18 ed., Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Дивись також, наприклад, WO 98/56418, який описує стабілізовані фармацевтичні композиції антитіл, придатні для використання у методах відповідно до даного винаходу. Кількість, щонайменше, одного антагоністичного анти-CD40 антитіла або білків відповідно до винаходу, що підлягають застосуванню, легко визначається будь-яким середнім фахівцем у даній галузі техніки. Фактори, що впливають на спосіб застосування та відповідну кількість, щонайменше, одного антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку, включають, крім іншого, певне захворювання, що підлягає терапевтичному впливу, важкість захворювання, історію захворювання, та вік, зріст, масу, стан здоров'я, стан за даними фізикального обстеження індивідуума, що проходить терапевтичне лікування. Аналогічним чином, кількість антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку, що підлягає застосуванню, буде залежати від способу застосування та від того, чи вводять суб'єктові одиничну дозу або багаторазові дози цієї речовини. Як правило, більш високе дозування анти-CD40 антитіла або білку є кращим зі збільшенням маси пацієнта, що проходить терапевтичне лікування. Доза анти-CD40 антитіла 19 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або білку, що підлягає застосуванню, знаходиться у діапазоні від приблизно 0,003 мг/кг до приблизно 50 мг/кг, переважно у діапазоні від 0,01 мг/кг до приблизно 40 мг/кг. Таким чином, наприклад, доза може становити 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 мг/кг. У іншому варіанті здійснення винаходу метод включає призначення багаторазових доз антагоністичного анти-CD40 антитіла або його фрагменту. Метод може включати призначення 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 або більше терапевтично ефективних доз фармацевтичної композиції, що включає антагоністичне анти-CD40 антитіло або його фрагмент. Частота та тривалість застосування багаторазових доз фармацевтичних композицій, що включають анти-CD40 антитіло або білок, може бути легко визначена будь-яким фахівцем у даній галузі техніки. Більше того, лікування суб'єкта терапевтично ефективною кількістю антитіла або білку може включати одноразовий лікарський вплив або, переважно, може включати серію лікарських впливів. У кращому прикладі, суб'єкта лікують антагоністичним антиCD40 антитілом або білком відповідно до винаходу у діапазоні від приблизно 0,1 до 20 мг/кг маси тіла, один раз на тиждень протягом від приблизно 1 до 10 тижнів, переважно від приблизно 2 до 8 тижнів, більш переважно від приблизно 3 до 7 тижнів, та навіть більш переважно протягом приблизно 4, 5 або 6 тижнів. Лікування можна проводити щорічно для запобігання рецидиву або при вказівці на рецидив. Також береться до уваги те, що ефективне дозування антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту, використовуваного для лікування, може збільшуватися або зменшуватися у ході певного терапевтичного лікування. Зміни у дозуванні можуть виникати та це стає очевидними з результатів діагностичних аналізів, як описано у даному документі. Таким чином, у одному варіанті здійснення винаходу, схема дозування включає перше застосування терапевтично ефективної дози, щонайменше, одного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу на 1, 7, 14 та 21 дні лікувального періоду. У іншому варіанті здійснення винаходу схема дозування включає перше застосування терапевтично ефективної дози, щонайменше, одного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу на 1, 2, 3, 4, 5, 6 та 7 дні тижня у лікувальному періоді. Додаткові варіанти здійснення винаходу включають схему дозування, що має перше застосування терапевтично ефективної дози, щонайменше, одного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу на 1, 3, 5 та 7 дні тижня у лікувальному періоді; схему дозування, що включає перше призначення терапевтично ефективної дози, щонайменше, одного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу на 1 та 3 дні тижня у лікувальному періоді; та кращу схему дозування, що включає перше застосування терапевтично ефективної дози, щонайменше, одного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу у 1 день тижня лікувального періоду. Лікувальний період може включати 1, 2, 3 тижня, місяць, 3, 6 місяців або рік. Лікувальні періоди можуть йти один за одним або відділені один від іншого днем, тижнем, 2 тижнями, місяцем, 3, 6 місяцями або роком з режимом дозування від 0,003 до 50 мг/кг, від 0,01 до 40 мг/кг, від 0,01 до 30 мг/кг, від 0,1 до 30 мг/кг, від 0,5 до 30 мг/кг, від 1 до 30 мг/кг, від 3 до 30 мг/кг, від 3 до 25 мг/кг, від 3 до 20 мг/кг, від 5 до 15 мг/кг або від 7 до 12 мг/кг. Таким чином, наприклад, доза будь-якого антагоністичного анти-CD40 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту, наприклад, анти-CD40 моноклонального антитіла або білку відповідно до винаходу, може становити 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мг/кг або інші такі дози, що знаходяться у межах діапазону від 0,003 до 50 мг/кг. Та сама терапевтично ефективна доза анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу може бути призначена на всьому протязі кожного тижня дозування антитіла. Альтернативно, різні терапевтично ефективні дози антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу можуть бути використані протягом лікувального періоду. У деяких варіантах здійснення винаходу, початкова терапевтично ефективна доза антагоністичного анти-CD40 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту, як визначено денебудь ще у даному документі, може бути у більш низькому діапазоні дозування (тобто від 0,003 до 20 мг/кг) з наступними дозами, що знаходяться у межах більш високого діапазону дозування (тобто від 20 до 50 мг/кг). У альтернативних варіантах здійснення винаходу початкова терапевтично ефективна доза антагоністичного анти-CD40 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту, як визначено денебудь ще у даному документі, може бути у верхньому діапазоні дозування (тобто від 20 до 50 мг/кг) з наступними дозами, що знаходяться у межах більш низького діапазону дозування (тобто від 0,003 до 20 мг/кг). Таким чином, у одному варіанті здійснення винаходу, початкова терапевтично ефективна доза антагоністичного анти-CD40 антитіла або його антигензв'язуючого фрагменту становить від 20 до 35 мг/кг, включаючи приблизно 20 мг/кг, приблизно 20 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25 мг/кг, приблизно 30 мг/кг та приблизно 35 мг/кг, та наступні терапевтично ефективні дози антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу становлять від приблизно 5 мг/кг до приблизно 15 мг/кг, включаючи приблизно 5, 8, 10, 12 мг/кг та приблизно 15 мг/кг. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-CD40 терапія починається із призначення "навантажувальної дози" антитіла або білку відповідно до винаходу суб'єктові, що потребує анти-CD40 терапії. Під "навантажувальною дозою" мають на увазі початкову дозу анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, яку призначають суб'єктові, де призначувана доза антитіла або білку відповідно до винаходу знаходиться у межах більш високого діапазону дозування (тобто від приблизно 20 мг/кг до приблизно 50 мг/кг). "Навантажувальна доза" може бути призначена у вигляді одноразового застосування, наприклад, одноразової інфузії, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент призначається IV, або у вигляді багаторазових застосувань, наприклад, багаторазових інфузій, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент призначається IV доти, поки повна "навантажувальна доза" не буде введена в межах приблизно 24-годинного періоду. Слідом за призначенням "навантажувальної дози" суб'єктові потім вводять одну або кілька додаткових терапевтично ефективних доз анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу. Послідовні терапевтично ефективні дози можуть бути призначені, наприклад, відповідно до щотижневої схеми дозування, або один раз кожні два тижні, один раз кожні три тижні, або один раз кожні чотири тижні. У таких варіантах здійснення винаходу, послідовні терапевтично ефективні дози, як правило, знаходяться у межах більш низького діапазону дозування (тобто від 0,003 до 20 мг/кг). Альтернативно, у деяких варіантах здійснення винаходу, слідом за "навантажувальною дозою" призначають послідовні терапевтично ефективні дози анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу у відповідності зі "схемою підтримки потрібного стану", де терапевтично ефективну дозу антитіла або білку відповідно до винаходу призначають один раз на місяць, один раз кожні 6 тижнів, один раз кожні два місяці, один раз кожні 10 тижнів, один раз кожні три місяці, один раз кожні 14 тижнів, один раз кожні чотири місяці, один раз кожні 18 тижнів, один раз кожні п'ять місяців, один раз кожні 22 тижня, один раз кожні шість місяців, один раз кожні 7 місяців, один раз кожні 8 місяців, один раз кожні 9 місяців, один раз кожні 10 місяців, один раз кожні 11 місяців, або один раз кожні 12 місяців. У таких варіантах здійснення винаходу терапевтично ефективні дози анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу знаходяться у межах більш низького діапазону дозування (тобто від 0,003 мг/кг до приблизно 20 мг/кг), зокрема, коли послідовні дози призначають із більш частими інтервалами, наприклад, один раз кожні два тижні до одного разу щомісяця, або у межах більш високого діапазону дозування (тобто від 20 до 50 мг/кг), зокрема, коли послідовні дози призначають із менш частими інтервалами, наприклад, де послідовні дози призначають із інтервалом від одного місяця до 12 місяців. Будь-яка фармацевтична композиція, що включає анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, що мають задані функціональні властивості, описані у даному документі, у якості терапевтично активного компоненту може бути використана у методах відповідно до винаходу. Отже, рідкі, ліофілізовані або висушені розпиленням композиції, що включають одне або декілька анти-CD40 антитіл або білків відповідно до винаходу, наприклад, антитіла mAb1, mAb2 або mAb3, можуть бути приготовлені у вигляді водного або неводного розчину або суспензії для послідовного призначення суб'єктові відповідно до методів відповідно до винаходу. Кожна із цих композицій включає, щонайменше, одне з анти-CD40 антитіл або один із білків відповідно до даного винаходу в якості терапевтично або профілактично активного компоненту. Під "терапевтично або профілактично активним компонентом" мають на увазі анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, специфічно включені у композицію для досягнення бажаного терапевтичної або профілактичної відповіді відносно лікування, запобігання виникнення або діагностики захворювання або патологічного стану у суб'єкта, коли фармацевтичну композицію призначають даному суб'єктові. Переважно, фармацевтичні композиції включають стабілізуючі речовини, об'ємоутворюючі речовини або обидві речовини для мінімізації проблем, пов'язаних із втратою стабільності та біологічної активності білку під час готування та зберігання. Інертні речовини можуть бути додані до фармацевтичних композицій, що включають антиCD40 антитіло або білок відповідно до винаходу. Ці інертні речовини можуть включати, крім іншого, масла, полімери, вітаміни, вуглеводні, амінокислоти, солі, буфери, альбумін, сурфактанти або об'ємоутворюючі речовини. Переважно, вуглеводні включають цукор або цукрові спирти, такі як моно-, ди- або полісахариди, або водорозчинні глюкани. Сахариди або глюкани можуть включати фруктозу, глюкозу, манозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, 21 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 декстран, пулулан, декстрин, α- та β-циклодекстрин, розчинний крохмаль, гідроксиетиловий крохмаль та карбоксиметилцелюлозу або суміші перерахованого вище. "Цукровий спирт" - це вуглеводень С4-С8, що має гідроксильну групу, та включає галактитол, інозитол, манітол, ксилітол, сорбітол, гліцерол та арабіт. Ці цукри або цукрові спирти можуть бути використані індивідуально або комбіновано. Концентрація цукру або цукрового спирту може бути в межах від 1,0 % до 7 % маса/об'єм, більш переважно від 2,0 % до 6 % маса/об'єм. Наприклад, амінокислоти включають лівообертальні (L) форми карнітину, аргініну та бетаїну; однак, можуть бути додані інші амінокислоти. Кращі полімери включають полівінілпіролідон (PVP) із середньою молекулярною вагою від 2000 до 3000, або поліетиленгліколь (PEG) із середньою молекулярною масою від 3000 до 5000. Сурфактанти, які можуть бути додані до композиції, представлено у ЕР №№ 270799 і 268110. Крім того, антитіла можуть бути хімічно модифіковані ковалентною кон'югацією з полімером для збільшення їх часу життя у циркулюючій крові, наприклад. Кращі полімери та методи їх прикріплення до пептидів представлені у патенті США №№ 4766106; 4179337; 4495285; і 4609546. Кращі полімери є поліоксиетильованими поліолами та поліетиленгліколями (PEG). PEG розчинний у воді при кімнатній температурі та має основну формулу: R(O-CH2-CH2)nО-R, де R може бути воднем або захисною групою, такою як алкільна або алканольна група. Переважно, захисна група має від 1 до 8 вуглеців, більш переважно, коли вона є метильною. Символ n є позитивним цілим числом, переважно, від 1 до 1000, більш переважно від 2 до 500. PEG має краща середню молекулярну масу від 1000 до 40000, більш переважно від 2000 до 20000, найбільше переважно від 3000 до 12000. Переважно, PEG має, щонайменше, одну гідроксигрупу, яка більш переважно є кінцевою гідроксигрупою. Вона є саме тією гідроксигрупою, яка переважно активується для взаємодії з вільною аміногрупою на інгібіторі. Однак, слід розуміти, що тип та кількість реактивних груп може варіюватися для досягнення ковалентно кон'югованого зв'язування PEG/антитіло відповідно до даного винаходу. Водорозчинні поліоксиетильовані поліоли також придатні у даному винаході. Вони включають поліоксиетильований сорбітол, поліоксиетильовану глюкозу, поліоксиетильованмй гліцерол (POG) тощо. Кращим є POG. Одна причина полягає у тому, що гліцероловий скелет поліоксиетильованого гліцеролу є таким же, як зустрічається у природі, наприклад, у тварин та людей у моно-, ди-, тригліцеридах. Отже, це розгалуження не обов'язково буде розглядатися як чужорідна речовина у організмі. POG має кращу молекулярну масу у тому ж діапазоні, що і PEG. Структура POG показана у Knauf et al. (1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070) та обговорення кон'югатів POG/IL-2 можна знайти у патенті США № 4766106. Іншою системою доставки лікарського засобу для підвищення його часу життя у циркулюючій крові є ліпосома. Методи готування ліпосомних систем доставки обговорюються у Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; і Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467. Інші системи доставки лікарського засобу відомі у даній галузі техніки та описані, наприклад, у Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed., Oxford, N. Y.) pp. 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277. Інертна речовина, що підлягає включенню у фармацевтичну композицію, повинна забезпечити стабільність антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу. Тобто, анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу повинні зберігати свою фізичну та/або хімічну стабільність та мати задані функціональні властивості, тобто одну або декілька заданих функціональних властивостей, визначених вище у даному документі. Методи моніторингу стабільності білку добре відомі у даній галузі техніки. Дивись, наприклад, Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York); та аналіз стабільності розглянуті у даному документі нижче. Як правило, стабільність білку виміряється при обраній температурі у певний період часу. У кращих варіантах здійснення винаходу, стабільна фармацевтична композиція антитіла забезпечує стабільність антагоністичного анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу в умовах зберігання при кімнатній температурі (приблизно 25ºС) протягом, щонайменше, 1 місяця, щонайменше, 3 місяців або, щонайменше, 6 місяців, та/або стабільна приблизно при 2-8ºС протягом, щонайменше, 6 місяців, щонайменше, 9 місяців, щонайменше, 12 місяців, щонайменше, 18 місяців, щонайменше, 24 місяців. Вважається, що білок, такий як антитіло, що входить до складу фармацевтичної композиції, зберігає свою фізичну стабільність у цей момент часу, якщо в нього не виявляють ніяких видимих ознак (тобто зміна кольору або втрата прозорості) або вимірюваних ознак (наприклад, використовуючи гель-фільтрацію (SEC) або розсіювання УФ-випромінювання) преципітації, агрегації та/або денатурації у цій фармацевтичній композиції. Що стосується хімічної 22 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стабільності, вважається, що білок, такий як антитіло, що входить до складу фармацевтичної композиції, зберігає свою хімічну стабільність у цей момент часу, якщо вимірювання хімічної стабільності вказують на те, що даний білок (тобто антитіло) зберігає біологічну активність, що представляє інтерес, у даній фармацевтичній композиції. Методи моніторингу змін хімічної стабільності добре відомі фахівцям у даній галузі техніки та включають, крім іншого, методи визначення хімічно змінених форм білку, таких, які є результатом усікання, використовуючи, наприклад, SDS-PAGE, SEC та/або часопролітну мас-спектрометрію з лазерною іонізацією та десорбцією з рідкої матриці; та деградацію, пов'язану зі змінами молекулярного заряду (наприклад, пов'язаними з дезамідуванням), використовуючи, наприклад, іоно-обмінну хроматографію. Дивись, наприклад, методи, розглянуті нижче у даному документі. Вважається, що анти-CD40 антитіло або білок відповідно до винаходу у складі фармацевтичної композиції зберігає бажану біологічну активність у цей момент часу, якщо бажана біологічна активність у цей момент часу знаходиться у межах приблизно 30 %, переважно у межах приблизно 20 % бажаної біологічної активності, що проявляється в момент створення фармацевтичної композиції, як визначуваної підходящим методом аналізу бажаної біологічної активності. Методи вимірювання бажаної біологічної активності антагоністичних анти-CD40 антитіл або білків, розглянутих у даному документі, можуть бути виконані, як описано у прикладах у даному документі. Дивись також методи аналізу, описані у Schutze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr Transplant. 2: 6-15; Evans et al. (2000) J: Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman et al. (1996) Curr Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan et al. (1991) Currentprotocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79: 439-444; and U. S. Patent Nos. 5674492 and 5847082. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-CD40 антитіло, наприклад, вибране серед рекомбінантних антитіл mAb1-mAb3, входить до складу рідкої фармацевтичної композиції. АнтиCD40 антитіло або білок відповідно до винаходу можуть бути приготовлені, використовуючи будь-який метод, відомий у даній галузі техніки, включаючи методи, описані вище у даному документі. У одному варіанті здійснення винаходу, анти-CD40 антитіло, наприклад, вибране серед mAb1-mAb3 антитіл, продукується з використанням рекомбінантних ДНК-технологій у клітинній лінії СНО. Після приготування та очищення анти-CD40 антитіла воно може входити до складу рідкої фармацевтичної композиції у формі, викладеній вище у даному документі. У випадку, коли антагоністичне анти-CD40 антитіло підлягає зберіганню до створення композиції, воно може бути заморожене, наприклад, при -20ºС, і потім відтануте при кімнатній температурі для подальшого складання рецептури. Рідка фармацевтична композиція включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіла. Кількість антитіла, що знаходиться в композиції, враховує спосіб застосування та бажаний об'єм дози. Таким чином, рідка фармацевтична композиція включає анти-CD40 антитіло, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіло, у концентрації в діапазоні від 0,1 до 300,0 мг/мл, від 1,0 до 200 мг/мл, від 5,0 до 100,0 мг/мл, від 7,5 до 50 мг/мл або від 15,0 до 25,0 мг/мл. Рідка фармацевтична композиція включає анти-CD40 антитіло, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіло та буфер, який підтримує значення рН композиції в діапазоні від рН 5,0 до рН 7,0. Будь-який придатний буфер, який підтримує значення рН рідкої композиції анти-CD40 антитіла в діапазоні від приблизно рН 5,0 до приблизно рН 7,0, може бути використаний у композиції за умови, що фізикохімічна стабільність та бажана біологічна активність антитіла зберігаються, як зазначено вище у даному документі. Придатні буфери включають, крім іншого, загальноприйняті кислоти та їх солі, де протиіон може бути, наприклад, натрієм, калієм, амонієм, кальцієм або магнієм. Приклади загальноприйнятих кислот та їх солей, які можуть бути використані для забуферювання фармацевтичної рідкої композиції, включають, крім іншого, бурштинову кислоту або сукцинат, гістидин або гідрохлорид гістидину, лимонну кислоту або цитрат, оцтову кислоту або ацетат, винну кислоту або тартрат, фосфорну кислоту або фосфат, глюконову кислоту або глюконат, глутамінову кислоту або глутамат, аспарагінову кислоту або аспартат, малеїнову кислоту або малеат, оксибурштинову кислоту або малат. Концентрація буфера у складі композиції може бути в діапазоні від 1 до 50 мМ, включаючи приблизно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ або інші такі значення в межах діапазону від 1 до 50 мМ. У деяких варіантах здійснення винаходу рідка фармацевтична композиція включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіла, та сукцинатний буфер або цитратний буфер або гістидиновий буфер або гістидингідрохлоридний буфер у концентрації, яка підтримує значення рН композиції в діапазоні 23 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рН від приблизно 5,0 до 7,0. Під термінами "сукцинатний буфер" або "цитратний буфер" мають на увазі буфер, що включає сіль бурштинової кислоти або сіль лимонної кислоти, відповідно. Під "гістидиновим буфером" мають на увазі буфер, що включає сіль амінокислоти гістидин. У кращому варіанті здійснення винаходу, буфер є гістидиновим буфером, наприклад, буфером гістидину гідрохлориду. Як зазначено вище, концентрація гістидинового буферу у складі композиції може бути в діапазоні від 1 до 50 мМ, включаючи приблизно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ або інші такі значення в межах діапазону від 1 до 50 мМ. У кращому варіанті здійснення винаходу протиіоном сукцинату або цитрату є катіон натрію, і отже буфер є сукцинатом натрію або цитратом натрію, відповідно. Однак будь-який катіон потенційно є ефективним. Інші можливі катіони сукцинату або цитрату включають, крім іншого, калій, амоній, кальцій та магній. Як зазначено вище, концентрації сукцинатного або цитратного буферу у складі композиції можуть бути в діапазоні від 1 до 50 мМ, включаючи приблизно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ або інші такі значення в межах діапазону від 1 до 50 мМ. У іншому варіанті здійснення винаходу рідка фармацевтична композиція включає антагоніст анти-CD40 антитіла, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіла, у концентрації від 0,1 до 300,0 мг/мл, від 1,0 до 200 мг/мл, від 5,0 до 100,0 мг/мл, від 7,5 до 50 мг/мл або від 15,0 до 25,0 мг/мл, та гістидиновий або сукцинатний або цитратний буфер, наприклад, буфер сукцинату натрію або цитрату натрію або гістидину гідрохлориду в концентрації від 1 до 50 мм, від 5 до 40 мм, від 10 до 35 мМ, переважно приблизно 30 мМ. У випадках, коли бажано, щоб рідка фармацевтична композиція була приблизно ізотонічною, рідка фармацевтична композиція, що включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, mAb1, mAb2 або mAb3 антитіла, та буфер для підтримки значення рН композиції в межах діапазону від приблизно рН 5,0 до приблизно рН 7,0, може додатково включати кількість ізотонізуючої речовини, достатню для перетворення композиції у приблизно ізотонічну. Під терміном "приблизно ізотонічний" мають на увазі, що водна композиція має осмолярність у діапазоні від 240 до 800 ммоль/кг, від приблизно 240 ммоль/кг до приблизно 600 ммоль/кг, більш переважно від 240 ммоль/кг до приблизно 440 ммоль/кг, більш переважно від приблизно 260 ммоль/кг до приблизно 320 ммоль/кг, ще більш переважно від приблизно 270 до приблизно 310 ммоль/кг. Методи визначення ізотонічності розчину добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Дивись, наприклад, Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628. Фахівці у даній галузі техніки знайомі із цілим рядом фармацевтично прийнятних розчинів, придатних для забезпечення ізотонічності у фармацевтичних композиціях. Ізотонуюча речовина може бути будь-яким реагентом, здатним регулювати осмотичний тиск рідкої фармацевтичної композиції відповідно до даного винаходу до одержання значення, приблизно рівного такому рідини організму. Бажано використовувати фізіологічно прийнятну ізотонуючу речовину. Таким чином, рідка фармацевтична композиція, що включає терапевтично ефективну кількість антагоністичного анти-CD40 антитіла, наприклад, антитіла mAb1, mAb2 або mAb3, та буфер для підтримки значення рН композиції в межах діапазону від приблизно рН 5,0 до приблизно рН 7,0, може додатково включати компоненти, які можуть бути використані для забезпечення ізотонічності, наприклад, хлорид натрію; амінокислоти, такі як аланін, валінта гліцин; цукри та цукрові спирти (поліоли), включаючи, крім іншого, глюкозу, декстрозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, манітол, трегалозу, гліцерол, сорбітол та ксилітол; оцтову кислоту, інші органічні кислоти та їх солі, та відносно незначні кількості цитратів або фосфатів. Фахівець середньої ланки знає додаткові речовини, які придатні для забезпечення оптимальної тонічності рідкої композиції. У деяких кращих варіантах здійснення винаходу рідка фармацевтична композиція, що включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла, наприклад, антитіла mAb1, mAb2 або mAb3, та буфер для підтримки значення рН композиції в межах діапазону від приблизно рН 5,0 до приблизно рН 7,0, додатково включає хлорид натрію як ізотонізуючу речовину. Концентрація хлориду натрію у композиції залежить від внеску інших компонентів у тонічність. У деяких варіантах здійснення винаходу, концентрація хлориду натрію становить від 50 до 300 мм. У одному такому варіанті здійснення винаходу, концентрація хлориду натрію становить приблизно 150 мМ. В інших таких варіантах здійснення винаходу, концентрація хлориду натрію становить приблизно 150 мМ, буфером є буфер сукцинату натрію або цитрату натрію у концентрації від 5 до 15 мМ, рідка фармацевтична композиція включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, антитіла mAb1, mAb2 або mAb3, та композиція має значення рН від 5,0 до 7,0. 24 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У інших варіантах здійснення винаходу рідка фармацевтична композиція включає антиCD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, у концентрації в діапазоні від 0,1 до 50 мг/мл або від 5,0 до 25,0 мг/мл, приблизно 150 мМ хлориду натрію, та приблизно 10, 20, 30, 40 або 50 мМ сукцинату натрію або цитрату натрію, зі значенням рН, рівним приблизно 5,5. Деградація білку внаслідок заморожування/відтавання або механічної деформації під час обробки рідкої фармацевтичної композиції відповідно до даного винаходу можуть бути інгібовані включенням сурфактантів у композицію для зниження поверхневого натягу на границі розділу розчину/повітря. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу, рідка фармацевтична композиція включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад антитіла mAb1, mAb2 або mAb3, буфер для підтримки значення рН композиції в межах діапазону від приблизно рН 5,0 до приблизно рН 7,0, та додатково включає сурфактант. У інших варіантах здійснення винаходу, рідка фармацевтична композиція включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, антитіла mAb1, mAb2 або mAb3, буфер для підтримання значення рН композиції в межах діапазону від приблизно рН 5,0 до приблизно рН 7,0, ізотонізуюча речовина, така як хлорид натрію в концентрації від приблизно 50 мМ до приблизно 300 мМ, та додатково включає сурфактант. Загальноприйнятими застосовуваними сурфактантами є неіонні сурфактанти, включаючи ефіри поліоксиетиленсорбітолу, такі як полісорбат 80 (Tween 80) та полісорбат 20 (Tween 20); ефіри поліоксипропілену-поліоксиетилену, такі як Pluronic F68; поліоксиетиленові спирти, такі як Brij 35; симетикон; поліетиленгліколь, такий як PEG400; лізофосфатидилхолін; та поліоксиетилен-п-т-октилфенол, такий як Triton X-100. Класична стабілізація фармацевтичних засобів сурфактантами або емульсифікаторами описана, наприклад, у Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3): 160-165, включена у даний документ як посилання. Кращим сурфактантом, застосовуваним на практиці відповідно до даного винаходу, є полісорбат 80. Там, де включений сурфактант, він звичайно додається у кількості від 0,001 % до 1,0 % (маса/об'єм). Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу, рідка фармацевтична композиція включає терапевтично ефективну кількість анти-CD40 антитіла або білку відповідно до винаходу, наприклад, білку mAb1, mAb2 або mAb3, буфером є буфер сукцинату натрію або цитрату натрію або гістидину або гістидину гідрохлориду в концентрації від 1 до 50 мМ, від 3 до 40 мМ або від 5 до 35 мМ, або від 7,5 до 30 мМ; композиція має значення рН від 5,0 до 7,0; та дана композиція додатково включає сурфактант, наприклад, полісорбат 80, у кількості від 0,001 % до 1,0 % або від 0,001 % до 0,5 %. Такі композиції можуть у деяких випадках включати ізотонізуючу речовину, таку як хлорид натрію в концентрації від 50 до 300 мМ, від 50 до 200 мМ або від 50 до 150 мМ. У інших варіантах здійснення винаходу, рідка фармацевтична композиція включає антиCD40 антитіло або білок відповідно до винаходу, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, у концентрації від 0,1 до 200,0 мг/мл або від 1 до 100,0 мг/мл, або від 2 до 50,0 мг/мл, або від 5,0 до 25,0 мг/мл, включаючи приблизно 20,0 мг/мл; від 50 до 200 мМ хлориду натрію, включаючи приблизно 150 мМ хлориду натрію; сукцинату натрію або цитрату натрію від 5 до 20 мМ, включаючи приблизно 10 мМ сукцинату натрію або цитрату натрію; хлориду натрію в концентрації від 50 до 200 мМ, включаючи приблизно 150 мМ; гістидин або хлорид гістидину від 5 до 50 мМ, включаючи приблизно 30 мМ гістидину або хлориду гістидину; та у деяких випадках сурфактант, наприклад, полісорбат 80, у кількості від 0,001 % до 1,0 %, включаючи від 0,001 % до 0,5 %; де рідка фармацевтична композиція має значення рН, рівне від приблизно 5,0 до приблизно 7,0. Рідка фармацевтична композиція може практично не містити яких-небудь консервантів та інших носіїв, допоміжних речовин або стабілізаторів, зазначених вище у даному документі. Альтернативно, композиція може включати один або кілька консервантів, наприклад, антибактеріальних речовин, фармацевтично прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори, описані вище у даному документі, за умови, що вони не виявляють несприятливого впливу на фізикохімічну стабільність антагоністичного анти-CD40 антитіла або антиген-зв'язуючого фрагменту, вказаного вище. Приклади прийнятних носіїв, допоміжних речовин та стабілізаторів включають, крім іншого, додаткові буферні речовини, допоміжні розчинники, сурфактанти, антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін, хелатуючі агенти, такі як ЕДТА, металокомплекси (наприклад, Zn-білкові комплекси), та полімери, які біорозкладаться, такі як поліефіри. Детальне обговорення композиції та вибір 25 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фармацевтично прийнятних носіїв, стабілізаторів та ізомолітів можна знайти у Remington's th Pharmaceutical Sciences (18 ed., Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Після того, як рідка фармацевтична композиція або інші фармацевтичні композиції, описані у даному документі, приготовлені, вони можуть бути ліофілізовані для запобігання деградації. Методи ліофілізування рідких композицій відомі середнім фахівцям у даній галузі техніки. Безпосередньо перед використанням композиція може бути розчинена у стерильному розріджувачі (розчині Рінгера, дистильованій воді або стерильному сольовому розчині, наприклад), який може включати додаткові інгредієнти. Після розчинення композицію переважно призначають суб'єктам, використовуючи ті методи, які відомі фахівцям у даній галузі техніки. Застосування антагоністичних анти-CD40 антитіл у виробництві лікарських засобів Даний винахід також представляє антагоністичне анти-CD40 антитіло або білки відповідно до винаходу для використання у лікуванні аутоімунних захворювань та/або запальних захворювань у суб'єкта, де приймання лікарського засобу скоординоване, щонайменше, з одним іншим видом терапевтичного лікування. Під терміном "координований" мають на увазі, що лікарський засіб повинен бути використаний або до, або під час, або після лікування суб'єкта, щонайменше, одним іншим видом терапії. Приклади інших видів терапії включають, крім іншого, ті, що описані вище у даному документі, тобто хірургічну операцію або оперативні втручання (наприклад, спленектомію, лімфаденектомію, тиреоідектомію, плазмаферез, лейкофорез, трансплантацію клітин, тканини або органу, перфузію органу, шлунково-кишкові маніпуляції, тощо), променеву терапію, терапію таку, як стероїдна терапія та нестероїдна терапія, гормонотерапія, цитокінотерапія, терапія з дерматологічними речовинами (наприклад, місцеводіючими засобами, використовуваними для лікування шкірних патологій, таких як алергія, контактний дерматит та псоріаз), імуносупресивна терапія, та інші способи протизапальної терапії моноклональними антитілами тощо, де лікування додатковим терапевтичним впливом або додатковими терапевтичними впливами відбувається до, під час або після лікування суб'єкта лікарським засобом, що включають антагоністичне анти-CD40 антитіло або білки відповідно до винаходу, як зазначено вище у даному документі. У одному такому варіанті здійснення, даний винахід представляє антитіло mAb1, mAb2 або mAb3 для використання у лікуванні аутоімунного захворювання та/або запального захворювання у суб'єкта, де застосування лікарського засобу скоординоване з лікуванням, щонайменше, одним іншим видом терапевтичного впливу, як описано вище у даному документі. У деяких варіантах здійснення винаходу, застосування лікарського засобу, що включає антагоністичне анти-CD40 антитіло, наприклад, моноклональне антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, розглянуте у даному документі, або антиген-зв'язуючий фрагмент перерахованого вище, скоординоване з лікуванням двома іншими видами терапевтичного впливу. У випадку, коли застосування лікарського засобу, що включає антагоністичне анти-CD40, скоординоване із двома іншими видами терапевтичного впливу, використання лікарського засобу може бути до, під час або після лікування суб'єкта будь-яким з двох або обома разом іншими видами терапевтичного впливу. Винахід також представляє антагоністичне анти-CD40 антитіло, наприклад, антитіло mAb1, mAb2 або mAb3, розглянуте у даному документі, для використання у лікуванні аутоімунного захворювання та/або запального захворювання у суб'єкта, де лікарський засіб використовується у суб'єкта, який попередньо вже пройшов курс, щонайменше, одного іншого виду терапевтичного лікування. Під терміном "який попередньо вже пройшов курс терапії" або "попередній курс терапії" мають на увазі, що суб'єктові було уже проведено один або декілька інших видів терапевтичного лікування до одержання лікарського засобу, що включає антагоністичне антиCD40 антитіло або білок відповідно до винаходу. Нижчеподані приклади пропонуються як ілюстрація, а не як обмеження. Опис креслень 3 Фіг. 1 демонструє включення Н-тимідину після того, як 72-годинна культура PBMC людини була стимульована дозозалежним впливом Chir12.12 (незаштриховане коло), mAb1 (заштриховане коло), mAb2 (заштрихований квадрат), mAb3 (заштрихований трикутник) або CD40L людини (незаштрихований квадрат). 3 Фіг. 2 демонструє включення Н-тимідину після того, як 72-годинна культура PBMC людини була стимульована дозозалежним впливом Chir12.12 (незаштриховане коло), mAb1 (заштриховане коло), mAb2 (заштрихований квадрат), mAb3 (заштрихований трикутник) або 26 UA 112417 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CD40L людини (незаштрихований квадрат), ізотиповий контроль (заштрихований ромб) був костимульований у присутності або 5 мкг/мл анти-IgM F(ab")2, або 1 мкМ CpG2006. 3 Фіг. 3 демонструє включення Н-тимідину після того, як 72-годинна культура PBMC людини була стимульована дозозалежним впливом Chir12.12 (незаштриховане коло), mAb1 (заштриховане коло), mAb2 (заштрихований квадрат), mAb3 (заштрихований трикутник) або CD40L людини (незаштрихований квадрат), ізотиповий контроль (заштрихований ромб) був костимульований у присутності 75 нг/мл IL-4. 3 Фіг. 4 демонструє включення Н-тимідину після того, як 72-годинна культура PBMC людини була стимульована 20 мкг/мл CD40L з дозозалежним впливом Chir12.12 (незаштриховане коло), mAb1 (заштриховане коло), mAb2 (заштрихований квадрат), mAb3 (чорний трикутник) або CD40L людини (незаштрихований квадрат). Фіг. 5 демонструє дозозалежне зв'язування анти-CD40 антитіла людини із клітинними лініями BJAB, відповідно, Chir12.12 (заштриховане коло), mAb1 (незаштрихований квадрат), mAb2 (незаштрихований трикутник), mAb3 (заштрихований трикутник). Приклади Матеріали 1. Моноклональні антитіла Chir12.12 (1.9 мг/мл), mAb1 (0,88 мг/мл), mAb2 (1,9 мг/мл), та mAb3 (1,9 мг/мл) були поставлені у 50 мМ цитраті рН 7,0, 140 мМ NaCl. Ізотиповий контроль IgG був також використаний для окремих експериментів (Sigma, St. Louis, USA). 2. Стимули активації В-клітин Кролячі антитіла проти фрагмента AfiniPure F(ab") IgM людини були отримані з Jackson Immuno Research (Suffolk, UK), та CpG2006 було отримано з Microsynth (Balgach, Switzerland). Рекомбінантний CD40L людини був отриманий, використовуючи стандартні методи, відомі середнім фахівцям у даній галузі техніки. Супернатант, що містить IL-4 людини, був отриманий, використовуючи стандартні методи, відомі середнім фахівцям у даній галузі техніки. 3. Реагенти для роботи із тканевими культурами in vitro Культуральне середовище для PBMC: RPMI-1640, 10 % FBS, 1 % пеніцилін/стрептоміцин, 1 % неосновні амінокислоти, 1 % піруват натрію, 5 мМ β-меркаптоетанол (усі з Invitrogen, San Diego, USA). Методи 1. Аналіз CD40 L-опосередкованої проліферації PBMC 1.1 Очищення мононуклеарних клітин периферичної крові людини (PBMC) Первинні PBMC були очищені з лейкотромбоцитарного шару цільної крові, отриманого від здорових добровольців (Blutspendezentrum, Basel). Лейкотромбоцитарний шар був розведений 1:4 PBS без Ca2+ і Mg2+, що містить 5 мМ ЕДТА, та розфасований аліквотами по 25 мл у пробірки Falcon об'ємом 50 мл. Поверх розведеного лейкотромбоцитарного шару нашаровували 14 мл фіколу Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare) розраховуючи на одну пробірку Falcon, та центрифугували при кімнатній температурі протягом 20 хвил. при 2250 об./хвил. (без гальмування). Після центрифугування шар інтерфази був перенесений у окрему пробірку Falcon об'ємом 50 мл. Шари інтерфази з декількох пробірок (від одного донора) були об'єднані з утворенням об'єму, що дорівнює або менше 30 мл. PBS, що додатково містить 5 мМ ЕДТА, був доданий, та клітини були центрифуговані при кімнатній температурі протягом 5 хвил. при 2250 об/хвил. Супернатант видаляли до додавання 15 мл лізуючого еритроцити буферу (RBC) та інкубації при кімнатній температурі протягом 5 хвил. Потім 20 мл PBS/5мМ ЕДТА були додані, та клітини були знову центрифуговані (кімнатна температура, 5 хвил., 2250 об./хвил.). Клітини були промиті двічі у PBS/5мМ ЕДТА (із проміжними етапами центрифугування) та ресуспендовані у 35 мл культурального середовища для PBMC до визначення числа живих клітин, використовуючи метод виключення трипанового синього. Клітини, що не підлягають негайному використанню для стимуляції in vitro, були кріоконсервовані. 1.2 Аналіз стимуляції PBMC in vitro Серія із семи дворазових розведень кожного анти-CD40 або ізотипового контролю mAb була зроблена тричі у 96-лункових планшетах Costar у присутності та за відсутності постійної дози величиною 5 мкг/мл анти-IgM F(ab")2, 1 мкМ CpG2006, супернатанта, що містить IL-4 (75 нг/мл) людини, або 40 мкг/мл рекомбінантного huCD40L (зазначені кінцеві концентрації). Початкові концентрації кожного анти-CD40 mAb були в діапазоні від 20 до 100 мкг/мл залежно від експерименту. CD40L був використаний в аналізі дозозалежного ефекту як позитивного контролю для всіх експериментів. Дози анти-IgM, CpG2006, IL-4 та CD40L були вибрані, керуючись попередніми експериментами, де здатність цих реагентів (окремо або у комбінації) індукувати проліферацію PBMC або В-клітин була оцінена у аналізі дозозалежного ефекту (дані 27 UA 112417 C2 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 не показані). PBMC (кінцева щільність 8×10 клітин на лунку) були послідовно додані у кожну 3 лунку до інкубації протягом 3 днів при 37ºС/5 % CO2. Н-тимідин (1 мкКі/50 мкл/лунку) був доданий у кожну лунку для культивування протягом останніх 6 годин до збору клітин та визначення включення тимідину, використовуючи сцинтиляційний лічильник MicroBetaTrilux. Важливо відзначити, що клітини плюс культуральне середовище та клітини плюс культуральне середовище плюс анти-IgM, IL-4, CpG2006 або CD40L контрольні культури (за відсутності антиCD40 mAb) були включені у кожний експеримент. Сцинтиляційні дані були проаналізовані програмою Excel та програмним забезпеченням GraphPad Prism. Результати представлені як середнє число імпульсів на хвилину (cpm) (+/стандартна помилка середнього) залежно від концентрації анти-CD40mAb у логарифмічній шкалі. Фоновий рівень позитивних контролів та клітин плюс культуральні середовища зазначені на кожному графіку. Значення IC50 або EC50 були обчислені відповідно до результативної апроксимації даних за допомогою програми Prism. PBMC були стимульовані, як зазначено вище, 20 мкг/мл CD40L у присутності або за відсутності дозозалежного ефекту тестуємого анти-CD40 mAb протягом 3 днів. Проліферацію 3 оцінювали за включенням Н-тимідину після 72 годин культивування. Результати представлені у вигляді середнього значення тричі повтореного культивування клітин з SEM та характерні для 4 донорів (незалежні експерименти). Значення IC50 для опосередкованого анти-CD40 mAb інгібування представлені у мкг/мл. 2. In vitro аналіз агоністів PBMC PBMC людини були стимульовані, як зазначено вище у параграфі 1.2, з дозозалежним ефектом Chir12.12, mAb1, mAb2 або mAb3 протягом 3 днів або за відсутності костимуляції, або в присутності або 5 мкг/мл анти-IgM F(ab")2 або 1 мкМ CpG2006. Проліферацію оцінювали 3 включенням Н-тимідину після 72 годин культивування. Результати представлені у вигляді середнього значення тричі повтореного культивування клітин з SEM та характерні для 4 донорів (незалежні експерименти). 3. Аналіз ADCC 6 50 мкл суспензії PBMC (10×10 клітин/мл) було додано в плашки з круглодонними гніздами 5 (Corning Incorporated-Costar #3790), 50 мкл пофарбованих кальцеїном клітин Raji (2×10 клітин/мл) та 100 мкл розведення антитіла або контролів були додані. Максимальний лізис визначали у 2 % Triton 100. Клітини були зібрані на дні плашки (3 хвилини при 250×g) та інкубовані при 37ºС у зволоженій CO2-атмосфері (5 %) протягом 1 години. Клітини були відділені від культурального середовища центрифугуванням (3 хвилини при 750×g), та 100 мкл супернатанта було перенесено у чисті плашки з темним дном (Corning Incorporated-Costar #3904) для вимірювання. Флуоресценцію вимірювали при 535 нм після збудження при 485 нм на спектрофотометрі Spectramax Gemini (Molecular Devices). Специфічний лізис був обчислений, використовуючи наступну формулу: (експериментальне випромінювання спонтанне випромінювання)/(максимальне випромінювання - спонтанне випромінювання)×100. 4. Зв'язування варіантів антитіла проти CD40 людини з людською клітинною лінією BJAB Була використана проточна цитометрія для порівняльного аналізу зв'язування різних 5 варіантів фрагменту Fc анти-CD40 антитіла із клітинами BJAB людини. У зв'язку із цим, 2×10 клітин були посіяні у кожну лунку 96-лункового планшету з V-подібним дном. Планшети були промиті двічі 200 мкл буферу FACS (PBS, 5 % FCS, 2 мМ ЕДТА) протягом 2 хвил. при 4ºС при 1350×g. Супернатанти були видалені, та клітини були ресуспендовані у 100 мкл буферу FACS, що містить 8 % сироватку людини (Invitromex, по каталогу № S4190) та інкубовані протягом 10 хвил. Після двох промивань варіанти Fc-фрагменту антитіла проти CD40 людини були додані у 50 мкл буферу FACS з 1 % сироваткою людини, починаючи з концентрації 10 мкг/мл у розведенні 1:2. Клітки були інкубовані протягом 30 хвилин на льоду з наступними двома етапами промивань. 50 мкл поліклональних кролячих поліклональних антитіл проти F(ab") 2 IgGFITC людини (DAKO, по каталогу № F 0315) були додані у кожну лунку та інкубовані протягом 30 хвил. на льоді. Наприкінці інкубації клітини були промиті двічі, ресуспендовані у 100 мкл буферу FACS, та була отримана інформація на FACS Cantoll. Після одержання інформації середня інтенсивність флуоресценції по каналу FITC була отримана у FloJo. Побудова графіків та апроксимація кривої була виконана за допомогою GraphPad Prism 5.0. Через змінювані інтенсивності між індивідуальними експериментами, дані були нормовані. Таким чином, найбільше значення кожної тестової серії антитіла було рівне 100 %. Нелінійна апроксимація була проведена для значень у відсотках. 28